Диагностическая эффективность иммуноферментных тест-систем (ИФР и дот-ИФА) при трихинеллезе свиней

Написанова, Людмила Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Диагностическая эффективность иммуноферментных тест-систем (ИФР и дот-ИФА) при трихинеллезе свиней
ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Диагностическая эффективность иммуноферментных тест-систем (ИФР и дот-ИФА) при трихинеллезе свиней"

На правах рукописи

Написанова Людмила Александровна

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ (ИФР И ДОТ-ИФА) ПРИ ТРИХИНЕЛЛЕЗЕ СВИНЕЙ

Специальность 03.00.19 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К.И. Скрябина (ВИГИС).

Научный руководитель: -доктор биологических наук

Бережко Вера Кузьминична

Официальные оппоненты: -доктор биологических наук

Новик Тамара Самуиловна (ВИГИС)

-кандидат ветеринарных наук, доцент Жданова Ольга Борисовна (Вятская ГСХА).

Ведущая организация: -Московский государственный университет

прикладной биотехнологии (МГУПБ).

Защита диссертации состоится« Ж» Ш-иРМЛ_2004г. асов

на заседании диссертационного совета Д 006.011.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К.И. Скрябина (ВИГИС)

Адрес: 117218, Москва, ул. Большая Черемушкинская, д.28 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС

Автореферат разослан « »

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Бережко В.К.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Трихинеллез, вследствие повсеместного распространения возбудителя на земном шаре, является глобальным антропозоогельминтозом. Это инвазионное заболевание представляет собой серьезную медицинскую, ветеринарную и социально-экономическую проблему во всем мире, так как наносит немалый ущерб хозяйству стран и обществу в целом. Поэтому во многих странах с неизменным постоянством и высокой интенсивностью ведутся комплексные ветеринарно-медико-биологические исследования по трихинеллезу, но несмотря на это актуальность проблемы не ослабевает, а в нашей стране в последнее время даже возрастает.

Для повышения результативности профилактических

противотрихинеллезных мероприятий в первую очередь следует разрабатывать надежные и недорогие методы прижизненной диагностики трихинеллеза свиней, что позволило бы предупреждать затраты на содержание больных животных и решать другие проблемы научно-исследовательского характера, а именно выявлять неблагополучные хозяйства и подворья при эпизоотологических обследованиях, уточнять некоторые вопросы эпизоотологии и эпидемиологии трихинеллеза, пути и факторы передачи, экстенсивность инвазии.

Исходя из сказанного, становится понятным, что совершенствование существующих и изыскание новых, высокоэффективных и возможно универсальных методов посмертной и прижизненной диагностики трихинеллеза является первостепенной задачей и насущной необходимостью как в научном, так и в практическом плане.

Цели и задачи исследования. Основной целью наших исследований было: разработать иммуноферментную тест-систему дот-ИФА и сравнить диагностическую эффективность ИФР и ХК ^'¿Р^ЦЙЬЙ^ЯвЖЯИбзе свиней.

БИБЛИОТЕКА I

Г БИБЛИОТЕКА I

Для выполнения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Получить личинки трихинелл для экспериментального заражения свиней и приготовления соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов.

2. Изучить динамику выработки антител у экспериментально зараженных разными дозами Trichineila spiralis свиней в ИФР.

3. Провести фракционирование, соматического экстракта личинок трихинелл и выделить наиболее эффективную диагностическую фракцию.

4. Провести культивирование личинок Т. spiralis в искусственной питательной среде, получить экскреторно-секреторный антиген.

5. Провести электрофоретический анализ соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов личинок трихинелл в ДСН-ПААГ.

6. Отработать параметры постановки иммуноферментной тест-системы дот-ИФА.

7. Оценить диагностические качества фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов.

8. Провести производственные испытания ИФР и дот-ИФА при трихинеллезе свиней

Научная новизна. Впервые в России разработана экономичная и перспективная для полевых испытаний иммуноферментная тест-система дот-ИФА (типа dot-ELISA) при трихинеллезе свиней. Изучена сравнительная динамика выработки антител у свиней, экспериментально зараженных разными дозами личинок трихинелл; проведено фракционирование экстракта Т. spiralis и определена наиболее активная и специфичная фракция; получен экскреторно-секреторный антиген личинок Т. spiralis культивированием в искусственной питательной среде. Проведена сравнительная оценка диагностической *' "эффективности фракционированного и экскреторно-

секреторного антигенов при трихинеллезе свиней; определена молекулярная масса диагностически эффективных фракций в антигенах, полученных- из личинок Т. spiralis.

Практическая ценность работы. По материалам диссертации разработаны «Временное наставление по применению набора для диагностики трихинеллеза свиней методом дот-ИФА» и ТУ на «Набор для диагностики трихинеллеза свиней методом дот-ИФА», а также «Временное наставление по применению набора для диагностики трихинеллеза свиней иммуноферментным методом (ИФА)» и ТУ на «Набор для диагностики трихинеллеза свиней иммуноферментным' методом (ИФА)». Документы утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза, России 30.03.04 г. (№13-5-02/0978, №13-5-02/0977).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:

• Международном Ветеринарном Конгрессе, 3-9 - сентября, 1995 год, Иокогама (Япония).

• 7-й Научной конференции по трихинеллезу человека и животных, 2-3 октября, 1996 год, Москва (Россия).

• 8-й Всероссийской конференции по трихинеллезу, 30-31 мая, 2000 год, Москва (Россия).

• Научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», 2003 год, Москва (Россия).

• Объединенных сессиях Координационного совещания по ветеринарной паразитологии Центрального совета Общества гельминтологов РАН и секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН. (10.12.97; 9.12.99; 26.05.00; 01.06.00; 20-22.02.01; 22-24.05.02; Москва).

• Заседаниях Ученого совета ВИГИС (1996-2003).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Приготовление соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигена из личинок Т. spiralis.

2. Электрофоретический анализ соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов в ДСН-ПААГ.

3. Разработка диагностической тест-системы дот-ИФА при трихинеллезе свиней.

4. Изучение динамики выработки антител при* экспериментальном трихинеллезе свиней.

5. Оценка диагностической эффективности фракционированного и экскреторно-секреторного антигена при трихинеллезе свиней.

6. Сравнительные испытания ИФР и дот-ИФА при трихинеллезе свиней в производственных условиях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 статей. Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 130 страницах машинописного текста. Состоят из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список литературы включает 223 источников, в том числе 53 отечественных и 170 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 5 таблицами, 16 рисунками.

Обзор литературы.

Представлен анализ литературы по методам получения антигенов из личинок трихинелл и их характеристики, по использованию иммуноферментной реакции в диагностике трихинеллеза и нового варианта иммуноферментного анализа - дот-ИФА в диагностике гельминтозов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы.

Объект исследования. Мышечные личинки Т. spiralis, первоначально выделенные в 1965 году от домашней свиньи из Белоруссии и в дальнейшем пассированные на белых крысах в ВИГИСе.

Сыворотки. Для проведения иммунодиагностических исследований использовали сыворотки крови свиней, экспериментально и естественно зараженных Trichmelk spiralis, Echinococcus granulosus, Oesophagostomum dentatum, Cysticercus tenuicollis, Ascaris suum, Trichocephalus suis и сыворотки клинически здоровых свиней.

Получение личинок трихинелл, приготовление соматического экстракта. Белых беспородных крыс заражали личинками лабораторного штамма Т. spiralis (ВИГИС) в дозе 2,5 тыс. личинок на животное. Через 45-60 дней крыс забивали и выделяли инвазионных личинок трихинелл методом переваривания в искусственном желудочном соке. Жизнеспособность проверяли под микроскопом. Выделенных личинок использовали для заражения животных и культивирования в искусственной питательной среде. Часть выделенных личинок накапливали до необходимого объема, замораживая и сохраняя при температуре минус 20°С, для приготовления впоследствии полного соматического экстракта.

Экстракт из мышечных личинок Т. spiralis готовили по методу Ruitenberg etaL(1976).

Получение соматического фракционированного антигена личинок Т. spiralis. Фракционирование цельного экстракта личинок трихинелл проводили по модифицированной методике Magat and JcSka (1976) гель-хроматографией на колонке размером 2,2x70 см, объемом 220 см. Антигенную активность полученных белковых фракций определяли в ИФР с

использованием референс-положительных и отрицательных контрольных сывороток. Дополнительно, по результатам реакции, из второго белкового пика выделяли фракцию, которая показала наилучшие диагностические свойства, и использовали в качестве соматического фракционированного антигена.

Получение экскреторно-секреторного антигена личинок Т. spiralis.

Экскреторно-секреторный антиген получали по методике Gamble et al.(1988), несколько модифицированной применительно к нашим условиям. Собранные экскреторно-секреторные- продукты личинок проверяли на антигенную активность в ИФР с использованием контрольных референс-сывороток, определяли спектрофотометрически содержание белка (Layne, 1957) и использовали в качестве экскреторно-секреторного антигена.

Физико-химическая характеристика соматического

фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов. Сравнение белкового спектра двух антигенов провели методом электрофореза в ПААГ согласно Laemmli' (1970) с некоторыми модификациями. Разделение проводили в денатурирующих условиях с использованием 12,5% геля в присутствии додецилсульфата натрия при напряжении 300 вольт.

Постановка и учет результатов иммуноферментной реакции при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном. Постановку иммуноферментной реакции проводили в непрямом варианте с целью выявления антител в сыворотке крови животных. Параметры (оптимальная концентрация антигена, минимальный диагностический титр сывороток), режим сенсибилизации планшетов антигеном и постановки ИФР с экскреторно-секреторным антигеном отрабатывали в предварительных экспериментах на сыворотках свиней с гомологичной инвазией (слабый и умеренный иммунный ответ), гетерологичной инвазией и отрицательного контроля (клинически здоровые). Твердой фазой служили планшеты из полистирола (Медполимер, Санкт-Петербург).

Разработка дот-ИФА при трихинеллезе свиней. Постановку дот-ИФА осуществляли с учетом предложений Рарраз й а1.(1986) и Бойог й а1.(1987)в непрямом варианте для выявления антител в сыворотке крови свиней. Оптимальные параметры (концентрация антигена, минимальный диагностический титр), режим сенсибилизации мембран антигеном, блокирования несвязавшихся участков на мембранах и постановки дот-ИФА с экскреторно-секреторным антигеном отрабатывали в предварительных экспериментах на сыворотках от свиней с гомологичной (слабый и умеренный иммунный ответ), гетерологичной инвазией и клинически здоровых без тканевых гельминтов по данным ветсанэкспертизы (отрицательного контроля). Твердой фазой служили нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор 0,22 цт производства фирмы «МИНроге» (США). Все манипуляции с мембранами проводили с помощью анатомического пинцета, не касаясь ее руками.

