Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СРАВНИТЕЛЬНАЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТРЕХ ШТАММОВ В ВИРУСА АСПЕРМИИ ТОМАТОВ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "СРАВНИТЕЛЬНАЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТРЕХ ШТАММОВ В ВИРУСА АСПЕРМИИ ТОМАТОВ"

Я-2&&07

. ОРИША Л ШИНА И ОРДЕНА ДРУЖШ НАРОДОВ ifffparaff HAJK УКРАИНСДОЙ ССР

огпиц трудового красного знаыши иютитут шкрогашагии и виргосшагаи имши д.к. забшогного

На правах рукописи

ДЗЙРЖАДЕ Лига Тесщоровва

578.852.2

СРАШКГШНАЯ ШШООТШЗт К «ШИКШИЧЕЗКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА TPS ШТАМЮВ ШР7СА АССШШ ТОМАТОВ

03.00.06 - мфусаяогия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически! шук

Каез - 1967 -

липолкеш а Цроблешбй Лаборатории вирусных болезней растений х насекомых Латвийской ордена Трудового Красного Знамени Сельскохозяйственной академии и г отделе биохвмии вирусов растений Межфакультет ско 2 проблемноfi научно-исследовательской лаборатории биоорганической химии им.А.Н.Белозерского Мо сковского Государственного университета хм. U.B.Ломоносова

Научный руководитель: кандидат биологических наук

ведущий научный сотрудник Родионова H.H. Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор• Бойко А.Л.

кандидат биологических наук старший научный сотрудник Лаячик ХГ.

Ведущая организация: Институт микробиологии имени А.Кирхенштейна АН Латвийской ССР.

Защита состоится "ЯО * .омt?apА 1988г. в

и

9 час. на заседании Спецяалиэврованного совета Д OIS.ОБ.01 по защите диссертаций на■соискание ученой степени доктора биологических наук цри Институте микробиологии к вирусологии ли. Д.К.Заболотного АН УССР /252143, Киев-143,ул.3аболотвого, 26, Институт микробиологии'ж вирусологии им. Д.К.Заболотного/.

Ч ' ■ . ■ч *

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ы кробиолопи и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН УССР.

* Автореферат разослан " /5 я qckc¿J/¿su_1987 г.

** /

Учений, секретарь ■ .

Caen» л.тгЕэиро данного оовета, } J^ ■/

ка'глават; биологических наук ,Уч t¿> Э.Д.Коваленко

ОЭДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение биологических в антигенных свойств,итакже структурных особенностей вирусов растений необходимо при исследования взаимоотношений между разящи: Группами вирусов и,особенно при изучении штаммов одного вируса. Распространение. разных штаммов одного и того же вируса, вызываших у растений различные тины болезней, пред-с тавляет ' б олыпой практические интерес как для изучения вирусных болезней, так и для разработки мер борьбы с вика.

Объектом наших . исследований является вирус асперши томатов, порагашдай овосше. и декоративные - культуры, в тем 'числе томаты и хрпзантеш.

. В Латвийской ССР тошаты. как. одна из наиболее ценных св^ ссшых культур занимаея важное кесто в овацеводстве закрытого. грунта. Латвийские штаммы вируса аспермии томатов УВАТ/ ена-гапт урогай томатов от 30 до SQ % вплоть до полной гибели у-рсиая. ВАТ поражает.такхе.экономически ваднуд декоративвур культуру - гризантеш, которые являются резерватораш и иь-точниками данного вируса.

' Репенае проблемы оздоровления растений от вирусов требует внедрения в практику методов своевременной и аффективной диагностики.

- Рель и задачи взбеггн. Целью шшех исследований явилось 'изучение биологических г физико-химических свойств виргоноэ и субструктурных компонентов трех пташов ВАТ,' вэделаннах в Латвии, а также разработка метода быстрой и надежной диагностики атого вируса.

Для выполнения поставленной цели „било необходимо реезть

■ .■■. -с о( jt.a^ii .viiîmi f

; :... I1 ^^HZi Я-2&&0/

следущие задачи : I. Дифферевщфовать три штамьи. ВАТ в изучить характер симптомов. 2. Получть высокоочвденные пресат-рахы изучаемых штаммов В£Г я наделить кг оубструктурнне компоненты. 3* Изучать фазяко-шняческие свойства вираонов, структурных белков -й нуклеиношх кислот в сра внитаяьном аспекте. 4. Получить високоспеготфичвые антлсыворотки ко всем . трек штаагмаи, в с ах помскы) дать иннунохимическую характеристику изучаемых штамме®. S. Провести сравнительное олзто-нуклеотидное картирование гетомаштаыаов ВАТ.

