Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тест-система для диагностики трихинеллеза свиней иммуноферментной реакцией с антигеном, очищенным моноклональными антителами

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козлова, Галина Александровна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕЛЬМИНТОЛОГИИ имени академика К.И. Скрябина

На правах рукописи

Козлова Галина Александровна

ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТРИХИНЕЛЛЕЗА СВИНЕЙ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ РЕАКЦИЕЙ С АНТИГЕНОМ, ОЧИЩЕННЫМ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ

Специальность 03.00.19 паразитология, гельминтология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук профессор Бенедиктов И.И.

МОСКВА - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ................................................4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................9

2.1. Антигены в диагностике трихинеллеза......................... 13

2.2. Методы иммунологической диагностики трихинеллеза.......... 17

2.3. Внутрикожная аллергическая проба.......................... 17

2.4. Реакция кольцепреципитации................................ 19

2.5. Реакции агглютинации......................................21

2.6. Реакция непрямой гемагглютинации.......................... 21

2.7. Реакция латекс-агглютинации................................22

2.8. Реакция связывания комплемента............................ 24

2.9. Реакции иммунофлуоресценции..............................26

2.10. Иммуноферментная реакция (ИФА).......................... 28

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ............................33

3.1. Материалы и методы.......................................33

3.1.1. Культивирование гибридом................................34

3.1.2. Криоконсервирование клеток............................................................37

3.1.3. Восстановление клеточной культуры после хранения в глубокозамороженном состоянии....................................................38

3.1.4. Определение качества клеточных линий........................................42

3.1.5. Спектрофотометрическое определение концентрации белков ... 44

3.1.6. Приготовление антигенов из личинок трихинелл..........................45

3.1.6.1. Получение культуры личинок трихинелл................................45

3.1.6.2. Приготовление цельного экстракта личинок трихинелл............46

3.1.6.3. Фракционирование экстракта личинок Т.spiralis......................46

3.1.6.4. Очистка антигена с помощью моноклональных антител..........47

3.1.7. Отработка технологических условий создания тест-системы ... 47

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ........................50

3.2.1. Влияние криоконсервирования на биологическую активность

клеточной культуры.......................................50

3.2.2. Технологические параметры тест-системы...................52

3.2.3. Изучение сравнительной диагностической эффективности антигенов в иммуноферментной реакции.....................70

3.2.4. Динамика иммунного ответа при экспериментальном заражении свиней личинками Т. spiralis......................78

3.2.5. Динамика выделения антител при экспериментальном заражении свиней личинками T.pseudospiralis................ 81

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................... 85

5. ВЫВОДЫ.................................................88

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ...........................90

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................91

8. ПРИЛОЖЕНИЯ

119

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Широкое распространение ряда опасных гельминтозоонозов, таких как трихинеллез, эхинококкозы, цистицеркозы и др. свидетельствуют о недостаточно высоком уровне ветеринарно-санитарных мероприятий при этих заболеваниях и необходимости разработки и внедрения средств и методов борьбы, обеспечивающих их надежную профилактику и, соответственно, защиту населения в отношении этих инвазий.

Данная проблема становится особенно значимой в условиях современной реорганизации сельскохозяйственного производства, формирования животноводческих хозяйств различных форм собственности, с широким спектром технологии выращивания животных и слабой кормовой базой.

На этом фоне, особенно последние годы, четко просматривается тенденция в увеличении экстенсинвазированности сельскохозяйственных животных, в частности, свиней трихинеллезом, и соответственно уровень заражения этим гельминтозом населения.

Комплекс противотрихинеллезных мероприятий широко применявшихся в предыдущие годы, как правило, базировался на решении ветеринарных и медико-санитарных вопросов - трихинеллоскопическом контроле туш и мясопродуктов, дератизации, наведении санитарного порядка на территориях ферм и населенных пунктов, борьбе с бродячими животными.

Анализ современной эпизоотической и эпидемической ситуаций по трихинеллезу и перспектив развития агропромышленного комплекса в России свидетельствуют о необходимости коррекции системы мер борьбы с трихинеллезом и интеграции в нее новых приоритетных направлений.

