Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунологическая диагностика трихинеллеза песцов

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Иммунологическая диагностика трихинеллеза песцов"

^ л. * #

о

N

^ На правах рукописи

Жданова Ольга Борисовна

Иммунологическая диагностика трихинеллёза песцов

03.00.19 - паразитология, гельминтология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

Киров- 1997

Работа выполнена в Вятской государственной сельскохозяйственной академии и во Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени академика К.И. СКРЯБИНА (ВИГИС)

Научный руководитель -доктор ветеринарных наук A.B. Успенский

Научный консультант -

доктор ветеринарных наук, профессор С.Н. Белозёров Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.К. Бережко (ВИГИС); кандидат ветеринарных наук П. И. Щелчков (ВГСХА)

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт охотничьего хозяйства и звероводства им. Б.М. Житкова (ВНИИОЗ)

Защита диссертации состоится " 24 " июня 1997 г., в 14 час. на заседании Диссертационного совета К 120.50.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Вятской государственной сельскохозяйственной академии по адресу: 610017 г. Киров, Октябрьский пр-т, 133.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Вятской государственной сельскохозяйственной академии

Автореферат разослан 20 мая 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного .¿>.

совета, кандидат биологических наук H.H. Шулепова

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Среди паразитарных заболеваний человека и животных важнейшее социальное и экономическое значение имеют антропозоогельминтозы, а среди последних трихинеллез. Диагностика трихинеллеза является чрезвычайно важной проблемой ветеринарии и медицины. Известно, что источником заражения трихинеллами человека является мясо животных, инвазированных личинками трихинелл. Поэтому высокоэффективная, точная и быстрая диагностика трихинеллеза у животных, организация ветеринарных и медико-санитарных мероприятий должны быть направлены на надежную профилактику этого заболевания у населения. Предусмотренные существующей инструкцией мероприятия по борьбе с трихинеллезом не обеспечивают надежной профилактики этого заболевания среди свиней и клеточных пушных зверей, которые до недавнего времени вообще не рассматривались, как источник трихинеллезной инвазии. Однако, в настоящее время в связи с недостаточной обеспеченностью хозяйств кониной, рыбной мукой и другими традиционными кормами, кормовой баланс зверосовхозов претерпел серьезные изменения: во многих хозяйствах стали использоваться продукты морского промысла и мясо пушных зверей, убитых в этом же хозяйстве. В результате во многих зверохозяйствах страны у клеточных пушных зверей регистрируется трихинеллез (Н.И. Овсюкова, 1966; В.Е. Симаков, В.А. Бритов, 1972,1981; A.B. Успенский; Н.С. Назарова и др., 1975; Е.В.Сороченкова, 1976; С.Бизюлявичус, А.Бураускас, И.Кайрюштис, И.Сангайла, 1976; В.А. Фигурнов, М.Г. Василининин, В.Г. Соложенкин, 1981; М.Г. Василининин 1985)

В 1979 г. отмечено заражение свыше 15 тысяч свиней трихинеллезом в совхозе "Красногвардеец". Расследование показало, что источником заражения животных послужил мясной фарш из тушек пушных зверей, убитых в Баканском зверосовхозе Краснодарского края ( Б.Л. Гаркави, А.Я. Сапунов, В.Я Меньшенин, 1981). На свинокомплексе колхоза им. Ленина Кировоградской области отмечалось заражение свиней трихинеллезом, предположительно, первоисточником заражения свиней явились тушки пушных клеточных зверей со зверофермы, расположенной в санитарной зоне комплекса (A.B. Успенский , Н.В. Шеховцов, 1992). Имеются многочисленные сообщения о распространении трихинеллеза среди плотоядных Германии (Schoop, Lamina, 1962 ; Trommer, 1970 и др.), Польши (Kosar, Warda, 1960), Словакии ( Mituch, 1957, 1964 ), Финляндии (Rislakki, 1956), Норвегии (Lamina, 1961). В Польше 70-75%

случаев обнаружения Т. spiralis у свиней так или иначе связаны со скармливанием тушек пушных зверей ( Ramisz et al., 1988). В Норвегии также отмечены случаи заболевания свиней, а кроме того, и людей, источником которых было мясо со звероводческих ферм (Hauge, 1969).

Комплекс противотрихинеллезных ветеринарно-санитарных мероприятий в звероводческих хозяйствах, как правило основывается на обеспечении надежной термической обработки свиных субпродуктов и проведении общих санитарных и дератизационных мероприятий. Однако, опыт показывает, что данная система мероприятий не всегда обеспечивает надежную профилактику трихинеллеза. В связи с этим изыскание эффективных мер борьбы с этой инвазией имеет важное социально-экономическое значение.