. Научная ноадзна. В 1федсгавлешо8 работе : пцделен ноша птамм БАГ, шзываццдй желтую мозаику ва зараженных растениях / 5, 8 /. В сравнительном аспекте проведено биологическое' я фнзшЕО-азшаческое изучение трех ттаггковВАТ, выделенных в Затеяв..

В имщтнахимичесяит иссяедовавиях волучены внсокоспвци-фичвне- антисыворопси ко всей трем штаммам а показано, что лат-кгйскле штаьиа вируса серологически идентичны» что позволяет -расширить круг использования антисывороток в диагностике вируса. Впервые приготовлена специфические иммуноглобулины в нашшгаты используя в качестве маркера щелочную фосфатазу * отечественного производства /НПО "Еяолар"/ а проведена ишу- " яофершнтные анализа В4Т;

Методой одигонуклествдиого картирования показали разля- . чиа в нуклеотидЕОЙ последовательности FHIt-З латвийских шта»-. ков BAI. ■..',■

, Практически? ценность работы. Практическая ценность проведенных исследований" закзшчается в тем, - что подученныэ . сведения о молекулярных аспектах кукумовлрусвой инфекции. ьк>-гутв дальнейшем способствовать разработке мер -борьбы с этими

патогенами, . Полученные результаты являются основой для раз- " работка диагностических шборовиммунофериентного анализа для определения BAT« Приготовленные при содействии с сотруд-НПО "Биолар" иымунашыические наборы, вклочащие. специфические иммуноглобулина и конызгаты к ВАТ используются для равней я эффективной двагностшга. на с/х предприятии "¡¿е- -ристемные культур" Министерства Коммунального хозяйства Латвийской ССР.

Апробапая работа. Основные положения работы доложены в обсуждена на Международной конференции по хроматографии /Будапешт 1987/, Втором всесоюзном симпозиуме. по штатам виру- • сов растений '/Елгава-1981/, XI Всесоюзной конференции "Взру-; сы микроорганизмов и растений* /Ташкент 1986/, научно-производственных конференциях со защите растений республик Прибалтики а Белоруссии /Таллин 1974, Рига 1976, Минск 1979» 1981, Рига 1933/, на конференции биахгадков Дрдбадтайстпгг республик, Белорусской ССР и Ленинграда /Рига 1981/, ва конференции молодых ученнх-бисдогов /Рига 1981/ в научво-прсиэасщственных конференциях Латвийской CIA /Елгава IS77, 1980, 1932, 1934,1985» 1986/.

■Объё» работа. Ддссертапиокняя работа содержит введение, обзор литературы, посвященный характеристике вирусов, относимых к семейству ■'Trícorr»aw«ídoe , а также иэтодам дагг— востики вирусных заболеваний растений, списание материалов г кетодов,-собственные ра^уттырапт ^^ид^ггаяниИ" обсуждение ре— зультатов и список цитируемой литература, Общий объем диссертации составляет 135 страниц, вкдочая 2 таблица, 3 cxei^ и 33 рисунка; список литературы содержит 229 наяыеноваягЯ.

РЕШЬТАТЫ И 0БСУ2Д2ШЕ

I. Биологические свойства трех штаммов ВАТ ' Из хризантем, зараженных природным взолятом ВАТ. с ПОМОЩЬЮ ргстензй-ввддааторов Nicotian а rustica. L., Nitotíana íabacwn „Sams un Chenopodium yulnoa .Wílid наш удалось

дифференцировать три изолята ВАТ. Поскольку, ош отличаются □о степени патогенноета вызываемой инфекции на растениях томатов, типом реакция на дурмане } Daiura ь&атопшт } я лебеде /Otenofwdiuni ^ainoa /» то их можно назвать датвсйскш.ш , дгаыыами ВАТ /т дг обозначили как ВАТ-I» ВАТ-2 я ВАТ-3/. Из них SAT—X -самый патогенный. На томата! ВАТ-I вызывает угнетение точки роста главного стебля, растения становятся кустистыми, завязывается неб слыл ое число плодов, которые к . току, же являются мелкими. При заражении ВАТ-2. и ВАТ-3 потеря урожая достигает.от ЗД до 50 %•

На дурмане*все_три штамма ВАТ вызывают местные хлороти-ческзе округлые пятна; но системная инфекция развивается ТОЛЬКО, при заражении":ВАТ-3.