Изучение динамики антител при экспериментальном трихинеллезе свиней в ИФР и дот-ИФА. В опыте использовали поросят 2-3 месячного возраста массой 20-24 кг, разбитых на 3 группы: первая группа (3 поросенка) получила по 1000 личинок трихинелл на животное, вторая группа (3 поросенка) - 20000 личинок на животное, контрольная группа из 2 поросят заражению не подвергалась. У подопытных свиней до заражения дважды брали кровь. В течение месяца после заражения у всех животных взятие крови проводили с интервалом 5 дней, затем с 30 дня по 90 с интервалом 10 дней и далее один раз в месяц до конца наблюдений.

Диагностическая эффективность ИФР при трихинеллезе свиней с соматическим фракционированным и экскреторно-секреторным антигенами. Оценку диагностической эффективности с соматическим фракционированным и экскреторно-секреторным антигенами в сравнительном аспекте провели в ходе комиссионной проверки. Сыворотку крови получали от свиней во время убоя из районов благополучных и

неблагополучных по трихинеллезу (Московская область, г. Вологда, Краснодарский край, Украина), а также от экспериментально инвазированных свиней. Испытания проводили на 123 сыворотках свиней в том числе 33 пробы с различными инвазиями и 90 - от условно здоровых животных.

Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФР при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном в производственных условиях. Сыворотки получали с мясокомбинатов от убойных свиней из благополучных и неблагополучных по трихинеллезу районов Российской Федерации и Украины с учетом данных ветсанэкспертизы, а также от экспериментально инвазированных Т. spiralis животных.

Исследовали 354 сыворотки, в число которых вошли сыворотки от свиней с различными инвазиями и 322 сыворотки от клинически здоровых свиней по данным ветсанэкспертизы свободных от трихинелл и других тканевых гельминтов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ данных по получению соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов Т. spiralis. Соматический фракционированный антиген. В процессе фракционирования экстракта, личинок трихинелл на сефадексе G-200 мы получили пять белковых пиков, из которых первые два - содержали диагностически активные антигенные компоненты. При этом белки первого пика имели очень хорошую активность, но давали много ложноположительных реакций в серологии. Белки второго пика показали не только высокую чувствительность, но и лучшую специфичность. Исходя из полученных данных, мы модифицировали методику фракционирования и ввели дополнительное разделение на фракции объема элюата - наиболее специфического второго

пика и граничащей с ней зоны первого, как активного белкового пика. В результате были получены 9 фракций, иммунологическую активность которых испытали в ИФР с сыворотками свиней, экспериментально зараженных личинками трихинелл (умеренный и слабый иммунный ответ), а специфичность с 96 сыворотками крови убойных свиней из различных зон страны.

Экскреторно-секреторный антиген, Культированием инвазионных личинок Т. spiralis в питательной среде ДМЕМ получили экскреторно-секреторные продукты общим объемом 100 мл с содержанием белка 400-550 мкг/мл. Их диагностическую активность испытали в ИФР с теми же сыворотками, что и с соматическим фракционированным антигеном. Анализируя данные по приготовлению этих антигенов мы заключили, что метод получения экскреторно-секреторного антигена менее трудоемок и экономит время.

Физико-химическая характеристика соматического

фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов. На

электрофореграмме соматического фракционированного антигена выявлено 17, а экскреторно-секреторного - 18 белковых полос.

При сравнении белкового спектра соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов отметили в обоих препаратах компоненты, расположенные в диапазоне белков, имеющих одинаковую молекулярную массу - 55 кДа (для соматического - №2, для экскреторно-секреторного - №4). Тем не менее они отличаются по степени проявления: на электрофореграмме первого антигена она представлена четко выраженной широкой полосой, второго - значительно слабее. Полосы, представляющие компоненты молекулярной массы 44 кДа, хотя на электрофореграммах обоих антигенов хорошо проявлены и в количественном отношении сопоставимы, тем не менее в экскреторно-секреторном антигене - это основной белковый компонент. В соматическом фракционированном антигене таковыми

✓А

являются компоненты, расположенные в зоне белков молекулярной массы 55,44,40,31 и 68 кДа.

Результаты исследований по постановке и учету иммуноферментной реакции при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном. Чувствительность, а также в немалой степени и специфичность иммуноферментной реакции во многом зависит от концентрации антигена при сенсибилизации планшетов. Опыты по определению оптимальной концентрации г антигена, режима сенсибилизации планшетов, определению минимального диагностического титра показали наилучшие результаты при концентрации антигена 5-10 мкг/мл по белку, сенсибилизации планшетов антигеном в течении 18-20 часов при температуре 4°С и минимальном диагностическом титре испытуемых сывороток 1:100. Выбранный минимальный диагностический титр позволяет выявлять достаточно низкий уровень антител у зараженных личинками трихинелл животных при сохранении высокой специфичности реакции. Оптимальным раствором для разведения антигена в процессе экспериментов был выбран 0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6, а для сывороток - 0,01 М фосфатно-солевой - рН 7,2-7,4.

При отработке режима постановки ИФР с экскреторно-секреторным антигеном трихинелл установили, что оптимальным является вариант инкубации с сыворотками- и с конъюгатом по 30 минут при 37 °С. Увеличение времени инкубации на каком-либо из этих двух этапов заметно снижает специфичность.

Проявление реакции проводили субстратной смесью из 10 мл цитратного буфера рН 4,7-5,0 с добавлением 8 мг ортофенилендиамина и 10 мкл стабилизированной 30-33% перекиси водорода (пергидроля). После проявления (10-15 минут), реакцию останавливали стоп-реагентом, который состоял из водного раствора концентрированной серной кислоты в соотношении 1:1. Стоп-реагент вносили в объеме 50 мкл на лунку.

Учет реакции при визуальной оценке проводили, сравнивая степень окраски испытуемых сывороток с контрольными, а при автоматическом - на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Положительной считали сыворотку, превосходящую по оптической плотности отрицательный контроль на 0,080 и более единиц.

Результаты исследовании по разработке дот-ИФА при трихинеллезе свиней. Диагностическую тест-систему дот-ИФА разрабатывали с целью усовершенствования иммунодиагностики трихинеллеза и облегчения работы в полевых условиях. Использовали экскреторно-секреторный антиген, который предварительно для удобства перед отработкой параметров сконцентрировали посредством лиофильной сушки.

Опыты по определению оптимальной концентрации антигена, минимального диагностического титра, режима сенсибилизации нитроцеллюлозных мембран антигеном, блокирования несвязавшихся участков на мембранах показали наилучшую эффективность реакции при концентрации антигена 400 мкг/мл (0,8 мкг/дот - 1 исследование) и титре испытуемых сывороток 1:10. Сыворотки разводили в 0,01 М фосфатно-солевом буфере с 0,5% содержанием бычьего сывороточного альбумина и 0,05% твина 20 (40). Режим сенсибилизации мембран антигеном составлял 15 минут при 56°С с последующим блокированием в 0,01 М фосфатно-солевом буфере с 2% бычьего сывороточного альбумина в течение 18-20 часов при 4°С.

При отработке режима постановки дот-ИФА с экскреторно-секреторным антигеном установили, что оптимальным является вариант инкубации с сыворотками 40 минут во влажной камере и 30 минут в рабочем растворе конъюгата. Этапы реакции проходят при комнатной температуре (18-26°С). Увеличение времени инкубации усиливает неспецифическое связывание, а следовательно возрастает количество ложных ответов. Влажная камера состоит из чашки Петри или подобной подходящей емкости с тонким слоем

поролона (0,5 см) и листа фильтровальной бумаги на нем, смоченных отмывающим раствором (0,01 М фосфатно-солевой буфер с 0,05% твина-20 (40)). Отмывали мембрану после инкубирования 3 раза по 5 минут в чашке Петри, периодически потряхивая емкость.

Коньюгат использовали в рабочем разведении, которое устанавливали в предварительных опытах для каждой новой серии. Для приготовления рабочего разведения конъюгата использовали 0,01 М фосфатно-солевой буфер рН 7,2-7,4 с 1% содержанием бычьего сывороточного альбумина и 0,05% содержанием твина-20 (40). Мембрану помещали в раствор конъюгата и выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре (18-26 °С), затем отмывали.

На заключительном этапе мембрану помещали в раствор субстратной смеси и выдерживали 5-10 минут в темноте. Субстратную смесь готовили следующим образом: 5 мг 3,3' - диаминобензидина растворяют, тщательно перемешивая, в 20 мл 0,1 М трис-НС1 буфера рН 7,6 и отфильтровывают через бумажный или ватный фильтр. Раствор хранят не более 2 недель при температуре 4 °С в темном месте. Непосредственно перед употреблением в раствор субстрата добавляют 0,06 мл раствора гидроперита (1 таблетка гидроперита (1,5 г) растворяется в 16,5 мл дистиллированной воды). После проявления реакцию останавливали промыванием мембраны в водопроводной воде.

Оценку реакции проводили визуально по интенсивности окрашивания точек-дотов в сравнении с контрольными сыворотками. Результат считали отрицательным, если на месте нанесения сыворотки пятно не проявляется (может проявляться незначительное фоновое светло-бежевое окрашивание). Результат считали положительным, если на месте нанесения сыворотки появляется коричневое пятно с четким контуром по интенсивности окраски сопоставимое со слабоположительным контролем.

Анализ данных по динамике антител при экспериментальном трихинеллезе свиней в ИФР и дот-ИФА. По окончании опыта экспериментально зараженные личинками Т. spiralis свиньи были убиты и методом переваривания проб мышц в искусственном желудочном соке была определена интенсивность инвазии. У шести поросят в 1 г мышечной ткани (ножки диафрагмы) выявили соответственно 4,1; 0,5; 15,45; 9,75; 168,95 и 19,6 личинок трихинелл. В среднем по группам количество личинок Т. spiralis в грамме мышц коррелировало с дозой заражения: 1-я группа (1000 личинок) - 6,68; 2-я группа (20000 личинок) - 66,1 личинок. Однако в каждой группе среди животных наблюдали значительные колебания.