Цели и задачи исследований. Цель исследований - изыскание новых высокоэффективных методов иммунодиагностики трихинеллеза песцов. Испытание наиболее перспективных вариантов иммуноферментной реакции ( ПФР) в лабораторных условиях на экспериментально и спонтанно зараженных животных с целью изучения чувствительности и специфичности испытуемого теста и внедрения его в ветеринарную практику для выяснения эпизоотической ситуации по трихинеллезу у пушных клеточных зверей. В качестве основного метода исследования разработана и испытана ПФР с фракционированным антигеном, проведено сравнение диагностической эффективности ИФР с реакцией кольцепреципитации в капилляре (РКПК) с антигеном БИЭМ.

В связи с этим поставлены следующие задачи :

1. Отработать параметры постановки ИФР с фракционированным антигеном при трихинеллезе песцов и провести усовершенствование метода оценки результатов ИФР.

2. Изучить динамику ИФР с фракционированным антигеном и РКПК с антигеном БИЭМ в сравнительном аспекте при экспериментальном трихинеллезе песцов.

3. Провести испытание оптимальных вариантов ИФР в производственных условиях для прижизненной диагностики трихинеллеза песцов с целью определения возможности ее применения в ветеринарной практике для индивидуальной диагностики и сероэпизоотологических исследований по трихинеллезу в зверохозяйствах.

4. Изучить степень влияния гетерологичной инвазии и вакцинации на специфичность испытуемых иммунологических реакций при трихинеллезе песцов.

5. Провести гематологические исследования при экспериментальном

трихинеллезе песцов (как дополнительного метода при комплексной постановке диагноза).

6. Изучить селективное расселение личинок трихинелл в мыщцах песцов при экспериментальном заражении, в целях объективной оценки результатов иммунологических реакций и усовершенствования посмертной диагностики трихинеллеза у песцов.

Научная новизна

1. Впервые изучена диагностическая эффективность ИФР с фракционированным антигеном для диагностики трихинеллеза песцов.

2. Изучена степень влияния гетерологичной инвазии и вакцинации на специфичность испытуемых иммунологических реакций (РКПК и ИФР) при трихинеллезе песцов.

3. Отработаны оптимальные параметры постановки и учета иммуноферментной реакции при трихинеллезе песцов.

4. Впервые проведены исследования по изучению селективного расселения личинок трихинелл в различных группах мышц у песцов, экспериментально зараженных Т. spiralis .

Практическая ценность работы

1. Разработаны параметры постановки и учета ИФР с фракционированным антигеном для прижизненной диагностики трихинеллеза у песцов.

2. Установлена перспективность применения тест-системы на основе ИФР для прижизненной диагностики трихинеллеза у песцов.

3. Выявлены при компрессорной трихинеллоскопии и трихинеллоскопии после переваривания в ИЖС группы мышц, наиболее часто поражаемые личинками трихинелл (жевательные, икроножные, заднебедренная группа мышц и мышцы языка), которые мы предлагаем в первую очередь исследовать при посмертной диагностике трихинеллеза у песцов.

4. Предложено проводить гематологические исследования при комплексной постановке диагноза на трихинеллез у песцов.

5. Разработано и утверждено на заседании секции технического совета Департамента по АПК Кировской области Временное наставление по применению ИФР для прижизненной диагностики трихинеллеза песцов.

6. Материалы диссертационной работы вошли в Федеральные санитарные правила, нормы и гигиенические нормативы, раздел 3.2. Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации ( Сан ПиН 3.2.569 - 96).

Апробация материалов исследования . Результаты данной работы докладывались на ежегодных научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ВГСХА 19941996 гг., на заседаниях совета факультета ветеринарной медицины ВГСХА, на координационном совете по ветеринарной гельминтологии ( Москва,ВИГИС, 1995) и представлены на конференции "Актуальные проблемы ветсанконтроля сельскохозяйственной продукции" (Москва, 1995), на VII научной конференции по трихинеллезу человека и животных (Москва, ВИГИС, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в которых отражены основные направления и результаты исследований.

Объем и структура диссертации . Диссертация изложена на 154 страницах и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, выводов и списка использованной литературы ( 184 работы, из них 74 на иностранных языках ). Работа иллюстрирована 12 рисунками и содержит 18 таблиц.

Основные положения выносимые на защиту

1. Применение ИФР для диагностики трихинеллеза песцов.

2. Результаты экспериментальных исследований по отработке параметров постановки и учета ИФР.

3. Сравнительная диагностическая эффективность ИФР и РКПК для диагностики трихинеллеза песцов.

4. Результаты исследований гематологических показателей при экспериментальном трихинеллезе песцов.