В этом плане наиболее важное значение имеет внедрение современных иммунологических методов прижизненной диагностики с использованием высокочувствительных и высокоспецифичных антигенов.

В связи с этим Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации и Министерством здравоохранения РФ утвержден ряд важных нормативно-технических документов, указывающих на роль прижизненной диагностики трихинеллеза в системе мер борьбы с этой инвазией (Инструкция о мероприятиях по предупреждению и ликвидации заболеваний животных гельмин-тозами, Москва, 1999; Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации - Санитарные правила и нормы Сан ПиН 3.2 569-96; Методические указания по лабораторной диагностике трихинеллеза животных, 1998, N13-7-2 1428 и др.).

Таким образом включение в комплекс мер борьбы с трихинеллезом иммунологической диагностики позволяет оперативно решать вопросы массового сероэпизоотического обследования и выявления больных животных, определять в целом иммунологическую структуру в отношении трихинеллеза у животных на уровне фермы, или конкретной группы, уточнять результаты противотрихинеллезных мероприятий, а при снятии ограничений с неблагополучного по трихинеллезу хозяйства ведущее значение имеют результаты иммунологических обследований свиней.

Подчеркивая роль прижизненной диагностики в борьбе с трихинеллезом необходимо выделить значение таких критериев, как специфичность и чувствительность теста, технологичность постановки, уровень сложности оценки результатов, т.е. показателей, определяющих в целом диагностическую эффективность теста.

Анализ лабораторных и производственных испытаний некоторых иммунологических реакций, выполненных в нашей стране и за рубежом (Коновалова J1.M. с соавт., 1977; Полетаева О.Г. с соавт., 1986; Лейкина Е.С.,1980; Бессонов А.С.,1975; Takanashi Y. et al.,1990; Gamble

Н.Я.Д983,1984,1986; БеБропитег а1.Д970) свидетельствует о сложности иммунохимической структуры антигенов трихинелл и, определенных затруднениях в создании эффективных диагностических средств. Таким образом поиск перспективных методов очистки антигенов, их испытание и выявление наиболее специфических компонентов позволяют оптимизировать разработку эффективных тест-систем.

Цель и задачи исследования. Учитывая актуальность проблемы, цель работы заключалась в разработке тест-системы для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней на основе иммуноферментной реакции с использованием антигена, очищенного с помощью моноклональ-ных антител.

В соответствии с этим определены следующие задачи исследований:

1. Получить препаративные количества моноклональных антител для очистки трихинеллезного антигена.

2. Оптимизировать методику постановки и учета иммунофермент-

»-» I* II

ной реакции с моноклональным антигеном.

3. Провести сравнительные диагностические испытания опытного (очищенного моноклональными антителами) и коммерческого (фракционированного) антигенов в экспериментальных и производственных условиях.

4. Изучить в сравнительном аспекте динамику иммунного ответа при трихинеллезе, вызванном экспериментальным заражением свиней личинками Т.БркаНз и Т.рБеисЬзркаШ.

5. Освоить тест-систему для диагностики трихинеллеза свиней на основе ИФА с использованием антигена, очищенного с помощью моноклональных антител и разработать технологический регламент на его получение.

Научная новизна.

1. Испытана тест-система для прижизненной диагностики трихинеллеза с использованием антигена, очищенного с помощью мо-ноклональных антител, на сыворотках экспериментально и спонтанно зараженных животных.

2. Определена специфичность и чувствительность тест-системы в сравнении с коммерческим набором компонентов для иммуно-ферментной диагностики трихинеллеза свиней.

3. Изучена в сравнительном аспекте динамика иммунного ответа у животных зараженных Т. spiralis и T.pseudospiralis с использованием очищенного моноклональными антителами антигена.

4. Дана комплексная оценка тест-системы с "моноклональным" антигеном.

Практическая ценность работы.

На основании выполненных исследований отработаны технология получения "моноклонального" антигена и тест-система для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней.

Созданы необходимые условия для опытного производства наборов этого диагностикума и разработан технологический регламент на получение антигена, очищенного моноклональными антителами.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены:

1. На 7-й научной конференции по трихинеллезу человека и животных (1996 г.)