Антитела в минимальных диагностических титрах (ИФР - 1:100, lg=2; дот-ИФА - 1:10, lg=l) у поросенка №1 регистрировали в обеих реакциях с 30-го дня. В последующие сроки инвазии уровень антител увеличивался и достигал максимума с 80-го дня после заражения по 150-й день. У второго и третьего поросенка из этой группы специфические антитела обнаруживали на 50 и 40-й день инвазии соответственно. Максимальные титры антител у них наблюдали с 90 по 150-й день после заражения. Во второй группе (заражение 20000 личинок на животное) у четвертого поросенка антитела к Т. spiralis регистрировали с 40-го дня инвазии с максимальным уровнем на 90-120-й день. Похожая закономерность была отмечена в динамике антител у пятого поросенка этой группы (80-120-й день), но впервые антитела в минимальном диагностическом титре регистрировали с 20-го дня инвазии. У шестого поросенка из этой группы, как и у пятого, антитела обнаруживали с 20-го дня; однако период максимальных титров наблюдался с 80 по 150-й день.

Согласно нашим наблюдениям динамика антител у некоторых животных как первой, так и второй группы, имела одинаковые тенденции. Максимальные титры антител в обеих реакциях (1:12800, lg=4,l в ИФР и 1280, lg=3,l в дот-ИФА) регистрировали у первого и шестого поросенка с 80

по 150-й день. У слабо реагировавших животных - второй и третий поросенок - титры антител были низкими (соответственно 1:200, lg=2,3, 1:400, Ig=2,6 и 1:20, Ig=l,3,1:40, Ig=l,6) со сдвигом пика на 90-150-й день. У умеренно реагировавших - четвертый и пятый - (1:800, lg=2,9 и 1:400, lg=2,6; 1:80, lg=l,9 и 1:40, lg=l,6) с 80-90 по 120-й день после заражения.

Исходя из полученных данных можно заключить, что высота титров антител в ИФР и дот-ИФА не имела прямой корреляции с интенсивностью заражения животных Т. spiralis. Третий поросенок (15,45 личинок/г) в ИФР и дот-ИФА реагировал гораздо слабее, чем первый (4,1 личинки/г). Эти показатели свидетельствуют об индивидуальных особенностях иммунной реактивности животных. В то же время средние арифметические значения логарифмов титров антител в обеих группах позволяют выявить такую закономерность в отношении. дозы заражения - и средней по группам интенсивности инвазии.

Диагностическая-эффективность ИФР. при трихинеллезе свиней с соматическим фракционированным и. экскреторно-секреторным антигеном. В опытах, выполненных комиссионно, по оценке диагностической эффективности ИФР с обоими антигенами использовали 123 сыворотки крови свиней, в том числе от экспериментально и естественно зараженых Т. spiralis (соответственно 6 и 7) и Echinococcus granulosus (7 и 6), естественно инвазированных Cysticercus tenuicolis (5) и Oesophagostomum dentaram (2), клинически здоровых (90). У последних тканевых гельминтов при ветсанэкспертизе не обнаружено.

Чувствительность ИФР оценили по результатам реакции с 13 сыворотками крови свиней, экспериментально и естественно зараженных Т. spiralis (для подтверждения диагноза применяли метод переваривания мышц в искусственном желудочном соке). Ложноотрицательных ответов с обоими антигенами не наблюдали.

Все неспецифические (положительные и дважды сомнительные) результаты считали ложноположительными. С экскреторно-секреторным антигеном в ИФР регистрировали три ложноположительных ответа, из которых один с сывороткой свиньи, естественно зараженной эхинококкозом (ложноположительный), и два (дважды сомнительный) с сыворотками свиней, экспериментально инвазированных Е. granulosus. С соматическим фракционированным антигеном четыре сыворотки дали ложноположительные результаты - две от свиней с естественным и две - с экспериментальным эхинококкозом (табл. 1).

Таким образом, ложноположительные ответы с экскреторно-секреторным и соматическим фракционированным антигенами зарегистрировали соответственно в 2,44 и 3,25% случаев; специфичность в ИФР составила -97,56 и 96,75% при чувствительности 100%. Диагностическая эффективность теста ИФР с первым антигеном была несколько выше, чем со вторым.

Результаты наших опытов подтвердили данные исследователей о том, что специфичность серологических тестов при трихинеллезе свиней повышается при использовании экскреторно-секреторных антигенов, продуцируемых инвазионными личинками Т. spiralis. Причем, наибольшую эффективность отмечают с антигенами-метаболитами, полученными при 24-часовом культивировании личинок.

У свиней, зараженных Е. granulosus, ложноположительный ответ при использовании соматических фракционированных антигенов по сравнению с экскреторно-секреторными антигенами, регистрировали чаще. Появление этих ложноположительных результатов связывают с наличием общих для Т. spiralis и Е. granulosus эпитопов, а также с болезнями печени. Известно, что некоторые из них (цирроз и др.) провоцируют подобные реакции на антигены самых различных возбудителей.

Ложноотрицательные реакции также возможны в более ранние сроки после заражения (обычно до 30-и дней) или при зоологическом трихинеллезе.

Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФР при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном. Для оценки диагностической эффективности обоих тестов при трихинеллезе с экскреторно-секреторным антигеном использовали сыворотки, полученные с мясокомбинатов от убойных свиней из благополучных и неблагополучных по трихинеллезу районов Российской Федерации и Украины с учётом данных ветсанэкспертизы, а также сыворотки от естественной и экспериментально зараженных другими гельминтами животных.

В производственных испытаниях исследовали 354 сыворотки. В их число вошли 12 сывороток от свиней с инвазией Т. spiralis: 6 - с экспериментальной (З0-150-й день после заражения) и 6 - с естественной (г. Вологда). Диагноз подтверждён перевариванием проб мышц в искусственном желудочном соке. Других тканевых гельминтов весанэкспертизой не обнаружено. Сыворотки от клинически здоровых свиней в количестве 322 пробы получены с мясокомбинатов из разных районов РФ и Украины и по данным ветсанэкспертизы свободных от трихинелл и других тканевых гельминтов; 20 сывороток получили от свиней, свободных от трихинелл, но по данным ветсанэкспертизы имеющих гетерологичную гельминтную инвазию, в том числе: 5 - естественно инвазированы С. tenuicollis; 2 - O.dentatum; 6 - Е. granulosus; 7 - экспериментально инвазированы Е. granulosus. Сыворотки от свиней с естественным цистицеркозом тенуикольным и эхинококкозом получили с мясокомбинатов, а 2 сыворотки от свиней с естественным эзофагостомозом были взяты во время подворного убоя.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Сыворотки от свиней как естественно, так и экспериментально инвазированных трихинеллами в обеих реакциях дали положительный ответ. Сыворотки от свиней с гетерологичными инвазиями С. tenuicollis, О. dentatum дали отрицательный ответ.

Все неспецифические положительные и сомнительные результаты относили к ложноположительным. Ложноположительные ответы дали в каждой реакции по 9 сывороток, из которых: 2 - естественный эхинококкоз, 1 - экспериментальный эхинококкоз, 6 - от клинически здоровых свиней.

Следовательно, ложноположительные результаты зарегистрированы в 2,54% случаев. Специфичность в дот-ИФА и ИФР была в пределах 97,46%. Чувствительность составила в обоих тестах 100%.

Таким образом, на основании проведённых сравнительных исследований и полученных данных нами установлено, что по диагностической эффективности дот-ИФА равноценна используемой в настоящее время для диагностики трихинеллёза свиней ИФР. Но в то же время, дот-ИФА более проста в постановке и лучше приспособлена для работы в полевых условиях и малооснащенных лабораториях, так как не требует электрооборудования.

Исходя, из выше сказанного, нами сделано заключение, что дот-ИФА может использоваться наряду с ИФР для дифференциальной диагностики трихинеллеза свиней и массовых сероэпизоотологических исследований в широкой практике.

Диагностическая эффективность ИФР с соматическим фракционированным и экскреторно-секреторным антигенами

Диагностический статус животного Количество животных Результаты ИФР

СФ антиген ЭС антиген

положи-тельный отрицательный чувсг-ви-тель- ность % специфичность % поло-жи-тель-ный отрицательный чувст-ви-тель- ность % специфичность %

Т. spiralis Экспериментально * б 6 - 100,0 - 6 - 100,0 -

Т. spiralis Естественно 7 7 - 100,0 - 7 - 100,0 -

Е. granulosus Экспериментально 7 2 5 - 71,4 2 5 - 71,4

Е. granulosus Естественно 6 2 4 - 66,6 1 5 - 83,3

С. tenuicollis Естественно 5 - 5 - 100,0 - 5 - 100,0

О. dentatum Естественно 2 - 2 - 100,0 - 2 - 100,0

Клинически здоровые свиньи** 90 - 90 - 100,0 - 90 - 100,0

Итого 123 17 106 100,0 96,75 16 107 100,0 97,56

♦ Сыворотки крови получили через 30 дней и более после заражения ** По данным ветсанэкспертизы без тканевых гельминтов

Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФР с экскреторно-секреторным антигеном при трихинеллезе свиней.

Диагностический статус животного Количество животных дот-ИФА ИФР

поло-жи-тель-ный отрицатель-ный ложно поло-жи-тель-ный Чувст-ви-тель- ность % специфичность % поло-жи-тель-ный Отри-Ца-Тель-Ный ложно поло-жи-тель-ный чувст-ви-тель- ность % специфичность %

Т. spiralis Экспериментально * 6 б - - 100,0 6 - 100,0

Т. spiralis Естественно б 6 - - 100,0 б - • 100,0

Е. granulosus Экспериментально 7 - 6 1 85,71 - б 1 85,71

Е. granulosus Естественно б - 4 2 66,67 - 4 2 66,67

С. tenuicollis Естественно 5 - 5 0 100,0 - 5 0 100,0

О. dentatum Естественно 2 - 2 0 100,0 - 2 0 100,0

Клинически Здоровые свиньи** 322 - 316 6 98,14 - 316 6 98,14

Итого 354 12 333 9 100,0 97,46 12 333 9 100,0 97,46

* Сыворотки крови получили через 30 дней и более после заражения ** По данным ветсанэкспертизы без тканевых гельминтов

выводы.

1. (Сработана методика получения экскреторно-секреторного антигена из инвазионных личинок Trichinella spiralis культивированием в искусственной питательной среде ДМЕМ для проведения иммунологических исследований.

2. Модифицирована методика получения соматического фракционированного антигена из инвазионных личинок Т. spiralis, обладающего лучшими диагностическими свойствами.

3. Электрофорезом в полиакриламидном геле в белковом спектре соматического фракционированного антигена трихинелл выявлено 17 полос, пять из которых, расположенных в диапазоне белков молекулярной массы 31-68 кДа, являются мажорными; белковый спектр экскреторно-секреторного антигена включает 18 компонентов, из которых мажорным является один, проявляющийся в зоне белков молекулярной массы 44 кДа.

4. Разработана тест-система дот-ИФА и проведена отработка параметров и режима постановки ИФР при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном.

