Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительная диагностическая эффективность соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов трихинелл и их иммунохимический анализ
ВАК РФ 03.00.19, Паразитология
Автореферат диссертации по теме "Сравнительная диагностическая эффективность соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов трихинелл и их иммунохимический анализ"
На правах рукописи
Курносова Ольга Петровна
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ СОМАТИЧЕСКОГО ФРАКЦИОНИРОВАННОГО И ЭКСКРЕТОРНО-СЕКРЕТОРНОГО АНТИГЕНОВ ТРИХИНЕЛЛ И ИХ ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Специальность 03.00.19-паразитология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2005
Работа выполнена во Всероссийском на>чно-исстедовательском институте гельминтологии им К И Скрябина
Научный руководитель-
доктор ветеринарных наук, профессор УСПЕНСКИЙ Александр Витальевич
Официальные оппоненты
доктор биологических наук НОВИК* Тамара Самуиловна (ВИГИС)
доктор ветеринарных наук ГЛАМАЗДИН Игорь Геннадьевич (МГУПБ)
Ведущая организация Рязанская Государственная Сельскохозяйственная Академия им П А Костычева
Защита диссертации состоится « 200 ®г в часов на заседании
диссертационного совета Д 006 011 01 при Всероссийском на\ чно-исстедовательском институте гельминтологии им К И Скрябина (ВИГИС) Адрес 117218. Москва. Б Черемушкинская \л , 28
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС
Автореферат разослан^!2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, £/
доктор биологических наук ^' Бережко В К
2,00£А
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Трихинеллез является широко распространенным зоонозом. характеризующимся сложным патологическим проявлением, нередко с тяжелыми последствиями В связи с тгим. проблема борьбы с этим опасным гельминтозом имеет важное медицинское, ветеринарное и социально-экономическое значение.
Ежегодно в Российской Федерации регистрируется до 700 случаев заболевания трихинеллезом людей, причем в 40% они носят групповой характер Стационарно неблагополучными по данном) паразитоз} в настоящее время остаются регионы Северного Кавказа Восточной Сибири. Дальнего Востока и Кировской области (Т.Н Ашурбекова 2000 1 И Гвердохлебова и др 2000 Б Р Гаркави и др 2001. М А Попов и др 2002 А А Пшеничный А Я Сапунов 2002) Широкий круг восприимчивых животных и многообразие трофических связей способствует передаче возбудителя на нескольких уровнях с вовлечением в циркуляцию как насекомых-трупоедов. так и мелких млекопитающих, птотоядных. всеядных животных и крупных хищников (Б Р Гаркави 2004 НН Макаров 2003. В А Ромашов. Б В Ромашов. 1992, Ф К Скворцова 2002. В А Ромашов и др 1996. Б В Ромашов, М В Рогов 2002) Все э ги условия создают реальную опасность заражения людей трихинеллезом несмотря на меры предосторожности пред}(.МО!репные с_\ществ\ ющими вегеринарно-сапитарными требованиями
Диагностика трихинеллеза занимает ведущее место в системе мероприятий, направленных на предупреждение заболевания населения и животных В данном случае, наибольшею внимания заслуживают методы прижизненной диагностики, позволяющие предупредить распространение инвазии и существенно сни!и!ь затраты на содержание зараженных животных
В настоящее время активно продолжается поиск точных методов прижизненной диагностики, которые бы отличались высокой лиагностической эффективностью с одной стороны и являлись достаточно экономичными дня широкого использования не только в медицине, но в первую очередь в сфере ветеринарного обслуживания животноводства
Общеизвестно, что успех любой серодиагностики зависит от качества антигенов используемых для выявления того или иного гельминтоза Без предварительного имму нохимичеекпго исследования белковой структуры трихинелл, невозможно направленное применение антигенных компонентов данного гельминта для высокоспецифичной и чувствительной прижизненной зиагносгики
Цели и задачи исследования. Основной печью настоящих исследований явилось получение соматического фракционированного и экскреторно-секреторных антигенов, проведение их иммунохимического анализа и оценка диагностических свойств в ИФР Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи
1 Получить личинки грихинелл для приготовления разных антигенов,
2 Получить полный соматический экстракт. соматический фракционированный и экскреторно-секреторные антигены трихинелл,
3 Получить кроличьи гипериммунные сыворотки,
4 Провести электрофоретическое разделение полученных антигенов в ПААГ.
5 Провести иммунохимический анализ белков-антигенов с помощью иммуноблота с использованием гипериммунных сывороток кроликов'
6 Оценить диагностическую эффективность соматического фракционированного и экскреторно-секреторных антигенов в ИФР.
7 Провести сравнительные испытания диагностической эффективности ИФР и иммуноблота
Научная новизна. В данной работе предложены качественно новые способы получения белковых компонентов Т spiralis Наработанные белки-антигены изучены с помошыо иммунохимического анализа, позволившего определить молекулярную масс) основных антигенов Т spiralis, выделенных из сложного набора белков, секретируемых этим гельминтом, а также дать им иммунологическую характеристику Эти исследования помогай пол\чить высокоспецифичные, чувствительные антигены Т spiralis которые можно использовать для точной прижизненной диагностики, а также в качестве протективного препарата } живогных
Практическая ценность работы. По результатам исследований по теме диссертации подготовлены и утверждены следующие нормативные документы-
Методика получения экскреторно-секреторных продуктов личинок Т spiralis Автор Курносова О П
Методические рекомендации по получению и анализу иммуногенных белков тканевых гельминтов и клеток генно-инженерных штаммов, продуцирующих антигены (Т spiralis. Е granulosis) Авторы Одоевская ИМ Курносова ОП. Успенский A.B. Бенедиктов И И
Патент Способ получения основных иммуногенных антигенов Т spiralis Входящий номер 006444, регистрационный номер 2005105086 от 25 02 200^ i
Апробация результатов. Материачы диссертации дозожены и обсуждены на -научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными бочезнями» (Москва. 2004 i ).
-секции «Инвазионные бозезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005 г).
-заседаниях Ученого совета ВИГИС 2003-2005 i г
Основные положения, выносимые на защиту:
-методические основы получения соматического фракционированного и экскреторно-секреюрного антигенов личинок Т spiralis,
-комплексная оценка бечковот состава антигенов личинок трихинелл на основе градиентного электрофореза в ПААГ
-имм\нохимический анализ белков-антигенов с помощью иммуноблота с использованием гипериммл иных сывороток кроликов
-оценка диагностической эффективности соматического фракционированного и экскреторно-секреторных антигенов в ИФР.
-сравнительные испытания диагностической эффективности ИФР и иммуноблота Публикации. По теме диссер i ации опубликовано 10 работ
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состой! и! ввезепия. обзора литературы, материалов и методов исследований результатов собственных исс 1едований. выводов, практических предложений, списка литературы и приложения Список литературы включает 193 источника, в том числе 97 отечеивенных авторов и 96 зарубежных авторов Работа иллюс грирована 6-ю таблицами и 9-ю рис) нками
Обзор литературы.
Представлен анализ литературы по иммунологическим аспектам паразито-хозяинных взаимоотношений при трихинеплезе. по антигенному составу личинок трихинелл и их иммунохимических свойствах Анализируются современные достижения ученых разных стран по способам получения, иммунохимического анализа антигенов [рихинелл и создания качественных и новых диагностикумов для выявления данною заболевания у человека и животных
Собственные исследования.
Материалы и методы исследований.
Исследования проводились в 2003-2005 г в лабораториях диагностики, биотехнологии ВИГИ С.
Объект исследования: Антигены "Г spiralis полный соматический, сомашческий фракционированный и экскреторно-секреторные
Получение личинок трихинелл Инвазионные личинки получали методом переваривания в искусственном желудочном соке тушек крыс «раженных лабораторным штаммом Т spiralis в дозе 10 личинок на один грамм живого Reca Жизнеспособность личинок оценивали под микроскопом Выделенных личинок концентрировали и использовали для получения необходимых в работе антигенов
11олучение полного соматического экстракта Личинки механически измельчали и жеграгировали 0.9% NaCI в течение 18 часов Экстракт центрифугировали Супернатант диализовапи против 0.9% NaCI и концентрировали против ГТЭГ-6000 Полученный по шый соматический экстракт использовали для изучения белкового состава и получения сомажческого фракционированного антигена и гипериммунных кроличьих сывороток
Получение соматического фракционированного антигена Полный соматический экстракт в объеме 5 мт фракционировали на колонке Sephadex О-100, диаметром 3 см. высотой 50 см Колонка была уравновешена 0.9 % NaCI Белки элюировали тем же раствором, скорость .иноции составила 20 мл/ч, объём собираемых фракций - 3 мч Содержание белка во фракциях определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм Антигенную активность полученных белковых фракций определяли в ИФР L использованием заведомо положительных, отрицательных и гетерологичных сывороток Фракции, показавшие наилучшие диа! ностические свойства использовали в качестве соматического фракционированного антигена
Получение экскреторно-секреторных продуктов личинок трихинелл Белковые продукты личинок получали по методу Gamble Н R (1985) с некоторыми модификациями Выращивание личинок проводили в различных вариантах
в СОг-инкубаторс при 37°С с 10% содержанием углекислоты и 70%-ной влажностью.
в обычном термостате при 38,5 С.
в термостатирующей установке при той же температуре с регулируемым числом оборотов
Белковые продукты отбирали один раз в сутки в течение 3-х дней После каждого отбора экскреторно-секре горных продуктов объем среды инкубации доводили до исходного, добавлением новой порции питательной среды с глутамином Жизнеспособное 1Ь тичинок трихинелл оценивали под микроскопом
Полученные зкскреюрно-секрегорные продукты диализовали против 0.9% NaCI в течение 48 часов концентрировали и определяли концентрацию белка Полученные экскреторно-секреторные продукты проверяли на антигенную активность в ИФР и использовали в качестве экскреторно-секреторных антигенов Получение i ипериммунных сывороток
Для получения гипериммунных сывороток использовали кроликов породы «Советская шиншилла» в возрасте 6 месяцев, весом 3-4,5 кг. содержащихся в одинаковых условиях и получающих равноценный рацион Всем животным для гипериммунизации вводили подкожно в подлопаточную область полный соматический экстракт личинок I spiralis с полным адъювантом Фрейда (! 1) в дозе 1 мл Экстракт живожым вводили через 14. 28. 42. 56. 60 и 72 дня, 1-е и 2-е введение антигена осуществляли с ПАФ. в последующие периоды проводили инъекции антигена без ПАФ Полный цикл иммунизации составил 1 месяца
По окончании иммунизации. у опытных животных проверячи уровни клеточного и гуморального иммунного ответа Уровень гуморального иммунного ответа определяли ИФР Уровень ктегочного иммунного ответа определяли в реакции Грисса
Полученные гипериммунные сыворотки замораживали и хранили при -20 °С до использования
Изучение белкового состава антигенов личинок трихинелт
Для определения белкового состава антигенов проводили электрофорез в денатурирующих условиях по «etоду 1 aemmli (1970) с испочьзованием прибора для вертикального элекрофореза в мини-геля\ Mim Proteant® После проведения электрофореза и окрашивания геля молекутярный ве<. белков определяли с помощью компьютерной npoi раммы OneD-Scan
Иммунохимический анализ антигенов личинок трихинелл Для определения иммуногенных белков, входящих в состав полученных белковых комплексов проводили иммуноблот Элсктроперенос осуществляли по методу Н Towbin el al (1979) с модификациями (Kyhse - Andersen, 1984) Использовали нитроцеллюлозные фильгры (Schleicher - Schuell. Германия) с диаметром пор 0,2 мкм Перенос осуществляли в камере для переноса При лом контакт «сендвича» из геля и нитроцеллюлозы с пластинчатыми графитовыми электродами обеспечивается за счет прокладок из фильтровальной бумаги
смоченных в б\ ферах Электроперенос проводили при комнатной температуре в течение 2-х ч при 120 В
Иммунное выявление антигенов на фильтре выполняли по методу Н í owbin et al (1979) с использованием гипериммунных сывороток кроликов Все операции проводили мри температуре 37Т и легком покачивании с помощью аппарата для встряхивания АВУ-6с (частота встряхивания 65 раз в мин)
Определение диагностической эффективности полученных антигенов Диагностическую эффективность соматического фракционированного и экскреторно-секреторных антигенов оценивали в иммуноферментной реакции (ИФР). В реакции использовались сыворотки свиней, полученных от спонтанно и экспериментально зараженных трихинеллами животных, от условно здоровых животных и и ( неблагополучного по трихинеллезу хозяйства сыворотки от свиней, больных эхинококкозом. а также сыворотки крови людей, больных трихинеллезом и здоровых доноров
ИФР ставили в непрямом варианте, в качестве твердой фа!ы использовали полистироловые планшеты фирмы Costar предварительно сенсибилизированные антигенами трихинелл из расчета 0 5 мкг на лунку Сыворотки крови использовали в разведении! 100 антивидовой коныогат - в разведении I 12000. окрашивание проводили субстратной смесью (на 10 мт цит ратного буфера рН 5 0 вносили 8 мг ортофенилендиамина и 10 чкл 33% перекиси водорода) Останавливали реакцию добавлением 2М серной кислоты Учет результатов проводили на спектрофотометре при длине волны 492 нм
Результаты исследований.