2. На 5-й Всероссийской научной конференции "Актуальные вопросы медицинской паразитологии" (1998 г.)

3. На Всероссийской научной конференции "Взаимоотношения паразита и хозяина" (1998 г.)

4. На заседаниях Ученого совета ВИГИС (1993 - 1999 гг.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в которых отражены основные направления и результаты исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список использованной литературы, содержащего 79 отечественных и 111 иностранных источников, приложения. Работа иллюстрирована 10 фотографиями, 9 рисунками и 3 таблицами.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Оценка диагностической эффективности тест-системы с антигеном, очищенным с помощью моноклональных антител.

2. Результаты сравнительных испытаний очищенного монокло-нальными антителами и фракционированного антигенов в иммунофер-ментной реакции на сыворотках экспериментально и спонтанно зараженных трихинеллами свиней.

3. Обоснование перспектив применения разработанной тест-системы для иммунологической диагностики трихинеллеза.

4. Особенности динамики иммунного ответа у свиней, зараженных T.spiralis и T.pseudospiralis.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Социально-экономическое значение проблемы трихинеллеза, сложность организации эффективных мер борьбы с этой инвазией, требуют выполнения широкого комплекса исследований, связанных с эпизоотологией (эпидемиологией), биологией паразита, клининическими проявлениями, патогенезом, совершенствованием противотрихинеллезных мероприятий. Этим аспектам данной проблемы уделяется большое внимание учеными и практическими специалистами как в России, так и за рубежом.

Согласно опубликованным данным /А.С.Бессонов, 1985,1988/ в конце 70-х, начале 80-х годов в бывшем СССР наблюдалась стойкая стабилизация по трихинеллезу свиней (1-5 зараженных туш на 1 млн исследованных) и снижение заболеваемости людей. В течение 1983-1987 гдов из-за частичной реорганизации сельского хозяйства (создание небольших подсобных и арендных ферм, неупорядоченность содержания и кормления свиней) эпизоотическая ситуация по трихинеллезу ухудшилась. Эта тенденция прослеживается и в последние годы в связи с переходом к рыночной экономике, разрешению свободной торговли мясом вне рынков и магазинов и реорганизацией крупных коллективных ферм в мелкие частные с неустоявшейся технологией, недостаточным обеспечением кормами и низкой ветеринарно-санитарной культурой /Бессонов A.C., 1994/.

По данным департамента ветеринарии Минсельхозпрода Российской Федерации в 1989 году на каждые 100 тысяч свиней диагностировали 1,9 случая трихинеллеза, в 1990 году - 2,0 , в 1991 году - 2,6 , в 1992 году - 4,0 и в 1993 году 5,3 случая, что в 2,7 раза чаще, чем в 1989 году.

В последующем, на каждые 100 тыс. экспертиз трихинеллез регистрировался в 1994 году в 6,2; в 1995 - в 6,7 и в 1996 - в 7,3 случаях, т.е. в целом рост за 5 лет составляет 45,4% на 100 тыс. исследований.

Распространение трихинеллеза животных не могло не сказаться на увеличении числа заболевания людей. В 1993 году по сравнению с 1991 годом число зарегистрированных случаев трихинеллеза человека возросло в 3,8 раза, причем 33% из них приходится на 22 территории, в которых трихинеллез животных официально не установлен /Понтюшенко Н.Т., Богомолова Е.Е., 1994/.

Анализ эпидемической ситуации по трихинеллезу за последние годы указывает на выраженную тенденцию к увеличению числа больных. Так в расчете на 100 тыс. населения пораженность людей трихинеллезом в 1992 году составляла 0,45 человек, в 1993 году - 0,42 , в 1994 - 0,71 , в 1995 -0,74 6 т.е. рост заболеваемости за 5 лет составил 55,6% /А.С.Довгалев, 1998/.

Таким образом, анализ уровня неблагополучия по данной инвазии в структуре субъектов Российской Федерации указывает, что на территории страны сформировался ряд регионов и областей стационарно-неблагополучных по этому гельминтозу. К ним относятся: СевероКавказский регион, включая Ростовскую область, Краснодарский край, Ставропольский край, Северную Осетию; Северо - Западный регион -Мурманская, Вологодская, Ленинградская, Калининградская области; Восточный регион - Хабаровский край, Приморский край, Камчатская область; и Центральный регион - Московская, Смоленская, Псковская области. Регистрируются очаги трихинеллеза и в других сопредельных территориях. Так за последние 3 года заболевания свиней отмечались в 21-ом из 31-ого субъекта федерации, где только в 1997 году из 6 млн. обследованных животных было выявлено 836 пораженных туш.

На период относительной стабилизациии эпизоотической ситуации по трихинеллезу (1997-1998 гг.) заболевание регистрировалось на убойных пунктах хозяйств и организаций в 12, а по данным мясоперерабатывающих предприятий и рынков в 10 и 14 субъектах РФ соответственно.

Сложная ситуация по трихинеллезу сохраняется и в некоторых странах СНГ и дальнего зарубежья - США, Польше, Югославии, Румынии, Китае, Украине, Белоруссии, странах Балтийского региона.

По данным Национального союза американских фермеров-свиноводов за 1989 год ликвидация трихинеллеза свиней в США позволила бы увеличить доходы фермеров на 449 млн. долларов в год. В этом случае экспорт свинины возрос бы на 1/3, а спрос на нее в США увеличился бы на 2%. /Бессонов А.С. 1988/.

В Париже в декабре 1993 года зарегистрирована новая вспышка трихинеллеза, возникшая после употребления людьми сырой конины. В течение 7 недель выявлено 538 случаев зболевания в 9 очагах / Batteli J. et al., 1993; Ancelle Т. et al.,1994/.

Регулярно проводившиеся международные и всесоюзные конференции по трихинеллезу свидетельствуют о пристальном внимании специалистов к разработке приоритетных направлений по данной проблеме, связанных с вопросами таксономии и биологическими особенностями трихинелл, выделенных из различных источников инвазии; эпидемиология и эпизоотология; разработка и совершенствование средств диагностики, лечения и профилактики /Бессонов А.С., 1975,1985,1988,1994; Бритов В.А., 1982,1987; Березанцев Ю.А., 1986; Полетаева О.Г. 1986, Бекиш О. Я-Л. 1984, 1988; Гаркави Б.Л. 1987; van Khapen F. et al. 1984; Seawright G.L. et al. 1984; Chan et al. 1988; Candolfi et al. 1988/.

Вместе с этим, многие вопросы остаются недостаточно изученными. Диагностика трихинеллеза животных (особенно свиней) - это первый и решающий этап в системе мероприятий, направленных на искоренение данного гельминтоза. Своевременное выявление зараженных свиней, пушных клеточных зверей и некоторых промысловых животных (медведя, кабана и др.) является гарантией предупреждения вспышек

заболевания среди населения и является важным фактором обеспечения санитарного качества пищевых продуктов.

Существует несколько методов установления диагноза трихинеллеза. Наибольшего внимания заслуживают методы прижизненной диагностики, поскольку в случае раннего выявления гельминтоза можно недопустить распространения инвазии через мясные отходы убоя свиней, тушки пушных клеточных зверей и диких животных, а также предупредить затраты на содержание и кормление зараженных животных /Бессонов A.C. 1975/.

Прижизненная диагностика трихинеллеза с разной вероятностью установления точного диагноза может осуществляться по клиническим признакам болезни в сочетанием с данными анамнеза /Березанцев Ю.А. 1974; Озерецковская H.H. 1968; Озерецковская H.H., Переверзева Э.В. 1976, 1977; Озерецковская с соавт. 1975, 1976; Железникова В.В. 1976; Kociecka W, wan Khapen F. 1978/, при исследовании крови и цереброспинальной жидкости на обнаружение мигрирующих личинок трихинелл /Бессонов A.C. 1975/, а также путем прижизненного трихинеллоскопического исследования биопсированных мышц /Бессонов A.C. 1975, Березанцев Ю.А. 1974/, однако при слабой интенсивности инвазии (менее 1 личинки в 1 г), трихинеллы выявляются этими метод