5. Изучена динамика синтеза антител при экспериментальном трихинеллезе свиней, зараженных разными дозами личинок Т. spiralis, в ИФР и дот-ИФА. Показатели уровня антител у инвазированных животных свидетельствуют об их индивидуальной иммунной реактивности.

6. Установлена сопоставимость результатов в динамике антител по срокам появления регистрируемых уровней, по величине титров и периодам их максимальных значений в ИФР и дот-ИФА.

7. Установлена корреляция средних значений логарифмов титров антител в обеих группах свиней, экспериментально инвазированных Т. spiralis, с дозой заражения и средней по группе интенсивностью инвазии.

8. Определена диагностическая эффективность ИФР при трихинеллезе свиней в сравнительном аспекте с соматическим фракционированным и

экскреторно-секреторным антигеном. Чувствительность реакции с обоими антигенами составила 100%, специфичность 96,75% и 97,56% соответственно.

9. Проведен сравнительный анализ диагностической эффективности иммуноферментной реакции и дот-ИФА при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном. Установлена сопоставимость результатов по чувствительности и специфичности сравниваемых тестов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

По разработанной нами реакции дот-ИФА при трихинеллезе свиней подготовлены и утверждены Департаментом. ветеринарии Минсельхоза России Технические условия и Временное наставление по ее применению (30.03.04, №13-5-02/0978).

Материалы исследованний по ИФР вошли в Технические условия и Временное наставление по использованию этой реакции в диагностике трихинеллена свиней, также утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России (30.03.04, №13-5-02/0977).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бережко В. К., Белозеров С. Н., Шеховцов Н. В., Написанова Л. А. , Успенский А В. Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции при трихинеллезе свиней //Матер. 5-й Всес. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных, Новочеркасск.- М., 1988.- С.21-22.

2. Шеховцов Н. В., Бережко В. К., Написанова Л. А. Сравнительная эффективность РНИФ и ИФР' в диагностике трихинеллеза' свиней //Ветеринария - 1989- №12 - С.39-41.

3. Бережко В. К., Написанова Л. А., Успенский А В, Шеховцов Н. В. Сравнительные испытания наборов на основе иммуноферментной реакции

для прижизненной диагностики трихинеллеза //Матер, докл. 7-й науч. конф. по трихинеллезу человека и животных.- М., 1996.- С.7-10.

4. Написанова Л. A. ELISA и dot-ELISA в динамике экспериментального трихинеллеза свиней //Матер, докл. 7-й науч. конф. по трихинеллезу человека и животных.- М., 1996- С.48-49.

5. Написанова Л. А., Бессонов А. С. Эффективность антигенов реакции типа EUSA при трихинеллезе свиней //Ветеринария.-1999.- №3, - С.27-ЗО.

6. Написанова Л. А., Бессонов А С. Динамика титров антител в ELISA и dot-ELISA при экспериментальном трихинеллезе свиней //Ветеринария-1996.-№11.-С.26-28.

7. Написанова Л. А., Сивкова Т. Н., Бережко В.К. Использование dot-ELISA в диагностике гельминтозов //Тр. Всерос. ин-та гельминтол.- 2002,-Т.38.-С.206-221.

8. Написанова Л. А, Вирбалене Р. Диагностическая эффективность антигенов трихинелл, производимых в России //Вет. коне- 2003.- №18.-С.9

9. Belozyorov S.N., Shekhovtsov N. V., Napisanova L. A. Use of fractionated antigens in immunoferment reactions for diagnostics of trichinellosis in pigs //7-th Int conf. of Trichinellosis.- Alicante (Spain).-1988.-P.77.

10. Napisanova I* A., Bessonov A. S. Dynamics of ELISA and dot-ELISA titres in experimental trichinellosis of pigs //Abstr. of World Vet. Congr. -Yokogama (Japan).-1995- P.239.

11. Napisanova L. A., Bessonov A. S. Efficacy of excretory-secretory (ES) and fractionated antigens in immunofermentatine reaction of ELISA type of trichinellosis of swine //Abstr. of the DC Int. Congr. of Parazitol - 1998 - 47-P.365

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1 -00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 12.05.04 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,5 Печать авторефератов (095) 730-47-74, 778-45-60 (сотовый)

»-933 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Написанова, Людмила Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Антигены трихинелл и их характеристика.

1.2. Диагностика трихинеллеза иммуноферментным методом.

1.3. Дот-ИФА в диагностике гельминтозов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Материалы.

2.1.2. Методы исследований. а) Получение личинок Trichinella spiralis, приготовление соматического экстракта. б) Получение соматического фракционированного антигена трихинелл. в) Получение экскреторно-секреторного антигена трихинелл. г) Физико-химическая характеристика соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов трихинелл. д) Постановка и учет иммуноферментной реакции при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном. е) Разработка дот-ИФА при трихинеллезе свиней. ж) Изучение динамики антител при экспериментальном трихинеллезе свиней в ИФР и дот-ИФА. з) Диагностическая эффективность ИФР при трихинеллезе свиней с соматическим фракционированным и экскреторно-секреторным антигенами. и) Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФР при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном в производственных условиях. к) Статистическая обработка результатов.

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Анализ данных по получению соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов Trichinella spiralis.

2.2.2. Анализ данных по физико-химической характеристике соматического фракционированого и экскреторно-секреторного антигенов трихинелл.

2.2.3. Результаты исследований по постановке и учету иммуноферментной реакции при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном.

2.2.4. Результаты исследований по разработке дот-ИФА при трихинеллезе свиней.

2.2.5. Анализ данных по динамике антител при экспериментальном трихинеллезе свиней в ИФР и дот-ИФА.

2.2.6. Диагностическая эффективность ИФР при трихинеллезе свиней с соматическим фракционированным и экскреторно-секреторными антигенами.

2.2.7. Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФР при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Диагностическая эффективность иммуноферментных тест-систем (ИФР и дот-ИФА) при трихинеллезе свиней"

Предусмотренные- существующими инструкциями мероприятия по борьбе с трихинеллезом не обеспечивают надежной профилактики этого гельминтоза у сельскохозяйственных животных. Свинина и изделия из нее продолжают оставаться основными источниками возбудителя заболевания людей. Причиной этого является недостаточная эффективность посмертных прямых методов диагностики, используемых на мясокомбинатах и убойных пунктах, не гарантирующих полную выявляемость всех зараженных животных. Так, наиболее широко применяемая в своем классическом варианте методика компрессорной трихинеллоскопии по К^Бтап (1908), основанная на исследовании 24 срезов ножек диафрагмы, позволяет выявлять инвазию с интенсивностью свыше 1-2 личинок на 1г мышц. Между тем, слабое заражение встречается гораздо чаще, чем умеренное и сильное. Помимо этого, метод плохо поддается механизации, малопроизводителен, крайне утомителен и достаточно дорог (требует привлечения большого штата трихинеллоскопистов).

Групповое исследование мышц методом переваривания в искусственном желудочном соке (ИЖС) значительно превосходит по диагностической эффективности компрессорную трихинеллоскопию, особенно с позиций главной задачи экспертизы - предупреждения опасного для здоровья людей заражения трихинеллами, так как успешно выявляет жизнеспособные личинки. Однако, при высоких скоростях убоя и переработки свинины, которые обычно имеются на больших мясоперерабатывающих предприятиях, применение его становится затруднительным (Р.С. Ье1£Ь1у, 1983). Кроме того, он неэффективен в случае гибели личинок, что значительно снижает его ценность (особенно для решения некоторых вопросов эпизоотологии и эпидемиологии).

Для повышения результативности профилактических противотрихинеллезных мероприятий, в первую очередь следует разрабатывать надежные и недорогие методы прижизненной диагностики трихинеллеза свиней, что позволило бы предупреждать затраты на содержание больных животных и решать другие проблемы научно-исследовательского характера, а именно выявлять неблагополучные хозяйства и подворья при эпизоотологических обследованиях, уточнять некоторые вопросы эпизоотологии и эпидемиологии трихинеллеза, пути и факторы передачи, экстенсивность инвазии.

Цели и задачи исследования. Основной целью наших исследований было: разработать иммуноферментную тест-систему дот-ИФА и сравнить диагностическую эффективность ИФР и дот-ИФА при трихинеллезе свиней.

Для выполнения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

2. Изучить динамику выработки антител у экспериментально зараженных разными дозами Trichinella. spiralis свиней в ИФР.

3. Провести фракционирование соматического экстракта личинок трихинелл и выделить наиболее эффективную диагностическую фракцию.

6. Отработать параметры постановки иммуноферментной тест-системы дот-ИФА.

7. Оценить диагностические качества фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов.

8. Провести производственные испытания ИФА и дот-ИФА при трихинеллезе свиней

Научная новизна. Впервые в России разработана экономичная по времени и перспективная для полевых испытаний иммуноферментная тест-система дот-ИФА (типа dot-ELISA) при трихинеллезе свиней. Изучена сравнительная динамика выработки антител у свиней, экспериментально зараженных разными дозами личинок трихинелл; проведено фракционирование экстракта Т. spiralis и определена наиболее активная и специфичная фракция; получен экскреторно-секреторный антиген личинок Т. spiralis культивированием в искусственной питательной среде. Проведена сравнительная оценка диагностической эффективности фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов при трихинеллезе свиней; определена молекулярная масса диагностически эффективных фракций в антигенах, полученных из личинок Т. spiralis.

Практическая ценность работы. По материалам диссертации разработаны «Временное наставление по применению набора для диагностики трихинеллеза свиней методом дот-ИФ А» и ТУ на «Набор для диагностики трихинеллеза свиней методом дот-ИФ А», а также «Временное наставление по применению набора для диагностики трихинеллеза свиней иммуноферментным методом (ИФА)» и ТУ на «Набор для диагностики трихинеллеза свиней иммуноферментным методом (ИФА)». Документы утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30.03.04 г. (№13-5-02/0978, №13-5-02/0977).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:

• Международном Ветеринарном Конгрессе, 3-9 сентября, 1995 год, Йокогама (Япония).

• 7-й Научной конференции по трихинеллезу человека и животных, 2-3 октября, 1996 год, Москва (Россия).

• 8-й Всероссийской конференции по трихинеллезу, 30-31 мая, 2000 год, Москва (Россия).

• Научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», 2003 год, Москва (Россия).

• Заседаниях Ученого совета ВИГИС (1996-2003).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Приготовление соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигена из личинок Т. spiralis.

3. Разработка диагностической тест-системы дот-ИФА при трихинеллезе свиней.

4. Изучение динамики выработки антител при экспериментальном трихинеллезе свиней.