При заражении ВАТ-3 главной отдкчителгьной-особенностью _ является желтая мозаика на многих видах растенйй, среди ко- 9 торыг можно назвать томагн, дурман обыкновенный, табак хл едкий я настоящий, -петунию и др. Появление желтой мозаики при заражении ВАТ другими авторами не отмечалось.

Латвийские штаивд ВАТ не заражают сгурцн даже на стадии' семядольных .листьев.

Стачмовые отяичия на.растешях-ишцпкаторах отражены в тгллгпе I.

Таблица I-

Диффереяциащм штампов- ВАГ при помощи растеннй-ивдшгаторов

Раотенае-вдаяатер ■'.■ : .Вризн&кгэара&едас на растештнюй^тсрах

ВАХ-2 1 • ВАТ-З' ■

¿фс^шиэоп. екй1ел(ит каряиковосп,.йес-шюдие деформация листьев ярко-вдтая-.мозаика-

. Сиса/пИ не зарагает ■ неэаралаэт не заражает

■Мкс&ала - <^и&ло<>а китевадвос^Ь" ластьев мозаика, деформация лвспег ярко-желтая мозаика« ■ деформация

Ж {аЬ&сит 'ЗатЛл* мозаййа,- киУеий- ; ноогв яя'йПев* посветленяеаллои . ... мозаика " ярко-желтая. . . мозаика.'

С^то/ю&шп ушпоа : местные некрозы; симптомов вет местные некроза.

■ /¡¿хауполалт, \ 'местные некрозк местные некрозы \ цеотше векрозн» системная инф. -желтая мозаияа

мозаика; теино-зеле-. вне вздутия сосветлеше холок желтая »возаика 'деформация листьев •

Z. Очяства и характеристика вирионов ВАТ ■ Вирусный материал размнохалв на растения! W. iabacam rustica . ВАТ ^чттглт^ на зараженных растений используя методы /1973/, lot et Ы /1972/, Moss op et ai /1976/, а также модифицированный нами меток. Для препаративного получения больших количеств вирусных препаратов ВАТ наиболее удобным методом является осаждение вируса ГОГ.

Для * дальнейшей очистка препаратов использовали центрифугирование в линейном /6-30$/ градиенте ; концентрации сахарозы. После центрифугирования в течение 150 минут при 22 000 об/мин зова, рассеиващая УФ-свет находилась примерно по середине пробирки. .Результаты намерения поглощения • УФ-света при 2SO ни отдельных фракций после центрифугирования совпадают е визуальными наблюдениями и показывают , что основная' масса.ВАТ сосредоточена в однойзоне/рис.1/. ;■■■■.

Рис. I. Профиль седиментации ВАТ-2 в линейном

/б-ЗС%/ градиенте концентрации, сахарозы. Ротор sivü5't 22 ООО об/iezH, 150 минут.

В 'йсшмшзегве случаев для препаративного вцделешя очищенных npesajatoB ВАТ использовали модифицированный нами' метод, в котором для дальнейшей очистки вируса на второй цикле использовали центрифугирование через IOSí-ную "сахарозную подушу".

Выход вгрусяого.. катериала ВАТ-I и ВАТ-2 составлял 50 -100 кг на I дг листьев, в то' вреия как выход ВАТ-3 обычно составлял, около ХО кг. ине-превышал 30 иг на ! кг исходного иа-тервала»

Полученные вами ' препараты трех птвкмов ВАТ бит шфек-квонеы а имели тшшчный для сферических растительных вирусов' спектр поглощения' в; УФ-ойкасти. ".

. Для определения гомогенности полученных препаратов и из* , *

учения морфодогид частгц проводили электронномикроскогшческде исследования.

Рио.2. электронная- микрофотография очищенного препарата ВАТ-2 негативно кошртстяровааного 2 3£:уранил • .адетатом. Увеличение х 300.000 .-•••> ■

Из элек^ронномгвроскопических исследований следует,. что препарат ВАТ содержат морфологически сходные сферические части-Ш£ со средним диаметром 25,0 ни.

- С едпментационный анализ очищенных препаратов ВАТ пад-твервдал их гомогенность.Центрифугирование провешили на аналитической ультрадентрифуге Весктап Mode! £ при 36 ООО об/мин, используя шлирен—оптику.■ ■ Коэффициент седиментации вараонов ВАТ» рассчитанный общепринятым методом равен 99 S .

■ ! • / , * j — ^_*

Рве. 3. Аналитическое ультраце»-. трифугирование счищенного . препарата ВАТ. - Шлирен-оп-; тика, скорость 36 ООО об/мин, 17-я минута.