Анализ данных по получению антигенов трихинелл.
Полный соматический экстракт Полный соматический экстракт - это препарат белков, экстрагируемых из гомогената личинок трихинелл физиологическим раствором В результате, из 6 мл личинок трихинелл было получено В мл препарата полного соматическо! о антигена с концентрацией белка 12 мг/мл
Соматический фракционированный антиген Препарат полною соматического антигена содержит большое количество белков Некоторые из этих бетков вилоспецифичны. некоторые иммуногенны, а часть из них может являться обшей для нескольких видов гельминтов Перед нами стояла задача фракционировать полный
л
S 1
s
S 0,8
l06
| 0,4
о
0,2 0
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 («фракции
Рис. 1. Хроматографическое разделение белков полною соматического антигена T.spiralis.
соматический антиген и проверить подученные фракции на специфичность и чувствительное i ь
В процессе фракционирования на Гефадексе G-100 полного соматическою же факта, было поточено 5 белковых пиков Все полученные фракции проверили в ИФР на специфичность и чувствительность В ре!упьтате диагностически значимые антигенные компоненты содержали фракции с 10-и по 14-ю. входящие в состав второго белкового пика Электрофоретический анализ показан, что в состав этих фракций входит 9 белков с молекулярными массами от 29.9 до 85.6 кДа (Рис I)
Экскреторно-секре i орные антигены Полученные в ходе культивирования экскреторно-секреторные продукты личинок Т spiralis содержали разное количество белка (табз № I) Как видно из таблицы № 1. на 2-й и 3-й с\тки культивирования личинок концентрация белка посгененно увеличивается вероятно, это связано с постепенной гибелью личинок в процессе инкубации и с последующим выходом белка в кутьтуральную жидкость При культивировании личинок в тсрмостатирующей установке с перемешиванием после 24 ч концентрация белка составила 1059.5 мкг/мл. и последующие культивирование было прекращено и!-за гибели около 50-ти % личинок
Концентрация белка в экскреторно-секреторных метаболитах личинок Т. spiralis
Способ культивирования Концентрация белка в экскреторно-секреторных проду ктах i I (мкг/мл) I
I -е сутки 2-е сутки 3-й сутки | I
СОг-инкубатор с 10%-ным С02 396,8 437,3 599,2
Обычный термостат (38,5 С) 401.4 487 I 557.5 , I
Получение гиперимму иных сывороток В ходе гипериммунизации кроликов полным соматическим антигеном личинок Т spiralis нами были получены гипериммунные сыворотки высокого титра Уровень гуморального иммунного ответа оценивали в ИФР. максимальный титр антител составил 1 25600 Уровень клеточного иммунного ответа определяли, измеряя концентрацию окиси азота в моче подопытных животных (реакция Грисса) При эюм, показатели оптической плотности (концентрации N0? ) составили 1.540-1,730 по отношению к контролю 0.147-0.198 Анализируя полученные данные можно отметить что существуй корреляция между уровнями гуморального и клеточного иммунного ответа (Рис 2) Это объясняется тем, что высокий уровень гуморального ответа опосредован клеточным иммунитетом Из полученных в ходе опыта результатов мы сделали вывод, что реакцию Грисса можно использовать для определения уровня hmmviihoio ошета в ходе иммунизации животных
Концентрация
№ИО« No,
(мкг/мп)
титр
спвиифичвгких антител 1 30000
III
Рис. 2. Зависимость концентрации ионов N0; в моче от титра специфических антител в крови гипериммунизированных кроликов.
Физико-химическая характеристика и сравнительный анализ антигенов T.spiralis.
Методом электрофореза в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле у полного соматического экстракта было обнаружено 29 полос с молекулярной массой от 30 до 160 к Да У фракционированного соматического - 9 с молекулярным весом от 25 до 63 кДа У экскреторно-секреторных продуктов личинок трихинелл после первых суток куль гивирования в СОг-инкубаторе обнаружено 5 белковых полос с молекулярной массой от 27 кДа до 56 кДа; на 2-е сутки инкубирования 7 белковых полос с молекулярной массой от 27 кДа до 65 кДа; на 3-й сутки инкубирования 8 белковых полос с молекулярной массой от 27 кДа до 65 кДа. После инкубирования личинок трихинелл в обычном термостате после первых суток обнаружено 5 белковых полос с молекулярной массой от 25 до 60 кДа ; на 2-е сутки инкубирования 7 белковых полос с молекулярной массой от 25 до 71 кДа; на 3-й сутки инкубирования 8 белковых полос с молекулярной массой от 25 до 79 кДа.
У всех белковых продуктов личинок Т. spiralis, полученных, разными способами нами установлено наличие бежов с одинаковым молекулярным весом в диапазоне от 42 кДа до 50-55 кДа.
Иммунохимическая характеристика и сравнительный анализ выделенных антигенов T.spiralis.
Иммуноблотингом с использованием гипериммунных кроличьих сывороток было установлено наличие 5-ти белковых полос у соматического фракционированного антигена с основными иммуногенными белками молекулярной массой 53, 57 и 60 кДа. В тоже время показанный в электрофореграмме мажорный белок 49 кДа антителами почти не определяется. У экскреторно-секреторных антигенов, полученных при культивировании личинок в ССЬ-инкубаторе после 24 часов инкубирования, электрофорез выявляет два мажорных белка - 42 и 45 кДа, а также слабые полосы 49 и 56 кДа. При этом иммуноблот показывает, что основным иммуногенным белком является белок 53 кДа, не заметный на электрофореграмме. В дальнейшем количество белков в смеси увеличивается, становится заметным белок 53 кДа, появляется белок 65 кДа, но основным иммуногенным белком остается 53 кДа. При культивировании личинок трихинелл в условиях обычного термостата основным иммуногенным белком является белок с молекулярной массой 52 кДа, также иммуноблотом выявляются белки 56 и 60 кДа.
|р
Рис. 3. Иммунохимнческий «валю соматического фракционированного и экскреторпо-секреторных антигенов.
1-5) соматический фракционироваIшый антиген, 10-14 фракции, соответственно;
6-8) экскреторно-секреторный антиген, полученный при культивировании личинок в С02 инкубаторе, 24,48 и 72 часа инкубации, соответственно;
9-11) экскреторно-секреторный антиген, полученный при культивировании личинок ■ условиях обычного термостата, 24,48 н 72 часа инкубации, соответственно.
У всех экскреторно-секреторных и соматического фракционированного антигенов присутствуют мажорные полосы с молекулярной массой в диапазоне 43-56 кДа (Рис. 3).
Определение диагностической эффективности выделенных антигенов в ИФР.
Диагностическую эффективность соматического фракционированного и экскреторно-секреторных антигенов трихинелл проверяли в иммуноферментной реакции с сыворотками крови лабораторных животных (кролики) и с сыворотками крови свиней.
В опытах по оценке диагностической эффективности ИФР с обоими антигенами использовали 58 сывороток крови кроликов, в том числе от экспериментально зараженных T.spiralis (8) и культурой криптоспоридий (12), гипериммунизированных экстрактом личинок T.spiralis (5), иммунизированных экскреторно-секреторным антигеном с ПАФ личинок T.spiralis (9), гипериммунизированных экстрактом протосколексов E.multilocularis (2), иммунизированных антигеном EgFB с ПАФ с последующим заражением Е multilocularis (12), спонтанно зараженных пассалурусами (2) и цистицеркозом тениукальным (3), клинически здоровых (5).
Чувствительность и специфичность ИФР с обоими антигенами составила 100% (табл. 2).
При оценке диагностической эффективности ИФР с сыворотками крови свиней в реакции использовали 88 проб, из них экспериментально и естественно инвазированные Т spiralis (8), инвазированные E.granulosus (12), сыворотки крови свиней из очага трихинеллеза Московской области (35) и от клинически здоровых свиней (33) Тканевых гельминтов при ветсанэкспертизе не было обнаружено
Специфичность ИФР с соматическим фракционированным антигеном составила 88,63%, с экскреторно-секреторным - 90,98%, при чувствительности обоих антигенов 100%. Диагностическая эффективность ИФР с экскреторно-секреторным антигеном была несколько выше, чем с соматическим фракционированным (табл 3).
Сравнительный анализ диагностической эффективности ИФР и иммуноблота.
Для сравнительного анализа ИФР и иммуноблота были использованы сыворотки крови людей, больных трихинеллезом, с подтвержденным диагнозом (3), сыворотки крови свиней, зараженных T.spiralis, с подтвержденным диагнозом (16) и сыворотки крови свиней из очага трихинеллеза Московской области (35).
Чувствительность и специфичность обоих методов в реакции с сыворотками крови от людей и свиней с подтвержденными диагнозами составила 100% Из 35-ти сывороток крови свиней из очага трихинеллеза, в ИФР положительно прореагировало 8, из них 6 - ложноположительно. Из этих 8-ми в иммуноблоте положительную реакцию дали только 2 сыворотки. Специфичность ИФР составила 77,14%, иммуноблота - 94,28% Таким образом, используя иммуноблот в диагностических целях при спонтанном иражении свиней в очаге инвазии, удалось установить более высокую специфичность метода по сравнению с ИФР (табл. 4).
Таблица № 2.
Диагностическая эффективность ИФР с антигенами Т. spiralis с использованием сывороток лабораторных животных.
Сыворотки крови животных (кролики) Кол-во животных в группе Результаты ИФР
фракционированный соматический ai экскреторно-секреторный аг
полож. , отриц чувст ! спец полож | отриц чувст. специф
Эксперим зараж животные 8 - 100% 100% 8 - 100% 100%
Гипериммун экстрактом личинок 1 spiralis 5 5 - 5 -
Иммуниз экскрет/секрет Аг+ИАФ 9 9 - 9
Гиперимм\н экстрактом Е. multilocularis (пртосколексов) 2 - 2 - 2
Иммуниз AI EgFB+ПАФ с послед заражением Е multilocularis 12 12 12
Спонтанно зараженные пассалурисами 2 2 - 2
Эксперимент зараженные культурой криптоспоридий 12 - 12 - 12
Спонтанно зараженные цистицеркозом тенуикальным 3 - з - 3
Здоровые кролики . ! - 5 - 5
Сравнительная диагностическая эффективность антигенов T.spiralis в ИФР.
Диагностический .... Копи-чество животных Соматический фракционированный антиген Экскреторно-секреторный антиген
стату с животного (сыворотки свиней) положите зьно отрицательно чу встви-течьноегь специфичность положительно отрицательно чувствительность специфичность
Экспериментально и естественно инвазиро ванные 1 spiralis 8 8 - 100,0% - 8 - 100,0%
Инвазированные Е granulosus 12 2 10 - 83.3% 1 11 91,7%
Из очага трихинеллеза Московской области 35 8 27 - 77,4% 7 28 80,8%
Клинически здоровые животные 33 33 - 100.0% 33 - 100.0%
Итого 88 18 70 100,0% 88.63% 16 72 100.0% 90,9%
Сравнительный анализ диагностической эффективности ИФР и иммуноблота.
Сыворотки крови Количество Результат ИФР Результаты иммуноблота
положительные ложно-положительные чувст- отрица- 1 витель-тельные | ность специфичность положительные ложно-положительные отрицательные чувствительность специфичность
Сыворотки людей с подтвержденным диагнозом 3 3 - - 100 - 3 - - 100% -
Сыворотки свиней с подтвержденным диагнозом 16 16 100 16 1 [ | 100% _
Сыворотки свиней из неблагопотучного по трихинеллезу хозяйства 35 8 27 77,14% 2 - 33 94,28%
Выводы.
1 Оптимизированы методы пол) нения антигенов трихинелт Модифицирована и упрощена методика пол)чения экскреторно-секреторных антигенов личинок Т spiralis
2 Исстсдован белковый состав антигенов трихинелл методом электрофореза в полиакриламидном геле У всех белковых продуктов личинок Т spiralis, полученных разными способами, установлено наличие белков с одинаковым молекулярным весом в диапазоне от 43 кДа до 50-55 кДа Можно заключить, что при получении экскреторно-секреторных продуктов личинок [рихинелл с увеличением сроков культивирования количественный антигенный состав белков постепенно увеличивается, как за счет низко, гак и за счет высокомолекулярных белков
3 Проведение иммунохимического анализа позволило определить основные иммуно! енные белки личинок Т spiralis. Иммуноблот показал, что > всех экскреторно-секреторных антигенов и соматического фракционированного присутствуют мажорные полосы с молекулярной массой в диапазоне 43-56 кДа Попученные данные свидетельствуют об антигенной идентичности белковых продуктов Т spiralis и возможности испопьзования их в серодиагносжке трихинеллеза
4 В процессе исстедований отработана методика получения гипериммунных кроличьих сывороток с контролем клеточного и гуморального иммунитета в реакции Грисса и ИФР соответственно, что позволило провести дифференцированную оценку уровня специфического ответа.