6. Сравнительные испытания ИФР и дот-ИФА при трихинеллезе свиней в производственных условиях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 статей.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 130 страницах машинописного текста. Состоят из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список литературы включает 223 источника, в том числе 53 отечественных и 170 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 5 таблицами, 16 рисунками.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Написанова, Людмила Александровна

4. ВЫВОДЫ

1. Отработана методика получения экскреторно-секреторного антигена из инвазионных личинок Trichinella spiralis культивированием в искусственной питательной среде ДМЕМ для проведения иммунологических исследований.

3. Электрофорезом в полиакриламидном геле в белковом спектре соматического фракционированного * антигена трихинелл выявлено 17 полос, пять из которых, расположенных в диапазоне белков молекулярной массы 31-68 кДа, являются мажорными; белковый спектр экскреторно-секреторного антигена включает 18 компонентов, из которых мажорным является один, проявляющийся в зоне белков молекулярной массы 44 кДа.

8. Определена диагностическая эффективность ИФР при трихинеллезе свиней в сравнительном аспекте с соматическим фракционированным и экскреторно-секреторным антигеном. Чувствительность реакции с обоими антигенами составила 100%, специфичность 96,75% и 97,56% соответственно.

9. Проведен сравнительный анализ диагностической эффективности иммуноферментной реакции и дот-ИФА при трихинеллезе свиней с экскреторно-Секреторным антигеном. Установлена сопоставимость результатов по чувствительности и специфичности сравниваемых тестов.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

По разработанной нами реакции дот-ИФА при трихинеллезе свиней подготовлены и утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза России Технические условия и Временное наставление по ее применению (30.03.04, №13-5-02/0978).

Материалы исследованний по ИФР вошли в Технические условия и Временные наставления по использованию этой реакции в диагностике трихинеллена свиней, также утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России (30.03.04, №13-5-02/0977).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Написанова, Людмила Александровна, Москва

1. Бекеш О.-Я.Л., Рачковская И.В. Аллергическая реакция при экспериментальном трихинеллезе тучных клеток брызжеки крыс //Матер, науч. исслед. членов Всес. об-ва гельминтол,- М.- 1972.- Вып.24.- С. 15-18.

2. Белозеров С.Н. Эффективность реакции непрямой иммунофлуоресценции при экспериментальном трихинеллезе свиней //Бюл. ВИГИС.- М.- 1973.-Вып.Ю.- С. 11-15.

3. Белозеров С.Н. Применение непрямой реакции иммунофлуоресценции для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней //Матер, докл. 2-й Всес. конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных.- Вильнюс.-1976.-С. 175-178.

4. Белозеров С.Н. Иммунологическая диагностика гельминтозов //Автореф. дис. док. вет. наук,- М.-1990.- 44с.

5. Белозеров С.Н., Бессонов A.C. Применение реакции иммунофлуоресценции для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней в производственных условиях //Бюл. ВИГИС.- М.- 1974.- Вып. 12.-С. 175-179.

6. Белозеров С.Н., Гуданавичус Т.И. Реакция энзимом меченных антител для диагностики трихинеллеза //Ветеринария.-1982.- №11.- С.41-44.

7. Белозеров С.Н., Жданова О.Б. Прижизненная диагностика трихинеллеза песцов с помощью иммуноферментной реакции //Ветеринария.- 2000.- №2.-С.34-36.

8. Белозеров С.Н., Шеховцов Н.В. Реакция иммунофлуоресценции для диагностики трихинеллеза //Ветеринария.-1978.- №2.- С.61-64.

9. Бережко В.К. Видоспецифические антигены гельминтов и иммуноферментная реакция в диагностике гельминтозов //Тр. ВИГИС.-1988.-Т.29.-С.8-22.

10. Бережко В.К., Белозеров С.Н., Шеховцов Н.В., НаписановаЛ.А., Успенский A.B. Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции при трихинеллезе свиней //Матер. 5-й Всес. конф. по пробл. человека и животных, Новочеркасск,- 1988.- С.21-22.

11. Бессонов A.C. К вопросу об аллергической диагностике трихинеллеза свиней //Тр. ВИГИС.- 1962.- Т.9.- С. 196-209.

12. Бессонов A.C. Изучение реакции латекс-агглютинации для диагностики трихинеллеза свиней //Вопросы очаговости болезни.- Алма-Ата.- 1966.-С.23-25.

13. Бессонов A.C. Сравнительная диагностическая эффективность внутрикожной аллергической реакции, биопсии, трихинеллоскопии ножек диафрагмы при трихинеллезе свиней //Тематический сборник работ по гельминтол. с/х животных,- М.-1967.- №13.- С. 165-174.

14. Бессонов A.C. Эпизоотология и диагностика трихинеллеза свиней //Животноводство и ветеринария.- М:Колос.- 1968.- С.325-337.

15. Бессонов A.C. Эпизоотология (эпидемиология), диагностика и профилактика трихинеллеза (монографический анализ и собственные исследования) //Автореф. дис. док. вет. наук.- М.- 1970.

16. Бессонов A.C. Диагностика трихинеллеза //Вильнюс:Минтис.- 1975.-380с.

17. Бессонов A.C. Иммунитет и иммунодиагностика трихинеллеза //Трихинеллез.- М.:Колос.- 1976.- С. 162-237.

18. Бессонов A.C., Успенский A.B. Прижизненная диагностика трихинеллеза песцов в звероводческом хозяйстве //Бюл. ВИГИС.- 1971.-Вып.75.- С.5-9.

19. Бессонов A.C., Успенский A.B. Методика постановки и учета реакции кольцепреципитации в капилляре для прижизненной диагностики трихинеллеза песцов //Бюл. ВИГИС.- 1977.- Вып. 19.- С.9.

20. Гаркави Б.Л. Реакция кольцепреципитации при трихинеллезе свиней (РКП) //Ветеринария.-1971.- №7.- С.69-70.

21. Ефремов Е.Е. Реакция на ензим белязаните антителя в серодиагностиката на трихинеллозата //5 нац. конф. на младите спец. Варна.-1977.- С.132-133.

22. Ефремов Е.Е., Ермолин Г.А. Иммуноферментный метод обнаружения антител кантигенам декапсулированных личинок трихинелл //В кн.:Морфофункциональные закономерности неспецифических защитных реакций организма.- М.-1980.- С. 112-116.

23. Жданова О.Б. Диагностическая эффективность ИФА при трихинеллезе песцов //Матер, докл. 7-й Науч. конф. по трихинеллезу человека и жмвотных.- М.- 1996.- С.27-28.

24. Жданова О.Б. Иммунологическая диагностика трихинеллеза песцов //Дис. канд. вет. наук.- Киров,- 1997.- 154с.

25. Калюс В.А. Трихинеллез (трихиноз) человека //Автореф. дис. док. мед. наук.- М.-1947.- 41с.

26. Костецкий А.Ф., Васерин Ю.И. Сравнительная характеристика чувствительности и специфичности РНГА с культуральным и коммерческим трихинеллезными антигенами //Матер. 5-й Всес. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных.- М.- 1988.- С.90-91

27. Лейкина Е.С. Сероэпидемиологические исследования пригельминтозах //Мед. паразитол. и паразитар. болезни.-1989.- №2.- С.3-8.

28. Лейкина Е.С., Мартыненко В.Б., Зорихина В.И. и др. Формула коррекции показателей сероэпидемиологического обследования населения на эхинококкозы //Мед. паразитол. и паразитар. болезни.- 1984.- №1.- С. 1719.

29. Лейкина Е.С., Полякова О.И. Упрощенный метод иммунодиагностики гельминтов. I Реакция агглютинации при диагностике экспериментального аскаридоза и трихинеллеза животных //Мед. паразитол и паразитар. болезни.- 1956.- Вып.25(2).- С.131-136.

30. Лукашенко Н.П. Прижизненная диагностика трихинеллеза свиней методами аллергической (внутрикожной) и серологических реакций //Дисс. на соиск. уч. ст. канд. вет. наук.- М.- 1956.- 21с.

31. Лукашенко Н.П. Изучение прижизненной диагностики трихинеллеза свиней методами аллергических и серологических реакций //Ветеринария.-1957.-№2,- С.31-32.

32. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития //М.:Наука.- 1991.- 288С.

33. Озерецковская H.H. Иммунологические и иммунопатологические реакции в клинике и патогенезе трихинеллеза //Тр. 1 Моск. мед. ин-та.-1967.- Т.48.- С. 179-194.

34. Пашук В.П. Экспериментальные данные к применению иммунологических реакций в диагностике трихинеллеза //Здравоохранение Белоруссии.- 1956.- Вып.З.- С.42-45.

35. Пашук В.П. Опыт серологической дтагностики трихинеллеза у свиней //Матер. ВОГ.- 1965.- Ч.4.- С.191-195.

36. Пашук В.П. Трихинелльные антигены и серодиагностика трихинеллеза //Вет. наука -пр-ву.- 1984.- Вып.22.- С.199-206.

37. Пашук В.П. Реакция непрямой иммунофлуоресценции и непрямой гемагглютинации в диагностике трихинеллеза человека и вопросы персистенции трихинелл //Матер. 4-й ; Всес. конф. по пробл. человека и животных.- Ереван.-1985.- С.107-110.

38. Полетаева О.Г., Красовская H.H., Глаголева В.А. Характеристика иммуноферментной тест-системы с антигенами трихинелл //Мед. паразитол. и паразитар. болезни.- 1986.- №3.- С.51-56.

39. Полетаева О.Г., Нгуен Суан Тхао, Красовская H.H. Оценка эффективности серологических реакций при трихинеллезе //Матер, докл. науч. конф. Гельминтозы — меры борьбы и профилактика.- М.- 1994.- С. 121123.

40. Полетаева О.Г., Угликова М., Хюбнер И., Красовская H.H. Эффективность двух тест-систем иммуноферментного анализа в диагностике трихинеллеза человека //Мед. паразитол. и паразитар. болезни.-1990.- №4.- С.43-45.

41. Сакалаускайте Ю.А. Иммунный ответ хозяина на паразитирование трихинелл и его изменение под воздействием мебендазола. Сообщение 1//Мед. паразитол. и паразитар. болезни.- 1978.- №5.- С.24-29.

42. Сапунов О.Я. Эффективность реакции кольцепреципитации (РКП) при диагностике трихинеллеза свиней //Бюл. ВИГИС.- 1986.- Вып.43.- С.83.

43. Степанов A.B. Динамика преципитинов в сыворотке крови и лейкоцитарная формула у лабораторных животных при экспериментальном трихинеллезе //Сб науч. тр. Моск. вет. акад.- 1975.- Т.79(2).- С. 13-14.