5. Результаты изучения селективного расселения личинок трихинелл в различных группах мышц при экспериментальном трихинеллезе песцов.

6. Результаты производственных испытаний ИФР в целях сероэпизоотологического обследования зверохозяйств.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы Материалы

Антиген. В работе использовали фракционированный антиген из экстракта личинок Т.spiralis, полученный по методу Magat (1976) в модификации ВИГИС и антиген БИЭМ.

Антисыворотки. Сыворотки против иммуноглобулинов песцов, меченные пероксидазой хрена.

Сыворотки крови: сыворотки крови песцов, экспериментально зараженных личинками трихинелл (200, 1000 и 10 000 личинок на 1 животное), взятые в разные сроки в динамике инвазии; сыворотки крови песцов, взятые при забое зверей на мех в различных зверохозяйствах; сыворотки крови песцов, инвазированных Toxocara canis и Toxascaris leonina, сыворотки крови песцов, вакцинированных против чумы плотоядных и сальмонеллеза, любезно предоставленные сотрудниками Всероссийского института охотничьего хозяйства и звероводства им. Б.М. Житкова.

Тушки песцов. экспериментально зараженных трихинеллезом для изучения селективного расселения личинок.

Методы

Для изучения диагностической эффективности РКПК при трихинеллезе 9 песцов, подобранных по методу аналогов, заражали различными дозами личинок трихинелл (200,1000 и 10 000), 3 песца были контрольными. Кровь у песцов брали из плантарной вены через 5-7 дней после заражения до появления положительной реакции, а затем 2 раза в месяц до забоя. Постановку и учет РКПК с антигеном БИЭМ осуществляли по методике Успенского A.B. (1974). Реакцию считали положительной при образовании кольца преципитации на границе антигена и плазмы в течение 15-40 минут.

Клинико - гематологические исследования проводили на 9 песцах, зараженных трихинеллезом и трех - контрольных; перед заражением животные подвергались клиническому осмотру. Кровь исследовали общепринятыми методами на количество эритроцитов, лейкоцитов, содержание гемоглобина, высчитывали лейкоцитарную формулу, из мазков крови окрашенных по Романовскому - Гимзе.

Диагностическую эффективность ИФР изучали при экспериментальном заражении песцов трихинеллезом и в производственном опыте.

Постановку и учет ИФР проводили в микроварианте с целью обнаружения антител в сыворотке крови животных. Нерастворимой основой служили планшеты из полистирола, при постановке реакции при небольшом количестве проб использовали стрипы. Все виды биологических жидкостей (антиген, исследуемую сыворотку, конъюгат) и субстрат вносили в объеме 0,2 мл. Исследуемую сыворотку разводили в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН 7,2 с 0,05 % раствором Твина с добавлением 0,05 % альбумина и вносили в раститровке (для определения минимального диагностического титра), либо в скрининг -титре, определенном для тест системы, а затем инкубировали в течение 30 минут при температуре +37 градусов С. Отрицательным контролем служила сыворотка здорового животного, а положительным от экспериментально инвазированного 10000 личинок трихинелл на животное. Конъюгат вносили также в 0,01 М ФСБ рН 7,2 в рабочем разведении, испытанном предварительно для каждой серии конъюгата. После каждого каждого этапа проводили инкубирование во влажной атмосфере и отмывку планшетов. Свежеприготовленную субстратную смесь (ортофенилендиамин в цитратном буфере) вносили в каждую лунку и выдерживали при комнатной температуре 30 минут в темноте. Реакцию останавливали, используя в качестве стоп-реагента концентрированную серную кислоту. Реакцию оценивали визуально (по интенсивности окрашивания лунок), а инструментальный учет ИФР осуществляли на многоканальном спектрофотометре для 96-луночных планшетов (регистрацию результатов ИФР проводили по оценке оптической плотности (ОП) немедленно после остановки реакции).

Пороговое значение (ОП пор) вычисляли по формуле: как сумму среднего значения ОП контроля конъюгата (ОПкк) и среднего значения ОП К+ , умноженного на коэффициент А, т.е.

ОПпор= А х ОПк + ОПкк, где А= 0,2 Образец сыворотки учитывали как положительный, если значение ОП данного образца превышало пороговое.

С целью усовершенствования методов оценки ИФР при трихинеллезе песцов, для анализа результатов ИФР пользовались следующими показателями, рассчитанными по формулам:

1. Е(1)=Еи/Ео

2. Е(2)= Ей - Ео

3. КЕ=( Еи-Ео)/(Ет-Ео),

где Ей- экстинкция испытуемой сыворотки,

Ет- экстинкция положительной тест-сыворотки Ео- экстинкция отрицательной тест-сыворотки КЕ - коэффициент экстинкции.