5 Определение диагностической эффективности ИФР при трихинеллезе свиней в сравнительном аспекте с полученными антишшми показало, чю чувствительность реакции составила 100% специфичность фракционированного антигена - 88,76%. экскреторно-секреторного антигена - 90,98%
6 Сравнительным анализом диагностической эффективности ИФР и иммуноблота при трихинеллезе свиней установлено что иммуноблот явтяется более специфичным методом Потученные данные свидетельствуют о перспективности использования иммуноблота в диагностических целях
7 В ходе работы установлено, чю метод пол\чения зкскреторно-секрегорного антшена по сравнению с методом получения соматического фракционированного, менее тр)доемок и достаточно экономичен Диагностическая эффективноыь ИФР при трихинелпезе свиней с использованием первого антигена несколько выше, чем со вторым Эти данные позволяют считать возможным широкое использование экскреюрно-
секреторного антигена как в научных исследованиях так и в комплектации тест-систем для диагностики трихинеллеза
Практические предложения.
Методика получения экскреторно-секреторных продуктов личинок Т spiralis одобрена секцией «Инвазионные болезни животных» отделения ветеринарной медицины РАСХН 27 мая 2005 г и рекомендована для получения антигенов, в целях иммунодиагностики трихинеллеза
Материалы диссертации могут быть использованы в ветеринарных и медицинских лабораториях, проводящих иммунологические исследования на основе паразитарных антигенов
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1 Курносова О П . Красавченко К С Анализ белкового состава экскреторно-секрезорного. полного соматического и фракционированного антигенов Trichinella spiral is//MaTep докл науч конф «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» -М -2004 -Вып 5 -С 211-212
2 Курносова О П. Красавченко К С Руденская Ю.А . Акимова К И . Мельгунов В А Сравнительный анализ антигенного состава соматического и -»кскрезорно-секрегорного антигенов Trichinella spiralis методом Western blot//MaTep докл науч конф «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» -М.-2004 - Вып 5 -С.213-214
3 Одоевская И М Бенедиктов И И , Курносова О П . Курочкина К Г . Руденская Ю А Гуморальный и клеточный иммунный ответ при экспериментальном трихинеллезе и альвеолярном гидатидозе//Матер докл нау ч конф «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» -М -2004 - Вын 5 -С 278-280
4 Курносова О П. Одоевская И М . Красавченко К С Акимова F И. Мельгунов В А Исследование белкового спектра антигенов Trichinella spiralis с помощью градиентного электрофореза/'Матер докл науч конф «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» -М -2005 - Вып 6 -С 194-195
5 Курносова ОН. Одоевская И М . Успенский А В . Красавченко К С . Акимова ЕИ Получение экскреторно-секреторных продуктов Trichinella
spiralis и их анапиз//Матер докл науч конф «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» -М -2005 - Нып 6 -С 195-199
6 Курносова ОП. Одоевская ИМ. Красавченко КС.. Акимова ЕИ Получение и анализ экскреторно-секреторных продуктов личинок Trichinella spiralis//MaTep 7-й международной научно-практич конф «Научные основы производства биологических препаратов»-!!! -2005 -С 284-289
7 Курносова ОП Сравнительный анализ белкового состава экскреюрно-секреторных продуктов личинок Trichinella spiralis//Tp Всерос ин-та гельминтол -2005 -т 41 .-С 225-228
8 Курносова О П Получение белков-антигенов I richinella spiralis и их анализ методом Western blot/ЛГр Всерос ин-та гельминтол -2005 -т 41 -С 229-233
9 Клрносова ОП Одоевская ИМ Акимова Г И. Красавченко КС Изеннс иммуно! енных свойств экскреторно-секреторных продуктов личинок Trichinclla spiralis//Te3H(,bi докл XI! междун Конф «Ломоносов-2005»-М -2005 -С 127-128
10 Кчрносова О П Одоевская ИМ. Успенский А В Акимова ЕИ Красавченко КС Диа! ностические свойства соматическою фракционированного и экскреторно-секреторного антшенов rrichinella spiralis/nVmcbi докл XII Междун Конф «Ломоносов-2005»-М -2005 -С 128-129
Г
-s
Подписано в печать 14.11.2005 Формат 60x88 1/16. Объем 2.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 149 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102
200GR
"11 16
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Курносова, Ольга Петровна
1 Введение.
2 Обзор литературы.
2.1 Характеристика антигенов трихинелл.
2.2 Иммунохимический анализ антигенов Trichinella spiralis.
2.3 Иммунитет при трихинеллезе.
2.4 Иммунодиагностика трихинеллеза с помощью серологических реакций и методом иммуноблотинга.
3 Материалы и методы.
3.1 Антисыворотки.
3.2 Белковые маркеры.
3.3 Состав компонентов ИФА.
3.4 Препаративные методы.
3.4.1 Получение инвазионного материала.
3.4.2 Приготовление соматического экстракта личинок трихинелл.
3.4.3 Получение соматического фракционированного антигена.
3.4.4 Получение экскреторно-секреторных продуктов личинок трихинелл.
3.4.5 Получение гипериммунных сывороток.
3.5 Электрофоретические методы.
3.5.1 Электрофорез в денатурирующих условиях.
3.5.2 Электроперенос.
3.6 Иммунохимические методы.
3.6.1 Выявление антигенов на фильтре.
3.6.2 Иммуноферментная реакция.
3.7 Аналитические методы.
3.7.1 Определение концентрации белка в пробе.
3.7.2 Определения концентрации окиси азота по модифицированному методу Грисса.
4 Результаты исследований.
4.1 Выделение соматических и экскреторно-секреторного антигенов
4.2 Получение гипериммунных сывороток.
4.3 Определение и сравнение белкового состава антигенов.
4.4 Изучение иммуногенных свойств выделенных антигенов.
4.5 Определение диагностической эффективности выделенных антигенов.
4.5.1 Определение диагностической эффективности выделенных антигенов в ИФР.
4.5.2 Сравнительный анализ диагностической эффективности ИФР и иммуноблота.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная диагностическая эффективность соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов трихинелл и их иммунохимический анализ"
Трихинеллез является широко распространенным зоонозом, характеризующимся сложным патологическим проявлением, нередко с тяжелыми последствиями. В связи с этим, проблема борьбы с этим опасным гельминтозом имеет важное медицинское, ветеринарное и социально-экономическое значение.
Ежегодно в Российской Федерации регистрируется до 700 случаев заболевания трихинеллезом людей, причем в 40% они носят групповой характер. Стационарно неблагополучными по данному паразитозу в настоящее время остаются регионы Северного Кавказа, Восточной Сибири, Дальнего Востока и Кировской области (А.В. Маркин 1994, С.А. Нагорный и др. 1996, 2000, А .Я. Сапунов 1996, 2000, Т.Н. Ашурбекова 2000, Т.Н. Твердохлебова и др. 2000, Б.Р. Гаркави и др. 2001, М.А. Попов и др. 2002, А.А. Пшеничный, А.Я. Сапунов 2002). Широкий круг восприимчивых животных и многообразие трофических связей способствует передаче возбудителя на нескольких уровнях с вовлечением в циркуляцию как насекомых-трупоедов, так и мелких млекопитающих, плотоядных, всеядных животных и крупных хищников (Ю.Д. Артеменко 1973, A.M. Асатрян и др. 2002, А.И. Батькаев, В.Г. Ваккер 1988, Ю.А. Березанцев 1974, В.А. Бритов 1982, Б.Р. Гаркави 2004, Н.Н. Макаров 2003, В.А. Ромашов, Б.В. Ромашов, 1992, Ф.К. Скворцова 2002, В.А. Ромашов и др. 1996, Б.В. Ромашов, М.В. Рогов 2002). Все эти условия создают реальную опасность заражения людей трихинеллезом, несмотря на меры предосторожности, предусмотренные существующими ветеринарно-санитарными требованиями. Это определяет острую необходимость детального и всестороннего изучения данного заболевания, без знаний о котором немыслимы ни своевременная диагностика, ни эффективное лечение, ни осуществление противоэпидемиологических и ветеринарных мероприятий в очагах трихинеллеза.
Диагностика трихинеллеза занимает ведущее место в системе мероприятий, направленных на предупреждение заболевания населения и животных. В данном случае, наибольшего внимания заслуживают методы прижизненной диагностики, позволяющие предупредить распространение инвазии и существенно снизить затраты на содержание зараженных животных.
В настоящее время активно продолжается поиск точных методов прижизненной диагностики, которые бы отличались высокой диагностической эффективностью с одной стороны, и являлись достаточно экономичными для широкого использования не только в медицине, но, в первую очередь, в сфере ветеринарного обслуживания животноводства.
Общеизвестно, что успех любой серодиагностики зависит от качества антигенов используемых для выявления того или иного гельминтоза. Без предварительного иммунохимического исследования белковой структуры трихинелл, невозможно направленное применение антигенных компонентов данного гельминта для высокоспецифичной и чувствительной прижизненной диагностики.
Актуальность работы.
В процессе жизненного цикла с последовательно сменяющимися кишечной, миграционной и мышечной стадиями, трихинеллы индуцируют ряд комплексных стадиоспецифических антигенов, в ответ на появление которых организм хозяина вырабатывает специфические антитела.
Ведущее значение в иммунодиагностике трихинеллеза имеет выделение строго специфичных белковых продуктов с их последующей детальной характеристикой и сравнительным анализом.
В настоящее время в иммунологии, молекулярной и клеточной биологии для анализа белковых комплексов широко применяется комбинация электрофоретического разделения индивидуальных компонентов и последующей иммунологической детекции с помощью специфических антител, получившая название «иммуноблотинг».
Использование этого метода для изучения антигенного состава Т. spiralis позволит выявить взаимодействие антител с разделенными антигенами в соответствии со своей специфичностью, показывая антигенные различия и изменения молекулярной массы белков.
Научная новизна работы.
В данной работе предложены качественно новые способы получения белковых компонентов Т. spiralis. Наработанные белки-антигены изучены с помощью иммунохимического анализа, позволившего идентифицировать молекулярный вес основных антигенов Т. spiralis, выделенных из сложного набора белков, секретируемых этим гельминтом, а также дать им иммунологическую характеристику. Эти исследования помогли получить высокоспецифичные, чувствительные антигены Т. spiralis, которые можно использовать для точной прижизненной диагностики, а также в качестве протективного препарата у животных.
Цели и задачи исследования.
Целью данной работы было получить соматический фракционированный и экскреторно-секреторные антигены личинок Т. spiralis, провести их иммунохимический анализ и оценить диагностические свойства полученных антигенов в ИФР.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Получить личинки трихинелл для приготовления разных антигенов.
2. Получить полный соматический экстракт, соматический фракционированный и экскреторно-секреторные антигены трихинелл.
3. Получить кроличьи гипериммунные сыворотки.
4. Провести электрофоретическое разделение полученных антигенов в ПААГ.
5. Провести иммунохимический анализ белков-антигенов с помощью иммуноблота с использованием гипериммунных сывороток кроликов.
6. Оценить диагностическую эффективность соматического фракционированного и экскреторно-секреторных антигенов в ИФР.
7. Провести сравнительные испытания ИФР и иммуноблота с полученными антигенами в производственных условиях.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Методические основы получения соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов личинок Т. spiralis.
2. Комплексная оценка белкового состава антигенов личинок трихинелл на основе градиентного электрофореза в ПААГ.
3. Иммунологический анализ белков-антигенов с помощью иммуноблота с использованием гипериммунных сывороток кроликов.
4. Оценка диагностической эффективности соматического фракционированного и экскреторно-секреторных антигенов в ИФР
5. Сравнительные испытания ИФР и иммуноблота с полученными антигенами в производственных условиях.
2 Обзор литературы
Трихинеллез - это тяжелое паразитарное заболевание человека и животных, вызываемое нематодами семейства Trichinellidae. Трихинеллез распространен почти повсеместно и является глобальной проблемой, привлекающей внимание исследователей во многих странах мира. Личинки трихинелл локализуются в поперечнополосатой мускулатуре под плазмалеммой клеток мышечных волокон, взрослые гельминты - в тонком отделе кишечника.
Личинки трихинелл, находящиеся в зараженном мясе, попав в желудок под действием желудочного сока освобождаются от капсул, проникают в тонкий отдел кишечника и развиваютя в слизистой оболочке до половозрелых особей. Через 30-33 часа после поедания животным мяса с личинками трихинелл большинство самок становятся оплодотворенными и на 6-7 день они рождают первых личинок. Последние внедряются в кровеносные и лимфатические сосуды и током крови разносятся по всему организму. Благоприятные условия для своего развития юные трихинеллы находят в волокнах скелетных мышц, где они растут и инкапсулируются. Мясо таких животных является источником заражения трихинеллезом других животных и человека. Таким образом, весь цикл развития паразита проходит в одном хозяине (В.А. Бритов, 1982).
По характеру эпидемических вспышек, по массовости и внезапности трихинеллез напоминает многие инфекционные заболевания, а по злокачественности и смертности в случаях интенсивного заражения нередко не имеет себе равных (А.С. Бессонов, 1988).
Социально-экономическое значение проблемы трихинеллеза и сложность организации эффективных мер борьбы с этой инвазией, требуют выполнения целого комплекса исследований, связанных с эпизоотологией (эпидемиологией), биологией паразита, клиническими проявлениями заболевания, патогенезом и совершенствованием противотрихинеллезных мероприятий (G. Cairns 1968, Y. Cironeanu 1979, Т. Dick, М. Belosevic 1978, S. Henriksen 1979, M. ICormanova et al. 1991, J. Massaud 1976, J. Lupascu et al. 1970, K. Nockler et al. 2000). Этим аспектам уделяется большое внимание исследователей многих стран мира. Вместе с этим, многие вопросы остаются недостаточно изученными.
Диагностика трихинеллеза животных (особенно свиней) - это важный этап в системе мероприятий, направленный на искоренение данного гельминтоза. Поэтому, своевременное выявление зараженных животных (свиней, пушных клеточных зверей и некоторых промысловых животных - медведя, кабана и др.) является ведущим фактором обеспечения санитарного качества пищевых продуктов и гарантией предупреждения вспышек заболевания среди людей.
В мире сложились две системы профилактики трихинеллеза - одна основана на индивидуальном исследовании туш животных (методами компрессорной трихинеллоскопии и искусственного переваривания мышечной ткани) с последующей утилизацией пораженных туш. Вторая система основана на обеззараживании (замораживание, проварка) в сочетании со специально воспитанными привычками и навыками населения в хранении мяса и приготовлении мясных блюд. Первая система сформировалась в Европе, вторая возникла в США и оказалась менее эффективной. В дополнение к двум названным системам профилактики трихинеллеза, в последние годы разрабатывается система сертификации свиноферм в отношении трихинеллеза, включающая «образцовую практику производства» (good production practices) и «хорошее ветеринарное обслуживание» (good veterinary practices) (А.С. Бессонов, 2003). Такая практика ведения свиноводства предусматривает абсолютное исключение скармливания свиньям непроваренного корма животного происхождения; исключение контакта свиней с дикой природой; разработку и внедрение программ борьбы с грызунами; обеспечение биобезопасности свиней путем создания внешней защиты вокруг и внутри свинарников; поддержание высокого уровня гигиены на фермах. Также, такая практика подразумевает обязательную сертификацию свиноводческих предприятий. Предполагается, что в скором будущем сертифицированные фермы и сертифицированная продукция будут доминировать и в международной торговле.
Однако, существующие и широко применяемые в настоящее время методы ветеринарно-санитарного контроля на трихинеллез имеют свои недостатки. Компрессорная трихинеллоскопия позволяет выявлять сильное и средней степени заражение (интенсивность инвазии 1-2 личинок на г мышц), в то время, как слабое заражение встречается гораздо чаще, что создает потенциальную угрозу заражения людей (А.В. Успенский
2002). Недостатком данного метода является также небольшая производительность и быстрая утомляемость ветсанэкспертов при ее осуществлении (Д.В. Васильева 1981, 1986). Переваривание образцов мышц в ИЖС по эффективности и производительности превосходит компрессорную трихинеллоскопию (П.А. Владимирова 1963, 1965, 1967, 1972), однако широкое использование данного метода без автоматизации и механизации процесса в условиях крупных промышленных комплексов невозможно.
Учеными ВНИИ Гельминтологии им. К.И.Скрябина (А. С. Бессонов и др. 1977, А.В. Успенский, Н.В. Шеховцов 1994, А.А. Иващенко, А.В. Успенский 2001, А.В. Успенский и др., 1977, 1981, 1984, 1992, 2000, 2002,
2003) для решения этой проблемы созданы аппараты типа АВТ. Приборы отвечают необходимым требованиям качественной экспертизы по диагностическим показателям и позволили значительно облегчить работу ветсанэкспертов. Тем не менее, при исследовании технологически обработанной мясной продукции необходим дифференцированный подход к исследованию каждого вида продукции, с учетом продолжительности переваривания, объемов исследуемых образцов и скоростных режимов активации среды (А.А. Гребенкин, 2004).
Особого внимания заслуживают методы прижизненной диагностики трихинеллеза, способствующие в случае выявления заболевания предотвратить траты на содержание инвазированных животных, а главное, предупредить распространение инвазии.
Диагноз на трихинеллез может быть установлен по клиническим признакам болезни в сочетании с данными анамнеза (Ю.А. Березанцев, 1986; Н.Н. Озерецковская 1968, Н.Н. Озерецковская, Э.В. Переверзева 1977, В.В. Железникова, 1976), но сильное варьирование клинического проявления данного заболевания, схожесть с клиникой других инфекционных заболеваний могут вызвать существенные затруднения (О.Я. Бекиш 1984, Н. Year et al. 2003).
Обнаружение мигрирующих личинок при исследовании крови и цереброспинальной жидкости, а также при биопсии мышц, могут стать окончательным этапом в установлении диагноза, однако в случае слабой интенсивности инвазии (менее 1-й личинки на 1 г мышц) трихинеллы могут быть выявлены данными методами лишь случайно (А.С. Бессонов, 1975а). В этом плане, более чувствительным является метод переваривания образцов биопсированных мышц в ИЖС, который позволяет не пропустить даже единичные личинки, но этот способ мало эффективен в том случае, когда личинки в мышцах мертвы.
Вышеизложенные методы прижизненной диагностики в силу своей специфики не нашли широкого применения как в ветеринарной, так и в медицинской практике, в то время, как именно раннее установление диагноза этого заболевания позволяет особенно успешно проводить терапевтические мероприятия среди пациентов (А.С. Бессонов, 19756). Возможность диагностики трихинеллеза с помощью иммунологических методов имеет большое, зачастую решающее значение, особенно когда нет возможности подтвердить диагноз другими методами, а также позволяет провести исследование в начальные сроки заболевания при стертых клинических картинах. Поэтому, разработка простых и легко воспроизводимых методов иммунологической диагностики трихинеллеза, основанных на реакции связывания антигенов и антител, приобретают важное практическое значение не только для ветеринарии, но и для здравоохранения. Основополагающим моментом для создания эффективных тест-систем является качество используемых компонентов тех или иных методов серодиагностики, на первом месте из которых находятся антигены, определяющие чувствительность и специфичность применяемых реакций.
Изучение антигенов трихинелл и иммунодиагностика трихинеллеза имеет уже почти столетнюю историю. В течение этого периода были осуществлены разработки, сыгравшие важную роль в развитии новых направлений в совершенствовании методов диагностики этого заболевания.
Первые антигены трихинелл представляли собой грубые экстракты мышечной ткани животных, зараженных трихинеллезом, или экстракты декапсулированных, но не очищенных от мышечных белков личинок трихинелл. Впервые такие исследования провели независимо друг от друга М.И. Романович (1911) и Н. Strobel (1911). Эффективность таких антигенов была очень низкой, или они вообще оказывались непригодными для диагностических целей.
Постепенно исследователи научились получать очищенные культуры личинок трихинелл, а затем и взрослых гельминтов. Слабая чувствительность экстрактов, содержащих примеси белков хозяина и малое количество специфических антигенов, побудила G.W. Bachman (1928) заняться разработкой методов очистки личинок от примесей и изысканием новых экстрактов и новых режимов экстракции специфических антигенов. Им была использована методика получения экстракта с помощью эфира. Позднее, A. Trawinski (1934) и I. Maternivska
1933) установили, что только антигены, экстрагированные физиологическим раствором, дают наиболее точные реакции, в то время как обработка их эфиром и фенолом приводит к возникновению ложных реакций.
Опыты по использованию в иммунологических реакциях с использованием цельных экстрактов трихинелл убедили многих исследователей в необходимости их очистки от балластных веществ, не являющихся антигенами (липидов, некоторых полисахаридов и белков) или общих для многих гельминтов и обуславливающих развитие перекрестных неспецифических реакций.
Однако примерно до начала 50-х годов прогресс в изучении антигенов был незначительным, а их природа и качественный состав оставались по существу нераскрытыми. И только с развитием биохимических, биофизических и иммунохимических лабораторных методов и внедрение их в иммунологическую практику способствовали достаточно быстрому и правильному развитию исследований антигенного спектра трихинелл, сравнительному изучению антигенных фракций в различных иммунологических реакциях (А. С. Бессонов, 19756).
Первое разделение экстракта личинок трихинелл было проведено M.R. Melcher (1942). В результате щелочного экстрагирования личиночного материала и осаждения экстракта кислотой были получены полисахаридная и белковая фракции. Причем после испытаний их в кожной аллергической реакции на кроликах, белковая фракция показала более выраженную положительную реакцию.
Изучая полисахаридные фракции трихинелл и других гельминтов, установили, что они являются полноценными антигенами, но содержат несколько качественно различимых субстанций, многие из которых и обуславливают возникновение перекрестных реакций при трихинеллезе, аскариозе, фасциолезе, тениаринхозе.
Разностороннее изучение антигенов трихинелл и иммунологических реакций при трихинеллезе провели Н.П. Лукашенко (1956) и В.П. Пашук (19566). Авторы исследовали полный экстракт, кислоторастворимую белковую фракцию, полисахаридно-белковый комплекс и полисахаридную фракцию и каждый из этих антигенов был испытан в кожных аллергических и серологических реакциях, в результате которых, авторы установили, что лучшими диагностическими качествами обладает кислоторастворимая фракция личинок трихинелл. Дальнейшее улучшение диагностических качеств соматических антигенов было связано с очисткой их различными методами.
Логические рассуждения и практические наблюдения по преципитации на живых трихинеллах in vitro (Е.А. Mauss 1940) убедили многих исследователей в целесообразности использования в качестве антигена экскреторно-секреторных продуктов личинок трихинелл или метаболического антигена. Это послужило толчком для целого ряда последующих испытаний в этом направлении.
Использование электрофореза для исследования антигенов трихинелл позволило установить молекулярные веса белков Т. spiralis, установить тождество или существующие различия в антигенной структуре между различными видами трихинелл.
С появлением возможности детального исследования различных комплексов антигенов трихинелл, ферментов, протеаз входящих в их состав; возможности иммунохимического анализа, анализа аминокислотной последовательности, расшифровки ДНК, компьютерной обработки данных и еще целый ряда методов, применяемых на сегодняшнем этапе развития науки позволили значительно углубиться в раскрытие многих тонких взаимодействий, происходящих между хозяином и паразитом, представить существующие процессы на современном уровне понимания, а также, открыть аспекты, представляющие большой интерес для последующих исследований.
Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Курносова, Ольга Петровна
Выводы
1. Оптимизированы методы получения антигенов трихинелл. Модифицирована и упрощена методика получения экскреторно-секреторных антигенов личинок Т. spiralis
2. Исследован белковый состав антигенов трихинелл методом электрофореза в полиакриламидном геле. У всех белковых продуктов личинок Т. spiralis, полученных разными способами, установлено наличие белков с одинаковым молекулярным весом в диапазоне от 43 кДа до 50-55 кДа. Можно заключить, что при получении экскреторно-секреторных продуктов личинок трихинелл с увеличением сроков культивирования количественный антигенный состав белков постепенно увеличивается, как за счет низко, так и за счет высокомолекулярных белков.
3.Проведение иммунохимического анализа позволило определить основные иммуногенные белки личинок T.spiralis. Иммуноблот показал, что у всех экскреторно-секреторных антигенов и соматического фракционированного присутствуют мажорные полосы с молекулярной массой в диапазоне 43-56 кДа. Полученные данные свидетельствуют об антигенной идентичности белковых продуктов Т. spiralis и возможности использования их в серодиагностике трихинеллеза.
4. В процессе исследований отработана методика получения гипериммунных кроличьих сывороток с контролем клеточного и гуморального иммунитета в реакции Грисса и ИФР соответственно, что позволило провести дифференцированную оценку уровня специфического ответа.
5. Определение диагностической эффективности ИФР при трихинеллезе свиней в сравнительном аспекте с полученными антигенами показало, что чувствительность реакции составила 100%, специфичность фракционированного антигена - 88,76%, экскреторно-секреторного антигена - 90,98%.
6. Сравнительным анализом диагностической эффективности ИФР и иммуноблота при трихинеллезе свиней установлено, что иммуноблот является более специфичным методом. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования иммуноблота в диагностических целях.
7. В ходе работы установлено, что метод получения экскреторно-секреторного антигена по сравнению с методом получения соматического фракционированного, менее трудоемок и достаточно экономичен. Диагностическая эффективность ИФР при трихинеллезе свиней с использованием первого антигена несколько выше, чем со вторым. Эти данные позволяют считать возможным широкое использование экскреторно-секреторного антигена как в научных исследованиях, так и в комплектации тест-систем для диагностики трихинеллеза.
Практические предложения
Методика получения экскреторно-секреторных продуктов личинок Т. spiralis одобрена секцией «Инвазионные болезни животных» отделения ветеринарной медицины РАСХН 27 мая 2005 г. и рекомендована для получения антигенов, в целях иммунодиагностики трихинеллеза.
Материалы диссертации могут быть использованы в ветеринарных и медицинских лабораториях, проводящих иммунологические исследования на основе паразитарных антигенов.
Заключение.
Иммунологическая диагностика трихинеллеза имеет большую значимость наряду с другими методами выявления этого заболевания. Наличие специфических циркулирующих антител в зараженном трихинеллами организме выявляют методами, основанными на взаимодействии антигенов и антител. Обьективность иммунологических тестов, и следовательно, точность прижизненной диагностики, зависит от качества (чистоты, активности и специфичности) применяемых в этих реакциях антигенов.
Многие авторы (Г.А. Ермолин 1968, M.G.Ortega-Pierres 1995, Р. Mahannop et al. 1992, R.M.E. Parkhouse, N.M. Almond, 1985) указывают в первую очередь на необходимость всестороннего и детального исследования получаемых различными способами антигеных комплексов. Известно, что в процессе онтогенеза в белковом спектре гельминтов происходят изменения, влияющие на количественный и качественный состав экскретируемых белковых компонентов. Поэтому, пренципиальное значение в исследовании имеет определение антигенного состава и иммуногенных свойств белков изучаемых гельминтов.
Для решения вышеизложенных задач выполнен целый комплекс паразитологических, аналитических, биохимических и иммунохимический исследований, позволивших получить высокоспецифичные и чувствительные антигены, пригодные для прижизненной иммунодиагностики трихинеллеза.
В настояще время в качестве антигенов для выявления трихинеллеза в различных диагностических тест-системах используются белковые компоненты T.spiralis, получаемые разными способами. О перспективности использования того или иного антигена сделано большое количество исследовательских работ многими зарубежными и отечественными авторами (С.Р. Белозеров, Т.И. Гуданавичюс, 1982, Л.И. Липатова, 1991, В.К. Бережко и др., 1996, H.R. Gamble 1995, F. Van Knapen et al. 1984, Y. Tarahashu et al. 1990). С аналогичной целью были проведены и наши исследования. В работе проводили получение и анализ полного соматического, соматического фракционированного и экскреторно-секреторных антигенов личинок T.spiralis.
Полный соматический экстракт в настоящей работе получали по традиционной методике. В результате экстракт содержал большое количество белков, с молекулярными массами от 30 до более 150 кДа, дающимих при электрофорезе в денатурирующих условиях полосы примерно одинаковой интенсивности. Такой эктракт по мнению, разделяемому многими авторами (J.Cui et al. 1999, A. Capron et al. 1968, E. binder et al. 1992, D. Rapic et al. 1981, J.L. De-La-Rosa et al. 1995), непригоден для диагностики трихинеллеза, поскольку содержит большое количество белков, часть из которых не иммуногенны, а часть может давать перекрестные реакции. Поэтому было необходимо фракционировать полученный эктракт. В качестве метода разделения нами была выбрана гель-хроматография, поскольку при разделении этим методом не разрушаются входящие в состав антигена белковые комплексы и полностью сохраняется нативность белков.
В ходе гель-хроматографии белки полного соматического экстракта личинок трихинелл поделились на три пика. Все полученные фракции исследовали на специфичность и чувствительность в ИФР. В результате, было установлено, что специфические антигенные детерминанты содержат белки, входящие в состав второго пика. Эти данные очень похожи на результаты, полученные JI.A. Написановой (2004), которая так же обнаружила специфеческие антигенные компоненты во втором белковом пике при разделении полного соматического экстракта трихинелл методом гель-фильтрации с использованием Сефадекса G-200. Электрофоретический анализ фракций второго пика показал, что они. содержат белковые молекулы с массами 25, 28, 35, 38, 45, 49, 53, 57 и 63 кДа. Белок 45 кДа является минорным компонентом и находится только в 10 фракции. Максимальная концентрация всех остальных белков приходится на 11 фракцию. Исследование фракций второго пика методом иммуноблоттинга дополнительно выявило еще два белка, с молекулярными массами 71 и 93 кДа. Из всех белков второго пика наиболее иммуногенным оказался белок 53 кДа, который очень четко выявлялся антителами во всех исследованных фракциях. Кроме него, достаточно интенсивно выявлялись белки 57 и 60 кДа. Мажорный компонент 11 фракции, белок 49 кДа, антителами окрашивался очень слабо, что говорит о его невысокой иммуногенности. Белки 71 и 93 кДа, видимо, являются весьма иммуногенными, поскольку узнаются антителами даже находясь в таком небольшом количестве, что не видны при окрашивании геля Кумасси.
Следующим этапом нашей работы было изучение экскреторно-секреторных продуктов личинок трихинелл. Эти продукты личинки выделяли в жидкую питательную среду, которую собирали после 24, 48 и 72 часов культивирования личинок в разных условиях. В настоящей работе выращивание личинок проводили: в С02-инкубаторе при 37°С с 10% содержанием углекислоты и 70%-ной влажностью, в обычном термостате о при 38,5 С и в термостатирующей установке с регулируемым числом оборотов при 38,5 °С. Личинки, культивируемые в термостатирующей качалке уже после 48 часов погибли более чем на 50 %. поэтому такой метод культивирования был признан неприемлемым и в дальнейшем не использовался. Личинки, культивируемые как в СОг-инкубаторе, так и в обычном термостате оставались жизнеспособными в течение трех суток. При этом было отмечено, что с увеличением срока культивирования личинок в получаемых продуктах растет концентрация белка. Вероятно, это связано с гибелью части личинок и последующим выходом белка в культуральную жидкость. Сходные результаты были получены L. Turcelcova et al. (1997).
При культивировании личинок в С02-инкубаторе после 24 часов основными белковыми компонентами экскретов были белки 42 и 45 кДа, после 48 часов также мажорным компонентом становится белок 49 к Да, а после 72 часов он остается единственным мажорным компонентом. Также с увеличением сроков культивирования появляются белки с 56 и 65 кДа. Иммунохимический анализ показал, что белок 53 кДа является основным иммуногенным компонентом экскреторно-секреторных продуктов, и интенсивно выявляется антителами в экскретах уже после 24 часов культивирования, когда еще не виден при окрашивании геля Кумасси. Белок 49 кДа, полоса которого очень хорошо видна в геле, довольно слабо взаимодействует с антителами. Также заметными иммуногенными компонентами явялются белки 56 и 72 кДа. Можно заметить, что с увеличением сроков культивирования личинок трихинелл, идет постепенное увеличение количества белков в составе антигенов, причем за счет более высокомолекулярных. Это также отмечено в работе L. Turcekova et al. (1997), где исследователи увеличивали сроки культивирования личинок до 5-ти суток и наблюдали приближение антигенного профиля белков к соматическому антигену.
При культивировании личинок в термостате с нерегулируемой концентрацией С02, после 24 часов наиболее заметными в составе экскретов являются белки с молекулярными массами 52, 56 и 60 кДа. Со временем содержание белка 52 кДа увеличивается, а также появляются полосы белков 71 и 79 кДа. Иммунохимический анализ показал, что наибольшей иммуногенностью обладает белок 52 кДа. Также иммуногенными являются белки 56, 60 и 71 кДа. Интересно также,что иммуноблотинг выявляет в составе экскреторных продуктов белок с молекулярной массой 49 кДа, который не окрашивается Кумасси на электрофореграмме.
Таком образом, анализируя результаты, полученные в ходе работы, можно заметить, что белковый состав экскреторно-секреторных продуктов, исследованный электрофоретически, включает в себя те же белковые полосы, что и соматический фракционированный антиген. Некоторые различия в определении молекулярных масс белков на различных электрофореграммах, рассмотренных в работе, объясняется тем, что электрофорез позволяет определять молекулярные массы белков с точностью лишь до нескольких килодальтон. При этом белковый состав экскреторно-секреторных продуктов, полученных в разных условиях, довольно заметно различается, но антигенный состав этих продуктов почти идентичен. Во всех случаях наиболее иммуногенным компонентом является белок с молекулярной массой 52-53 кДа. Также заметными антигенами являются белки 49 кДа, 5657 кДа, 60 к Да, 71-72 кДа. Обращает на себя внимание то, что полоса, соответствующая белку с молекулярной массой 49 кДа в составе соматического фракционированного антигена практически не взаимодействует с антителами, а такая же полоса в составе экскреторно-секреторных антигенов достаточно иммуногенна. Учитывая данные R.K. Leung и R.C.Ko (1997), которые при исследовании экскреторно-секреторных продуктов трихинелл установили, что в состав одной полосы входят разные белки, отличающиеся по изоэлектрической точке и обладающие различной иммуногенностью, можно предположить , что с таковым явлением мы и имеем дело в данном случае.
Диагностическая эффективность соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигена трихинелл в ИФР с использование сывороток крови кроликов составила 100 %. При взаимодействии с сыворотками крови свиней специфичность ИФР с соматическим фракционированным антигеном составила 88,63 %, с экскреторно-секреторным - 90,98 %, при чувствительности обоих антигенов 100 %. Поскольку диагностическая эффективность этих антигенов практически одинакова, а выделение экскреторно-секреторного антигена гораздо менее трудоемко, чем соматического фракционированного, можно считать возможным широкое использование экскреторно-секреторного антигена как в научных исследованиях, так и в комплектации тест-систем для диагностики трихинеллеза. Это мнение также высказывали такие авторы, как H.R. Gamble et al. (1983), K.D. Murrel et al. (1986), F. Van ICnapen (1984) и B.H. Nuiet al.(1986). А учитывая то, что антигенный состав экскреторно-секреторных продуктов, полученных культивирование личинок трихинелл в С02-инкубаторе и термостате с нерегулируемой концентрацией С02 практически одинаков, мы считаем, что культивировать личинки можно в обычном термостате, что сильно упрощает процедуру получения экскретов.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Курносова, Ольга Петровна, Москва
1. Артеменко Ю.Г. Изучение эпизоотологии трихинеллеза//Ветеринария.-1973.-№ 9.-С.62-64.
2. Ашурбекова Т.Н. К эпизоотологии трихинеллеза в Дагестане//28-я межвузовая научно-практическая конференция по проблемам биологии и медицинской паразитологии. Санкт-Петербург.-2000.-С.29-30.
3. Батькаев А.И. Ваккер В.Г. Роль диких хищных млекопитающих в паразитарной системе трихинеллы в ландшафтах Среднего Прииртышья//Материалы пятой Всесоюзной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных. Новочеркасск.-1988.-С.8.
4. Бекиш О.Я., Бурак И.И. Особенности патогенеза трихинеллеза в зависимости от интенсивности заражения//Паразитоценозы диких и домашних животных. Белоруссия.-Минск.-1984.-С.56-58.
5. Белозеров С.Н, Бессонов А.С. Применение реакции иммунофлуорисценции для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней в производственных условиях//Бюлл. ВИГНС.-М.-1974.-12.-С.175-179.
6. Белозеров С.Н. Прижизненная диагностика трихинеллеза свиней//Ветеринария.-1975 .-6.-С.70-72.
7. Белозеров С.Н., Гуданавичюс Т.П. Реакция энзим-меченых антител для диагностики трихинеллеза//Ветеринария.-1982.-11.-С.41-44.
8. Белозеров С.Н. Иммунологическая диагностика гельминтозоонозов //Дис. докт. вет. наук.-М.-1990.
9. Березанцев Ю.А. Трихинеллез.-Медицина.-1974.-С.160 Березанцев Ю.А., Осков И.В. Микрогемоциркулярные системы, формирующиеся в скелетных мышцах вокруг личинок трихинелл//Докл.АН СССР. -1986. 287. - 5. - С.1278-1280.
10. Березанцев Ю.А. Трихинеллез//Медицина.-1974.-С. 160.
11. Бессонов А.С. Пути совершенствования иммунологической диагностики трихинеллеза//Проблемы паразитологии в Прибалтике. -1970. С.206-209.
12. Бессонов А.С. Трихинеллез//Киев. Урожай. - 1977. - С. 122.
13. Бессонов А.С. Ветеринарная гельминтология: проблемы девяностых// Вестник сельскохозяйственных наук. 1988.- 8.- С.78-84.
14. Бессонов А.С. Профилактика трихинеллеза посредством сертифткации свиноферм/ЛГеория и практика борьбы с паразитарными болезнями, Москва, 2003 г.:Тез. докл.-М.: 2003.-С.79-82.
15. Бессонов А. С., Успенский А.В., Шеховцов Н.В. Диагностика трихинеллеза свиней//Ветеринария. М. - 1977. - №6. - С.62-64.
16. Бессонов А.С. Диагностика трихинеллеза (часть вторая)//Вильнюс. -Митис. 1975.
17. Бритов В.А. Возбудители трихинеллеза//В.А. Бритов.-М.: Наука, 1982.-С.272.
18. Буракова О.В. Иммуноферментный анализ//Практикум по иммунологии//Москва.-МГУ.-2001 .-С.69-81.
19. Васерин Ю.И. Иммунодиагностика трихинеллеза человека// Восьмая Всерос. конф. по трихинеллезу. Тез. Докл.-М.-2000.-С. 16-22.
20. Васильева Д.В. К диагностике трихинеллеза животных//Материалы докладов III Всероссийской конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных.-Вильнюс.-1981.-С.146-147.
21. Васильева Д.В.Трихинеллез: Усовершенствование метода посмертной диагностики и некоторые вопросы патогенеза и терапии//Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук.-Казань.-1986.
22. Владимирова П.А. Сравнительное обследование свиных туш на трихинеллез компрессорным методом и метод искусственного переваривания мышц//Бюллетень Всесоюзного института гельминтологии им. К.И. Скрябина. 1967. - 1. - С. 14-16.
23. Владимирова П.А. К вопросу о скорости переваривания мышц различных животных в искусственном желудочном соке//Материалы докладов Всесоюзной научной конференции, посвященной 90-летию Казанского института.-1963.-С. 134-135.
24. Владимирова П.А. Ускоренный метод диагностики трихинеллеза//В етеринария .-1965.-№10.-С.95-96.
25. Гаркави Б.Л., Звержановский М.И., Галдина Е.Б., Ильин С.В., Козлова И.К., Мирошниченко Л.П. Эпизоотология трихинеллезадомашних свиней в Краснодарском крае//Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. Москва.-2001.-С.56-58.
26. Гаркави Б.Л. Особенности расптостранения и передачи Trichinella (Bessonoviela) pseudospiralis//Tpyflbi Всероссийского института гельминтологии им. К.И. Скрябина, том 40. Москва, 2004.-С.64-71.
27. Горбачевский Г.И., Панкратов С.М. Ранняя диагностика и лечение больных трихинеллезом//Мед. паразитология и паразитарные болезни.-1988.-3.-92-98.
28. Гребенкин А.А. Оптимизация ветеринарно-санитарной экспертизы на трихинеллез//Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук. М. - 2004.
29. Ермолин Г.А. Иммунохимическое изучение антигенной структуры декапсулированных личинок Trichinella spiralisZ/Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. -1968.
30. Ермолин Г.А. Антигены, экскретируемые личинками Trichinella spiralis в процессе их инкубации в искусственных питательных средах//Труды Всес. ин-та гельминтологии.-1971.-17.-С.276-279.
31. Ефремов Е.Е. Биохимические и иммунохимические критерии в таксономии трихинелл и иммунологическая диагностика трихинеллеза//Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологичеких наук.-М.-1982.-С.217.
32. Ефремов Е.Е., Ермолин Г.А. Иммуноферментный метод обнаружения антител к антигенам декапсулированных личинок трихинелл//В.кн.: Морфофункциональные закономерности неспецифических защитных реакций организма.-М.-1980.-С.112-116.
33. Кетти Д. Антитела. Методы. Т 2//Москва.: Мир.-1991.
34. Козлова Г.А. Тест-система для диагностики трихинеллеза свиней иммуноферментной реакцией с антигеном, очищенным моноклональными антителами//Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. - 1999.
35. Кондратьева И.А., Воробьева Н.В., Буракова О.В. Практикум по иммунологии//Москва.-МГУ .-2001.
36. Кондратьев С., Михов JI. Исследование механизма и факторов иммунитета при трихинеллезе. Фракционирование водорастворимых антигенов личинок трихинелл методом дискового электрофореза ихимической идентификации полученных фракций//М.-1974.-17.-С.81-87.
37. Костецкий А.Ф., Васерин Ю.И. Получение и характеристика экскреторно-секреторного антигена трихинелл//Материалы докладов к 6-й научной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных.-Киров.-1992.-С.93-95.
38. Лейкина Е.С. Иммунитет при трихинеллезе//В кн.: Трихинеллы и трихинеллез. Под ред. Боева С.Н. Алма-Ата. 1978. - С.134-146.
39. Лейкина Е.С. Применение иммунологических методов для изучения эпидемоологии и оценки эффективности мероприятий по борьбе с гельминтозами//Мед. паразитология и паразитарные болезни.-1980.-З.-С.З-Ю.
40. Лефковитс И., Пернис Б. Методы исследований в иммунологии//Москва. :Мир.-1981.
41. Липатова Л.Н. Получение антител к антигенам Trichinella spiralis с использованием гибридомной технологии//Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. - 1991.
42. Лукашенко Н.П. Прижизненная диагностика трихинеллеза свиней методами аллергической (внутрикожной) и серологический реакций//Диссертация на соискание звания кандидата ветеринарных наук.-М.-1956.
43. Лукашенко Н. П. Труды 2-й научной конференции паразитологов УССР.- 1956.-С.79-81
44. Лысенко А .Я., Ермолин Г.А., Цветкова B.C. Реакция энзим-меченых антител (РЭМА) в иммунодиагностике паразитарных болезней//Мед. паразитология и паразитарные болезни.-1978.-4.-С.39-47.
45. Лысенко А.Я., Ермолин Г.А. Современные тенденции в иммунодиагностике заразных болезней//Иммунодиагностика тропических и паразитарных болезней.-М.-1980.-С.3-13.
46. Лысенко А.Я., Ермолин Г.А., Цветкова B.C., Ефремов Е.Е., Эткин А.Ф., Курманова Л.В. Параметры конструирования диагностических тест-систем на основе реакции энзим-меченых антител// Иммунодиагностика тропических и паразитарных болезней.-М.-1980.-С.36-44.
47. Макаров Н.Н. Международная классификация заразных болезней животных//Ветеринарный консультант.-2003.-№ 19.-С.5-7.
48. Маркин А.В. Трихинеллез человека в России (1950-1990 гг.)//Гельминтозоонозы меры борьбы и профилактики. Москва.-1994.-С.96-98.
49. Нагорный С.А., Артамонов Н.А., Кудактин Н.А. Миграция крупных диких животных Северного Кавказа и трихинеллез//Седьмая Всерос. конф. по трихинеллезу. Тез. Докл.-М.-1996.-С.46-48.
50. Написанова Л.A. ELISA и dot-ELISA в динамике экспериментального трихинеллеза свиней//Материалы докладов к 7-й научной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных.-М.-1996.-С.48-49.
51. Написанова JI.A. Диагностическая эффективность иммуноферментных тест-систем (ИФР и ДОТ-ИФА) при трихинеллезе свиней// Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.-М.-2004.
52. Написанова JI.A. Сравнительное изучение диагностической эффективности модифицированного экскреторно-секреторного антигена трихинелл//Восьмая всероссийская конференция по трихинеллезу .-М.-2000 .-С.128-130.
53. Нго Т.Т., Ленхофф Г. Иммуноферментный анализ//М., Мир.-1988.-С.941-399.
54. Озерецковская Н.Н. Клинико-эпидемиологические особенности трихинеллеза из разных географических районов СССР//Мед. Паразитология и паразитарные болезни. 1968. - №4. - С.387.
55. Озерецковская Н.Н., Переверзева Э.В. Трихинеллез человека от природных штаммов трихинелл//Тезисы докладов 16-го Всесоюзн. съезда микробиологов и эпидемиологов.-М.-1977.-С.274-276.
56. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование//М., Наука.-1981.-7.-С. 168.
57. Пашук. В. П. Экспериментальные данные к применению иммунологических реакций в диагностикетрихинеллеза//Здравоохранение.-Белоруссия.-195 ба.-З.-С.42-45.
58. Пашук В. П. Тезисы докладов научно-практической конференции Белорусского института эпидемиологии, микробиологии и гигиены.-19566 С.68-70.
59. Пашук В. П. К иммунологической диагностике трихинеллеза//Сборник научных трудов белорусского института эпидемиологии, микробиологии и гигиены.-1957.-С.349-354.
60. Переверзева Э.В. Морфологическое исследование стихоцитов у мышечных трихинелл//Материалы научной конференции Всесоюзного общества гельминтологов. Москва.-1969.-С.239-242.
61. Полетаева О.Г., Красовская Н.Н. Оптимизация методов иммунологической диагностики трихинеллеза//Материалы докладов к4.й конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных.-Ереван.-1985.-С.145-146.
62. Полетаева О.Г., Красовская Н.Н., Глаголева В.А. Характеристика иммуноферментной тест-системы с антигенами трихинелл//Мед. паразитология и паразитарные болезни.J 1986.-3.-С.51-56.
63. Попов М.А., Васерин Ю.И., Нагорный С.А., Твердохлебова Т.И Диагностика трихинеллеза на Северном Кавказе/ЛГеория и практика борьбы с паразитарными болезнями. Москва.-2002.-С.246-247.
64. Пшеничный А.А., Сапунов В.А. Новый и необычный источник заражения людей трихинеллезом в Краснодарском крае//Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. Москва.-2002.-С.287-290.
65. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология//Москва.-«Мир».-2000.
66. Романович М. И. Ученые записки Казанского ветеринарного института.- 1911.- 28,- С.614-620.
67. Ромашов В.А., Ромашов Б.В. Особенности очага трихинеллеза в Воронежской области//Материалы шестой научной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных. Киров,-1992.-С 156166.
68. Ромашов В.А., Ромашов Б.В., Сапельников С.Ф. Обнаружение трихинелл у щенков обыкновенной лисицы//Материалы седьмойнаучной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных.-М.-1996.-С.68-69.
69. Ромашов Б.В., Рогов М.В. Особенности распределения личинок трихинелл в различных группах мышц диких млекопитающих//Материалы докладов научной конференции Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями (зоонозы).-М.-2002.-С.203-264.
70. Сапунов А.Я. Эпизоотический процесс и очаги трихинеллеза на Северном Кавказе//Седьмая Всероссийская конференция по трихинеллезу, Москва,-1996.-С.74-77.
71. Сапунов А.Я. Эпизоотология и эпидемиология трихинеллеза на северо-западе Кавказа//Восьмая Всероссийская конференция по трихинеллезу, Москва.-2000.-С.51-67.
72. Скворцова Ф.К. Резистентность личинок трихинелл к замораживанию//Материалы докладов научной конференции «Теория и практика борбы с паразитарными болезнями (зоонозы)».-М.-2002.-С.311-314.
73. Скоупс Р. Методы очистки белков//Москва.: Мир.-1985.
74. Твердохлебова Т.И., Васерин Ю.И., Цибульская М.А., Пляков Б.И. Сероэпидемическая характеристика трихинеллеза в Ростовской области//Восьмая Всероссийская конференция по трихинеллезу, Москва.-2000.-С.151-153.
75. Успенский А.В. Принцип групповой диагностики трихинеллеза/УСборник статей научной сессии «Гастроэнтеральные заболевания по свинине».-1977.-Шумен.- С.51-53.
76. Успенский А.В. Групповая диагностика трихинеллеза свиней//Мат. Докл. 3-й Всесоюзной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных. Вильнюс.-1981.-С. 148-149.
77. Успенский А.В. Защита от трихинеллеза населения г. Москвы//Тезисы доклада «Паразитарное загрязнение мегаполиса Москвы».-М.-1994.- С.43.
78. Успенский А.В., Бессонов А.С., Шеховцов Н.В., Дзиковский Н.В. Усовершенствование групповой диагностики трихинеллеза/ДПестая конференция по трихинеллезу, Киров, 1992 г.: Тез. докл.-М.: 1992.-С.199-201.
79. Успенский А.В., Гребенкин А.А., Максимов А.А. Особенности формирования очагов трихинеллеза//Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями, Москва, 2002 г.:Тез. докл.-М.: 2002.-С. 343-345.
80. Успенский А.В., Шеховцов Н.В., Гребенкин А.А. Сравнительные испытания устройств для трихинеллоскопического контроля//Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями, Москва, 2003 г.:Тез. докл.-М.: 2003.-С. 463-465.
81. Успенский А.В., Назарова Н.С., Нечиненный А.Д., Певнева В.Д. Реакция кольцепреципитации в капилляре (РКПК) для прижизненнойдиагностики трихинеллеза песцов//Бюл.ВИГИС.-М.-1975.-16.-С.80-81.
82. Успенский А.В., Бессонов А.С., Шеховцов Н.В. Автоматизация трихинеллоскопического контроля//Восьмая Всесоюзнаяконференция по трихинеллезу.-2000.-С.153-156.
83. Успенский А.В. Групповая диагностика трихинеллеза свиней/ЛГретья Всесоюзная конференция по трихинеллезу. Вильнюс.-1984.-С. 148150.
84. Успенский А.В., Шеховцов Н.В. Совершенствование ветеринарно-санитарных мероприятий при трихинеллезе//Гельминтозоонозы -меры борьбы и профилактики. Москва,-1994.^-С. 163-166.
85. Фрезе К.В. Иммуноглобулины: выделение и анализ//Практикум по иммунологии//Москва.-МГУ .-2001 .-С.83-111.
86. Шеховцов Н.В., Успенский А.В, Белозеров С.Н. Сероэпизоотологичекие исследования по трихинеллезу в производственных условиях//Матер. Докл. 6-й науч. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных. Киров.- 1992.-С.219-221.
87. Шеховцов Н.В. Испытания диагностической эффективности антигенов при трихинеллезе//Восьмая всероссийская конференция по трихинеллезу.-М.-2000.-С. 156-157.
88. Шимкунене Б.А. Применение реакций преципитации при диагностике трихинеллеза//Ас!а Parasitologica. -1969. -9. -С. 96-106.
89. Шимкунене Б.А. Сравнительная оценка серологических реакций в диагностике трихинеллеза/УДиссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.- 1970.
90. Alcantara P., Correa D. Human humoral response against Trichinella spiralis//International Journal of Parasitology. -1993. -23.-P.657-660.
91. Alcantara P.,Gorodezky D., Correa D., Martinez M., Magos C., Olivo A. Diagnosis of human trichinosis by the enzyme linked immunosorbent assay.//Revue of Latino American Microbiology. -1989. -31.-P.227-230.
92. Arasu P., Ellis L.A., Iglesias R., Ubeira F.M., Appleton J.A. Molecular analysis of antigens by protective antobody rapid expulsion of Trichinella spiralis//Mol. Biochem. Parasitol.-1995.-65.-P.201-211.
93. Arriaga C., Muniz E., Morilla A., Ortega-Pierres G. Trichinella spiralis: Recognition of muscle larva antigens during experimental infection of swins and its potential use in diagnosis//Exp. Parasit. -1989.-69.-363-372.
94. Arriaga C., Yepez-Mulia L., Morilla A., Ortega-Pierres G. Detection of circulating Trichinella spiralis muscle larvae antigens in serum samples of experimentally and naturally infected swin.e//Vet. Parasitol.-1995.-58.-P.319-326.
95. Bachman G.W. A precipitin test in experimental trichiniasis//J.Prevent. Med.- 1928.-2.-P.35-48.
96. Bell R.G., McGregor D.D., Despommier D.D. Trichinella spiralis: Mediation of the intestinal component of protective immunity in the rat by multiple, phase-specific antiparasitic responses//Exp. Parasitol.-1979.-47.-P.140-157.
97. Boulos L.M., Ibrahim I.R., Negm A.Y. Detection of coproantigen in early Trichinellosis//Parasite.- 2001.- 8.-P. 136-139.
98. Cairns G.C. The occurrence of Trichinilla spiralis New Zeland pigs, rats and cats//New Zeland Veterinary Jornal.-1968.-37.-№ 4555.
99. Candolfi E., Freche P., Liance M., Houin R., Kien T. Detection of circulating antigens in trichinellosis by immunology. Comparative results in mice, rats and humans//Proc. 7th Int. Conf. Trichinellosis.-1989.-P. 194201.
100. Capron A., Biguet J., Vernes A., Afchain D. Structure antigenuque des gelminthes: aspects immunologiques des. relation hote-parasite//Pathol. Biol.-1968.-16.-P. 121-13 8.
101. Chris K.F., Li C.K.F., Ко R.C. Detection of.circulating antigens in acute trichinellosis//Proc. 9th Int. Conf. Trichinellosis.-1996. -P.126.
102. Cironeany Y. Trichinellosis in Romania//Wiad. Parazytology.-1979.-Vol. 25.-№ 5.-P.597-598.
103. Cui J., Wang Z. Q., Zhu W., Zhang R.G. Seroepidemiological survey of Trichinilla spiralis infection in central China//Helmintologia.- 1999.-36.-4:P.235-239.
104. Cui J., Wang Z.- Q. Zhand D. Studies on specific diagnostic antigens in excretory-secretory products from Trichinilla spiralis muscle larvae. PubMed.
105. Denham D.A. Immunity to Trichinilla spiralis.II. Immunity produced by the adult worm in mice//Parasitology.-1966.-56.-P.745-751.
106. Despommier D.D. Biology. In: Campbell WC (ed) Trichinella and trichinosis//Premum, New York 1983.-P.31 -73.
107. Despommier D.D., Muller M. The stichosome and its secretion granules in the muscle larva of Trichinilla spiralis//J. Parasit.-1976.-62.-P.775-785.
108. Despommier D.D, Muller M. The stichosome of Trichinella spiralis. Its structure and function//Second Inter. Congr. ofParasitol.-1970.-2.-P.ll.
109. Despommier D.D., Kajima M., Wostmann B.S. Ferritin-conjugated antibody studies on the larvae of Trichinella spiralis//J.Parasitol.-1967.-53.- 3.-P.618-624.
110. Despommier D.D., Gold A.M., Buck S.W., Capo V., Silberstein D. Trichinilla spiralis: secreted antigen of infective larvae localizes to the cytoplasm and nucleplasm of infected host cells//Exp. Parasitol.-1990.-71.-P.27-38.
111. Dick T.A., Belosevic M. Trichinilla spiralis. Comparison with an artic isolate//Experimental Parasitology.-1978.-Vol. 49.-№ 2 .-P.266-276.
112. Dupouy-Camet J., Kociecka W., Bruschi F., Bolas-Fernandez F., Pozio E. Opinion on the diagnosis and treatment of human trichinellosis//Exp.Opin. Phamacother.-2002.-3 .-P. 1117-1130.
113. Duzhang Z., Bell R.G. Trichinella spiralis: murine strain variation in response to monoclonally defined, protective, nonstage-specific antigens//Exp. Parasitol.-1990.-70.-P.330-343.
114. Dziemian E., Machnicka B. Reduction of muscle larvae burden in experimental infected rats//Proc. 10th Int. Conf. Trichinellosis. 2000.
115. Dziemian E., Machnicka B. Influence of Trichinella spiralis infective dose on the level of antibodies, circulating antigens and circulating immune complexes in rats//Helmintologia.-2000.-37.-2.-P.59-66.
116. Gamble H. R., Andersom W. R., Graham ., Murrel K.D. Diagnosis of swine trichinosis by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using excretory-secretory antigen//Veterinary Parasitology. -1983. -13. -349-361.
117. Gamble H. R. Trichinella spiralis: immunization of mice using monoclonal antibody affinity-isolated antigens//Exp. Parasitology.-1985.-59.-P.398-404.
118. Gamble H. R., Murrell K.D., Marti Ph. Inoculation of pigs against T.spiralis using excretory-secretory antigens//Amer. J. Vet. Res.-1986.-47.-11 .-P.2396-23989.
119. Gamble H.R. Detection of trichinellosis in pigs by artificial digestion and enzyme immunoassay//!, of Food Protection.-1995.-58(3).- P.295-298.
120. Gamble H.R., Rapic D., Murinculic A., Murrell IC.D. Evaluation of excretory-secretory antigens for the ' serodiagnosis of swine trichinellosis//Veterinary Parasitoligy.-1988.-30.-P. 131-134.
121. Gamble H.R., Wisnewski N., Wassom D. Detection of trichinellosis enzyme immunoassay using a synthetic glycan antigen//American Journal of Veterinary.-1997.-5 8.-P.417-421.
122. Gamble H.R., Rapic D., Murinculic A., Murrell K.D. Factors influencing the excretory-secretory antigens in the serodiagnosis of swine trichinellosis//Consejo Superior de Investigaciones Press Madrid Spain.-1989.-P.202-209.
123. Henrilcsen S. Report on T. spiralis in Denmark (1977-1978)//Wiad. Parasital.-l 979.-25 .-№5 .p. 5 82-5 83.
124. Hereza-Esparza R., Rio-Castaneda A.D., Avalos-Diaz E., Herera-Dioadado R.M. Trichinella spiralis: Immunochemical characterization of antigens in experimental infection.//Experimental Parasitology. -1987. -63. -233-236.
125. Hulinska D., Grim M., Mackinnon B.M. Alteration of muscle fibres of mice experimentally infected with Trichinella pseudospiralis, T. spiralisand Т. nativa//In: Kim CW (ed) Trichinosis.-State University of New York, Albany.-1985.-P. 152-162.
126. Ivanoska D., Cuperlovic K., Gamble H.R., Murrell K.D. Comparative efficacy of antigens and antibody detection rests for human trichinellosis//J. Parasitol.-1989.-75.-P.38-41.
127. Ко О. С., Fan L. Heat shock respons to Trichinella spiralis and T. pseudospiralis//Parasitology.-1996.-112.-P. 89-95.
128. Ко R.C., Fan L., Lee D.L., Compton H. Changes in host muscles induced by excretory-secretory products of larval Trichinella spiralis//Parasitology.-1994.-108.-P. 195-205.
129. Kormanova M., Mitterpak I., Konic S. On the epidemiology of trichinellosis in the vihorlat region over the last 20 years//6th International Helminthological symposium.-1991 .-Kosice.-P. 134.
130. Kyhse-Andersen J. 1984 /J.Biophys.BioChem. Methods. 10: 203-209. цитировано по "Практическая химия белка" стр. 311.
131. Laemmli U.K. Cleavage of structure proteins during the head of bacteriophage T4//Nature.-1970.-227.-P.680-685.'
132. Lee D.L., Shivers R.R. A freeze-fracture study of muscle fibres infected with Trichinella spiralis//Tissue Cell. 1987.-19.-P.665-671.
133. Leung R.K., Ко R.C. Production specific antigens from Trichinella spiralis using a continuous elution method and isoelectric focusing//Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health.-1997.-28.-P.99-106.
134. Li C.K.F., Chung Y.Y.Y., Ко R.C. The distribution of excretory-secretory antigens during the muscle phase of Trichinella spiralis and T. pseudospiralis infection//Parasitol Res.-1999.-85.-P.993-998.
135. Linder E., Thors C., Lundin L., Ljungstrom I., Farah S., Hagi H., Dias F. Schistosome antigen gp50 is responsible for serological cross-reactivity with Trichinella spiralis//! Parasitol.-1992.-78.-P.999-1051.
136. Lupascu J., Tantacanu J., Salomon P., Smolinsky. Trichinellosis in Romania//Epidemiological aspects.-Wead. Parazytol.-1970.-v. 16.-P.78.
137. Machnicka В., Prolcopowicz D., Madalinski K., Dziemian E., Prokopowicz K. Antibodies, circulating antigens and circulating immune complexes in human trichinellosis//Proc. 8th Int. Conf. Trichinellosis.-1994.-P.341-346.
138. Mahamor P., Setasudan P., Morakote N., Tapchaisri P., Chaicumpa W. Immunodiagnosis of human trichinellosis and identification of specific antigen for Trichinella spiralis//Int. J. Parasitol.-1995.-25.-P.87-94.
139. Mahannop P., Chaicumpa W., Setasuban P., Morakote N., Tapchaisri P. Immunodiagnosis of human trichinellosis using excretory-secretory (ES) antigen//! Helmintol.-1992.-66.-P.297-304.
140. Мак C.H., Ко R.C. DNA-binding activity in the excretory-secretory products of Trichinella pseudospiralis (Nematoda: Trichinelloidea)//Parasitology.- 2001.- 123.-P.301-308.
141. Massaud I. Trichinellosis in Carnivores in Iran//Proc. 4th Int. Conf. Trichinellosis.-1976 .-Poland.-P5 51-554.
142. Maternivska I. Zbl. Bakteriol., Parasitenkunde, Infektionskrankh. Und Hyg.- 1933.-129.- 3-4.- C.284-301.
143. Matsuo A., Wu. Z., Nakada I., Nagano Т., Taracashi Y. Localization of antigens Trichinella spiralis recognized by four different strains of mise//Proceedings of 6ht Parasitic Zoonoses.-2000.-121.-P.203-210.
144. McLaren D.J., Ortega-Pierres G., Parkhouse R.M. Trichinella spiralis: Immunocytochemical localization of surface and intracellular antigens using monoclonal antibody probes//Parasitology.-1987.-94.-P.300-312.
145. Mauss E.A. J. Parasitol.-1940.-26, 6,- P.43.
146. Melcher L.R. J. Parasitol.- 1942.-28, 6,- P.20.
147. Moore L.L.A. Studies in nise on the immunogenicity of cuticular antigens from larvae Trichinella spiralis//J. Elisha Mitchell Scient. Sos.- 1965.-81.-2.-P.137-143.
148. Morakote N., Khamboonruang C., Siriprasert V., Suphawitayanukaul S., Marcanantachoti S., Thamasonthi W. The value of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for diagnosis of human trichinosis//Tropical Medecine Parasitology. -1991. -42. -172-174.
149. Nishiyama Т., Araki Т., Mizuno N., Wada Т., Ide Т., Yamaguchi T. Detection of circulating antigens in human trichinellosis//Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.-l992.-86.-P.292-293.
150. Noclcler K., Przio E., Voigt W.P., Heidrich J. Detection of Trichinella infection in food animals//Ver. Parasitol.-2000.-93.-P.335-350.
151. Nui B.H., Pan G.W., He W., Pou L.Q. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in trichinellosis of pig//Chin. J. Vet. Sci. Tech.-1985.-2.-P.3-7.
152. Ortega-Pierres M.G. Characterization of surface antigenes of the nematode parasite Trichinella spiralis: study of their involvment in protection mechanisms and their use in the diagnosis of trichinellosis//Gaceta Medica de Mexico.-1995.-131.-P. 2-12.
153. Parkhouse R.M.E., Almond N.M. Stage-specific antigenes of Trichinella spiralis. //Transactions Biochem.Soc. -1985. -13. -P. 426-428.
154. Parkhouse R.M.E., Philip M., Ogilvie B.M. Characterization of surface antigens of Trichinella spiralis infective larvae//Parasite Immunol.-1981.-3.- P.339-352. '
155. Philip M., Taylor P., Parkhouse R.M.E., Ogilvie B.M. Immune response to stage specific surface antigens of the parasitic nematode Trichinella spiralis/Л. Exp. Med.-1981.-154.-P.210-215.
156. Rapic D., Dzkula N., Zulcovic M. A study of crossreaction between trichinellosis and metastrongylosis in pigs by enzyme-linlced immunosorbent assay (ELISA)//Vet. Arth.-1981.-51.- P.223-227.
157. Rapic D. Immunoenzimaski test (ELISA) u diagnostici experimentale I prirodne trihinellose svinja//Acta Parasitol. Yugosl.-1980.-11.-1-2.-P.49-57.
158. Silberstein D.S., Despommier D.D. Antigens from Trichinella spiralis that induce a protective response in the mouse//Journal of Immunology.-1984.-132.-898-904.
159. Smith H.J., Snowdon K.E. Detection of T.spiralis nativa antibodies in parcine sera by ELISA using excretory-secretory antigens//Canadian J. of Vet. Research.-1987.-51.-(3).-P.413-414.
160. Strobel H. The serum diagnosis of trichmosis//Am. J. Med. Sci. 1911.- 13.-P. 282.
161. Suphawitayanukul S., Markanantochoti S., TamasonthiW. The value of the enzime-linked immunosorbent assay (ELISA) for diagnosis of human trichinosis// Trop.Med.Parasitol. -1991. -42. -P. 172-174.
162. Takahashi Y., Uno Т., Mizuno N., Suzuki H., Shimazu K., Araki T. Trichinella spiralis: the in situ localization of muscle larvae antigens recognized by humans//Exp. Parasitol.-1990.-70.-1.-P. 107-110.
163. Todorova V.K., Tankov C.V., Dimitrov T.V. Trichinella spiralis characterization of circulating and immune-complex-associated antigens/ZParasitol. Res. 1993. - 79. - P.86-88.
164. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and someapplications//Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1979. -76. P.4350-4354.
165. Trawinski A. Berliner und munchener tierarztl//Wochenschr.-1934.-50.-C.223-224.
166. Turcekova L., Boroskova O., Tomasovicova O., Reiterova K., Kincekova J. Immunochemical analysis of larval antigens of Trichinella spiralis and T. pseudospiralis//Helmintologia.-1997.-34(4).-P.241-243.
167. Van Knapen F., Franchimout J.H., Ruitenberg E.J Comparison of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with three other methods for the detection of T.spiralis infection in pigs//Vet. Parasitol.-1980.-7(2).-P.09-121.
168. Van Knapen F., Framstand K., Ruitenberg E.J. Reliability of ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) as control method for the detection of Trichinella spiralis naturally infected slaughter pigs//J. Parasitol.-1976.-62(2).-P.232-233.
169. Wakelin D., Denham D.A. The immune response//In "Trichinella and Trichinosis".-1983 .-P.265-3 08.
170. Wang C.H. and Bell R.G. Trichinella spiralis: Intestinal expression of systemic stagespecific immunity to newborn larvae//Parasite immunology.-1987.-9.-P.465-475.
171. Who T.T. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)//Bull. Wld. Hlth. Org.-1976.-54.-2.-P. 129-139.
172. Wu Z., Nagano I., Nakada Т., Tarahashi Y. Expression of excretory and secretory antigenes of Trichinella at muscle stage differ before and after cyst formation//Parasitology.-2002.-51.-P. 155-161.
173. Year H., Andiva S., Perret C., Limonne D. Development and evaluation of a western blot rit for diagnosis of human trichinellosis//Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology.- 2003.-10.-5.-P.793-796.
174. Zarlenga D.S., Gamble H.R. Molecular cloning and expression of an immunodominant 53 kDa excretory-secretory antigen from Trichinella spiralis muscle larvae//Moleculary Biochemical Parasitology. -1990. -42. -165-174.
175. Zhan Y.A., Yan Z.Z., Wan W., Lu Z.Y., Zhu Z.Q. Localization and characterization of partial immunodominant antigen epitopes of Trichinella spiralis//Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi.-2000.-18(4).-P.216.
176. Zhu D., Bell R.G. Trichinella spiralis: murine strain variation in response to monoclonally defined, protective, nonstage-specific antigens//Exp. T. spiralis).
177. Методика получения экскреторно-секреторных антигенов личинок Т. spiralis.1. Аспирант Курносова О.П.1. Москва 2005
178. Подготовка лабораторной посуды, инструментов и растворов для проведения культивирования личинок трихинелл.
179. Получение инвазионных личинок трихинелл для культивирования.
180. Белых беспородных крыс заражают перорально личинками Т. spiralis в дозе 10 личинок/г живого веса.
181. Через 1,5-2 месяца животных убивают, снимают шкуру, удаляют внутренние органы и тушки измельчают. Полученный фарш переваривают в искусственном желудочном соке, при 38,5 -39,0°С.
182. Инкубирование инвазионных личинок.
183. Белковые продукты личинок трихинелл получают по методу Gamble Н. R. (1), но без применения С02-инкубатора, фиксированного уровня (10%) содержания углекислоты и (70%) влажности; в обычном термостате при 38,5°С .
184. Контроль полученных метаболитов.
185. Методы выделения и фракционирования иммуногенных белков из тканевых гельминтов и клеток генно-инженерных штаммов, продуцирующих гибридные белки (T.spiralis, Е. granulosus).
186. Разработчики: н.с. И.М.Одоевская асп. О.П.Курносова проф. А.В.Успенский проф. Бенедиктов И.И.
187. Предлагаемые методы получения иммуногенных белков тканевых гельминтов являются обобщением многолетних исследований по выделению антигенов этих паразитов, как нативных, • так и генно-инженерных, обладающих протективной и диагностической эффективностью.
188. Приготовление разделяющих полиакриламидных гелей (1 гель-16 мл).
189. Состав и приготовление растворов для электрофореза в Ds-Na-ПААГ
190. Вид буфера Состав Способ приготовления
191. Буфер для концентрирующего геля, четырехкратный концентрат 0,5 мМ трис-HCL рН 6,8; 0,2%-й Ds-Na; В 40 мл дистиллированной воды растворить 3 г трис и 0,2 г Ds-Na, титровать концентрированной HCI до рН 6,8, довести объем до 100 мл, хранить при 4°С
192. ТЕМЕД N, N, N', N'-тетраметилендиамин, хранить при 4°С в темноте
193. Используемые реактивы для ИФР. Фосфатный буферный раствор (ФБ), рН 7,4:
194. NaCl 8 г.; Na2HP04 ■ 12Н20 - 2,9 г.; Na2HP04 • 2Н20 -0,2 г.; Растворяют в 1 л дистиллированной воды.
195. ФБ-Т. В 1 л ФБ растворяют 0,5 мл детергента Tween-20 (0,05% по объему). •ФБ-Т. В 500 мл ФБ-Т растворяют 0,5 г БСА.
196. Карбонатно-бикарбонатный раствор (КББ) 0,05 М, рН 9,6:
197. Na2C03 1,59 г (0,015 М); Na2HC03 - 2,59 г (0,035 М). Растворяют в 1 л дистиллированной воды и доводят рН раствором карбоната (0,05 М) или бикарбоната (0,035 М) натрия.
198. Цитратный (субстратный) буфер (ЦБ), рН 5,0:
199. Раствор A (Na2HP04 • 12Н20 -0,2 моль/л растворяют 14,3 г соли в 200 млн2о;
200. Раствор В (лимонная кислота 0,1 моль/л) - растворяют 2,1 г лимонной кислоты в 100 мл Н20.
201. Субстратная смесь — раствор субстрата с хромогеном для пероксидазы хрена: смешивают 5,5 мл раствора А, 5 мл раствора Б и 10 мл Н20, проверяют рН; в 10,5 мл полученного ЦБ растворяют 3,4 мг ОФД, после чего добавляют 10 мкл 30%-й Н202.
202. Субстратную смесь готовят непосредственно перед применением. При работе с сухим ОФД пользуются резиновыми перчатками.
203. Подготовка биологического материала.
204. Качественный антигенный материал можно получить только из свежей или свежезамороженной биомассы гельминтов, их личинок, клеток-продуцентов рекомбинантных белков.
205. Подготовка экстрагирующих буферных растворов.
206. Высаливание белков сульфатом аммония.
207. Приготовление растворов (NH^SC^ различной степени насыщения.
208. Очистка и фракционирование белков-антигенов гельминтов методом гель-фильтрации с использованием сефадекса G-100
209. Иммунохимические методы анализа фракционированных нативных и рекомбинантных антигенов гельминтов.
210. Проведение денатурирующего электрофореза в ПААГ.
211. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
212. На первом этапе проводят электрофорез в полиакриламидном геле (Ds-Na-ПААГ) и немедленно после электрофореза гель используют для переноса.
213. Электрофоретический перенос.
214. Электрофорез проводят в течение 1 ч при напряжении 10 В. Общие правила по полярности и направлению переноса такие же, как и при электрофоретическом разделении.3. Окраска нитроцеллюлозы.
215. Остатки краски смывают в дистиллированной воде. Для контроля полноты переноса оставшийся гель окрашивают каким-либо белковым красителем (Кумасси R-250).4. Иммуноокрашивание
216. Реплику помещают в блокирующий раствор на один час при постоянном перемешивании на качалке.
217. Примывают в трех сменах ФСБ-Т, по 10 мин в каждой.
218. Примывают в трех сменах ФСБ-Т, по 10 мин в каждой.
219. Промывают в трех сменах ФСБ-Т, по 10 мин в каждой.
220. Реплику проявляют раствором 1-хлор-4-нафтола. После появления черно-синих окрашенных полос продукта окисления 1-хлор-4-нафтола пероксидазой реплику промывают водой.
221. Окрашенную реплику в случае использования 1-хлор-4-нафтола в качестве субстрата целесообразно сфотографировать или задокументировать каким-либо другим способом (ксерокопирование).8. Иммуноферментный анализ.
222. Проведение твердофазного ИФА "ELISA"
223. Ход определения иммунологической активности рекомбинантных антигенов1. E.granulosus в ИФА
224. Эксресс-метод иммунохимической характеристики антигенных препаратов.
225. Методика проведения ракетного иммуноэлектрофореза в микромодификации1. Материалы и оборудование
226. Сыворотка крови заражённого соответствующим гельминтозом или иммунизированного животного
227. Исследуемые антигены в различных концентрациях
228. Барбиталовый буфер 0,08М, рН 8,2 ( барбитал 4,4г., барбитал натрия - 12г., дистиллированная вода до 1 литра)
229. Камера для горизонтального электрофореза
230. На подогретое и тщательно обезжиренное стекло, расположенное на строго горизонтальной поверхности, наносят гель. После полимеризации (10-15мин.) в нём вырезают лунки диаметром 4мм на расстоянии одна от другой не менее бмм.
231. Титрование антигенов проводят на том же барбиталовом буфере, в лунки их вносят в объёме от 10 до 50 мкл. Объём исследуемых белковзависит от концентрации исходного вещества в растворе и в каждом конкретном случае определяется экспериментально.
232. В электродные отсеки камеры заливают барбиталовый буфер и соединяют с буфером с помощью контактных мостиков из фильтовальной бумаги. Электрофорез проводят при напряжении от 7 до 20 в/см в течение 23 часов.
233. Список используемой литературы.
234. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология: Принципы и применение/Под. ред. Н.К.Янковского. Пер. с англ. М.: Мир, 2002.
235. Досон Р., Элииот Д., Элииот У., Джонс К. Справочник биохимика/Пер. с англ. -М.: Мир, 1991.
236. Иммуноферментный анализ/Под ред. Т. Нго, Г. Лефковитса. М.: Мир, 1988.
237. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. -М.: Наука, 1983.
238. Практикум по иммунологии/Под ред. И.А.Кондратьевой, В.Д.Самуилова. -М.: Изд-воМГУ, 2001.
239. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999.
240. Т.Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.
-
Курносова, Ольга Петровна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2005
-
ВАК 03.00.19
- Диагностическая эффективность иммуноферментных тест-систем (ИФР и дот-ИФА) при трихинеллезе свиней
- Трихинеллез в прибрежных районах Чукотского полуострова, распространение, меры профилактики
- Разработка клеточной технологии получения антигенов цестод
- Трихинеллез на юге России: эпидемиология, диагностика и профилактика в современных социально-экономических условиях
- Эпизоотология, эпидемиология и совершенствование мер борьбы с трихинеллезом в Республике Северная Осетия-Алания