;..■■' 3. Иьастнойорлические исследования. " . .';.■' Важной .характеристикой вируса-является его антигенные, свойства. Используя в качестве антигена очищенные вирусные ' препараты, стабилизированные- формальдегидом, и применяя полный адъЕБант Орейнда, нам удалось .-получить высакоспенлфичные антисыворотки ко всем тремштаммам. ВАТ. Титр антис^вороток, определенный методом двойной иммуиодиффузни в агарсвомгеде,, был равен 1/128. Антисыворотки реагировали с гомологичными - и гетерологегшпш-птаммакиВАТ.Образования "шпор* не наблюдали..

'Аз антксывороткс к ЕАТ-2 осалдением ПЭГ выделили ишуно-глобудпнз,- После очистки глобулинов на целлюлозе ДЭ-32 получили чистке гамиа-глобузтины. Используя щелочную фосфатазу.

отечественного производства /НПО "Баоетр"/, приготовили комплекс антител со щелочной фосфатазой /кокьсгат/ и провели иьз— ыуноферкентныЗ анализ/ИФА/, используя ."с кят7> ■ -

Методом ИФА мы определяли ВАТ в очищенных препаратах вплоть до концентрации 5 нг/мл. При анализе зараженные растений табака получили положительную реакцию при разведении сока I : 10 . В инфицированных - растениях-хризантем ВАТ мохно определить при разведении сока I : 10^. Методом ИФА показано, что латвийские штаммы ВАТ серологически идентична и таким образом подтверждена результаты, полученные методом двойной им-ыунодиффузии в агаровой геле. Чувствительность реакции при ' определении всех трех игтаамов была одинаковой и потому, приготовленные иммуноглобулин а ВАТ и соответствуюте коньпгаты ыажно успешно использовать- а практике для определения любого штамма ВАТ*

. Методом ИФА ш. проверяли растения хризантем на зараженность ВАТ. По данным Игната /1980/ тридцатидвевая - термотерапия при температуре 37% и относительной влажности воздуха 65-70 % дает, надежные результаты в оздоровлении хризантем от ВАТ. Хризантема , зараженные ВАТ.по данным. ИФА, подвергал: термотерапии;Уже через 14 дней термотерапии концентрация вируса в растениях существенно снижалась и через ЗОдвей выявить ВАТ в хризантемах ве удалось.

Л Используа йФА,, ш изучили динаяику накопления-вируса в разных частях растения. Nicotian a qiutinesa.. Через 72 часа после заражения ВАТ в растениях.не обнаруживали, однако уже на 4- -н2 день после ивонуляции-удалось выявить различии в концентрации.вируса в инокузщрованных и в необработанных листьях при отсутствии внешних симптомов заболевания. О На'П-ый день

после заражения аа листьях верхнего яруса появлялась симптомы заболевания, при этой наивысшая концентрация вируса выявлялась в инокулировднннх листьях, а самая низкая - в листьях среднего яруса. ;

4. Характеристика калеидны^ белков Для анализа чистоты и■■ гомогенности структурные белки трех штаммов ЕАТ анализировали.методом электрофореза в IOíS-нсм СААГ в трубках /Weber, Osbam 1969/ » а также в системе laemU в градиентных' /8-20#/ вертикальных ■ пластинах геля /iaemtí 1970/. При атом показали, -что вирусные частицы содержат по одному полипептиду и все три капсидные белка имеют одинаковые электрофоретические- подвижности. Их молекулярная масса» рассчитанная на основании сравнения. электрофоретичес-кой подвижности с таковыми белкоа-ыаркеров- равна 26 ООО Д.

i ' . ""- Электрофоретическиа

i .. ■; J. 1 ■■ : •'.,"*''■ -j

I ' анализ структурваос

■- ■. белков" штаммов ВАТ в

. ■ • ■ • градиенте ПААГ ,8-20* -

. • ' X - белки-маркери

- • : 2 ~ BAT-I

-..'■ * . з - ВАТ-г ';

4 - ВАТ-3

5. Характеристика вирусной РНК Методом фенольно-детергентной: депротепнизадаи из ота-щенннг препаратов ВДТ-1,ВАТ-2 я ВАТ-3 ввдмгижи препарата ШС /метод Рес/еп, З^топз 1973/, проавляюте ивфекциопность, если их аспользовали в качестве - инед^улут при заражении растений МссгЬлла дЫ11л05о . РНК имели типичные для нуклеиновых кислот спектры поглощения в ТФ-свете о маасимуисц при 260 ни и циншуыоы йра 230 нм и отношением ■&2сс/А280 01 1,8 1(0 2,0 » свидетедьствущие од отсутствии захряэведаЭ белковой природа.