44. Субботин Н.Ф. Эффективность иммунологических реакций в диагностике трихинеллеза //Ветеринирия.- №2.- С.66-68.

45. Тараканов В.И. Методика приготовления искусственной питательной среды для культивирования трихинелл //Матер. 2-й Всес. конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных, Вильнюс.-1976.- С.209.

46. Тараканов В.И. Методические приемы и принципы культивирования гельминтов в искусственных питательных средах //Тр. ВИГИС.- 1985.-№28.- С.109-116.

47. Твердохлебова Т.И., Васерин Ю.И., Нагорный С.А., Попов М.А. Разработка технологии получения диагностикума трихинеллезного антигенного эритроцитарного сухого для РИГА //Метер. докл. науч. конф,-М.- 2001.- С.268-270.

48. Успенский А.В. Изучение реакции латексагглютинации для прижизненной диагностики трихинеллеза животных //Бюл. ВИГИС.- М.-1971.- Вып.5.- С. 127-130.

49. Успенский А.В. Сравнительная диагностическая эффективность агглютинационных реакций при трихинеллезе //Автореф. дис. канд. вет. наук.- М.- 1972.- 27с.

50. Успенский А.В., Назарова Н.С., Нечиненный А.Д., Певнева В.Д. Реакция кольцепреципитации в капилляре (РКПК) для прижизненной диагностики трихинеллеза песцов //Бюл. ВИГИС.- М.- 1975.- Вып.16.- С.80-81.

51. Шеховцов Н.В., Бережко В,К., Написанова JI.A. Сравнительная эффективность РНИФ и ИФР в диагностике трихинеллеза свиней //Ветеринария.-1989.- №12.- С.39-41.

52. Allan J.C., Mencos F., Garsia-Noval J., Sarti E., Flisser A., Wang Y., Liu D., Craig P.S. Dipstick dot-ELISA for the detection of Taenia coproantigens in humans //Parasitology.-1993.- V.107.- P.79-85.

53. Arriaga C., Yepez-Mulia L., Morilla A., Ortega-Pierres G. Detection of circulating Trichinella spiralis muscle larva antigens in serum samples ofexperimentally and naturally infected swine //Vet. Parasitol.- 1995.- V.58(4).-P.319-326.

54. Armas-Serra C., Gimenez-Pardo C., Bernadina W.E., Rodriguez-Caabeiro F. Antibody response to a protease secreted by Trichinella spiralis muscle larvae //Parasitol. Res.-1995.- V.81(6).- P.540-542.

55. Avrameas S., Guilbert B. Dosade enzymo-immunoglogique de proteines a l'aide d'immunosorbants d'antigenes marques aux enzymes //S.R. Acad, Sci., Ser.D.- 1971.- V.273.- P.2705-2715.

56. Berntzen A.K. Efects of environment on the growth and development of Trichinella spiralis in vitro //Proceedings of the 3-d Inter. Conf. on Trichinellosis. New York.- 1974.- P.25-30.

57. Bloomfield N., Snook G.W. Use of slide-latex test for detecting trichinosis in hogs //Cornell Veterinarian.-1962.- V.52(4).- P.569-581.

58. Boctor F.N., Farid Z. El-Scherif N. Using whole bacteria, LPS, and soluble antigens to detect IgG, IgM, IgA in human brucellosis by dot-ELISA with nitrocellulose as a solid phase //Clin. Chemistry.-1987.- V.33.- P.1570-1571.

59. Choy W.E., Lin P.L., Ng M.H. A comparison of immunological methods for the detection of Trichinella spiralis antigen //J. Immunol. Meth.- 1988.-V.113(l).- P.17-24.

60. Choy W.E., Lin P.L. A rapid method for detecting Trichinella spiralis larvae in pork using a monoclonal AT-latex conjugate //Vet. Parasitol.- 1989.- V.32(4).-P.301-310.

61. Chroust K. Sensibility of indirect fluorescent method with living Trichinella spiralis larvae //Wiad. Parasitol.-1970.- V.16(l).- P.12-15.

62. Chroust K., Dubansky V. Fluorescent-antibody studies on muscle larvae Trichinella spiralis (Owen,1835), II the indirect fluorescent-antibody method //Acta Univ. Agric. Fac. Vet.- 1967.- V.36(2).- P.299-306.

63. Chroust K., Mittermayer T. Indirect fluorescent antibody test in diagnosis of trichinellosis in man //Acta Vet. Brno.-1983.- V.52(3-4).- P.177-181.

64. Clinard E. Evaluation of soluble-antigen fluorescent antibody test for antibodies to Trichinella spiralis in experimentally infected swine //Amer. J. Vet. Res.- 1975.- V. 36(5).- P.615-618.

65. Daryl O.M., Benjamin L. An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of platelet antibodies using detergent-solubilized platelets immobilized on nitrocellulose discs //J. Immunol: Meth.-1987.- V.I05.- P.63-70.

66. Derer M.M., Miescher S., Johansson H. Application of the dot immunobinding assay to allergy diagnosis //J. Allergy Clin. Immunol.- 1984.-V.74.- P.85-92.

67. Diaconu S., Militaru D., Vior E., Sarca M. Kinetics Trichinella antibodies defected by ELISA, the ELITRICH kit, in experimentally infected pigs //Studies and Researches in Vet.Ved.- 1995.- V.3.- P.77-79.

68. Draelants E., Hofkens E., Harding E., Brandt J., Geerts S. Development of a dot-enzyme immunoassay for the detection of circulating antigen in cattle infected with Taenia saginata cysticerci //Res. Vet. Sci.- 1995.- V. 58(1).- P.99-100.

69. Durham R.J., Isenstein R.S., Despommier D.D., Robinson B.J., Mattingly J.A. The use of an ELISA for detection of antibody to Trichinella spiralis in porcine serum of blood //Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol.- 1987.- P276.

70. Durham R.J., Isenstein R.S., Despommier D.D., Mattingly J . A. Development of an ELISA for detection of antibody to Trichinella spiralis in porcine serum //Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol.-1986.- P.277.

71. Dzebenski Т.Н., Bitkowska E., Plonka W. Detection of a circulating parasitic antigen in acute infections with Trichinella spiralis: diagnostic significance of finding //Zentralblatt fur Bakteriologie.-1994.- V.281(4).- P.519-525.

72. Engvall E., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quatitative assay of immunoglobulin G by means of enzymelabelled antigen and antibody-coated tubes //Biochim., Biophys. Acta.-1971.- V.271.- P.427-435.

73. Faubert O.M., Viens P., Magluilo P. Superiority of the ELISA technique over parasitological methods for detection of trichinellosis in slaughtered pigs in Canada //Can. I. Cong. Med.- 1985.- V.49(l).- P.75-78.

74. Franci C., Ingles J. et al. Further studies on the ELISA-spot technique. Its applications to particulate antigens and potential improvement in sensitivity //J. Immunol. Meth.-1986.- V.88.- P.225-232.

75. Frydas S.I., Alexakis A.E., van Knapen F. Prevalence of IgG antibodies to Trichinella spiralis in dogs in Macedonia, northern Greece /Net. Parasitol.-1995.- V.59(l).- P.81-85.

76. Furuya K., Nero S. et al. Adsorption of influenza viruses to nitrocellulose membrane filters by filtration and their quantitative densitomatric determination //J. Virol. Meth.-1984.- V.- P.191-199.

77. Gamble H.R., Anderson W.R., Graham C.E., Murrell K.D. Diagnosis of swine trichinosis by enzyme-linked immunosorbent (ELISA) using an excretory-secretory antigen //Vet. Parasitol.- 1983.- V.13(4).- P.349-361.

78. Gamble H.R., Graham C.E. Comparison of monoclonal antibody-based competedv and indirect enzyme-linked immunosorbent assays for the diagnosis of swine trichinosis //Vet. Immunol. Immunopathol.- 1984.- V.6(3-4).- P.379-389.

79. Gamble H.R., Murrell K.D. Conservatin of diagnostic antigen epitopes among biologically diverse isolates of Trichinella spiralis //J. Parasitol.- 1986. V.72(6).- P.921-925.

80. Gamble H.R., Rapic. D., Marinculic. A., Murrell K.D. Evaluation on excretory-secretory antigens for the serodiagnosis of swine trichinellosis //Vet. Parasitol.- 1988.- V.30(2).- P.131-137.

81. Gancarz Z. Metody immunologiczne w diagnostyce wlosnicy u ludzi i zvierzat //Med. dosw. i microbiol.-1968.- V.20(2).- P.213-218.

82. Giannini S.H. Induction and detection of leishmanial infections in Rattus norvegicus //Trans. Roy. Trop. Med. Hyg.- 1985.- V.79.- P.458-461.

83. Gore R.W., Sadun E.H. A soluble antigen fluorescent antibody (SAFA) test for the immunodiagnosis of trichinellosis in man and experimental animals //II Int. Conf. of Trichinellosis. Wroclaw.- 1969.- P.153-154.

84. Haralambidis S.T., Fridas S.J., Himonas C.A. Latex agglutination test for detecting Trichinella spiralis infections in pigs using muscle extract //Vet. Parasitol.- 1989.- V.34(3).- P.191-201.

85. Hardman E., Jarvis H.M. Nitrocellulose-based assays for the detection of glucolipids and other antigens: mechanism of binding to nitrocellulose //J. Immunol. Meth.-1985.- V.33.- P.113-123.

86. Hassan M.M., Seleem M.A., Eterwa S.E. Humoral and cellular immune responses in experimental trichinosis //J. Egypt. Soc. Parasitol.- 1994.- V.24(2).-P.363-370.

87. Hawkes R., Niday E., Gordan J.A. A dot immunobinding assay for monoclonal and other antibodies. //Analyt. Biochem.-1982.- V.119.- P.142-147.

88. Ibhu B., Lesia B., Sumana B. Detection of IgE binding to same airborne pollen and fungal allergens using dot immunoassay //J. E. Mitchell Sci. Soc.-1988.- V.103- P.77-79.

89. Isenstein R.S. Testing of swine for trichinellosis in the US //4-th Int. Conf. on Trichinellosis Abstr. of Papers.- 1976.- V.82

90. Isenstein R.S., Marks H.M., Webert D.W., Judkins J.C., Parker C.M., Despommier D.D. Development of an enzyme immunoassay for surveillance of trichinellosis in swine //6-th Int. Conf. on Trichinellosis. Trichinellosis Proceedings.- 1985.- P.240-245.

91. Isenstein R.S., Webert D.W., Leightg J.C., Zimmermann W.J., Singh P., Oliver D.G., Jang L. Development of an industrial immunoassay for trichinellosis //7-th Int. Conf. on Trichinellosis Prog, and Abstr.- 1988.- №.62.