Определение минимального специфического титра при трихинеллезе песцов провели на сыворотках экспериментально инвазированных животных со слабым и умеренным заражением. С этой целью песцов заразили 200,1000,10000 личинками трихинелл на животное. Сыворотки получали через 1,5-2 месяца, после заражения, т.е. в период их максимальной активности. В качестве контроля использовали сыворотки крови от здоровых животных, а также сыворотки от песцов, вакцинированных и инвазированных Toxocara canis & Toxascaris leonina, для контроля на возможность перекрестных неспецифических реакций. Минимальным специфическим титром считали такой , при котором наблюдали выявление пероксидазной активности по изменению цвета субстрата от насыщенного желтого до темно - бурого с сыворотками экспериментально инвазированными личинками трихинелл песцов, но изменение цвета субстрата отсутствовало или было весьма незначительным (до бледно-лимонного) с гетерологичными сыворотками и сыворотками здоровых животных.

Изучение динамики ИФР при экспериментальном трихинеллезе песцов проводили для того, чтобы проследить влияние интенсивности инвазии на скорость появления и продолжительность сохранения ИФР у песцов зараженных различными дозами личинок трихинелл. Взятие крови проводили до заражения дважды, а затем через 5 дней после заражения до появления положительного ответа и с интервалом 710 дней до появления максимального титра ИФР, после чего кровь брали 2 раза в месяц до забоя. В качестве контрольного теста применяли РКПК с антигеном БИЭМ. После забоя животных на мех выявляли интенсивность инвазии компрессорной трихинеллоскопией 72 срезов и трихинеллоскопии осадка после переваривания мышц в искусственном желудочном соке (жевательных, икроножных мышц и языка).

Производственные испытания проводили на клеточных песцах во время забоя на мех: 430 голов - из зверохозяйства "Вятка", биостанции ВНИИОЗ им. Житкова, 93 - из зверохозяйства Костинской птицефабрики (Кировской области) и 89 - из ТОО Тамерлан и Сайда (Северный Кавказ). Тушки животных, от которых брали кровь, проверяли на инвазированность гельминтами. Пробы массой не менее 10 грамм

икроножных, жевательных мышц и мышц языка исследовали компрессорной трихинеллоскопией 72 срезов и методом переваривания в искусственном желудочном соке.

С целью выяснения распределения личинок трихинелл в отдельных группах мышц, нами были заражены песцы в дозе 200, 500, 1000, 10000 личинок трихинелл на животное. Через 4,5- 6 месяцев после заражения животные были убиты, в возрасте 10-13 месяцев. Всего было исследовано 14 тушек песцов : 11 тушек экспериментально зараженных и 3 тушки контрольных.

Пробы были взяты из ножек диафрагмы, языка, гортани, жевательных, межреберных, предостных, хвостовых, поясничных, икроножных мышц и из заднебедренной группы мышц. Все группы мышц были подвергнуты сравнительному исследованию методом компрессорной трихинеллоскопии и трихинеллоскопии осадка после переваривания мышц в искусственном желудочном соке. Переваривание в искусственном желудочном соке проводили по методу П. А. Владимировой (1967) . Кроме того, мышцы исследовали методом стандартной трихинеллоскопии 72 срезов, предусмотренной для плотоядных животных. Срезы делали из 5 различных участков мышц, после чего производили перерасчет инвазированности на исследуемую мышцу либо группу мышц.

Всего за 1994 -1997 гг. нами исследовано 934 пробы сыворотки в ИФР, 491 - в РКП К и проведено 72 гематологических исследования клеточных песцов. При посмертной диагностике трихинеллеза клеточных песцов искусственному перевариванию проб мышц подвергнуто 654 тушки, а компрессорной трихинеллоскопии - 743. Полученные данные были обработаны биометрически, с использованием персонального компьютера (программа Microsoft Excel версия 5.0, Microsoft Word 6.0 for Microsoft Windows версия 3.1.)

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.2.1. Изучение диагностической эффективности РКПК

При проведении данных исследований нами была установлена прямая зависимость от интенсивности инвазии. Чем выше была интенсивность инвазии в перерасчете на 1 г мышц, тем раньше реакция

кольцепреципитации становилась положительной и тем быстрее достигался максимальный иммунный ответ.

Раньше всех реакция появилась и достигла максимума (на 35 день) у песцов первой группы (при дозе заражения 10000 личинок трихинелл на одно животное) и оставалась на этом уровне до конца опыта. У песцов второй группы, зараженных 1000 личинок реакция достигла максимума на 50 день и оставалась неизменной до конца опыта, у одного песца наблюдали сомнительную реакцию, которая исчезла на 128 день. При заражении 200 личинок на животное реакция не проявлялась ни у одного песца на протяжении всего опыта. Но необходимо отметить, что интенсивность инвазии в данном случае была очень слабая. При изучении специфичности данной реакции установили, что 10 из 37 сывороток крови песцов, инвазированных Toxocara canis и 14 из 35, зараженных Toxascaris leonina, а также 16 из 40, вакцинированных против чумы плотоядных и сальмонеллеза дали положительную реакцию, кроме того в некоторых случаях встречались ложноположительные реакции и у здоровых песцов (3 из 100). Таким образом специфичность РКПК в наших опытах составила 75%.

2.2.2. Результаты гематологических исследований

При исследовании крови количество эритроцитов составило (7,4+0,9 млн/мкл), лейкоцитов (8,5+1,Зтыс/мкп), содержание гемоглобина (9,8+1,0 г%) существенных отклонений от нормы не обнаружили. Лейкоцитарная формула соответствовала таковой у песцов (базофилы - 0,3+0,11%; зозинофилы - 6,6+1,9%; нейтрофилы: юные - 0,4+0,2 %, палочкоядерные -1,1+0,3%, сегментоядерные-29+1,4%; лимфоциты - 58+1,5%; моноциты - 4,4+0,8%). Количество эозинофилов (%) у песцов до и после заражения личинками трихинелл (в динамике) показано в табл.1.

Клинического проявления у зараженных трихинеллезом песцов не наблюдали. Температура, пульс, дыхание были в пределах нормы. Установлено, что в лейкоцитарной формуле отмечается эозинофилия только при интенсивности инвазии 10000 личинок трихинелл, прослеживается тенденция к увеличению эозинофилов при инвазии 1000 личинок на животное (увеличение эозинофилов в 1,2 раза).

Таблица 1

Количество эозинофилов (%) у песцов до после заражения личинками трихинелл (в динамике)

Доза за- до зараже- 5 день 15 день 20 день

ражения ния

10000 4 10 16 16

100 9 8 10 18

10000 8 17 12 14

1000 7 8 10 8

1000 7 6 8 6

1000 4 10 9 7

200 7 1 8 2

200 8 1 6 7

200 4 0 4 6

К 4 1 8 6

К 6 2 5 5

К 8 2 5 4

2.2.3. Изучение диагностической эффективности ИФР

Нами установлен минимальный диагностический титр, который равен 1:100. Этот титр на наш взгляд может выявить самый слабый уровень инвазии животных личинками трихинелл, при сохранении высокого уровня специфичности реакции. Результаты, полученные нами при определении минимального титра практически не отличаются от результатов других исследователей, в частности С.Н. Белозерова (1990), Ruitenberg (1975), Ruitenberg et al.(1977) и др., которые предлагают считать минимальным специфическим титром 1:80 и 1:100, при диагностики трихинеллеза свиней. Мы считаем, что незначительные отличия могут происходить не только из-за качества антигена, сорбирующего материала, но и физиологических особенностей плотоядных и всеядных.

При изучении динамики ИФР, положительную реакцию зарегистрировали на 22 день у песцов 1-й группы (зараженных 10000 личинок), у песцов 2-й группы (зараженных 1000 личинок) - на 28 день, у песцов 3-й группы (зараженных 200 личинок) на 42 день после заражения. У песцов 1-й и 2-й групп реакция оставалась положительной до забоя, а у песцов 3-й группы до 152 дня после заражения. Максимальное

увеличение титров до 1:3200 наблюдали у песцов 1-й группы на 35 день, до 1:800 у песцов 2-й группы-на 42 день, у песцов 3-й группы увеличения титров не наблюдали (предположительно из-за слабой интенсивности инвазии).

При производственных испытаниях изучили степень влияния гетерологичной инвазии и вакцинации на специфичность ИФР, исследовали более 700 проб сыворотки. Из 9 случаев положительной реакции 3 и 2 положительных реакции отмечены при токсокарозе и токсаскаридозе, соответственно, и 3 у вакцинированных песцов, и только 1 случай ложноположительной реакции отмечен у здоровых животных. Таким образом, специфичность ИФР составила 98,8% , в то время как специфичность РКПК - 75% (табл. 2). Приведенные в таблице 2 результаты изучения специфичности ИФР с фракционированным антигеном в сравнительном аспекте с реакцией кольцепреципитации в капилляре с антигеном БИЭМ показывают значительные преимущества ИФР. Учитывая также высокую чувствительность ИФР, мы рекомендуем данную реакцию для диагностики трихинеллеза у песцов, как более эффективную.