Для определения . нуклеотшшого состава РНК ВАТ-2 разрушает ферментативным методом,' используя смесь щелочной' фос-фатазы, РНК-азы Т1, панкреатической РНЕ-азы и фосфадиэстера-аы змеиного яда. Полученный . гидролизат Фрагазиоотровали на кол саке со смолой А*нлех'А7«.Дяя РНК ВАТ-2 определила следующие мояярнне отншеяия :

' ЫЦ ' *

Трацил 2,89 29,1

. . 1уанил 2,35 '' 23*7 . .. Адениа 2,66 2£,8

Дитозиа 2,02 50,4

При центрифугировании в 10-40£-ноы градиенте концентрации сахарозы в течение 6 часов ври 35 ООО об/шя /ротор 5\«/ 39 / разделить-так ВАТ-2 на.фрагменты неудалось. Она сегш-ментлровала.Еаксашвгшотеншйпш:.

Доказательство ': фрагиентиравадаости генома ВАТ получили

методе« электрофореза в 3 ? ПААГ. РНК ВАТ предварительно па-зтревади при 65°в течение 3 минут для выявления скрытых раэ-. рывов. При елентрофорегичеейом фрагиионироваяии РНК ВАТ в 3 % ПААГ в течение 6 часов,ври 'едле тояа 4мАватру0ку теля

по методу Loening /1967/ суммарные препарата ШК ВАТ разделялись ва четыре основных компонента / PHK-I, 2, 3» 4 /»визуально выявляемые при окрапшвавии гелей метиленовым синим. Однако,, при сканировании таких гелей в видимом-свете при длине волня-620 ш не выявлялись дискретные пики, соответствующие ЖК-1' и FHK-2. на денситограмые;были видны три основные.

Cromoscen дрд 620 ни. Стрелками указано ■ положение геномных ЕНК /l-З/ и суОтеномной РНК-4

Мы. провели определение молекулярной массы .отдельных фрагментов РНК ВАТ-2 *на основании их распределения в 3 JS-hom ПААГ» В качестве маркера была использована тотальная РНК : ШК, содержащая фрагменты РНК - 1, 2, 3, 4 с молекулярными ыассаш 1,09: 0,99; 0,75 и 0,2а мД соответственно. Молекулярные иасеа для фрагментов £HK- I, 2, 3 и 4 ВАТ-2 получила соответственоо равные 1,26; 1,10; 0.86 и 0,43 мК. '

Для сравнения электрофоретической подвижности фрагментов РНК исследуемых нами штаммов,. мн проводили анализ з пластинах 3 ¡í-ного ПААГ /180x250 мы/ в денагуриругпшх условиях с Ш U мочевиной. Вяриоиныв фрагмента РНК изучаемых штаммов BAI имела одинаковне подвижности.

Цри электрофорезе в пластинах 3 % ПААГ /180x250 ш/ у всех трех штаммов ВАТ»крсые трех геномных и субгевомноа

ШВ-4 нами бнд обнаружен ещё грд фрагмевт ШКс электрофо-

. t

ретичесвой подвижности меньше чем у РНК-4. которая могла п-меть по аналогия с другими кукумовирусами сателлитнуп . прирез ду и тедда мгиять на характер вызываемых симптомов, шг не проводили детального исследования природа этой РНК, - однако чтобн изучить влияние обнаруженной минорной РНК-5 ВАТ на проявление симптомов,- пег заражала индикаторные растения геномными РНК» освобожденными от FHK-4 и РНК-5 фракционированием виряонной РйК алектрофорезом в 2 Í агарозе. Симптомы на растениях Prfunio b^bnda зараженных таким препаратом геномных ШК» ,не содержащим НШ-5, не отличались от симптомов на растениях, зараженных Бирнонной РНК или вативным вирусом.

Ш также рровели анализ РНК нз потомства вируса после . заражения растений геномными РШС." По данным электрофоретачес-кого анализа РНЕ содержала пять фрагментов, как обычные тотальные препараты га К. Вероятно, выделенная вами ГНК-5 ВАТ образуется в растениях, несмотря на еа - отсутствие в инокулу-ме, еднако она не влияет на проявление сиял омов ВАТ, в отличие ОТ ВОМ / Lee, Kummft 12В5/.