92. Ivanoska D., Sofrinic L., Movsesijan M., Cuperlovic K., Murrell K.D., Gamble H.R. Detection of Trichinella spiralis antigens //Period. Biol.- 1986.-V.88(l).- P.243-245.

93. Ivo dos Santos J., Galvao-Castro B. et al. Dot enzyme immunoassay. A simple, cheap and stable test for antibody to human immunodeficiency virus (HIV) //J. Immunol. Meth.-1987.- V.99.- P.191-194.

94. Jacob H.P., Eckert J., Jemmi T., Gottstein B. Trichinellosis in slaughtered and wild animals in Switzerland using a digestion method and a serologic method (ES-ELISA). //Schweiz Arch. Tierheilkd.- 1994.- V.136(9).- P.298-308.

95. Jiang H.J., Yang L.X., Pang S.H., Sun T., Xie S.P., Meng J.M., Wen G.Z., Wang G.Z. Dot-ELISA in the diagnosis of neurocysticercosis // Chung Kuo Chi Sheng Chung Hsueh Yu Chi Sheng Chug Ping Tsa Chin.- 1990.- V.8(3).- P.207-209.

96. Jol-Van der Zijde C.M., Labadie J. et al. Dot immunobinding assay as an accurate and versatile technique for the quantification of human IgG subclasses //J. Immunol. Meth.- 1988.- V.108.- P.195-203.

97. Kagan I.G. Standardization and quality control of immunodiagnostic methods //Behring Inst. Mitt.-1982.- V.71.- P.10-22.

98. Kagan I.G. Serodiagnosis of trichinosis //Immunol. Parasit. Infect.- 1976.-P.143-151.

99. Kampelmacher E.H., Streefkerk E.W. Experiments with a latex-slide test for the serodiagnosis of trichinosis //Wiad. Parazytol.- 1965.- V.ll(4).- P.317-326.

100. Kimball S.R., Rannels S.L. et al. Quantitation of proteins by dot immunobinding assay. A comparison of visualization methods using eukariotic initiation factor 2 and a monospecific antibody. //J. Immunol. Meth.- 1988.-V.106.- P.217-223.

101. Knapen van F., Franchimont J.H., Ruitenberg E.J., Andre P., Baldelli B., Gibson T.E., Henriksen S.A. et al. Comparison of three methods for detection of prolonged experimental Trichinellosis in pigs //Vet. Parasitol.- 1984a.- V.16(l-2).- P.167-171.

102. Korinkova K., Kovafcik H., Pavlicova Z., Koldela B. Detection of Trichinella infections in experimentally inoculated goat kids by ELISA //Helminthologia.- 2003.- V.40(3).- P. 179.

103. Kozar Z., Kozar M. Indirect fluorescent antibody test in diagnosis on trichinellosis //Wiad. Parazytol.- 1970.- V.16(l).- P.7-13.

104. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature.-1970.- V.227.- P.680-685.

105. Layne E. Spectrophotometry; and turbidometric methods for measuring proteins //Methods Enzymol.-1957.- V.3.- P.447-454.

106. Lazarovits G., Zutra D., Bar-Joseph M. Enzyme-linked immunosorbent assay on nitrocellulose membranes (dot-ELISA) in the serodiagnosis of plant pathogenic bacteria //Canad. J. Microbiol.- 1987.- V.33.- P.98-103.

107. Leek M.L. van der, Dame J.B., Littel R.C. Minimizing ELISA background in the diagnosis of swine trichinellosis //J. Parasitol.-1982.- V.78(5).- P.822-829.

108. Lefroit-Joliy M., Neven T. Description and comparison of three in vitro methods for the detection of guined pig MHC antigen. //J. Immunol. Meth.-1986.- V.89.- P.141-148.

109. Leighty F.C. Regulatory action to control Trichinella spiralis //Food. Tehnol.-1983.- V.37(3).- P.95-97.

110. Lin T.M., Halbert S.P. Rapid dot enzyme immunoassay for the detection of antibodies to cytomegalovirus //J. Clin. Microbiol.- 1986.- V.24.- P.7-11.

111. Liu Y.S., Du W.P., Wu Z.X. Dot-immunogold-silver staining in the diagnosis of cysticercosis //Int. J. Parasitol.- 1996.- V.26(l).- P.127-129.

112. Londner M.V., Revel A. et al. Dot-ELISA a potential immunoassay of Plasmodium falciparum antibodies //Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg.- 1988.-V.82.- P.686-688.

113. Lupasco G., Hacig A., Solomon P. at al. Etude sur la dynamique des anticorps dans la trichinellose experimentale pas méthode de rimmunofluorescence //Arch. roum. pathol. exp. et microbiol.- 1968.- V.27(3).-P.611-618.

114. Magat W.J., Jeâka E.L. A sérodiagnostic antigen for trichinellosis //Acta parasitol polon.-1976.- V.24(ll-19).- P.191-198.

115. Mazzola V. New trichinosis test first step to fradication //Agricult. Res.-1984.- V.32(10).- P.10.

116. McVie A., Ersfeld K., Rogan M.T, Craig P.S. Expression and immunological characterisation of Echinococcus granulosus recombinant antigen

117. B for IgG4 subclass detection in human cystic echinococcosis //Acta Trop.-1997- V.67(l-2).- P.19-35.

118. Mearus G., Richmond S.J., Storey C.C. Sensitive immune dot blot test for diagnosis of Chlamidia trachomatis infection //J. Clin. Microbiol.- 1988.- V.26.-P.1810-1813.

119. Melcher L.R. An antigenic analysis of Trichinella spiralis //J. Infect. Dis.-1943.- V.73(l).- P.31-39.

120. Molinaro G.A., Eby W.C., Reimer C.A. A monoclonal antibody may show cross reactivities in Ouchterlony assay but not in other assays //J. Immunol. Meth.-1987.- V.96.- P.219-222.

121. Morlow S.J., Handa A.K. Immuno spot-blot using a membrane which covalently binds protein //J. Immunol. Meth.- 1987.- V.101.- P. 133-139.

122. Murrell K.D., Vannier W.E., Ahmed A. Antigenic heterogenity of excretions and secretions //Exp. Parasitol.- 1984.- V.36.- P.316-330.

123. Navarrete J., Reina D., Habela M., Serrano F. Standardization of the ELISA test for the serodiagnosis of Trichinella in pigs //Progr. and Abstr. of the 5-th Europ Multicolloq. of Parasitol.- 1988.- F.10-13.

124. Navarrete J., Serrano F., Habela M., Reina D. Cross-reaction between Trichinella antigens and other parasites of pigs in endemic area of Trichinellosis //Progr. and Abstr. of the 5-th Europ Multicolloq. of Parasitol.- 1988.- F.10-12.

125. Navarrete J., Serrano F., Reina D., Albarran-Gomez E., Habela M., Nieto C.G. Standardization of the enzyme-linked immunosorbent assay in the detection of swine trichinellosis //7-th Int. Conf. on Trichinellosis Progr. and Abstr.- 1988.-№68.

126. Norman L., Sadun E.H., Redding R.W., Cooperider O.E. Flocculation test in sera from hogs experimentally and naturally infected with Trichinella spiralis //J. Parasitol.-1955.- V.41(2).- P.162-166.

127. Ortega-Pierres M.G., Salinas-Tobon M.R., Morilla A., Gallego C., Arriaga C. Use of purified surface stichosomal antigens of Trichinella spiralis muscle larvae in the detection of naturally infected swine //Cull. Soc. fr Parasitol.-1990.-V.8(2).- P.54.

128. Pappas M.G. Recent applications of dot-ELISA immunoparasitology //Vet. Parasitology.-1988.- V.29.- P.105-129.

129. Pappas M.G., Ballou W.R., Gray M.R., Takafuji E.T., Miller R.N., Hockmeyer W.T. Rapid diagnosis of leptospirosis using the IgM specific dot-ELISA: comparison with the microscopic agglutination test //Am. J: Trop. Med. Hyg.- 1985.- V.34.- P.346-354.

130. Pappas M.G., Hajkowski R., Hockmeyer W.T. Dot enzyme-linked immunosorbent assay (dot-ELISA): a micro method for the rapid diagnosis of visceral leishmaniasis //J. Immunol. Meth.- 1983.- V.64.- P.205-214.

131. Pappas M.G., Lunde M.N., Hajkowski R:, McMahon J. Determination of IgM and IgG antibodies to toxoplasma using the IFA test, ELISA and dot-ELISA procedures //Vet. Parasitol.- 1986.- V.20.- P.31-42.

132. Pappas M.G., Schantz P.M., Cannon L.T.Sr., Wahlquist S.P. Dot-ELISA for the rapid serodiagnosis of human hydatid disease //Diag. Immunol.- 1986.- V.4.-P.271-276.

133. Parkhouse R.M.E., Ortega-Pierres G. Stage-specific antigens of Trichinella spiralis //Parasitology.- 1988.- V.88(4).- P.623-630.

134. Patel J.D., Joseph J.M., Falkler W.A. Direct detection of Chlamidia trachomatis in clinical speciamens by a dot immunobinding technique using monoclonal antibody //J. Immunol. Meth.- 1988.- V.108.- P.279-287.

135. Phillip M., Parkhouse R.M.E., Ogilvie B.M. Molecular basis for stage specificity of the primary antibody responses to the surface of T. spiralis //5-th Int. Conf. on Trichinellosis. Trichinellosis Proc. Readbooks.- 1980.- P.59-63.

136. Prichard D.I. Antigen production by encysted muscle larvae of Trichinella spiralis //J. Helminthol.-1985.- V.59(l).- P.71-77.

137. Prosad S., Thraves P. et al. A dot-blot method for screening polyclonal and monoclonal antisera to poly (ADP-ribose). //J.Immunol. Meth.- 1989.- V.116.-P.79-85.

138. Rapic D. Immunoenzimski test (ELISA) u dijagnostici eksperimentalne i prirodne trichineloze svinja //Acta Parasitol. Jugosl.-1980.- V.l 1(1-2).- P.49-57.

139. Rapic D., Dzakula N., Matic-Piantanida D. Evaluation of different antigens in seroepizootiological survey of trichinellosis by enzyme-linked immunosorbent assay //Vet. Parasitol.-1986.- V.21(4).- P.285-289.

140. Rapic D., Dzakula N., Zukovic M. A study of the cross reaction between trichinellosis and metastrongylosis in pigs trichinellosis by enzyme-linked immonosorbent assay (ELISA) //Vet. arhiv.-1981.- V.51(5).- P.223-227.