Таблица 2

Сравнительное изучение специфичности ИФР с фракционированным антигеном и РКПК с антигеном БИЭМ

Группа животных Результаты реакции

(специфи чность%)

ИФР РКПК

клинически здоровые 99,8 97,0

Т.1еопта 91,4 33,3

Т.сатз 94,6 71,4

вакцинированные(1) 93,3 73,3

вакцинированные (2) 90,0 20,0

ИТОГО 98,8 75,0

Сравнительное изучение эффективности методов диагностики трихинеллеза песцов (РКПК и ИФР ), проведенные при исследовании сывороток крови песцов, полученных из зверохозяйств, отличающихся возрастом, породой, условиями кормления и содержания, показало значительное превосходство ИФР, данная реакция выявляла положительно реагирующих животных даже при наличии всего 0,03 личинок в 1 г мышц тушки, в то время как в РКПК, при данной

интенсивности инвазии мы наблюдали отрицательный результат. Таким образом, мы считаем, что ИФР обладает абсолютной чувствительностью (100 %) и значительно превосходит РКПКпо данному показателю. Кроме того, при изучении специфичности данных реакций отмечено явное преимущество ИФР (98,8%), в то время как специфичность РКПК оказалась значительно ниже (75 %). К преимуществам ИФР можно также отнести более короткий срок от заражения трихинеллами до начала появления положительной реакции (с 22 по 42 день), в РКПК положительный ответ начинали регистрировать с 42 по 60 день после инвазирования животных ( табл. 3).

Таблица 3

Сравнительная диагностическая эффективность ИФР и РКПК при экспериментальном трихинеллезе песцов

№ Доза И Ф Р Р К п К

личи- появ- продолжи- макси- появ- продолжи- Оценка

нок ление+ тельность мальн. ление* тельность р-и

р-и (Дни) сохранения+ р-и (дни) титр р-и (дни) сохранения + р-и (дни) (мах)

1 10000 22 до забоя (160) 1:1600 35 160 +++

2 10000 22 до забоя (160) 1:3200 28 128 +++

3 10000 22 до забоя (160) 1:3200 28 128 +++

4 1000 28 до забоя (160) 1:200 - - ±

5 1000 28 до забоя (160) 1:800 60 105 ++

6 1000 28 до забоя (160) 1:400 42 90 +++

7 200 42 152 1:100 - - -

8 200 42 160 1:100 - - -

9 200 42 128 1:100 - _ _

10 0(К) - _ - - -

11 0(К) - - - - - -

12 0(К) - - - - - -

Сравнивая данные методы, нельзя не отметить и тот факт, что оценка результатов реакции, в случае с РКПК проводится визуально, в то время как для ИФР разработано специальное оборудование, которое дает возможность объективно оценить данную реакцию, кроме того возможны механизация и автоматизация процессов постановки ИФР.

С целью усовершенствования метода оценки ИФР при трихинеллезе песцов по методу О.Г. Полетаевой, H.H. Красовской, Тхас Нгуен Суан, и др. (1988) нами изучены 3 способа оценки показателей ИФР. Результаты оценки ИФР при слабой инвазии в сравнении с таковыми у клинически здоровых животных, песцов, инвазированных гельминтами (токсокарозом и токсаскаридозом) и песцов зараженных 10000 личинок на животное представлены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты ИФР у различных групп животных

Группа животных К-во проб сыворотки Е(1) Е(2) Количество проб сыворотки, при КЕ>=0,18

зараженные лич. трихинелл, в дозе: 200 10000 30 32 3,6±0,7 13,3±3,3 0,18±0,07 0,64±0,014 29 32

инвазир-е: Т.сатэ Т.1еоп1па 37 35 1,62±0,35 1,8±0,52 0,05±0,03 0,09±0,05 2 4

вакцинир-е: 1994 г 1995 г 30 10 1,39±0,48 2,57±0,81 0,046±0,04 0,11±0,06 4 4

кл.здоровые 100 0,68±0,01 0,011±0,01 0

Сравнительный анализ вариаций Е (1) свидетельствовал, что у

клинически здоровых животных данный показатель был значительно ниже, чем у вакцинированных песцов и животных, инвазированных гельминтами. Учитывая, что большая часть проб сывороток песцов, зараженных 200 личинками трихинелл (97 %) имела показатель Е(1) > 2,9, а у проб сывороток остальных исследуемых групп он был ниже,

последний был принят нами за диагностический при данном способе оценки оптической плотности сывороток. При оценке информативности показателя Е(2) было установлено, что у зараженных трихинеллезом животных он колебался от 0,18 до 0,93 (в среднем, при дозе 200 личинок он составил 0,18+0,07, а при дозе 10000 - 0,64+0,14). У остальных групп песцов данный показатель был ниже, в связи с этим Е(2) >0,18 был принят нами в качестве диагностического при данной форме учета.

Сравнительный анализ вариаций экстинкций ИФР , проведенный с помощью показателя КЕ свидетельствовал, что верхняя его граница, влияющая на выбор диагностического значения не превышала у всех животных, которые не были инвазированы трихинеллами 0,18. Поскольку большая часть сывороток от инвазированных трихинеллами имела показатель КЕ >0,18, а у большинства песцов вакцинированных и зараженных другими гельминтозами он был ниже (80% и 92,1%), данный показатель был принят нами за диагностический.

2.2.4. Результаты изучения селективного расселения личинок трихинелл в мышцах песцов, экспериментально инвазированных Т. spiralis

Для того, чтобы выяснить распределение личинок трихинелл в отдельных группах мышц песцов, были проведены сравнительные исследования методом компрессорной трихинеллоскопии и переваривания в искусственном желудочном соке.

Методом компрессорной трихинеллоскопии личинки трихинелл были обнаружены только у животных, зараженных большими дозами личинок (10000 и 1000 личинок на животное). Инвазированность отдельных групп мышц была неодинаковой: наибольшее число личинок обнаружено в икроножных мышцах (при дозе заражения 10000 личинок-9,39, при 1000 личинок- 0,71 в одном срезе), в мышцах языка (соответственно - 3,45 и 0,29 ), в жевательных мышцах (5,07 и 0,57), в заднебедренной группе мышц (3,87 и 0,43), в ножках диафрагмы (3,03 и 0,18), в межреберных (3,0 и 0,18) и в длиннейшей мышце спины (2,46 и 0,18), меньшее в мышцах гортани (1,53 и 0,06), предостной (2,07 и 0,18), в поясничных (1,83 и 0,13) и хвостовых (1,71 и 0,08). При исследовании проб мышц методом трихинеллоскопии осадка после искусственного переваривания наибольшее количество личинок также обнаружено в икроножных, жевательных мышцах, в мышцах языка и в заднебедренной группе мышц.

Результаты наших исследований вполне согласуются с данными А.С. Бессонова (1978), С. Бизулявичуса, Я. Сенутайте и др. (1976), изучавших селективное расселение трихинелл у свиней, нутрий и сем. кошачих, и подтверждаются исследованиями О.-Я. Бекиша (1971, 1972), обосновавшего влияние биохимического состава мышц на распределение личинок трихинелл.

Учитывая важное эпизоотологическое значение клеточных пушных зверей в распространении трихинеллеза, необходимо исследовать тушки клеточных песцов на трихинеллез методом компрессорной трихинеллоскопии 72 срезов или методом переваривания в искусственном желудочном соке проб мышц; при ветеринарно-санитарной экспертизе тушек песцов в первую очередь необходимо исследовать икроножные, жевательные мышцы, мышцы языка и заднебедренной группы, как наиболее часто поражаемые личинками трихинелл.

Учитывая данные многочисленных авторов о чрезвычайно низкой эффективности компрессорной трихинеллоскопии (С|'гопеаш, 1975; КиИепЬегд, 1983; В.Эогки/аггг 1940; Ь.Ыетезеп е\ а1.,1954 ), мы сопоставили данные о диагностической эффективности методов искусственного переваривания и компрессорной трихинеллоскопии и установили, что при использовании метода компрессорной трихинеллоскопии личинки трихинелл не обнаружены при слабой интенсивности инвазии ( менее 0,1 личинки в г). Результаты наших исследований согласуются с данными А.С. Бессонова (1964), Огопеат (1975), (ЧиКепЬегд (1983), которые установили, что компрессорная трихинелпоскопия позволяет выявить трихинеллез у свиней только при инвазии более 0,025 личинок трихинелл в грамме мышц, при интенсивности инвазии 1-2 личинки выявляется не более 50% зараженных туш (В.ЭогкУ^г 1940, ЬМетеэеп 1954, е1а1.).

Таким образом, преимущественно следует исследовать тушки клеточных песцов на трихинеллез методом трихинеллоскопии осадка после искусственного переваривания, как наиболее эффективного для посмертной диагностики трихинеллеза.

Мы рекомендуем для подтверждения прижизненного диагноза, установленного в ИФР, посмертно исследовать всех положительно реагирующих песцов на трихинеллез методами компрессорной трихинеллоскопии 72 срезов и методом трихинеллоскопии осадка после переваривания в искусственном желудочном соке проб мышц; при ветеринарно-санитарной экспертизе тушек песцов в первую очередь

необходимо исследовать икроножные, жевательные мышцы, мышцы языка и заднебедренной группы, как наиболее часто поражаемые личинками трихинелл. Причем, предпочтение следует отдавать последнему методу, как более надежному.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны параметры постановки и учета ИФР с фракционированным антигеном для прижизненной диагностики трихинеллеза у песцов (определен минимальный диагностический титр, а также показатели инструментальной оценки ИФР : Е(1),Е(2), КЕ).

2.Впервые изучена диагностическая эффективность ИФР с фракционированным антигеном для диагностики трихинеллеза песцов в сравнительном аспекте с РКПК, установлены преимущества при экспериментальном трихинеллезе песцов тест-системы на основе ИФР .

3. Изучена степень влияния гетерологичной инвазии и вакцинации на специфичность испытуемых иммунологических реакций (РКПК и ИФР) при трихинеллезе песцов.

4. При проведении производственных испытаний установлена высокая диагностическая эффективность ИФР (чувствительность - 100%, специфичность - 98,8%).

5. При проведении гематологических исследований при экспериментальном трихинеллезе песцов установлено, что эозинофилия является важным диагностическим признаком при трихинеллезе, но ставить диагноз на этот гельминтоз только на основании данного признака нельзя, так как нередко у клеточных пушных зверей может наблюдаться эозинофилия самого разнообразного происхождения: на почве аллергии (пищевой, лекарственной этиологии и др.), а кроме того и при других гельминтозах плотоядных.

6. Впервые проведены исследования по изучению селективного расселения личинок трихинелл в различных мышцах у клеточных песцов, экспериментально зараженных Т. spiralis и выявлены при компрессорной трихинеллоскопии и трихинеллоскопии осадка после переваривания в ИЖС группы мышц, наиболее часто поражаемые личинками трихинелл (жевательные, икроножные, заднебедренная группа мышц и мышцы языка), которые мы предлагаем в первую очередь исследовать при посмертной диагностике трихинеллеза песцов.

7. При сравнении методов посмертной диагностики : компрессорной

трихинеллоскопии и трихинеллоскопии после переваривания в ИЖС установлена более высокая диагностическая эффективность последнего.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать:

1. Для прижизненной диагностики трихинеллеза песцов иммуноферментную реакцию с фракционированным антигеном трихинелл в целях индивидуальной диагностики и для выяснения эпизоотической ситуации по трихинеллезу в зверохозяйствах страны.

2. Иммунологическим исследованиям следует подвергать песцов: в период формирования маточного стада всех племенных зверей в неблагополучных хозяйствах и весь племенной молодняк перед отправкой на продажу.

3. При постановке прижизненного диагноза на трихинеллез необходима оценка клинических и гематологических данных (как вспомогательных методов при комплексной постановке диагноза).

4. Посмертный диагноз трихинеллеза у песцов устанавливать на основании результатов компрессорной трихинеллоскопии и трихинеллоскопии осадка после переваривания в ИЖС мышц, наиболее часто поражаемых личинками трихинелл (жевательных, икроножных, заднебедренной группы мышц и мышц языка).

5. Полученные нами новые данные по прижизненной и посмертной диагностике трихинеллеза клеточных песцов, целесообразно использовать в учебном процессе при изложении курса паразитологии и ветеринарно-санитарной экспертизы на ветеринарных факультетах высших учебных заведений.

СПИСОК РАБОТ,

опубликованных по теме диссертации

1. Жданова О.Б., Белозеров С.Н. Результаты экспериментального заражения песцов личинками трихинелл и селективное расселение их в мышцах // Материалы докл. к межвуз. научной конф. по вопросам селекции и технологии производства продукции животноводства, охотоведения и природопользования. Киров , 3-4 июля 1995 г.- Киров., 1995,-С. 144-146.

2. Жданова О.Б., Успенский A.B. Иммунологическая диагностика трихинеллеза // Материалы докл. на конф. Актуальные пробл. ветеринарно-санитарного

ветеринарно-санитарного контроля с/х продукции. - М.: 1995. (в печати).

3. Жданова О. Б. Диагностическая эффективность ИФАпри трихинеллезе песцов // Материалы докл. к 7. научной конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. Москва, 2-3 октября 1996 г.- М., 1996. - С. 27-29.

4. Жданова О.Б. Изучение динамики иммуноферментной реакции при экспериментальном трихинеллезе песцов // Материалы докл. к межвуз. научной конф. по вопросам селекции и технологии производства продукции животноводства, охотоведения и природопользования.-Киров., 1997 (в печати).

5. Жданова О.Б. Изучение диагностической эффективности иммуноферментной реакции при трихинеллезе песцов в производственных условиях // Материалы докл. к межвуз. научной конф. по вопросам селекции и технологии производства продукции животноводства, охотоведения и природопользования.- Киров., 1997 (в печати).

Подписано в печать 29. 04. 97 Фирма « Лона » Г.Киров, ул.Щорса 95 тир. 60 экз.