.6. Олигонукяеотидное картирование ' В результате проведенных икыунохточескях и фвзако-хи-

ьшческп исследований вирусных препаратов и структурных компонентов трех штаммов ВАТ. ш показали» что они являются серологически идентичными и содержат сходные влриоввде РНК и структурные белки. Однако, поскольку эта птамш индуцируют различные симптомы на зараженных растениях, ма предприняли . попытку обнаружить различая в их геномных ШК изучив первичную структуру. фрагментов генома методом олигонуклеотидного картирования. Изменения в олигонуглеотидных картах отражают . те изменения, которые присутствуют в последовательности нук-леотидов изучаемых РИК.1КИЕичная замена в . нуклеотидной последовательности может.привести к' исчезновении одного пятна и появление, как минимум,одного нового пятна. Для многих.вирусов животных показано, что они не отличаются серологически, но могут иметь : сально отличапзиеся сошгонуклеотидные нарты /Липская и др.1Э85/. ■

Поскольку здектрофоретическое разделение ШК-I я ШК-2 ВАТ затруднительно, мы сравнили олигонуклеотидные карты ЕНК-З" ГНИ изучаемых шташов, ГНК-4'дублируется в FHK-3 в ее-3'-концевоЗ части и является матрицей для синтеза структурного белка вируса , in vitro и, повидимому, Ь vivo ,'во аналогии с другими вирусами семейства Tricornavtridoe . Суммарные вире- . енные ЩК фракционировали в 2 £-ном агарозиш геле. Из /. зон, содержащих НШ-3 и FHK-4» февольным методом выделили чистые препараты. I «г вирусной ШК-З иРНК-4 глдролизовали ЩК-азой И в присутствии целочной.фосфатазы в течение 30 минут при ■ 37° С и напученные алигонукяеотддн фосфорилировали по 5'-концу цри помада Щ ^рЗ -АТС и поденукдеогадккназы фага Т4. Me- . ченные олигонуклеотвды фракционировала двумерных электрофорезом с.последующей радиоавтографиеЗ. В.первой направлении

электрофорез проводили при кислом рн в 8 % авраланиде /0,1 % метилеЕйисакриламад/, а вовтором направлении - при пелочном рН в 21 £ агяааамвде /1,4 £ цетилевбисадрлдзшд/. На рисунках 6, 7 а 8 представлены олитонукдеотидвыа карта РНК-3 ВАТ-1, БАТ-2, ВАТ-3 и их схематические изображения.- На схеме пронумерованы варьирупаие пятна. Пунктиром обозначены пятна, отсут-ствувсдаена карте данного штамма, , но присутствутадае на картах других, штаммов.-. Заштрихованы те шина, которые специфичны дия РНК данного штамма,, но отсутствуй хотя бы на одной из. карт.Не' пронумероваш. пятна,;соответствуташе общий для.всех трех штаммов слигонукдестидам*

Рис.6..Олигонукдеотидняя карта и схецатп— • ческое изображение ;Т1-1Ш£-азного гид-ролизата.ГНК-З . ВАТ—I ■ Справа налево — первое направление, .•V ■ снизу вверх -1 - второе направление ^ алектрофсреза

та-, л.о

о Р

г -яз; ,

О 1

сз

■

о о о

о о ¿р

. —¿^гч.» -^ Рйс.7. СощгсяуклеотЕЕвая

карта я схеыати-

___„я*"

'" . ческое изображение

о Т1-РНК-азвого гид-

Т » О ■ '• О 1 ролизата ШК-3 -

т _ фЗмг»*^ * ВАТ-2

гч _ ■ ■

* ~ ■ • ' Справа налево -

■ " пеР®ое направление,

■'.- снизу вверх -

второе направление

о ■ ё3 <о о - электрофореза о0 о О сз

о ® ■■ ■

Ыошо видеть, что . ШК-3 всех трех штаммов ВАТ имеют -сходные олигонуклеотвдные карты. ВАТ-1 отличается от ВАТ-2 по двум специфическим- олигонуклеотКДам.и от ЕАТ-3 по трем специфическим, олигонуилео^идам. ВАТ-2 отличается сгт ВАТ-3 по 5 специфическим олигонуилесгГЕдам. В картах ВАТ-2 присутствуют пятва 3 и 5, но отсутствуют пятна I, 2, -4 . В картах ВАТ-2 присутствуют ПЯТна 2 и 3, отсутствуют - I, 4, 5. Оди-гонустеотидвая карта РНК-З ВАТ-3 содерют пятна I, 4, 5, но не имеет пятна 2 и 3. Так, возможно,'исчезновение пятна 2 у штаммов ВАТ-1'и ; ВАТ-3 связано с появлением у них пятна 5, а исчезновение пятна 3 на карте штамма ВАТ-3 связано с появле—

-17- :

- 4-

наем на,этой карте пятен Г а 4» которые отсутствует на кар-тах-штаммов ВАТ-1 и ВДТ-2, имепдкх пятно 3. - ■ ..

— '' '¿г^* ' ' Рвс.8. Олигонуклеотидная

_ _ О- _ . жарта а схематичес-

; -»Т 4 кое изображение

-г* -"©г' ■ Т1-ГНК-азного гвд-

- т,.-щ*;^ ** ■ ; ролшзата гнк-з

' - ВА1-3

о ^ С=С7 «Э

Справа налево -первое направление, снизу вверх -; второе направление электрофореза

оо о

о

■-' Для выявления локализации обнаруженных различий,-ш сравнила оллгонуклеотидныв карты и субгвноиной РН.Н-4 всех трех штаммов.; В картине олигануклеотидных пятен РШЕ-4 по сравнению с РЕК-З: никаких: дополнительных изменений не быяхд- ■ лось.. Значит, сСнарухеяные различив в нуплеотлдных последовательностях локализованы на 3'-концевой частпГНК-З. На этсм основания1 можем-заключать, что-5*-концевая часть РНК-3 ксдирувдая 35 К белок, консервативна для всех трех атаммов. Поскольку изучаемые птаммн серологических различий не про»

", являпт, то очевидно, обнаруженные замены не затрагивав? важных антигенных детерюиант. Таким образом, метод.олигонукл&-отидного картирования пригоден для выявления тонкие различий „ меду близко родственники штаммами фптоЕИрусоэ,

На основании полученных результатов можем предположить, что различия,' обнаруженные б структуре геномных РНК-3 лат^ вийских штаммов EAT «огут играть роль при образовании раз- • ных сииггшов.

По современным представлениям считает, что все. три части геномной РНК вируса во взаимодействии с геноиоы хозяина вов.*. лечены в образование симптомов, хотя Ttao, Pramki /1982/ отмэ-* чают, что наибольшее влияние ка образование симптомов ока* эывавт РНК-2 и РНЙ-З ВШ. ' ■ , ...■*■

ЗАИИШНИЕ :

. Изучение биологических, серологических и фйЗййохидачео-ких свойств трех выделенных в Латвийской ССР иэолятов 'вируса асперыии томатов /ВАТ/ позволяет утверздать, что они являет- . ся стаммака этого'вируса, которые были названы ВАТ-I, ВАТ-2 ■ Ж ВАТ—3. Из них наиболее патогенным является ВА5>1. При заражения ЫТ-3 главной.Отличительной особенностью является ■ желтая мозаика. Латвийские штаммы вызывают сильно различающиеся реакциина xjpíafis и лебеде. -.

ШК и белки штйммой Имеет сходные физико-химические . свойства*' Серологически штемми также не отличается, однако -" выявлены различия в цуклеотидной последовательности геном-игг РЕШ-З методом "олпгояуклеотвднаго картирования, причем эта изменении сосредоточены в 3*-концевой половине РЕК, где закодирован белой ейолочки. : '

-19-_ ВЫВОДЫ

I. Спомашз индикаторных растений дифференцирована три ' шташа ВАТ /ВАТ-I,ВАТ-2, ВАТ-3/* которые отделаются но индуцированным симптокам.

" 2. Получены очищенные препараты всех трех латвийских штаммов ВАТ. пмешие типичные нуклеопротеидные спектра поглощения* не отличапциеея со физико-химическим свойствам вирио-нов и по морфологии частиц.

3..Получены шсокоспецифичные антисыворстки в ВАТ-I, ВАТ-2 и ВАТ-3. Приготовлены гамма-глобулиш и конънгага для проведения ИЬА. Методами двойной има^сдиффузии в геле и ИФА установлено* тао штаммы являются серологически вдентичными. Используя методы имыунсщиффузии в геле я "сэвдвич"-вариант ИЗА серологи-, ческсго родства мезду латвийскими штатами ВАТ'и БШ не доказано. Подобраны оптимальные условия определения ВАТ- в хризантемах,. ■ * -,

4. Установлено* что структурные белки оболочек ВАТ трех штаммов имеют одинаковые молекулярные - массы около 26000 Д»-

5. Доказано,. что при электрофоретячеониг исследованиях > ЕНК ВАТ-I . ВАТ-2 и ВАТ-3 не отлпаются. У всех птаимсв ВАТ -кроме трах геномных РНК и субгеномноа.РНВ-4 обнаружена минор—, ная ШК-5.. Молекулярные массы, фрагментов генома ВАТ* спреде— леннае но электрофоретичесжой додвтсшостя а ШАГ равны 1,26; I.IOr0.86 и 0,43 чД» соответственно..

6.Методом олагонуклеоивдного ' картирована! выявлена различия в. последовательности : нукяеотгдоа FEK-3 штаммов ВАТ, локализованные в 3* -конце. Выявленные шггммошг отличия в FSK-3 характерны ii.для V8&-4 данного-шташлз.'

... . ■ .. ■ . -го-. • . . -

Основное содержание диссертации отражено в следупцгх ; работах :

I. Дзиркале Л,Г., Родионова В.П. Сравнение методов выделения вируса аспераии томатов// Труда Латв.СХА, выпЛЗб -Елгава- 1977 - Ч.Х - С.38-43.

■ -'2. ЭглитеГ.К.. Дззфкале д.Т. Изучение инфевивонаости вируса аслермии томатов // Вредители сельскохозяйственных ■ культур и леса. Тезисы докладов научно-1£>актичесгой жшферев-тда по заащте растений - Рига- 1976 - C.I26-X27.

3. Дзиркале Д.Т..;Эгяите Г.К. Сравнение некоторых фпэи-ко-хишческих свойств вирусов асперкии канатов и огуречной мозаики // Сути дальнейшего.совершенствования,защиты растений ... в Белсруссии и республиках Прибалтики. Тезисы докладов научно-производственной конференции - йинск - 1979 - ч.1- C.II9-I20.

4* Дзиркале Л.Т* Исследования биозимичеояза: свойств представителей грушш кукумовируо ов // Пути интевсифшсасши картофелеводства, плодоводства я овощеводства . Тезисы докладов научно-практической кевфередаии - Ушек - 1981 - ч.П -С .105-106. : . ■..•'.,

S. Дзиркале Л/Г., Нгнаш Я.Р. Характеристика латвийских штаммов вируса аспермиа томатов // Труда Датв.СХА, вал. 191-Евгава- I98I- С .40-44..

" - 6. Дзиркале Л.Т., Родионова Н.1Г. . О физико-химических свойствах IHK вируса аспермип томатов // Труды Латв-СХА^ЕИ. 191 - Елгава - 1981 - С.44-4В.

7. Дзиркале Л.Т. Цадекудяркяя биология вируса аспермви томатов //'Тезисы докладов конференции биохимиков Прибалтийских республик,- Белорусской ССР'и Ленинграда - Рига - 1931-с.156-157'. • '• . ■.*■■.

■ 8.Дзиркале Л., Игнаш Я. Значение вирусов группы огуречной мозаики в псразеши томатов и огурцов // Пути дальнейшего совершенствования зашиты растений в республиках Прибалтики и Белоруссии . Тезисы докладов научно-производственной конференции - Рига - 1983 - ч.П- С.151-153.

9. Эглите Г.К.,.Дэиркале Л.Т., Фелдмане Г.Я.» Дук А.Э. Влияние двусниральной рибонуклеиновой кислоты на развитие вирусной инфекции в растениях И Изв. АН Латв.ССР- I986 - .TO-С,104-107.

10. A.Zaidaka» O.Skrodelis, L. Qrna, L.Ezirk&le, J.Gibis-tts Chromotograpbic.purification of antibodies and antibody-enzyme conjugates // Abstracts of presentations of the Budapest chromatography conference — Budapest -, 198?.'

•Дагркале Лага Теодоровна

СРАЕЕШШШЯ июяопгакш ИШШКО-ХШНЕСКАЯ ХАРАКГШЮТИКА ТРЕ£ ЕТАШОВ ВИРУСА ¿ПШМИ ТОМАТОВ

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано и печати 03,12.87. Я1 - 09431 Ооркат бумаги 60x84 . Бумага писчая белая. Офсетная печать. 1,0 уч..-игд.л. 1,3 $дз.' печ.л. Тирах'100 экз. 'Заказ Л 475 Бесплатно.

Институт микробиологи: и'вируссдогйи им. Д.К.Заболотного 252143, 1йев-КЗ,ул.Заболотного,26

Отпечатано на ротапринте 1СХА, 225600,Еягаза,ул.Ленина 2