141. Rapic D., Stojilkovic D., Marinkulic A. Influence of cultivation time of Trichinella spiralis muscle larvae on antigenic properties of excretory/secretory products. //6-th Int. Congr. of Parasitol. Progr. and Abstr. Handbook.- 1986.-№536,1L.

142. Reina D., Munoz-Ojegda M.C., Serrano F., Molina J.M., Navarrete I. Experimental trichinellosis in goats //Vet.Parazitol.- 1996.- V.62(l-2).- P.125-132.

143. Reissmann E. Kann die Trichinenschau ohne sanitaren Nachteil bescharankt und verbilligt werden //Fleisch-u Milchhyg.- 1908.- V.19(l).- P.l-9.

144. Rickard LG. Development and application of dot-ELISA testforthe detection of serum antibodies to Fasciola hepatica antigens in lamas //Vet. Parasitol.-1995.-V. 58(l-2).-P. 9-15

145. Rivera Marrero C.A., Santiago N., Hillyer G.V. Evaluation of immunodiagnostic antigens in the excretory-secretory products of Fasciola hepatica //J.Parasitol.- 1998.- V.74(4).- P.646-652.

146. Rogan M.T., Craig P.S., Zeyhle E., Roming T., Lubano G.M., Deshan L. Evaluation of rapid dot-ELISA us a field test for the diagnosis of cystic hydatid disease. //Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg.-1991.- V.85 (6).- P.773-777.

147. Romia S.A., Youssef M.E., Handoussa A.E., Rizk H.M., Sallam S.M. Dot-ELISA as a diagnostic test in hydatid disease. //J. Egypt. Soc. Parasitol.- 1992.-V.22(3).- P.603-610.

148. Roop R.M., Preston-Moore D. et al. Rapid identification of smooth Brucella species with a monoclonal antibody. //J. Clin. Microbiol.- 1987.- V.25.- P.2090-2093.

149. Rozeik C., Schulz-Harder B. The competitive antigen spot test (CAST). A rapid and simple means of quantitatively screening antisera. //J. Immunol. Meth.-1986.- V.91.- P.91-97.

150. Ruitenberg E.J., Van Knapen F. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) as a diagnostic method for T.spiralis in pigs //Vet. Paraziol.- 1973.-V.3(4).- P.317-326.

151. Ruitenberg E.J., van Knapen F., Vermeulen C.J. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in Trichinella spiralis infections in pigs //Proc. of the 4-th Int.Conf on Trichinellosis (1976).- Poznan.- 1978.- P.487-489.

152. Ruitenberg E.J., Streerenberg P.A., Brosi B.J.M., Buys J. Serodiagnosis of Trichinella spiralis infections in pigs by enzyme-linked immunosorbent assay //Bull. Wld HLTH 1974.- V.51(l).- P108-109.

153. Rutenberg E.J., Steerenberg P.A., Brosi B.J.M., Buys J. Reliability of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the serodiagnosis of Trichinella spiralis infections in conventionally raised pigs //J. Immunol Method.-1976.- V.10(l).- P.67-83.

154. Sakamoto T. Development and behavior of adult and larval Trichinella spiralis cultured in vitro //Mem.Fac.Agr. Kagoshima Univ.- 1979.- V.15(24).-P.107-114.

155. Scholtens R.G., Kagan I.G., Quist K.D., Norman L.G. An evaluation of test for the diagnosis of trichinosis in swine and associated quantitative epidemiologic observations //Amer. J. Epidemiol.- 1966.- V.83(3).- P.489-500.

156. Seawight G.L., Bartlett M.L, Sanders W.M. Automated enzyme immunoassay for detecting Trichinella spiralis antibody in swine //Abstr. 79-th Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol.- 1979.- P.314.

157. Smith H.J. Evalution of the ELISA for the serological diagnosis of trichinosis in Canadian swine //Can. J. Vet. Res.- 1987.- V.51(2).- P.194-197.

158. Smith H.J. Comparison of pepsin-digestion and enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of trichinosis in swine //CanJ.Vet. Res.-1988.- V.52(l).- P.63-66.

159. Smith H.J., Snowdon K.E. Detection of Trichinella spiralis nativa antibodies in porcine sera by ELISA using T.spiralis spiralis excretory-secretory antigen ? //Can. J. Vet. Res.- 1987.- V.51(3).- P.413-414.

160. Smith H.J., Snowdon K.E. Experimental Trichinella infections in ponies //Can. J. Vet. Res.- 1987.- V.51(3).- P.415-416.

161. Smith H.J., Snowdan K.E., Bishop L.J. Prevalence of trichinosis in Canadian swine determined serologically by enzyme-linked immunosorbent assay //Can. J. Vet. Res.-1988.- V.52(3).- P.392-393.

162. Stay M., Wahl R., Beierwaltes W.H. Dot-based ELISA and RIA: two rapid assay that screen hybridoma supernatants against whole live cells //J.Immunol. Meth.-1984.- V.73.- P.75-81.

163. Steinmetz H.T., Pfreundschuh M.G. Production of monoclonal antibodies againts glucose oxidase,. alcaline phosphatase and peroxidase. //J. Immunol. Meth.-1987.- V.101.- P.251-259.

164. Strobel H. Die Serodiagnostik der Trichinosis //Munch, med. Wochennschr.-1911.- V.58.- P.672.

165. Su X.Z., Prestwood A.K. A dot-ELISA mimicry western blot test for the detection of swine trichinellosis //J. Parasitol.-1991.- V.77 (1).- P.76-82.

166. Sulzer A.J., Chisholm E.S. Comparison of the IFAA and other test for Trichinella spiralis antibodies //Publ. Health. Rep.-1966.- V.81(8).- P.729-734.

167. Taylor S.M., Kilpatrick D., Kenny J. The influense of age and husbandry of pigs on evaluatin of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for Trichinella spiralis infection //Zbe. Veterinarmed.-1978.- V.25(4).- P.482-489.

168. Tellez-Giron E., Ramas M.C., Alvarez P., Dufour L.,Montante M. Detection and characterization of antigens from Taenia solium cysticercus in cerebrospinal fluid//Acta Leiden.-1989.- V.57(2).- P.101-105.

169. Thomas E.H., Bozicevich J., Hoyem H.M. Flocculation reactions in rabbits experimentally infected with Trihinella spiralis //J. Infect. Diseuses.- 1953.-V.92(l).- P.89-96.

170. Tondon A., Murthy P.K. et al. Dot-ELISA for diagnosis of limphatic filariasis //Indian J. Med.- 1988.- V.87.- P.429-433.

171. Tong W.D., Guo S.J., Sun L.G. Studies on the rapid diagnosis of the cysticercosis, trichinosis and toxoplasmosis using trace blod dot-ELISA //Int. Conf. On Parasitic Zoonoses, Sept. 20-24.- 1994.- P.138.

172. Towbin H., Gordon L. Immunoblotting and dot immunobinding-current status and outlook //J. Immunol. Meth.- 984.-V.72.- P.313-340.

173. Uhlikova M., Hubner J. Comparison of the ELISA reaction with four other methods for the detection of Trichinella spiralis infection //6-ht Int. Helm. Symp.-High Tatras.- Prog. And Abstr.-1991.- P.133.

174. Vertosich F.T., Kelly R.H. Antibodies to native and denatured DNA. Quantitation using on immuno slot-blot technique // J.Immunol. Meth.- 1987.-V.102.- P.15-21.

175. Vior E., Popesku., Vior C., Fromunda V., Oproiu V., Tetu M. Aplicarea testilui imunoenzimatic (ELISA) in trichineloza experimentala //Rev. crest, anim.- 1980.- V.30(10).- P18-22.

176. Vishawapoka U., Hemachudha T. et al. Detection of rabies antigen in canine parotid glands by dot-blot technique //Lancet.-1988.- V.I.- P.881.

177. Vullo V., Contini C. et al. Evalyation of dot immunobinding assay (DIB) for the detection of antibodies against Brucella melitensis //J. Immunol. Immunopharmacol.- 1987.- V.7.- P.147-150.

178. Whelen A.C., George J.E., Osburn R.L., Wikel S.K. Dot-ELISA for examine serologic responses of Bos taurus and Bos indicus to ixodid tick infestation //Fed. Proc.- 1984.- V.43.- P.1628.

179. Wilozynski M., MikulskiZ., Gancarz Z. Immunobiologic methods in the diagnosis of trichinellosis in pigs and laboratory animals //2-d Int. Conf. on Trichinellosis. Abstr of Papers.- 1969.- P.169-170.

180. Yan X.X., Xu X.F., Ma Y.X. Changes in T lymphocytes and their subpopulations and IgG in peripheral blood from mice infected with Trichinella spiralis //Chung Kuo Chi Sheng Chung Hsueh Yu Chi Sheng Chug Ping Tsa Chin.- 1992.- V.10(l).- P.62-65.

181. Yang S.M. A preliminary study on the use of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of Trichinella spiralis infections in dogs //Vet. Parasitol.- 1989.- V.31(2).- P.165-171.

182. Yao C., Prestwood A.K., McGraw R.A. Trichinella spiralis (Tl) and Trichinella (T5): a comparison using animal infectivity and molecular biology techniques //J. Parasitol.-1997.- V.83(l).- P.88-95.

183. Yepez-Muila L., Ortega-Pierres M.G. Current aspects of trichinosis diagnosis. //Rev. Latinoam. Microbiol.-1994.- V.36(2).- P.127-138.

184. Zalis M., Jaffe C.L. Routine dot-blot assay of multiple serum samples using a simple apparatus //J. Immunol. Meth.- 1987.- V.101.- P.261-264.

185. Zapart W., Slusarski W. Attempts to employ hom-made latex particles in the serodiagnosis of trichinellosis in experimental animals //Acta parazitol polon.-1972.- V.10.- P.29.

186. Zhang Y.W., Lee D.L., Smith J.E. Biochemical haracterisation of Trichinellaspiralis and Trichinella pseudospiralis stihocyti antigens //Appl. Parasitol.- 1993.- V.34(4).- P.291-294.

187. Zhu X.Q., Dou L.Q., Shi X.H., Shi L., Niu B.H. Analisis of excretory-secretory and soluble antigens of Trichinella spiralis muscle larvae by electrophoresis //Acta Vet. at Zootech. Sin.- 1995.- V.26(2).- P.168-173.

188. Zimmerman G.L., Nelson M.J., Clark C.R.B. Diagnosis of ovine fascioliasis by a dot enzyme-linked immunosorbent assay: a rapid microdiagnostic technique //Am. J. Vet.Res.-1985.- V.46.- P.1513-1515.

Информация о работе

Написанова, Людмила Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.19

Диссертация

Диагностическая эффективность иммуноферментных тест-систем (ИФР и дот-ИФА) при трихинеллезе свиней - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы