Сравнение механизмов протекторного действия L-глутаминовой кислоты и гексапептида TGENHR на TNF-индуцированную гибель клеток линии HL-60

Гибанова, Наталья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнение механизмов протекторного действия L-глутаминовой кислоты и гексапептида TGENHR на TNF-индуцированную гибель клеток линии HL-60
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнение механизмов протекторного действия L-глутаминовой кислоты и гексапептида TGENHR на TNF-индуцированную гибель клеток линии HL-60"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт бноорганичсской химии им. академиков М. М. Шемякина и ТО. А. Овчинникова

Па правах рукописи ГИБАНОВЛ НАТАЛЬЯ В.ТАДИМНРОВИА

СРАВНЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ Х-ГЛУТАМННОВОЙ КИСЛОТЫ И ГЕКСАПЕПТИДА ТСЕХШ* НА Тда-ИНДУЦИРОВАННУЮ ГИБЕЛЬ КЛЕТОК ЛИНИИ ПЬ-60

03.00.03.- Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории белков гормональной регуляции Инсппу га бпоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.Л. Овчинникова РАТ-Г

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат химических наук H.A. Костанян

член-корреспондент РАН. доктор химических наук, профессор Л.Г. Габибов

кандидат химических наук М.Л. Грудень

Институт биологии гена РАН

Защита состоится« >> _____2006 г. в 10 часов на заседании

Специализированного совета Д002.019.01 при Институте биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина п Ю.Л. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-7. Москва 13-437, ул. Миклухо-Маклая, 16. 10.

С диссертаций можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН

Автореферат разослан «

_2006г

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук, профессор

В.А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Апоптоз является естественным физиологическим процессом, необходимым как для развития, так и для поддержания тканевого гомеостаза, эмбриогенеза и функционирования различных дифференцированных клеток. Восприимчивость клеток миелоидного ряда к цитотоксическим агентам зависит от степени их дифференцированное™. При этом до сих пор остается невыясненной точная взаимосвязь между клеточной дифференцировкой и апоптозом из-за того, что механизмы, контролирующие эти процессы, отчасти, используют схожие метаболические пути. В связи с этим, выяснение механизмов, регулирующих развитие аполтоза в опухолевых недифференцированных и нормальных дифференцированных клетках, является одним из ключевых аспектов при лечении больных различными формами лейкоза. Известно, что в процессе клеточной дифференцировки клетки миелоидного ряда становятся устойчивыми к действию целого ряда индукторов апоптоза. Так было показано, что обработка клеток НЬ-60 промиелоцитарного лейкоза такими известными индукторами дифференцировки, как форболовые эфиры, полностъю-транс-ретиноевая кислота, витамин Эз или диметилсульфоксид приводит к развитию резистентности клеток к различным апоптотическим стимулам, в том числе и к цитотоксичному действию фактора некроза опухоли альфа ТЫР-а(8огс1е1 1999, Ке^еу 1997, КлкисЫ 1996, Уоп(1гасек 2001).

ЮТ-а - многофункциональный цитокин, принадлежащий к семейству ТЫГ-лигандов, секретируется многими типами клеток. ТКТ-а является физиологическим индуктором таких процессов, как гибель клеток в результате апоптоза или некроза, клеточная дифференцировка, гемопоэз, а также участвует в регуляции и реализации иммунных и воспалительных реакций. Терапевтическое применение ТЫР-и в качестве противоопухолевого агента осложнено из-за его общей высокой токсичности, связанной с широким спектром биологических активностей этого цитокина. Поэтому одним из подходов к использованию этого цитокина для лечения злокачественных новообразований является поиск агентов, которые снижали бы его токсическое действие, но позволяли бы сохранить его противоопухолевую активность. В последние годы активно разрабатываются терапевтические методы на основе комбинаторного применения этого цитокина с различными индукторами дифференцировки либо химического (полностью-транс-ретиноевая кислота, диметилсульфоксид, форболовые эфиры), либо биологического происхождения (ростовые факторы СМ-СЯИ и С-СЭР, интерферон), что способствует

усилению дифференцирующего эффекта на опухолевые клетки при снижении токсического действия TNF-a на организм. Такими соединениями могут оказаться гексапептид TGENHR и ¿-глутаминовая кислота, являющиеся индукторами гранулоцитарной дифференцировки клеток миелоидного ряда.

Гексапептид TGENHR (HLDF-6) является фрагментом эндогенного фактора дифференцировки клеток линий HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor), который полностью воспроизводит дифференцирующую активность полноразмерного фактора. Установлено, что в основе механизма действия HLDF-6 на клетки HL-60, не имеющего собственного рецептора на поверхности клеток, лежит его способность взаимодействовать с липидным компонентом клеточных мембран. В ходе исследований было обнаружено, что наряду с дифференцирующей активностью, гексапептид обладает ярко выраженными протекторными свойствами. HLDF-6 предохраняет от дегенерации клетки Пуркинье червя мозжечка крыс in vivo и гранулярные нейроны мозжечка крыс in vitro при индуцируемой химической гипоксии (Жохов 2004). Кроме того, гексапептид повышает устойчивость клеток IIL-60 и мышиных эмбрионов к холодовому шоку и ионизирующей радиации (Гончаренко 2002). Было также продемонстрировано нейропротекторное действие этого пептида на моделях болезни Альцгеймера in vivo и in vitro (Костанян 2005). Была показана важная роль ¿-глутаминовой кислоты в составе этого пептида, замена, которой приводила к исчезновению биологической активности HLDF-6 (Костанян 2000). Кроме того, было обнаружено, что свободная ¿-Glu, как и пептид, проявляет антипролиферативное и дифференцирующее действие на клетки HL-60, при отсутствии специфических рецепторов на мембране клеток этой линии (Kostanyan 1998).

Целью работы являлось сравнительное изучение влияния гексапептида TGENHR (HLDF-6) и ¿-глутаминовой кислоты на процессы дифференцировки и апоптоза, вызываемые действием TNF-a на клетках линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека. В рамках этой работы были поставлены следующие задачи: 1) выяснение характерных особенностей дифференцирующего действия гексапептида HLDF-6, ¿-Glu и TNF-a; 2) исследование влияния гексапептида HLDF-6 и ¿-Glu на клеточную гибель, вызываемую действием TNF-a; 3) изучение молекулярного механизма действия HLDF-6 и ¿-Glu на TNF-опосредованную клеточной гибель.

Объем работы

Диссертационная работа изложена на 101 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части,

выводов и списка литературы. Работа содержит 13 рисунков, 4 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 237 наименований.

Научная новизна и практическая ценность работы

В настоящей работе впервые показано, что при обработке клеток HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека фактором некроза опухоли альфа (TNF-a) в сочетании с гексапептидом HLDF-6 или Z-глутаминовой кислотой усиливается процесс дифференцировки, о чем свидетельствует восстановление ряда секреторных функций в клетке. При этом HLDF-6 и Z-Glu оказывают протекторный эффект на TNF-индуцированную гибель клеток HL-60. Установлено, что гексапептид повышает устойчивость клеток линии HL-60 к цитотоксичному действию TNF-a за счет ингибирования апоптотического сигнала на одном из этапов митохондриального пути, тогда как протекторный эффект Z,-Glu связан с блокированием проведения TNF-опосредованного цитотоксического сигнала на этапе образования лиганд-рецепторного комплекса. Полученные результаты открывают перспективу для использования HLDF-6 и ¿-глутаминовой кислоты в онкологии при TNF-терапии опухолей, поскольку усиливают дифференцирующую активность TNF-a при снижении его токсического действия в случае ¿-Glu.

Апробация полученных результатов.

Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: X Юбилейная международная конференция «Новые информационные технологии в медицине и экологии-2002» (IT+Me'2002), 2002; VI чтения, посвященные памяти Ю.А. Овчинникова, 2002; «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», 2003; Tenth German-Russian Peptide Symposium, 2003; Российский симпозиум по химии и биологии пептидов, 2003; 7 International Symposium on Biomolecular Chemistry (ISBOC-7), 2004; XII Международной Конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии -2004» (1Т+Ме'2004), 2004; 3rd International and 28th European Peptide Symposium, 2004; Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова, 2004; XVIII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2006; XVI Международная конференция «Новые информационные технологии в медицине и экологии - 2006» (1Т+Ме'2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование дифференцирующей активности гексапептида TGENHR. ¿-глутаминовой кислоты и TNF-a на клетках линии H 1,-6(1

С помощью стандартного NBT-теста было обнаружено, что гексапептид HLDF-6, ¿-Glu и TNF-a индуцируют дифференцировку клеток HL-60, о чем свидетельствует двукратное увеличение количества клеток, способных восстанавливать нитроголубой тетразолий при инкубации с исследуемыми агентами в течение 72 ч (рис. 1 а, б). Одновременная обработка HL-60 клеток либо TNF-a и HLDF-6, либо TNF-a и ¿-Glu приводила к достоверному, хотя и не аддитивному увеличению количества NBT-позитивных клеток, что явно указывает на усиление процесса дифференцировки.

Рис. 1. Результаты NBT-теста клеток HL-60, обработанных (a) TNF-a (1мкг/мл); HLDF-6 (10 мкМ); либо TNF-a (1 мкг/мл) и HLDF-6 (10 мкМ); (б) TNF-a (1мкг/мл), i-GIu (1 мкМ); либо с TNF-a (1 мкг/мл) и i-Glu (1 мкМ) в течение 72 ч, выраженные в процентах. Контролем служили клетки, инкубируемые с PBS. Приведены средние значения трех независимых экспериментов ;LS.D. */'<0,05 - статистически достоверное увеличение процента NBT-позитивных по сравнению с клетками, обработанными только TNF-a

Учитывая, что HL-60 является плюропотентной клеточной линией, которая дифференцируются либо по моноцит/макрофагальному (под действием TNF-a, витамина D3), либо по гранулоцит/нсйтрофильному пути (под действием полностью-транс-ретиноевой кислоты, диметилсульфоксида) был проанализирован фенотип дифференцированных клеток методом цитофлуориметрического анализа. Анализ изменения экспрессии маркера моноцитарной дифференцировки CD 14 показал, что при инкубации клеток с TNF-a в течение 72 ч значительно увеличивалось количество СШ4-позитивных клеток (табл. 1). При обработке клеток TNF-a и HLDF-6 количество СБ14(+)-клеток достоверно не изменялось по сравнению с эффектом одного TNF-a. В присутствии Z-Glu и TNF-a количество CD14(+)-icneTOK достоверно увеличивалось, что свидетельствует об усилении моноцитарного типа дифференцировки.

во

Таблица 1, Влияние HLDF-6, ¿-Glu и TNF-a на экспрессию маркеров дифференцировки

CD14 и CD16

индуктор % CD14(+)-клеток* %CD16(+)-клеток*

контроль 2,8 ±0,4 22,0 ±0,6

TNF-a 54,6 ± 0,7 32,7 ±0,8

HLDF-6 3,0 ±0,6 21,1 ±0,4

TNF-a + HLDF-6 51,1 ±0,8 34,2 ± 1,4

¿-Glu 2,5 ± 0,2 22,8 ±1,3

TNF-a + L-Glu 57,2 ±0,8* 28,9 ± 1,5

"Количество CD14(+)- и CD16(+)- клеток определяли с помощью цитофлуориметрического анализа после окрашивания РЕ-меченным антителами к CD 14 и CD 16.

Инкубация клеток HL-60 с TNF-a (1 мкг/мл); HLDF-6 (10 мкМ); либо с TNF-a (1 мкг/мл) и HLDF-6 (10 мкМ); ¿-Glu (1 мкМ); либо с TNF-a (1 мкг/мл) и ¿-Glu (1 мкМ) проводилась 72 ч. Приведены средние значения трех независимых экспериментов + S.D.

* Р<0,05 - статистически достоверное увеличение количества СБМ-позитивных клеток по сравнению с клетками, обработанными только TNF-a

Используя аналогичный подход, было проанализировано влияние исследуемых индукторов на экспрессию маркера CD16. Под действием TNF-a количество СБ16-позитивных клеток увеличивалось почти в 1,5 раза. Количество клеток с фенотипом CD16(+) и CD14(+) достоверно не менялось под действием, как пептида HLDF-6, так и аминокислоты. При их одновременном воздействии количество СШ6(+)-клеток в культуре практически не отличалось от количества клеток в культуре HL-60, обработанных одним цитокином. Как известно, CD 16 экспрессируется моноцитами и нейтрофилами, находящимися на стадии терминальной дифференцировки (Вгасктап 1995). Дифференцированные по гранулоцитарному пути клетки HL-60 отличаются от своих зрелых аналогов и не всегда экспрессируют те же антигены. Даже при обработке клеток HL-бО таким сильным индуктором гранулоцитарной дифференцировки, каким является полностью-транс-ретиноевая кислота, экспрессия CD 16 не менялась (Tohyama 2003).

Исследование экспрессии двух других поверхностных антигенов CDllb и CD 114 (G-CSFR) под действием исследуемых индукторов анализировалась методом обратной транскрипции ПЦР (RT-PCR). В качестве внутреннего стандарта использовали кДНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). Как и следовало ожидать при инкубации клеток в течение суток,■ экспрессия CDllb, маркера дифференцировки клеток HL-60 (Vondracek 2001, Drayson 2001), усиливалась под действием гексапептида, ¿-Glu, и под

действием ТЫР-а, причем при костимуляции количество транскрипта было выше (рис. 2. Б, 3, Л). О гранулоцитарном типе дифференцировки под действием пептида П1ЮТ-6 свидетельствуют данные, полученные при изучении влияния исследуемых веществ на экспрессию СБ 114, маркера ранней стадии гранулоцитарной дифференцировки ^еттап 1994).

12 3 4

" 274

495

Рис. 2. Результаты ПЦР на суммарной кДНК, полученной из клеток HL-60, обработанных: (1) PBS; (2) TNF-a (1 мкг/мл); (3) HLDF-6 (10 мк-М), (4) TNF-a(l мкг/мл) и HLDF-6 (10 мкМ) в течение 24 ч. Панель А - продукты ПЦР на матрице кДНК рецептора CD114. Панель Б - продукты ПЦР на матрице кДНК антигена CD 11 b. Панель В - контрольный ПЦР на матрице кДНК GAPDH.

12 3 4

Рис. 3. Результаты ПЦР на суммарной кДНК, полученной из клеток HL-60, обработанных: (1) PBS; (2) TNF-a (1 мкг/мл), (3) HLDF-6 (10 мкМ); (4) TNF-a (1 мкг/мл) и HLDF-6 (10 мкМ) в течение 24 ч. Панель А - продукты ПЦР на матрице кДНК рецептора CD1 lb. Панель Б - контрольный ПЦР на матрице кДНК GAPDH.

Уровень экспрессии мРНК CD114 после инкубации клеток с TNF-a в течение 24 ч сопоставим с контрольным уровнем, что согласуется с многочисленными данными о преобладании моноцитарного типа дифференцировки под действием этого цитокина (Squinto 1989, Bergamaschi 1990). При воздействии HLDF-6, индуктора гранулоцитарной дифференцировки, наблюдалось увеличение количества транскрипта. При одновременной обработке клеток TNF-a и пептидом количество транскрипта антигена CD114 резко повышалось (рис. 2 А). В случае обработки клеток ¿-Glu и TNF-a, как и одной ¿-Glu, заметного эффекта на экспрессию антигена CD114 не отмечалось (данные не представлены).

Таким образом, при костимуляции клеток гексапептидом HLDF-6 и TNF-a происходит усиление HLDF-6-индуцированной нейтрофил/гранулоцитарной дифференцировки, тогда как ¿-Glu усиливает TNF-опосредуемую моноцитарную дифференцировку.

2. Гексапептид TGENHR и ¿-глутаминовая кислота повышают TNF-опосредуемую активацию фоефолипазы С

Процесс дифференцировки клеток HL-60, вызываемый целым рядом индукторов, сопряжен с активацией ферментов, участвующих в фосфатидилинозитидном цикле (Pi-cycle) (Zauli 1996, Bertagnolo 1997, Marchisio 1998). При клеточной дифференцировке происходит транслокация в ядро и активация различных изоформ фосфатидилинозит-специфической фоефолипазы С: четырех форм PI-PLC-h семейства (-hl, -h2, - h3, and -h4) и двух членов семейства PI-PLC-g (-gl и -g2) (Neri 1999, Bertagnolo 1998). Было показано увеличение уровня активности PI-PLC-h2 и - h3 в ядрах при инкубации клеток с полностъю-транс-ретиноевой кислотой, либо с витамином D3, а также аккумуляция изоформы PI-PLC-g 1 в ядрах в процессе созревания гранулоцитов (Brugnoli 2004). Фосфолипаза С расщепляет один из ключевых мембранных фосфолипидов фосфатидилинозит-4,5-дифосфат (PIP2) с образованием двух соединений, являющихся внутриклеточными вторичными мессенджерами - диацилглицерин (DAG), активатора цитозольной протеинкиназы С (РКС), и инозиттрифосфат (IP3), повышающего содержание внутриклеточного Са2+.

Следующим этапом исследования механизма действия гексапептида HLDF-6 и ¿-Glu на проведение TNF-опосредованного сигнала было изучение влияния исследуемых индукторов на активность PI-PLC, которую оценивали по изменению суммарной внутриклеточной концентрации инозитмоно- и дифосфатов, так как инозиттрифосфат нестабилен и гидролизуется до IP2. TNF-a, как и пептид HLDF-6, не влиял на активность фоефолипазы С (рис. 4 а). Под действием ¿-глутаминовой кислоты наблюдалась небольшое увеличение активности PI-PLC (рис. 4 б). Одновременная стимуляция клеток как TNF-a и HLDF-6, так и TNF-a и ¿-Glu приводила к значительному увеличению уровня активности фермента. Полученные результаты указывают на то, что хотя исследуемые агенты являются индукторами дифференцировки, однако их индивидуальное дифференцирующее действие не сопряжено с активацией фоефолипазы С, в отличии от процесса дифференцировки при костимуляции клеток как TNF-a и HLDF-6, так и TNF-a и Л-Glu. Данные о механизме регуляции активности PI-PLC фактором некроза опухоли и на сегодняшний день остаются противоречивыми, так одна группа исследователей сообщает об активировании цитокином этой фоефолипазы (Beyaert 1993), другая указывает на ингибиторную роль в фосфоинозитных сигнальных путях (Condliffe 1998, Kozawa 1997).

HLDF-6 TNF-OI + HlDf-6

!0 •

TNF4 + L-Clu

Рис. 4. Изменение суммарной активности фосфолипазы С в клетках HL-60 при действии на них (а) HLDF-6 (10 мкМ) и (б) L-Glu (1 мкМ) в присутствии TNF-a (1 мкг/мл). По оси ординат -концентрация IP и 1Р2 по отношению к контролю, выраженная в процентах. Приведены средние значения трех независимых экспериментов + S.D. *Звездочкой отмечен статистически достоверный результат (Р< 0,05).

Несмотря на это, информация об участии РГ-РЬС имеет большое значение при изучении передачи сигналов семейством ТИИ-а в некоторых типах клеток, особенно при исследованиях влияния клеточного окружения.

3. Гексапептид TGENHR и ¿.-Glu усиливают TNF-опосредованную экспрессию эндогенного фактора некроза опухоли

Эндогенный TNF-a является аутокринным фактором дифференцировки, блокирование его биосинтеза в процессе дифференцировки стволовых клеток ростовым фактором GM-CSF вызывало усиление их пролиферации (Williams 1997). Повышение секреции эндогенного TNF-a является одним из признаков дифференцировки клеток миелоидного ряда и сопряжено с повышением уровня экспрессии факторов клеточной адгезии и увеличением продукции свободных радикалов кислорода и оксида азота (Witsell 1992). Биосинтез эндогенного TNF-a является также одной из причин развития резистентности миелоидных клеток к стрессовым воздействиям (ультрафиолет, липосахарид, экзогенный TNF-a) (Hachiya 1997, Zyad 1994, Rogers 2001). Мы исследовали влияние гексапептида и ¿-Glu на способность экзогенного TNF-a регулировать экспрессию эндогенного TNF-a. Качественная оценка экспрессии гена tnf-a методом RT-PCR не дала однозначных результатов. Поэтому было решено провести количественный анализ экспрессии этого гена с помощью метода полуколичественной конкурентной ПЦР (QC-RT-PCR). Для проведения ПЦР были синтезированы конкурентные матрицы (конкуренты), не гомологичные исследуемым матрицам, но имеющие с ними общие последовательности для отжига

праймеров. Для оценки уровня экспрессии TNF-a проводилось предварительное выравнивание количества суммарной кДНК тестируемых образцов по уровню экспрессии GAPDH, концентрация которой во всех образцах предварительно также была проанализирована с помощью конкурентной ПЦР. Анализ показал, что количество транскрипта эндогенного TNF-a в ходе инкубации с исследуемыми индукторами изменялось поэтапно. На начальной стадии инкубации клеток (1 ч) с TNF-a, либо с TNF-a и гексапептидом HLDF-6, либо с TNF-a и ¿-Glu количество транскрипта резко увеличивалось, затем также резко снижалось к 4 ч инкубации. Причем при костимуляции уровень его экспрессии усиливался более чем в два раза в случае инкубации с гексапептидом по сравнению с эффектом одного TNF-a, и почти двукратно в случае Z-глутаминовой кислоты (рис, 5 а, б). После обработки клеток в течение суток наблюдалось вторичное пролонгированное повышение секреции эндогенного TNF-a, характерное уже для клеток, претерпевших начальную стадию дифференцировки. Но если TNF-a вызывал лишь двукратное увеличение уровня экспрессии эндогенного фактора некроза опухоли к 48 ч, то в присутствии гексапептида количество мРНК этого эндогенного цитокина возрастало уже к 24 ч более чем в 6 раз. В присутствии цитокина и аминокислоты вторая волна экспрессии эндогенного TNF-a начиналась позже, к 48 ч инкубации, при этом количество транскрипта превышало контрольный уровень в 5 раз, а к 72 ч - более чем в 8 раз.

3230 3000 2600 2600 г 2400 I 2200 Î- В 2000 ! & «00 L s 1600

i S

; о 1200

! * looo

! 800

BTNF-a О HLDF-6 BTNF-a+HLDF-6

шЛ

2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000

■ TNF-a OL-Glu

□ TNF-a+L-G lu

ti ii

■р«мя ИНКуМЦИИ, M

Рис. 5. Изменения уровня экспрессии эндогенного TNF-a под действием HLDF-6 (а) и L-Glu (б), проведенный методом конкурентной ПЦР. кДНК получали из клеток, обработанных TNF-a (1 мкг/мл); HLDF-6 (10 мкМ); либо с TNF-a (1 мкг/мл) и HLDF-6 (10 мкМ); t-Glu (1 мкМ); либо с TNF-a (1 мкг/мл) и L-GIu (1 мкМ) в течение указанного по оси абсцисс интервала времени. Контролем служили клетки, инкубируемые с PBS. По оси ординат - относительное количество транскрипта эндогенного TNF-a, выраженное в процентах от его содержания в контрольных клетках.

Уровень экспрессии эндогенного ТОТ-а достоверно не менялся (рис. 5. а) при индивидуальном действии как гексапептида, так и ¿-С1и (рис. 5. б). Следовательно,

усиление процесса TNF-индуцированной дифференцировки клеток HL-60 как при действии гексапептида, так и ¿-глутаминовой кислотой сопровождается пролонгированным во времени повышением секреции эндогенного TNF-a, что также свидетельствует об усилении дифференцировки клеток.

Таким образом, при обработке клеток HL-60 промиелоцитарного лейкоза либо пептидом HLDF-6, либо ¿-Glu идет TNF-опосредованное восстановление секреторных функций в клетке, что характерно для дифференцированных клеток миелоидного ряда.

4. Влияние пептида TGENHR, ¿-глутамииовой кислоты и TNF-a на цикл клеточного деления

Процесс дифференцировки клеток миелоидного ряда сопровождается изменением цикла клеточного деления: клетки аккумулируются в фазе Go (фазе покоя), а количество клеток в фазе S (фазе синтеза ДНК) уменьшается (Ketley 2000). Для определения влияния исследуемых агентов на цикл клеточного деления клетки анализировались на содержание дуплицированной и недуплицированной ДНК с использованием флуоресцентного красителя пропидиум иодида методом цитопроточной флуориметрии. Анализ клеточного цикла показал, что гексапептид, ¿-Glu и TNF-a вызывали преимущественный переход клеток в фазу Go/Gi и уменьшение доли клеток, находящихся в стадии S (рис. 6 а, б). При совместной инкубации клеток либо с TNF-a и гексапептидом, либо с TNF-a и ¿-Glu наблюдалось значительное увеличение количества клеток на стадии Go. Процент клеток, находящихся в S-фазе, был несколько выше, чем в случае действия одного TNF-a, но ниже, чем в случае одного пептида или аминокислоты. В тоже время количество гиподиплоидных (апоптотических) клеток при костимуляции не отличалось от контроля. Хотя в присутствии HLDF-6, как и ¿-Glu, увеличивалось количество клеток, находящихся в стадии G2/M, однако это не связано с усилением пролиферации, поскольку ранее нами было показано, что гексапептид и аминокислота ингибируют включение Н3-тимидина (Костанян 2000, Астапова 1999). Считается, что при дифференцировке аккумуляция клеток в G2/M фазе клеточного цикла предшествует переходу в Go/Gi фазу при снижении количества клеток, находящихся в S-фазе (Laskin 1991). Используемый подход не позволял нам определить количество клеток в G2 и M фазах по отдельности, однако было показано, что дифференцировка клеток миелоидного ряда, индуцируемая форболовыми эфирами, сопровождается аккумуляцией клеток в Ог-фазе, а переход в фазу митоза блокируется (Klingler-Hoffmann 2005, Kinzel 1988).

Bcy6-G1 ■ G0/G1 □ S

OG2/M *

TNF-«+L-Clu

Рис. 6. Влияние TNF-a, HLDF-б (a) и /.-Glu (б) на цикл клеточного деления. Анализ проводили методом цитофлуориметрического анализа после предварительного окрашивания клеток пропидиум иодидом. Инкубация клеток HL-60 с TNF-a(l мкг/мл); HLDF-6 (10 мкМ); либо с TNF-a(l мкг/мл) и HLDF-б (10 мкМ); ¿-Glu (1 мкМ); либо с TNF-a (1 мкг/мл) и ¿-Glu (I мкМ) проводилась в течение 48 ч. Приведены средние значения трех независимых экспериментов +_S.D.

*Р<0,05 - статистическое достоверное увеличение процента клеток в фазе Go по сравнению с контролем.

Задержка клеток на фазе G2/M свидетельствует об активации процессов, связанных со структурными перестройками ДНК, с ее репарацией, что предупреждает гибель клеток (Ketley 2000).

Поскольку при костимуляции клеток HL-60 либо TNF-a и HLDF-б, либо TNF-a и ¿-Glu в течение суток уменьшался процент клеток в фазе, отражающей количество гиподиплоидных (апоптотических) клеток по сравнению с действием одного цитокина (рис. 6 а, б), то мы предположили, что одновременная обработка HL-60 клеток TNF-a и либо HLDF-б, либо ¿-Glu приводит к потере восприимчивости клеток этой линии к цитотоксичному действию TNF-a.

5. Исследование влияние гсксапептида TGENHR и ¿-глутаминовон кислоты на TNF-индуцированную гибель HL-60 клеток

Протекторное действие гексапептида HLDF-б и ¿-глутаминовой кислоты на TNF-индуцированную цитотоксичность дополнительно проверялось еще двумя независимыми методами — окрашиванием клеток трипановым синим и цитопроточной флуориметрией (двойным окрашиванием клеток FITC-меченным аннексином V и пропидиум иодидом).

В первом случае клетки инкубировали с исследуемыми индукторами в течение 4, 24 и 72 ч. Обработка клеток TNF-a приводила к значительному увеличению числа погибших клеток в течение 24 и 72 ч, гексапептид и ¿-Glu не оказывали влияния на процесс гибели клеток (рис 7 а, б). Однако, в присутствии как HLDF-б, так и ¿-Glu наблюдалось увеличение устойчивости клеток к цитотоксическому действию TNF-a

TNF-e+HLDF-6

контроль TNF-a

' fÎl

I »• ■

Т I

£ "" И I

TNF-в

Рнс. 7. Влияние на TNF-индуцируемую (1 мкг/мл) гибель клеток HL-60 гексапептида HLDF-6 (10 мкМ) (а) и ¿-Glu (1 мкМ) (б). Количество погибших клеток определяли методом окрашивания трипановым синим после инкубации клеток в течение указанного времени. По оси ординат приведено количество погибших клеток в опытном образце с учетом погибших клеток в контроле, выраженное в процентах, трех независимых экспериментов + S.D.

Эти данные были подтверждены цнтофлуориметрическнм анализом клеток HL-60 после 24ч инкубации (табл. 2). Было установлено, что TNF-a повышает количество анексин-У(+) и Р1(+) клеток, т.е. клеток, в которых произошла индукция апоптоза, в то время как, ни гексапептид, ни ¿-Glu индукторами апоптоза не являются. Одновременная стимуляция клеток TNF-a либо гексапептидом, либо ¿-Glu приводила к снижению количества апоптотических клеток практически до контрольного уровня.

Табл. 2. Влияние TNF-a, HLDF-6 и ¿-Glu на количество апоптотических клеток

индуктор % апоптотических клеток*

контроль 7,6 ±1,1

TNF-a 21,5 + 3,3

HLDF-6 9,3 ± 1,3

TNF-a + HLDF-6 10,4+1,6

¿-Glu 9,5 ±1,4

TNF-a + ¿-Glu 7,2+ 1,0

"Количество апоптотических клеток определяли с помощью цитофлуориметрического анализа после двойного окрашивания FITC-меченным аннексином V и пропидиум иодидом. Инкубация клеток HL-60 с TNF-a (1мкг/мл); HLDF-6 (10 мкМ); либо с TNF-a (1мкг/мл) и HLDF-6 (10 мкМ); ¿-Glu (1 мкМ), либо с TNF-ct(1 мкг/мл) и ¿-Glu (1мкМ) проводилась в течение 24 ч. Приведены средние значения трех независимых экспериментов +.S.D.

Следовательно, дифференцирующее действие как HLDF-6, так ¿-глутаминовой кислоты способствует снижению восприимчивости HL-60 клеток к цитотоксичному действию TNF-a.

6. Исследование влияния TGENHR и ¿-Glu на TNF-индуиируемую активацию транскрипционного фактора Гч К-кВ

Молекулярный механизм развития резистентности клеток к цитотоксичному действию TNF-a еще не достаточно изучен в отличие от детально охарактеризованного процесса гибели, вызываемого этим цитокином. После связывания с TNF-a передача сигнала рецептором TNF-R1 приводит к образованию двух пространственно независимых молекулярных комплексов (Micheau 2003). Взаимодействие TNF-a с рецептором в течение первых нескольких минут ведет к формированию «комплекса I»,- содержащего рецептор и адапторные белки RIP1 (Receptor-Interacting Protein), TRAF2 (TNF Rcceptor-Associated Factor) и TRADD (TNF-Rl-Associated Death Domain Protein). Такой комплекс преобразует сигналы, ведущие к активации транскрипционного фактора NF-кВ и/или стресс-активируемых протеинкиназ (SARKs/JNK) (Poyet 2000). На более позднем этапе проведения сигнала после стимуляции происходит диссоциация «комплекса I», и формируется «комплекс II» (DISC или «комплекс смерти»), в состав которого входит также адапторный белок FADD (Fas-Associated Death Domain Protein) и прокаспаза-8. «Комплекс I» выполняет регуляторную роль за счет активации NF-кВ, контролирующего экспрессию антиапоптотических генов, тем самым, определяя возможность «комплекса II» индуцировать апоптоз (Micheau 2003).

Наиболее простым кажется предположение о том, что действие гексапептида и аминокислоты сопряжено с их влиянием на биосинтез рецепторов TNF-R1 и TNF-R2. Однако анализ экспрессии рецепторов TNF-a показал, что при инкубации клеток HL-60 с TNF-a, либо с TNF-a и гексапептидом HLDF-6, либо с TNF-a и ¿-Glu уровень мРНК рецепторов значительно не менялся, что было установлено нами методом полуколичественной конкурентной ПЦР (данные не представлены). Поэтому следующим этапом наших исследований было изучение влияния TNF-a, HLDF-6 и ¿-Glu на активацию NF-кВ, так как одной из причин возникновения резистентности клеток к действию многих индукторов алоптоза является изменение уровня активности транскрипционного фактора NF-кВ. Каскад реакций, приводящих к индукции NF-кВ, включает фосфорилирование регуляторного комплекса киназ, который, в свою очередь, фосфорилирует белок

IkB - ингибитор транскрипционного фактора NF-кВ. Это приводит к высвобождению и транслокации в ядро активных субъединиц NF-кВ - RelA/p65 и ReIB/p68.

TNFa TNFa + HLDF-6 TNFa + L-Glu

P-IKK m f§ «я Ш * v 4 » , m . л y ., : —

IKK ш т/ wê t 4 »> m ~

p-p65 — |

P65 тчтшштт

GAPDH — I—i mu llllllli — —' '........ it..... ........ it- ........— ' пищ, ш ш

время, ч 1/2 1 4 1/2 1 4 1/2 14

Рис. 8. Иммуноблот-анализ комплекса киназ IKK и RelA/p65 и их фосфорилированных форм р-1КК и р-р65 соответственно. Показано, изменение уровня фосфорилирования при инкубации клеток HL-60 с исследуемыми индукторами, которое оценивали с помощью антител к комплексу киназ IKK, к субъединице RelA/p65 и их фосфорилированным формам: (-) клетки, инкубируемые с PBS;

(+) клетки, инкубируемые с TNF-a (1 мкг/мл), либо с TNF-a (1 мкг/мл) и HLDF-6 (10 мкМ), либо с TNF-a ( 1 мкг/мл) и ¿-Glu ( 1 мкМ) в течение 30 мин, 1 и 4 ч.

Транскрипционная активность фактора NF-кВ коррелирует со степенью фосфорилирования RelA/p65 по остатку серина 536 (Vermeulen 2002). Активацию NF-кВ оценивали по увеличению уровня фосфорилирования регуляторного комплекса киназ (IKK) и транскрипционно-активной субъединицы RelA/p65 методом иммуноблот-анализа. Антитела к GAPDH использовали для оценки количества суммарного белка. Обработка клеток в течение 30 мин и 1 ч TNF-a приводила к значительному повышению уровня фосфорилирования комплекса киназ IKK, в ходе дальнейшей инкубации уровень фосфорилирования снижался до контрольного (рис. 8). Присутствие пептида не оказывало заметного влияния на TNF-индуцируемый процесс фосфорилирования комплекса киназ. Аналогичные результаты были получены при оценке степени фосфорилирования субъединицы RelA/p65. В присутствии ¿-Glu процесс фосфорилирования IKK и ReIA/p65, индуцируемый TNF-a, полностью блокировался (рис. 8). Следует отметить, что уровень экспрессии белков комплекса киназ и RelA/p65 в ходе инкубации не изменялся. При обработке клеток только пептидом, либо только глутаминовой кислотой уровень фосфорилирования IKK и RelA/p65 был сопоставим с контрольным (данные не представлены).

Следовательно, механизм протекторного действия гексапептида HLDF-б не связан с его влиянием на активность NF-кВ, то есть в присутствии пептида сохраняется проведение TNF-опосредованного сигнала посредством «комплекса I», которое блокируется в случае ¿-глутаминовой кислоты.

7. Влияние TGENHR и ¿-Glu на TNF- опосредуемую активацию каспазы-3 и каспазы -8

Для изучения влияния гексапептида и ¿-глутаминовой кислоты на проведение TNF-апоптотического сигнала посредством «комплекса II», было исследовано участие этих индукторов в активации инициаторной каспазы-8, а также ключевой эффекторной каспазы-3 колориметрическим анализом. Обработка клеток TNF-a в течение суток приводила к значительному повышению активности как каспазы-3 (рис. 9 а, б), так и каспазы-8 (рис. 9 в, г).

TNF-a HLDF-в TNF-wHLCf-в TNF-a L-Glu TNF-« + L-Glu

TNF-« HLDF-6 TNF-OHHLOF-e TNF-* L-Glu TNF-a.L-Gki

Рис. 9. Влияние HLDF-6 (а, в) и ¿-Glu (б, г) на активацию каспазы-3 (а, 6) и каспазы-8 (в. г) в присутствии TNF-a Активность каспаз оценивали колориметрически по появлению п-нитроанилина (pNA) в результате гидролиза модифицированных субстратов каспазы-3 (Ac-DEVD-p-NA) и каспазы-8 (Ac-IETD-pNA) после инкубации с клеточными лизатами. Инкубация клеток HL-60 с TNF-a (1 мкг/мл); HLDF-6 (10 мкМ); либо с TNF-a (1 мкг/мл) и HLDF-6 (10 мкМ); ¿-Glu (1 мкМ); либо с TNF-a (1 мкг/мл) и ¿-Glu (1 мкМ) проводилась в течение 24 ч. Количество образовавшегося n-нитроанилина в контрольных образцах принимали за 100 %. Приведены средние значения трех независимых экспериментов + S.D.

В присутствии пептида, который сам по себе не влиял на активность этих ферментов, TNF-индуцируемая активация каспазы-3 существенно снижалась (рис. 9 а), тогда как уровень активации каспазы-8 был достоверно выше по сравнению с действием TNF-a (рис. 9 в). Активация каспаз не наблюдалась как при совместной обработке клеток TNF-a и ¿-Glu, так и действии одной ¿-Glu (рис. 9 б, г). Помимо прямого рецепторного пути посредством

«комплекса II» и каспазы-8, TNF-индуцируемая активация эффекторной каспазы-3 происходит также через митохондриальный путь апоптоза вследствие деполяризации митохондриальной мембраны и освобождения цитохрома С, формирующего апоптосому с Apaf-1 и прокаспазой-9, которая приводит в активное состояние каспазу-9, активирующую, в свою очередь, каспазу-3 (Wolf 1999). Учитывая, что при одновременной стимуляции TNF-a и HLDF-6 происходило повышение активности каспазы-8 и снижение активности каспазы-3 по сравнению с действием одного цитокина, вероятно, что в присутствии гексапептида блокируется проведение апоптотического сигнала на одном из этапов митоходриального пути, ¿-глутаминовая кислота, вероятнее всего, блокирует цитотоксическое действие TNF-a на этапе образования лиганд-рецепторного комплекса и тем самым, предупреждает гибель клеток и развитие воспалительных процессов.

8. Гексапептид TGENHR отменяет иепамид-индунированный апоптоз

Для проверки гипотезы, что HLDF-6 ингибирует проведение апоптотического сигнала на одном из этапов митоходриального пути, мы изучили влияние пептида на гибель клеток HL-60, вызываемую Сг-церамидом методом цитофлуориметрического анализа. Сг-Церамид является аналогом природного фосфолипида церамида, высокоспецифичного и ключевого медиатора апоптотитической гибели, вызываемой TNF-a. Основной мишенью действия церамида является митохондрия (Агога 1997, Garcia-Ruiz 1997). Церамид индуцирует две важные стадии, характерные для митохондриального пути апоптоза: уменьшение митохондриального трансмембранного потенциала и выход цитохрома С из митохондрии (Ghafourifar 1999, Hengartner 2000).

Табл. 3. Влияние С2-церамида и HLDF-6 на количество апоптотических клеток

индуктор % апоптотических клеток*

контроль 13,3 + 1,4

С2-Сег . 33,7 ± 3,7

HLDF-6 13,6 ±1,5

Сг-Сег + HLDF-6 14,8 ± 1,6

* Количество апоптотических клеток определяли с помощью цитофлуориметрического анализа после двойного окрашивания ИТС-меченным аннексином V и пропидиум иодидом. Инкубацию клеток НЬ-60 с 1 мкМ С2-церамида, либо 10 мкМ НЬСГ-б, либо с обоими реагентами проводили в течение 24 ч. Приведены средние значения трех независимых экспериментов + 3.0.

Концентрация Сг-церамида была сравнима с физиологической концентрацией церамида, образующегося в результате расщепления мембранных сфинголипидов TNF-активируемыми сфингомиелиназами (Hannun 1996). После 24 ч инкубации клеток с 1 мкМ Сг-церамида в культуре наблюдалось появление значительного количества клеток, вступивших в апоптоз. Введение в среду культивирования 10 мкМ HLDF-6, приводило к снижению количества алоптотических клеток до контрольного уровня (табл. 3).

В основе механизма действия церамида лежит его способность реорганизовывать структуру липидов микродоменов внешней мембраны митохондрии, разрушая ассоциацию между цитохромом С и анионными фосфолипидами, что способствует выходу цитохрома С и запуску каскадов реакций, ведущих к апоптозу (Yuan 2003). На основании полученных результатов можно предположить, что благодаря своей способности изменять физико-химические свойства липидной мембраны (Костанян 2000), HLDF-6, по-видимому, способствует стабилизации структуры мембран митохондрий, тем самым, блокируя выход цитохрома С при действии церамида, что в итоге является причиной развития резистентности клеток HL-60 к цитотоксичному действию TNF-a.

С другой стороны, развитие резистентности клеток миелоидных линий к TNF-индуцируемой гибели сопряжено с повышенным биосинтезом эндогенного TNF-a (Safrit 1992). Цитотоксический эффект TNF-a сопровождается образованием активных форм кислорода (АФК), и, в первую очередь, супероксид аниона (02") (Schulze-Osthoff 1992). В клетках, как правило, Ог" разрушается рядом ферментов, в том числе супероксиддисмутазами (SOD), не успевая вступить в химические реакции. Известны три изоформы SOD: цитоплазматическая (SOD1), внеклеточная (SOD3), в гем которых входят ионы Си и Zn , и митохондриальная, содержащая Mn2+ (SOD2 или MnSOD) (Thannickal 2000). Эндогенный TNF-a участвует в регуляции биосинтеза MnSOD (Kizaki 1993). Блокирование эндогенного TNF-a приводит к снижению экспрессии MnSOD и, как следствие, гибели клеток (Zyad 1994). Принимая во внимание, что в присутствии как HLDF-6, так и Z,-Glu усиливается TNF-опосредованный биосинтез эндогенного TNF-a, нельзя исключить, что блокирование апоптоза связано не только за счет прямого воздействия гексапептида HLDF-6 на структуру митохондриальной мембраны, а в случае аминокислоты на этап образования лиганд-рецепторного комплекса, но и за счет активации синтеза эндогенного TNF-a, контролирующего экспрессию одного из ключевых ферментов митохондрии - MnSOD.

Заключение

На основании полученных результатов можно заключить, что в основе механизма протекторного действия как HLDF-6, так и ¿-Glu на TNF-опосредованную гибель клеток HL-60 лежит их стимулирующее влияние на дифференцировку клеток, однако реализация этого процесса при действии этих индукторов различна. Пептид HLDF-6 обладает своей собственной дифференцирующей активностью и при костимуляции с TNF-a происходит усиление HLDF-6-индуцированной нейтрофил/гранулоцитарной дифференцировки, тогда как ¿-Glu усиливает TNF-опосредуемую моноцитарную дифференцировку. Также различен механизм и протекторного действия исследуемых агентов. HLDF-6 повышает устойчивость клеток к цитотоксичному действию TNF-a за счет ингибирования апоптотического сигнала на одном из этапов митохондриального пути. ¿-Глутаминовая кислота блокирует проведение TNF-опосредованного цитотоксического сигнала на этапе образования лиганд-рецепторного комплекса.

Таким образом, полученные данные не только вносят существенный вклад в понимание молекулярных механизмов возникновения резистентности опухолевых клеток к цитотоксическому действию TNF-a, но и открывают возможности для использования пептида HLDF-6 и ¿-Glu в онкологии при TNF-тералии опухолей.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что при обработке клеток НЬ-60 промиелоцитарного лейкоза человека фактором некроза опухоли ТОТ-а в сочетании с НЬЦР-б или ¿-глутаминовой кислотой происходит усиление дифференцировки, однако реализация этого процесса под действием данных индукторов различна.

2. При костимуляции с ЮТ-сс происходит усиление НЬОР-б-индуцированной нейтрофил/гранулоцитарной дифференцировки, тогда как ¿-С1а усиливает ТИР-опосредуемую моноцитарную дифференцировку.

3. Обнаружен протекторный эффект НЬОР-6 и /.-глутаминовой кислоты на процесс гибели клеток линии НЬ-60, вызываемый ТЫР-сх.

4. Установлено, что механизмы протекторного действия гексапептида НЬБИ-б и ¿-глутаминовой кислоты различны. Пептид повышает устойчивость клеток линии НЬ-60 к цитотоксичному действию П^Р-а вследствие ингибирования апоптотического сигнала на одном из этапов митохондриального пути, тогда как ¿-глутаминовая кислота блокирует проведение "ШР-опосредованного цитотоксического сигнала на этапе образования лиганд-рецепторного комплекса.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ

ПУБЛИКАЦИЯХ Статьи в рецензируемых журналах:

1. С.С. Жохов, И.А. Костанян, Н.В. Гибанова, Е.А. Сурина, З.И. Сторожева, И.И. Бабиченко, В.М. Липкин. Сходство и различие действия пептидов ТвЕМНЯ и ТС)УЕНК на промиелоциты линии НЬ-60 и клетки Пуркинье червя мозжечка крыс. Доклады академии наук, 2004, т. 394, № 5, с. 1-4.

2. С.С. Жохов, И.А. Костанян, Н.В. Гибанова, Е.А. Сурина, И.Л. Родионов, З.И. Сторожева, А.Т. Прошин, И.И. Бабиченко, В.М. Липкин. Различные механизмы протекторного и дифференцирующего действия гомологичных пептидов ТО ЕКНИ и ТСЗУЕНК.. Биохимия, 2004, т.69, №8, с. 1059-1070.

3. Н.В. Гибанова, Т.В. Ракитина, С.С. Жохов, Н.М. Пустошилова, В.М. Липкин и И.А. Костанян. ¿-глутаминовая кислота модулирует цитотоксический эффект фактора некроза опухоли в клетках линии НЬ-60. Биоорганическая химия, 2005, т.31, № 6, с. 602-608.

Тезисы конференций:

1. Н.В. Гибанова, И.А. Костанян, В.М. Липкин. Изучение механизма протекторной активности HLDF-6 в клетках миелоидных линий. X Юбилейная международная конференция «Новые информационные технологии в медицине и экологии-2002» (1Т+Ме'2002). 2002, июнь, Гурзуф, Крым, Украина (тезисы докладов с. 361-362).

2. Н.В. Гибанова, И.А. Костанян, В.М. Липкин. Изучение механизма протекторной активности HLDF-6 в клетках миелоидных линий. VI Чтения, посвященные памяти Ю.А. Овчинникова. 2002, ноябрь-декабрь, Москва, Россия (тезисы докладов с. 59).

3. Н.В. Гибанова, И.А. Костанян, В.М. Липкин. Биологический пептид HLDF-6 блокирует цитотоксическое действие TNF-a в клетках миелоидных линий. Конференция «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». 2003, сентябрь Смоленск, Россия (тезисы докладов с. 59).

4. V.M Lipkin., S.M. Dranitsina, Е.А. Surina, A.V. Garkovenko, N.V Gibanova, S.S. Zhokhov, I.I. Babivhenko, I.M. Molotkovskaya, E.V. Smimova, I.L. Rodionov, G.B. Telegin, I.A. Kostanyan. Biologically active peptides from the 8.2 KDa differentiation factor HLDF. Tenth German-Russian Peptide Symposium. 2003, october, Friedrichroda/Thuringia, German.

5. С.С. Жохов, И.А Костанян, Н.В. Гибанова, Е.А. Сурина, З.И. Сторожева, А.Т. Прошин, В.М. Липкин. Гомологичные гексапептиды HLDF-6 и PEDF-6, обладающие дифференцирующим и нейропротекторным действием. Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. 2003, ноябрь, Москва, Россия (тезисы докладов с. 22).

6. V.M. Lipkin, S.M. Dranitsyna, Е.А. Surina, A.V. Garkovenko, N.V. Gibanova, S.S. Zhokhov, I.I. Babichenko, I.L. Rodionov, I.A. Kostanyan. Differentiation factor HLDF and its biologically active peptides. 7 International Symposium on Biomolecular Chemistry (ISBOC-7). 2004, June, University of Sheffield, UK (Book of abstracts p. P23-P24).

7. Н.В. Гибанова, С.С. Жохов, И.А. Костанян, В.М. Липкин. Сходство и различие действия ¿-глутаминовой кислоты и пептида HLDF-6 на TNF-индуцированную цитотоксичность в клетках миелоидных линий. XII Международная конференция «Новые информационные технологии в медицине и экологии -2004» (1Т+Ме'2004). 2004, май - июнь, Гурзуф, Крым, Украина (тезисы докладов с.67-68).

8. S.S. Zhokhov, I.A. Kostanyan, N.V. Gibanova., Е.А. Surina, Z.I. Storozheva, A.T. Proshin, V.M. Lipkin. Hexapeptides TGENHR and TQVEHR induce leukemia call differentiation and exhibit neuroprotective properties., Peptides. 2004. p. 483-484 (Proceedings of the 3rf International and 28lh European Peptide Symposium, 2004, September, Prague, Czech Republic).

9. В.М. Липкин, C.M. Драницина, Е.А. Сурина, А. В. Гарковенко, Н.В. Гибанова, С.С. Жохов, И.И. Бабиченко, И.Л. Родионов, И.А Костанян. Фактор дифференцировки HLDF и его биологические пептиды. Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. 2004, октябрь, Москва, Россия (тезисы докладов с.24).

10. Н.В. Гибапова, И.А. Костанян, Т.В. Ракптина. С.С. Жохов, В.М. Липкпн. ¿-глутаминовая к.ч^-ота модулирует цптотоксический эффект фактора некроза опухоли в клетках линии HL-60. Will Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической оие.'нч ии и био"1 ехнологии». 2006^ февраль. Москва, Россия (тезисы докладов с. 19) : 1. Н.В. Гибанова, Т.В. Ракитнна_. Л.Н. Шингарова, В.М. Липкпн. II А. Костанян. А.П. Богачук. Апологический активный пептид TGENHR (HLDF-6) снижает циго токсический эффект фактора некроза опухоли альфа па клетках линии LIL-60 промиелоин глрного лейкоза человека, усиливая их дифференцировку. XII Международная конференция ^Новые информационные технологии в медицине и экологии -2006» (1Т+Ме:2006). 2006, май - июнь. Г\рч\ф. Крым. Украина (тезисы докладов с. 276-277).

Заказ № 26/08/06 Подписано в печать 09.08.2006 Тираж 100 экз. Усп. и.л. 1

ООО "Цифрой инок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 . ' www.cfr.ru ; e-mail: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гибанова, Наталья Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ (TNF-a) И ЕГО ОБЩИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА.

1.1. Общие биологические свойства фактора некроза опухоли TNF-a.

1.2. Активация транскрипционного фактора NF-кВ TNF-a.

1.3. Образование вспомогательного комплекса при проведении сигнала рецептором TNF-R1.

1.4. Липидные микродомены клеточной мембраны как функциональные модуляторы сигнальных путей семейства рецепторов TNF-a.

1.5. Участие различных протеаз в сигнальных каскадах, индуцируемых TNF-a.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Исследование дифференцирующей активности гексапептида TGENHR, L-глутаминовой кислоты и TNF-a на клетках линии IIL-60.

2.2. Гексапептид TGENHR и L-глутаминовая кислота повышают TNF-опосредуемую активацию фосфолипазы С.

2.3. Гексапептид TGENHR и L-Glu усиливают TNF-опосредованную экспрессию эндогенного фактора некроза опухоли.

2.4. Влияние пептида TGENHR, L-глутаминовой кислоты и TNF-a на цикл клеточного деления.

2.5. Исследование влияние гексапептида TGENHR и I-глутаминовой кислоты на TNF-индуцированную гибель HL-60 клеток.

2.6. Исследование влияния TGENHR и L-Glu на TNF-индуцируемую активацию транскрипционного фактора NF-кВ.

2.7. Влияние TGENIIR и L-Glu на TNF- опосредуемую активацию каспазы-3 и касназы -8.

2.8. Гексапептид TGENHR отменяет церамид-индуцированный апоптоз.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнение механизмов протекторного действия L-глутаминовой кислоты и гексапептида TGENHR на TNF-индуцированную гибель клеток линии HL-60"

Апоптоз является естественным физиологическим процессом, необходимым как для развития, так и для поддержания тканевого гомеостаза, эмбриогенеза и функционирования различных дифференцированных клеток. Восприимчивость клеток миелоидного ряда к цитотоксическим агентам зависит от степени их дифференцированности. При этом до сих пор остается невыясненной точная взаимосвязь между клеточной дифференцировкой и апоптозом из-за того, что механизмы, контролирующие эти процессы, отчасти, используют схожие метаболические пути. В связи с этим, выяснение механизмов, регулирующих развитие апоптоза в опухолевых недифференцированных и нормальных дифференцированных клетках, является одним из ключевых аспектов при лечении больных различными формами лейкоза. Известно, что в процессе клеточной дифференцировки клетки миелоидного ряда становятся устойчивыми к действию целого ряда индукторов апоптоза. Так было показано, что обработка клеток HL-60 промиелоцитарного лейкоза такими известными индукторами дифференцировки, как форболовые эфиры, полпостыо-трапс-ратпносьая кислота, витамин D3 или диметилсульфоксид приводит к развитию резистентности клеток к различным апоптотическим стимулам, в том числе и к цитотоксичному действию фактора некроза оиухоли альфа TNF-a[l-4],

TNF-a - многофункциональный цитокин, принадлежащий к семейству TNF-лигапдов, секретируется многими типами клеток. TNF-a является физиологическим индуктором таких процессов, как гибель клеток в результате апоптоза или некроза, клеточная дифференцировка, гемопоэз, а также участвует в регуляции и реализации иммунных и воспалительных реакций. Многообразие биологических свойств TNF-a опосредованно двумя высокоаффинными рецепторами TNF-R1 и TNF-R2, принадлежащих к большому семейству рецепторов TNF-лигаидов (TNF-Rs) [5]. В подавляющем большинстве клеток TNF-R1 является ключевым медиатором в передаче сигналов, опосредованных TNF-a; TNF-R2, по всей вероятности, выполняет важную роль в функционировании лимфоидной системы. На молекулярном уровне выделяют три основных эффекта, определяющие пути реализации разнообразных клеточных ответов, обусловленных взаимодействием TNF-a с TNF-Rs: а) активация транскрипционного фактора NF-кВ; б) активация стресс-активируемых протеинкиназ (SARKs/JNK); в) индукция апоптоза. При действии TNF-a инициация процесса апоптоза осуществляется двумя путями - прямым рецепторным и митохондриальным [5].

Терапевтическое применение TNF-a в качестве противоопухолевого агента осложнено из-за его общей высокой токсичности, связанной с широким спектром биологических активностей этого цитокина. Поэтому одним из подходов к использованию этого цитокина для лечения злокачественных новообразований является поиск агентов, которые снижали бы его токсическое действие, но позволяли бы сохранить его противоопухолевую активность. В последние годы активно разрабатываются терапевтические методы на основе комбинаторного применения этого цитокина с различными индукторами дифференцировки либо химического (,полностью-транс-рстипоевая кислота, диметилсульфоксид, форболовые эфиры), либо биологического происхождения (ростовые факторы GM-CSF и G-CSF, интерферон), что способствует усилению дифференцирующего эффекта на опухолевые клетки при снижении токсического действия TNF-a на организм. Такими соединениями могут оказаться гексапептид TGENHR и L-глутамииовая кислота, являющиеся индукторами гранулоцитариой дифференцировки клеток миелоидного ряда.

Гексапептид TGENHR (HLDF-6) является фрагментом эндогенного фактора дифференцировки клеток линий HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor), который полностью воспроизводит дифференцирующую активность полноразмерного фактора. Установлено, что в основе механизма действия HLDF-6 на клетки HL-60, не имеющего собственного рецептора на поверхности клеток, лежит его способность взаимодействовать с липидным компонентом клеточных мембран [6]. В ходе исследований было установлено, что наряду с дифференцирующей активностью, гексапептид обладает ярко выраженными протекторными свойствами. HLDF-6 предохраняет от дегенерации клетки Пуркинье червя мозжечка крыс in vivo и гранулярные нейроны мозжечка крыс in vitro при индуцируемой химической гипоксии [7]. Кроме того, гексапептид повышает устойчивость клеток IIL-60 и мышиных эмбрионов к холодовому шоку и ионизирующей радиации [8]. Было также продемонстрировано нейропротекторное действие этого пептида на моделях болезни Альцгеймера in vivo и in vitro [9]. Была продемонстрирована важная роль 1-глутаминовой кислоты в составе этого пептида, замена, которой приводила к исчезновению биологической активности JILDF-6 [6]. Кроме того, было обнаружено, что свободная L-Glu, как и пептид, проявляет антипролиферативное и дифференцирующее действие па клетки HL-60, при отсутствии специфического рецептора на мембране клеток этой линии [10] Существуют данные, что многие из этих процессов дегенерации клеток потенцируются фактором некроза опухоли (TNF-a) [И].

Данная работа является частью структурно-функциональных исследований проводимых в лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по изучению биологически активного шестичленного фрагмента эндогенного фактора дифференцировки HLDF клеток линий HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека TGENHR (HLDF-6).

Целью работы являлось сравнительное изучение влияния гексапептида TGENHR (I1LDF-6) и L-глутаминовой кислоты на процессы дифференцировки и апоптоза, вызываемые действием TNF-a на клетках линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека. В рамках этой работы были поставлены следующие задачи: 1) выяснение характерных особенностей дифференцирующего действия гексапептида HLDF-6, L-Glu и TNF-a; 2) исследование влияния гексапептида HLDF-6 и L-Glu на клеточную гибель, вызываемую действием TNF-a; 3) изучение молекулярного механизма действия HLDF-6 и I-Glu на TNF-опосредованную клеточной гибель.

Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю, кандидату химических наук И.А. Костанян и заведующему лабораторией белков гормональной регуляции, члену-корреспонденту РАН В.М. Липкину за постоянное внимание к данной работе и помощь в ее проведении. Автор также признателен кандидату химических наук С.В. Хайдукову (ИБХ РАН) за помощь в проведении цитофлуориметрического анализа и кандидату химических наук Л.Н. Шингаровой за предоставленный фактор некроза опухоли (TNF-a).

1. СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ (TNF-a) И ЕГО ОБЩИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гибанова, Наталья Владимировна

4. ВЫВОДЫ

1. Показано, что при обработке клеток HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека фактором некроза опухоли TNF-a в сочетании с HLDF-6 или L-глутаминовой кислотой происходит усиление дифференцировки, однако реализация этого процесса под действием данных индукторов различна.

2. При костимуляции с TNF-a происходит усиление HLDF-6-индуцированной нейтрофил/гранулоцитарной дифференцировки, тогда как L-Glu усиливает TNF-опосредуемую моноцитарную дифференцировку.

3. Обнаружен протекторный эффект HLDF-6 и L-глутаминовой кислоты на процесс гибели клеток линии HL-60, вызываемый TNF-a,

4. Установлено, что механизмы протекторного действия гексапептида HLDF-6 и L-глутаминовой кислоты различны. Пептид повышает устойчивость клеток линии HL-60 к цитотоксичному действию TNF-a вследствие ингибирования апоптотического сигнала на одном из этапов митохондриального пути, тогда как L-глутаминовая кислота блокирует проведение TNF-опосредованного цитотоксического сигнала на этапе образования лигапд-рецепторного комплекса.

2.9. Заключение

На основании полученных результатов можно заключить, что в основе механизма протекторного действия как HLDF-6, так и L-GIu на TNF-опосредованную гибель клеток HL-60 лежит их стимулирующее влияние на дифференцировку клеток, однако реализация этого процесса при действии этих индукторов различна. Пептид HLDF-6 обладает своей собственной дифференцирующей активностью и при костимуляции с TNF-a происходит усиление HLDF-6-индуцированной нейтрофил/гранулоцитарной дифференцировки, тогда как I-Glu усиливает TNF-опосредуемую моноцитарную дифференцировку. Также различен механизм и протекторного действия исследуемых агентов. HLDF-6 повышает устойчивость клеток к цитотоксичному действию TNF-a за счет ингибирования апоптотического сигнала на одном из этапов митохондриального пути. L-Глутаминовая кислота блокирует проведение TNF-опосредованного цитотоксического сигнала на этапе образования лиганд-рецепторного комплекса.

Таким образом, полученные данные не только вносят существенный вклад в понимание молекулярных механизмов возникновения резистентности опухолевых клеток к цитотоксическому действию TNF-a, но и открывают возможности для использования пептида HLDF-6 и L-GIu в онкологии при TNF-терапии опухолей.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. В работе были использованы следующие материалы реактивы: L-глутаминовую кислоту RPMI 1640, фетальная сыворотка теленка, нитроголубой тетразолий NBT, хлорид кальция, хлорид лития, ацетат магния, трис-гидроксиметиламинометан (Трис), Аг-(2-гидрокисэтил)пиперазин-Л^'этансульфоновую кислоту (HEPES), бромистый этидий, 2-меркаптоэтанол, глицерин, додецилсульфат натрия (SDS), акриламид, ЛУУ'-метиленбисакриламид, персульфат аммония, N,N,N',N' - тетраметиленэтилендиамин (TEMED), дитиотреитол (DTT) (Sigma, Германия); смесь случайных праймеров, набор для очистки ПЦР-продуктов «Wizard PCR Preps DNA Purification System», 2'-дезоксирибонуклеозиддифосфаты (Promega, США); ингибитор РНКаз RNAaseZAP (Invitrogen, США); набор для конкурентной ПЦР «PCR MIMIC™ Construction Kit» (CLONTECII, США); набор для регистрации клеток, вступивших в апоптоз «Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit» (PharMingen, США) , кумасси R-250, кумасси G-250, агарозу (Bio-Rad", США), этанол, хлорид магния, ацетат натрия, хлорид кальция, уксусная кислота этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), метанол, изопропанол, диметилсульфоксид (DMSO) (Merck, Германия), набор белков-маркеров для электрофореза «Low Molecular Weight Calibration Kit for SDS Electrophoresis», мио-[3Н]-инозитол удельной активностью 95,0 Ки/моль (Amersham Biosciences, Англия); набора реактивов «ECL+Plus detection system» (Amersham Biosciences, США). Дистиллированную воду дополнительно очищали с помощью системы Milli-Q ("Millipore", США). Все остальные реактивы имели квалификацию «о.с.ч.» ферменты: ингибитор РНКаз RNAsin, обратную транскриптазу вируса мышиного лейкоза Мелони (Promega, США); Taq-nолимеразу (лаб. биотехнологии ИБХ РАН); сорбенты: Dowex AG 1><8 ("Serva", Германия). клеточная линия HL-60 была любезно предоставлена Р.Г. Василовым (Институт биотехнологии, Москва)

3.2. Буферные растворы.

Буферные растворы для SDS-электрофореза белков в полиакриламидном геле: Буфер для разделяющего геля: 375 мМ Tris-HCl (рН 8,8); 0,1% SDS. Буфер для концентрирующего геля: 125 мМ Tris-HCl (рН 6,8); 0,1% SDS. Электродный буфер: 25 мМ Tris; 192 мМ глицин; 0,2% SDS.

Буфер для нанесения образцов: 62,5 мМ Tris-HCl (рН 6,8); 10% глицерин; 2% SDS; 100 мМ DTT; 0,01% бромфеноловый синий. Фиксирующий раствор: 45% метанол, 10% СНзСООН.

Раствор для окрашивания гелей: 0,025% кумасси R-250 в 45% метаноле, 10% СНзСООН.

Отмывочная смесь: 40% метанол, 10% СНзСООН.

Буферные растворы для агарозного геля ТАЕ: 104 мМ Трис-АсОН, рН 7.8-8.2; 2 мМ EDTA

Буфер для нанесения образцов х 6: 0.25% бромфенолового синего, 30% глицерина. ТС: 10 мМ Трис-IICl рИ 7.4; 2 мМ EDTA.pII 8.0

Буферх 10 для ПЦР: 500 мМ КС1, 100 мМ Трис-HCl (рН 8.3), 15 мМ MgCl2 Фотографические растворы.

Проявитель: 14г метола;14 г гидрохинона (500 мл воды)

53 г Na2S03 (безводный); 10 г NaOH; 10 г КВг (500 мл воды) Растворы объединяли и фильтровали. Прерыватель: 2.5% уксусная кислота

Фиксаж: 200 г Na2S203; 20 г Na2S03 (800 мл воды);

25 мл ледяной уксусной кислоты (100 мл), растворы объединяли. 40 г NH4CI (100 мл Н20), растворы объединяли. Режим обработки пленок при проявлении: в проявителе при 20° С -2-4 мин, в прерывателе - 0.5 мин, в фиксаже - 7-10 мин.

3.3. Методы

3.3.1. Культивирование клеток IIL-60 проводили в среде RPMI 164 0 с 10% феталыюй сывороткой теленка при 37°С в атмосфере 5% С02

3.3.2. Определение дифференцирующей активности. Дифференцирующую активность определяли по способности клеток HL-60 восстанавливать нитроголубой тетразолий (NBT-тест). Клетки HL-60 (5x106) инкубировали либо TNF-a (1 мкг/мл), HLDF-6 (10 мкМ), либо с TNF-a (1 мкг/мл) и HLDF-6 (10 мкМ), L-Glu (1 мкМ), либо с TNF-a (1 мкг/мл) и L-Glu (1 мкМ) в течение 72ч. После инкубации к клеточному осадку добавляли раствор нитроголубого тетразолия (1 мкг/мл) и инкубировали в течение 25 мин при 37°С и 15 мин при комнатной температуре. По окончании реакции распределяли равномерно клетки на стекле (мазок) и фиксировали метанолом в течение нескольких минут. Подсчет клеток, содержащих в цитоплазме восстановленный NBT в виде темно-синих гранул формазана, осуществляли под микроскопом ("J10M0", Россия). В каждом образце просчитывали не менее 300 клеток. Дифференцированными считали клетки, содержащие не менее 10 гранул. Контролем служили клетки, инкубируемые с PBS. Было проведено не менее трех независимых экспериментов в трех повторах.

3.3.3. Определение внутриклеточной концентрации инозитолмоно- и дифосфатов в клетках линии HL-60. Клетки инкубировали в течение 24 ч в присутствии 10 мкКи/мл туо-[3Н] инозитола (Amersham Biosciences, США), затем дважды промывали буфером, содержащим 10 мМ HEPES-NaOH, 5.6 мМ глюкозы, 154 мМ NaCI, 5.6 мМ КС1, 1.3 мМ СаС12, 3.6 мМ NaHC03, 1 мМ MgCl2, рН 7.4 (раствор Locke's). Клеточный осадок ресуспендировали в этом же буфере, содержащем 20 мМ LiCl. К полученной суспензии клеток добавляли равный объем буфера, содержащий TNF-a (2 мкг/мл), HLDF-6 (20 мкМ), либо с TNF-a (2 мкг/мл) и HLDF-6 (20 мкМ), L-Glu (2 мкМ), либо с TNF-a (2 мкг/мл) и L-Glu (2 мкМ). Далее клетки инкубировали при 37 °С в течение 1 ч. После удаления инкубационной смеси клетки лизировали 0.1 М НС1 при комнатной температуре в течение 20 мин. Инозитолмоно- и дифосфаты выделяли методом ионообменной хроматографии на колонке с сорбентом Dowex AG 1x8 (Serva, Германия). Элюцию проводили буферным раствором, содержащим 1 М формиат аммония и 0.1 М муравьиную кислоту. Количество 3Н меченных IP и 1Р2 определяли с использованием сцинтилляционного счетчика Beckman LS 9800 (Beckman Instruments Inc., США).

3.3.4. Приготовление агарозного геля. Агарозу растворяли до концентрации 0.6 %-1 % в буферном растворе ТАЕ (в зависимости от размера ДНК) нагреванием, добавляли водный раствор бромистого этидия (до 1 мг/мл), смесь заливали в прибор для горизонтального электрофореза, вставляли гребенку и давали гелю остыть. При использовании «легкоплавкой» агарозы полимеризацию геля проводили при 4° С.

3.3.5. Суммарную РНК выделяли из 2*106клеток после инкубации с исследуемыми индукторами в течение 1, 4, 24, 48 и 72 ч с помощью набора для выделения РНК "SV Total RNA Isolation System" («Promega», США) в соответствии с инструкцией производителя. Процедура включала в себя также обработку ДНКазой, чтобы исключить загрязнение геномной ДНК РНК-образцов.

3.3.6. Получение кДНК из клеток.

Для обратной транскрипции брали 1мкг РНК каждого образца, 100 нг случайных шестичленных праймеров, 20 ед. акт. ингибитора РНКаз RNAsin, 20 ед. акт. обратной транскриптазы. Объем реакционной смеси составлял 20 мкл, реакцию проводили при 37° С в течении 1.5 часа. Фермент ингибировали при 95° С 5 мин. Реакционную смесь доводили до 500 мкл стерильной водой Milli-Q. Качество выделяемой РНК и эффективность обратной транскрипции проверяли ПЦР с использованием праймеров DGAP и RGAP на кДНК глицероальдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (табл. З.1.).

3.3.7. Полуколичествеиная конкурентная ПЦР. Для проведения ПЦР были синтезированы конкурентные матрицы (конкуренты), не гомологичные исследуемым матрицам, но имеющие с ними общие последовательности для отжига праймеров. Негомологичные конкурентные матрицы (конкуренты) получали с помощью набора "PCR MIMIC™ Construction Kit" («CLONTECH», США) в соответствии с инструкцией производителя. Продукты амплификации конкурентных матриц имели длину отличную от длины исследуемых матриц (мы использовали разницу в среднем на 200 п.о.), что необходимо для их идентификации при разделении продуктов ПЦР методом электрофореза. Для подсчета количества кДНК каждого образца был синтезирован конкурент GAPDII, имеющий длину 367 п.о., с использованием составных праймеров DGAPC и RGAPC (табл. З.1.). Аналогичным способом, для оценки количества TNF-a был получен конкурент размером 550 п.о. с помощью составных праймеров DTNFC и RTNFC, указанных в табл. 1. Полученные конкурентные матрицы затем очищали, используя "Wizard PCR Preps DNA Purification System" («Promega», США), в соответствии с инструкцией производителя. Измерение концентрации полученных конкурентов проводили спектрофотометрически при 260 нм. Выравнивание количества суммарной кДНК для каждого эксперимента производилось с помощью кДНК GAPDH, концентрация которой во всех образцах была проанализирована конкурентной ПЦР. Для проведения полуколичественной конкурентной ПЦР в реакцию для каждого образца были внесены рассчитанный объем суммарной кДНК, содержащий одинаковое количество кДНК GAPDH, и одинаковое количество конкурента TNF-a. Реакционная смесь объемом 25 мкл для проведения конкурентной ПЦР содержала 67 мМ Tris-HCl, 16.6 мМ (NH4)2S02, 1.5 мМ MgCl, 0.25 мМ dNTPs, 0.01% Tween-20, 5 пМ ген-специфических праймеров, 0.1 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы. Реакцию проводили на амплификаторе РТС-200 («MJ Research», США), при следующем температурном режиме: 94° при 90 с и в течение следующих 35 циклах 30с при 94°, 30с при 57 30с при 72 5 мин при 72°. После проведения электрофореза в 2% агарозном геле, окрашивания этидийбромидом и визуализации в UV свете наблюдалось два продукта ПЦР для каждой реакции. Изображение электрофореза обрабатывали при помощи программы Scion Image for Windows b.4.0.2. Данные представляли в виде отношения количества ПЦР-продукта на тестируемой матрице к количеству ПЦР-продукта на конкурентной матрице, которое и характеризовало относительное содержание исследуемой кДНК в образце. Было проведено не менее трех независимых экспериментов в.пяти повторах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гибанова, Наталья Владимировна, Москва

1. Sordet О., Bettaieb A., Bruey J. M., Eymin В., Droin N., Ivarsson M., Garrido C., Solary E. Selective inhibition of apoptosis by TPA-induced differentiation of U937 leukemic cells. Cell. Death. Differ. 1999. V.6. P.351-361.

2. Vondracek J., Sheard M. A., Krejci P., Minksova K., Hofmanova J., Kozubik A. Modulation of death receptor-mediated apoptosis in differentiating human myeloid leukemia IIL-60 cells. Jour. Leuk. Biol. 2001. V.69. P.794-802.

3. Locksley R.M., Killeen N. and Lenardo M.J. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. Cell. 2001. V.104 P. 487-501.

4. Tuzuner E., Liu L., Shimada M., Yilmaz E., Glanemann M., Settmacher U., Langrehr J.M., Jonas S., Neuhaus P., Nussler A.K. Heme oxygenase-1 protects human hepatocytes in vitro against warm and cold hypoxia. J. Hepatol. 2004. V 41. P.764-72.

5. Kriegler M., Perez C., DeFay K. et al. A novel form of TNF/cachectin is acell surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complex hysiology of TNF. Cell 1988. V. 53. P. 45-53.

6. Tang P., Hung M.C. and Klostergaard J. Human pro-tumor necrosis factor is a homotrimer. Biochemistry. 1996. V. 35. P. 8216-8222.

7. Black R.A., Rauch C.T., Kozlosky C.J. et al. A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells. Nature. 1997. V. 385 P. 729-733.

8. Bazan J.F. Emerging families of cytokines and receptors. Curr. Biol. 1993. V. 3 P. 603-606.

9. Locksley R.M., Killeen N. and Lenardo M.J. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. Cell. 2001. V. 104 P. 487-501.

10. Naismith J.H. and Sprang S.R. Modularity in the TNF-receptor family. Trends Biochem. Sci. 1998. V. 23 P. 74-79.

11. Banner D.W., D'Arcy A., Janes W. et al. Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor activation. Cell 1993. V. 73 P. 431-445.

12. Chan F.K., Chun H.J., Zheng L. et al. A domain in TNF receptors that mediates ligand-independent receptor assembly and signaling. Science. 2000 V. 288 P. 2351-2354.

13. Grell M., Douni E., Wajant II. et al. The transmembrane form of tumor necrosis factor is the prime activating ligand of the 80 kDa tumor necrosis factor receptor. Cell. 1995.V. 83. P.793-802.

14. Grell M., Wajant H., Zimmermann G. and Scheurich P. The type 1 receptor (CD 120a) is the high-affinity receptor for soluble tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 570-575.

15. Wallach D., Engelmann H., Nophar Y. et al. Soluble and cell surface receptors for tumor necrosis factor. Agents Actions Suppl. 1991. V. 35. P. 51-57.

16. Taylor P.С. Anti-tumor necrosis factor therapies. Curr. Opin. Rheumatol. 2001. V. 13 P. 164-169.

17. Solomon K.A., Pesti N., Wu G. and Newton R.C. Cutting edge: a dominant negative form of TNF-alpha converting enzyme inhibits proTNF and TNFRII secretion. J. Immunol. 1999. V. 163 P. 4105—4108.

18. McDermott M.F., Aksentijevich I., Galon J. et al. Germline mutations in the extracellular domains of the 55 kDa TNF receptor, TNFR1, define a family of dominantly inherited autoinflammatory syndromes. Cell 1999. V. 97 P. 133-144.

19. Tartaglia L.A., Ayres T.M., Wong G.H. and Goeddel D.V. A novel domain within the 55kd TNF receptor signals cell death. Cell 1993. V. 74 P. 845-853.

20. Schulze-Osthoff K., Ferrari D., Los M. et al. Apoptosis signaling by death receptors. Eur. J. Biochem. 1998 V. 254 P. 439-459.

21. Mannel D.N. and Echtenacher B. TNF in the inflammatory response. Chem. Immunol. 2000 V. 74 P. 141-161.

22. Beutler В., Greenwald D., Hulmes J.D. et al. Identity of tumour necrosis factor and the macrophage-secreted factor cachectin. Nature 1985 V. 316 P. 552-554.

23. Probert L., Akassoglou K., Pasparakis M. et al. Spontaneous inflammatory demyelinating disease in transgenic mice showing central nervous system-specific expression of tumor necrosis factor alpha. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 V. 92 P. 11294-11298.

24. Fontaine V., Mohand-Said S., Hanoteau N. et al. Neurodegenerative and neuroprotective effects of tumor necrosis factor (TNF) in retinal ischemia: opposite roles of TNF receptor 1 and TNF receptor 2. J. Neurosci. 2002 V. 22 P. 216.

25. Kontoyiannis D., Pasparakis M., Pizarro T.T. et al. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity 1999 V. 10 P. 387-398.

26. Yamada Y., Kirillova I., Peschon J.J. and Fausto N. Initiation of liver growth by tumor necrosis factor: deficient liver regeneration in mice lacking type I tumor necrosis factor receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997 V. 94 P. 1441-1446.

27. Bradham C.A., Plumpe J., Manns M.P. et al. Mechanisms of hepatic toxicity. I. TNF-induced liver injury. Am. J. Physiol. 1998 V. 275 P. G387-G392.

28. Taylor P.C., Peters A.M., Paleolog E. et al. Reduction of chemokine levels and leukocyte traffic to joints by tumor necrosis factor alpha blockade in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2000 V. 43 P. 38^7.

29. Blam ME, Stein RB and Liehtenstein GR (2001) Integrating anti-tumor necrosis factor therapy in inflammatory bowel disease: current and future perspectives. Am. J. Gastroenterol. 96:1977-1997

30. Chaplin DD and Fu Y Cytokine regulation of secondary lymphoid organ development. Curr. Opin. Immunol. 1998. V. 10 P. 289-297.

31. Ruddle N.H. Lymphoid neo-organogenesis: lymphotoxin's role in inflammation and development. Immunol. Res. 1999. V. 19 P. 119-125.

32. Marino M.W., Dunn A., Grail D. et al. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997 V. 94 P. 8093-8098.

33. Flynn J.L., Goldstein M.M., Chan J. et al. Tumor necrosis factor-alpha is required in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice. Immunity 1995 V. 2 P. 561-572.

34. Rothe J., Mackay F., Bluethmann H. et al. Phenotypic analysis of TNFR1 -deficient mice and characterization of TNFR1-deficient fibroblasts in vitro. Circ. Shock. 1994 V. 44 P. 51-56.

35. Vieira L.Q., Goldschmidt M., Nashleanas M. et al. Mice lacking the TNF receptor p55 fail to resolve lesions caused by infection with Leishmania major, but control parasite replication. J. Immunol. 1996 V. 157 P. 827-835.

36. Deckert-Schluter M., Bluethmann II, Rang A. et al. Crucial role of TNF receptor type 1 (p55), but not of TNF receptor type 2 (p75), in murine toxoplasmosis. J. Immunol. 1998 V.160 P. 3427-3436.

37. Camelo S., Lafage M. and Lafon M. Absence of the p55 Kd TNF-alpha receptor promotes survival in rabies virus acute encephalitis. J. Neurovirol. 2000 V. 6 P. 507-518.

38. Zhao Y.X., Lajoie G., Zhang II. et al. Tumor necrosis factor receptor p55- deficient mice respond to acute Yersinia enterocolitica infection with less apoptosis and more effective host resistance. Infect. Immun. 2000 V. 68. P. 1243-1251.

39. Lucas R., Juillard P., Decoster E. et al. Crucial role of tumor necrosis factor (TNF) receptor 2 and membrane- bound TNF in experimental cerebral malaria. Eur. J. Immunol. 1997 V. 27 P. 1719-1725.

40. Kollias G., Douni E., Kassiotis G. and Kontoyiannis D. On the role of tumor necrosis factor and receptors in models of multiorgan failure, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis and inflammatory bowel disease. Immunol. Rev. 1999 V. 169 P. 175-194.

41. Wagner Т.Е., Huseby E.S. and Huseby J.S. Exacerbation of Mycobacterium tuberculosis enteritis masquerading as Crohn's disease after treatment with a tumor necrosis factor-alpha inhibitor. Am. J. Med. 2002 V. 112 P. 67-69.

42. Old L.J. Tumor necrosis factor. Sci. Am. 1988 V. 258 P. 59-75.

43. Sugarman B.J., Aggarwal B.B., Hass P.E. et al. Recombinant human tumor necrosis factor-alpha: effects on proliferation of normal and transformed cells in vitro. Science 1985 V. 230 P. 943-945.

44. Eggermont A.M. and ten Hagen T.L. Isolated limb perfusion for extremity soft-tissue sarcomas, in-transit metastases, and other unresectable tumors: credits, debits, and future perspectives. Curr. Oncol. Rep. 2001 V. 3 P. 359-367.

45. Ruegg C., Yilmaz A. and Bieler G. et al. Evidence for the involvement of endothelial cell integrin alphaVbeta3 in the disruption of the tumor vasculature induced by TNF and IFN-gamma. Nat. Med. 1998 V. 4: P. 408^14.

46. Baud V. and Karin M. Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives. Trends Cell Biol. 2001 V. 11 P. 372-377. .r

47. Verma I.M., Stevenson J.K., Schwarz E.M. et al. Rel/NF-kappa B/I kappa В family: intimate tales of association and dissociation. Genes Dev. 1995 V. 9 P. 2723-2735.

48. Perkins N.D. The Rel/NF-kappa В family: friend and foe. Trends Biochem. Sci. 2000 V. 25 P. 434-440.

49. Mercurio F., Zhu II., Murray B.W. et al. IKK-1 and IKK-2: cytokineactivated IkappaB kinases essential for NF- kappaB activation. Science 1997 V. 278 P. 860-866.

50. DiDonato J.A., Hayakawa M., Rothwarf D.M. et al. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature 1997 V. 388 P. 548-554.

51. Zandi E., Rothwarf D.M., Delhase M. et al. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell 1997 V. 91 P. 243-252.

52. Yamaoka S., Courtois G., Bessia C. et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell 1998 V. 93 P. 1231-1240.

53. Rothwarf D.M., Zandi E., Natoli G. and Karin M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature 1998 V. 395 P. 297-300.

54. Mercurio F., Murray B.W., Shevchenko A. et al. IkappaB kinase (IKK)-associated protein 1, a common component of the heterogeneous IKK complex. Mol. Cell Biol. 1999 V. 19 P. 1526-1538.

55. Chen G., Cao P. and Goeddel D.V. TNF-induced recruitment and activation of the IKK complex require Cdc37 and Hsp90. Mol. Cell 2002 V. 9 P. 401-410.

56. Rudolph D., Yeh W.C., Wakeham A. et al. Severe liver degeneration and lack of NFkappaB activation in NEMO/IKKgamma-deficient mice. Genes Dev. 2000 V. 14 P. 854862.

57. Schmidt-Supprian M., Bloch W., Courtois G. et al. NEMO/IKK gammadeficient mice model incontinentia pigmenti. Mol. Cell 2000 V. 5 P. 981-992.

58. Makris C., Godfrey V.L., Krahn-Senftleben G. et al. Female mice heterozygous for IKK gamma/NEMO deficiencies develop a dermatopathy similar to the human X-Iinked disorder incontinentia pigmenti. Mol. Cell 2000 V. 5 P. 969-979.

59. Tanaka M., Fuentes M.E., Yamaguchi K. et al. Embryonic lethality, liver degeneration, and impaired NF-kappa В activation in IKK-beta-deficient mice. Immunity 1999 V. 10 P. 421-429.

60. Li Q., Van Antwerp D., Mercurio F. et al. Severe liver degeneration in mice lacking the IkappaB kinase 2 gene. Science 1999 V. 284 P. 321-325.

61. Takeda K., Takeuchi O., Tsujimura T. et al. Limb and skin abnormalities in mice lacking IKKalpha. Science 1999 V. 284 P. 313-316.

62. Hu Y., Baud V., Delhase M. et al. Abnormal morphogenesis but intact IKK activation in mice lacking the IKKalpha subunit of IkappaB kinase. Science 1999 V. 284 P. 316-320.

63. Li Q., Lu Q., Hwang J.Y. et al. IKK 1-deficient mice exhibit abnormal development of skin and skeleton. Genes Dev. 1999 V. 13 P. 1322-1328.

64. Senftleben U., Cao Y., Xiao G. et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa В signaling pathway. Science 2001 V. 293 P. 1495— 1499.

65. Xiao G., Cvijic M.E., Fong A. et al. Retroviral oncoprotein Tax induces processing of NF-kappaB2/pl00 in T cells: evidence for the involvement of IKKalpha. EMBO J. 2001 V. 20 P.6805-6815.

66. Li Q., Estepa G., Memet S. et al. Complete lack of NF-kappaB activity in IKK1 and IKK2 double-deficient mice: additional defect in neurulation. Genes Dev. 2000 V. 14 P. 1729-1733.

67. Pomerantz J.L. and Baltimore D. NF-kappaB activation by a signaling complex containing TRAF2, TANK and TBK1, a novel IKK-related kinase. EMBO J. 1999 V. 18 P. 6694-6704.

68. Bonnard M., Mirtsos C., Suzuki S. et al. Deficiency of T2K leads to apoptotic liver degeneration and impaired NF-kappaB-dependent gene transcription. EMBO J. 2000 V. 19 P. 4976-4985.

69. Tojima Y., Fujimoto A., Delhase M. et al. NAK is an IkappaB kinaseactivating kinase. Nature 2000 V. 404 P. 778-782.

70. Peters R.T., Liao S.M. and Maniatis T. IKKepsilon is part of a novel PMAinducible IkappaB kinase complex. Mol. Cell 2000 V. 5 P. 513-522.

71. Jiang Y., Woronicz J.D., Liu W. and Goeddel D.V. Prevention of constitutive TNF receptor 1 signaling by silencer of death domains. Science 1999 V. 283 P. 543-546.

72. Hsu H., Xiong J. and Goeddel D.V. The TNF receptor 1-associated protein TRADD signals cell death and NF- kappa В activation. Cell 1995 V. 81 P. 495-504.

73. Hsu H., Huang J., Shu H.B. et al. TNF-dependent recruitment of the protein kinase RIP to the TNF receptor- 1 signaling complex. Immunity 1996 V. 4 P. 387-396.

74. Wajant H., Henkler F., Scheurich P. The TNF-receptor-associated factor family. Scaffold molecules for cytokine receptors, kinases and their regulators. Cell Signal. 2001 V. 13 P. 389-400.

75. Hsu II., Shu H.B., Pan M.G. and Goeddel D.V. TRADD-TRAF2 and TRADD-FADD interactions define two distinct TNF receptor 1 signal transduction pathways. Cell 1996 V. 84 P. 299-308.

76. Devin A., Cook A., Lin Y. et al. The distinct roles of TRAF2 and RIP in IKK activation by TNF-R1: TRAF2 recruits IKK to TNF-R1 while RIP mediates IKK activation. Immunity 2000 V. 12 P. 419^29.

77. Zhang S.Q., Kovalenko A., Cantarella G. and Wallach D. Recruitment of the IKK signalosome to the p55 TNF receptor: RIP and A20 bind to NEMO (IKKgamma) upon receptor stimulation. Immunity 2000 V. 12 P. 301-311.

78. Devin A., Lin Y., Yamaoka S. et al. The alpha and beta subunits of IkappaB kinase (IKK) mediate TRAF2- dependent IKK recruitment to tumor necrosis factor (TNF) receptor 1 in response to TNF. Mol. Cell Biol. 2001 V. 21 P. 3986-3994.

79. Ting A.T., Pimentel-Muinos F.X. and Seed B. RIP mediates tumor necrosis factor receptor 1 activation of NF-kappaB but not Fas/APO-1- initiated apoptosis. EMBO J. 1996 V.15 P. 6189-6196.

80. Yang J., Lin Y., Guo Z. et al. The essential role of MEKK3 in TNF induced NF-kappa В activation. Nat. Immunol. 2001 V. 2 P. 620-624.

81. Baud V., Liu Z.G., Bennett B. et al. Signaling by proinflammatory cytokines: oligomerization of TRAF2 and TRAF6 is sufficient for JNK and IKKactivation and target gene induction via an amino-terminal effector domain. Genes Dev. 1999 V. 13 P. 12971308.

82. Kim J.W., Joe C.O. and Choi E.J. Role of receptor-interacting protein in tumor necrosis factor-alpha-dependent MEKK1 activation. J. Biol. Chem. 2001 V. 276 P. 2706427070.

83. Xia Y., Makris C., Su B. et al. MEK kinase 1 is critically required for c-Jun N-terminal kinase activation by proinflammatory stimuli and growth factorinduced cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 V. 97 P. 5243-5248. i

84. Yujiri Т., Ware M., Widmann C. et al. MEK kinase 1 gene disruption alters cell migration and c-Jun NH2- terminal kinase regulation but does not cause a measurable defect in NF- kappa В activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 V. 97 P. 7272-7277.

85. Sanz L., Diaz-Meco M.T., Nakano II. and Moscat J. The atypical PKC interacting protein p62 channels NF-kappaB activation by the IL1-TRAF6 pathway. EMBO J. 2000 V. 19 P.1576-1586.

86. Leitges M., Sanz L., Martin P. et al. Targeted disruption of the zeta PKC gene results in the impairment of the NF-kappaB pathway. Mol. Cell 2001 V. 8 P. 771-780.

87. Anrather J., Csizmadia V., Soares M.P. and Winkler H. Regulation of NF kappaB Rel A phosphorylation and transcriptional activity by p21(ras) and protein kinase Czeta in primary endothelial cells. J. Biol. Chem. 1999 V. 274 P. 13594-13603.

88. Zhong H., SuYang H., Erdjument-Bromage H. et al. The transcriptional activity of NF-kappaB is regulated by the IkappaB- associated PKAc subunit through a cyclic AMP-independent mechanism. Cell 1997 V. 89 P. 413-424.

89. Lallena M.J., Diaz-Meco M.T., Bren G. et al. Activation of IkappaB kinase beta by protein kinase С isoforms. Mol. Cell Biol. 1999 V. 19 P. 2180-2188.

90. Sanz L., Sanchez P., Lallena M.J. et al. The interaction of p62 with RIP links the atypical PKCs to NF-kappaB activation. EMBO J. 1999 V. 18 P. 3044-3053.

91. Wang D., Westerheide S.D., Hanson J.L. and Baldwin A.S. Tumor necrosis factor alpha-induced phosphorylation of RelA/p65 on Ser529 is controlled by casein kinase II. J. Biol. Chem. 2000 V. 275 P. 32592-32597.

92. Ozes O.N., Mayo L.D., Gustin J.A. et al. NF-kappaB activation by tumour necrosis factor requires the Akt serine-threonine kinase. Nature 1999 V. 401 P. 82-85.

93. Romashkova J.A. and Makarov S.S. NF-kappaB is a target of АКТ in antiapoptotic PDGF signalling. Nature 1999 V. 401 P. 86-90.

94. Hanna A.N., Chan E.Y., Xu J. et al. A novel pathway for tumor necrosis factor-alpha and ceramide signaling involving sequential activation of tyrosine kinase, p21(ras), and phosphatidylinositol 3-kinase. J. Biol. Chem. 1999 V. 274 P. 12722-12729.

95. Kim B.C., Lee M.N., Kim J.Y. et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and Rac in the nuclear signaling by tumor necrosis factor-alpha in rat-2 fibroblasts. J. Biol. Chem. 1999 V. 274 P. 24372-24377.

96. Reddy S.A., Huang J.H. and Liao W.S. Phosphatidylinositol 3-kinase as a mediator of TNF-induced NF-kappa В activation. J. Immunol. 2000 V. 164 P. 1355-1363.

97. Pastorino J.G., Tafani M. and Farber J.L. Tumor necrosis factor induces phosphorylation and translocation of BAD through a phosphatidylinositide-3-ОН kinase-dependent pathway. J. Biol. Chem. 1999 V. 274 P. 19411-19416.

98. Osawa Y., Banno Y., Nagaki M. et al. TNF-alpha-induced sphingosine 1- phosphate inhibits apoptosis through a phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in human hepatocytes. J. Immunol. 2001 V. 167 P. 173-180.

99. Mayo M.W., Madrid L.V., Westerheide S.D. et al. PTEN blocks tumor necrosis factor-induced NF-kappa B-dependent transcription by inhibiting the transactivation potential of the p65 subunit. J. Biol. Chem. 2002 V. 277 P. 11116-11125.

100. Gustin J.A., Maehama Т., Dixon J.E. and Donner D.B. The PTEN tumor suppressor protein inhibits tumor necrosis factor- induced nuclear factor kappa В activity. J. Biol. Chem. 2001 V. 276 27740-27744

101. Burkle A. Poly(APD-ribosyl)ation, a DNA damage-driven protein modification and regulator of genomic instability. Cancer Lett. 2001 V. 163 P. 1-5.

102. Oliver F.J., Menissier-de Murcia J., Nacci C. et al. Resistance to endotoxic shock as a consequence of defective NF-kappaB activation in poly(ADP-ribose) polymerase-1 deficient mice. EMBO J. 1999 V. 18 P. 4446-4454.

103. Hassa P.O. and Hottiger M.O. A role of poly (ADP-ribose) polymerase in NF-kappa В transcriptional activation. Biol. Chem. 1999 V. 380 P. 953-959.

104. Hassa P.O., Covic M., Hasan S. et al. The enzymatic and DNA binding activity of PARP-1 are not required for NF-kappa В coactivator function. J. Biol. Chem. 2001 V. 276 P.45588-45597.

105. Chang W.J. and Alvarez-Gonzalez R. The sequence-specific DNA binding of NF-kappa В is reversibly regulated by the automodification reaction of poly (ADP-ribose) polymerase 1. J. Biol. Chem. 2001 V. 276 P. 47664-47670.

106. Ullrich O., Diestel A., Eyupoglu I.Y., Nitsch R. Regulation of microglial expression of integrins by poly(ADP-ribose) polymerase-1. Nat. Cell Biol. 2001 V. 3 P. 1035-1042.

107. Le Page C., Sanceau J., Drapier J.C., Wietzerbin J. Inhibitors of ADP-ribosylation impair inducible nitric oxide synthase gene transcription through inhibition of NF kappa В activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998 V. 243 P. 451-457.

108. Kameoka M., Ota K., Tetsuka T. et al. Evidence for regulation of NF-kappaB by poly(ADP-ribose) polymerase. Biochem. J. 2000 V. 346 P. 641-649.

109. На Н.С., Hester L.D., Snyder S.H. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 dependence of stress-induced transcription factors and associated gene expression in glia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. V. 99 P. 3270-3275.

110. Hoeflich K.P., Luo J., Rubie E.A. et al. Requirement for glycogensynthase kinase-3beta in cell survival and NF- kappaB activation. Nature 2000 V. 406 P. 86-90.

111. Higuchi M. and Aggarwal B.B. TNF induces internalization of the p60 receptor and shedding of the p80 receptor. J. Immunol. 1994 V. 152 P. 3550-3558.

112. Mosselmans R., Hepburn A., Dumont J.E. et al. Endocytic pathway of recombinant murine tumor necrosis factor in L-929 cells. J. Immunol. 1988 V. 141 P. 3096-3100.

113. Schutze S., Machleidt Т., Adam D. et al. Inhibition of receptor internalization by monodansylcadaverine selectively blocks p55 tumor necrosis factor receptor death domain signaling. J. Biol. Chem. 1999 V. 274 P. 10203-10212.

114. Beg A.A., Sha W.C., Bronson R.T. and Baltimore D. Constitutive NF-kappa В activation, enhanced granulopoiesis, and neonatal lethality in I kappa В alpha-deficient mice. Genes Dev. 1995 V. 9 P. 2736-2746.

115. Sarma V., Lin Z., Clark L. et al. Activation of the B-cell surface receptor CD40 induces A20, a novel zinc finger protein that inhibits apoptosis. J. Biol. Chem. 1995 V. 270 P.12343-12346.

116. Song H.Y., Rothe M. and Goeddel D.V. The tumor necrosis factorinducible zinc finger protein A20 interacts with TRAF1/TRAF2 and inhibits NF kappaB activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 V. 93 P. 6721-6725.

117. Lee E.G., Boone D.L., Chai S. et al. Failure to regulate TNF-induced NFkappaB and cell death responses in A20-deficient mice. Science 2000 V. 289 P. 2350-2354.

118. Zetoune F.S., Murthy A.R., Shao Z. et al. A20 inhibits NF-kappa В activation downstream of multiple МарЗ kinases and interacts with the I kappa В signalosome. Cytokine 2001 V. 15 P. 282-298.

119. Jaattela M., Mouritzen H., Elling F. and Bastholm L. A20 zinc finger protein inhibits TNF and IL1 signaling. J. Immunol. 1996 V. 156(3) P. 1166-73.

120. Micheau 0., and Tschopp J. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes. Cell 2003 V. 114(2) P. 181-90.

121. Poyet J.L., Srinivasula S.M., Lin J.H., Fernandes-Alnemri Т., Yamaoka S., Tsichlis P.N., and Alnemri E.S. Activation of the Ikappa В kinases by RIP via IKKgamma /NEMO-mediated oligomerization J. Biol. Chem. 2000. V. 275(48) P. 37966-77.

122. Irmler M., Thome M., Hahne M., Schneider P., Hofmann K., Steiner V., Bodmer J.L., Schroter M., Burns K., Mattmann C. et al. Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP. Nature 1997 V. 388 P. 190-195.

123. Wang C.Y., Mayo M.W., Korneluk R.G., Goeddel D.V., and Baldwin A.S., Jr. NF-kappaB antiapoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAPl and C-IAP2 to suppress caspase-8 activation Science 1998 V. 281 P. 1680-1683.

124. Tang G., Minemoto Y., Dibling В., Purcell N.H., Li Z., Karin M. and Lin A. Inhibition of JNK activation through NF-kappaB target genes. Nature 2001 V. 414 P. 313317.

125. Deng Y., Ren X., Yang L., Lin Y., and Wu X. A JNK-dependent pathway is required for TNF alpha-induced apoptosis. 2003. V. 115 P. 61-70.

126. De Smaele E., Zazzeroni F., Papa S., Nguyen D.U., Jin R., Jones J., Cong R., and Franzoso G. Induction of gadd45beta by NF-kappaB downregulates pro-apoptotic JNK signalling Nature 2001 V. 414 P. 308-313.

127. Amanullah A., Azam N., Balliet A., Hollander, C., Hoffman В., Fornace, A., and Liebermann, D. Cell signalling: cell survival and a Gadd45-factor deficiency. Nature 2003 V. 424 P. 741.

128. Lee E.G., Boone D.L., Chai S., Libby S.L., Chien, M., Lodolce, J.P., and Ma, A. Failure to regulate TNF-induced NF-kappa В and cell death responses in A20-deficient mice Science 2000 V.289 P. 2350-2354.

129. Bubici C., Papa S., Pham C.G., Zazzeroni F., Franzoso G. The NF-kappaB-mediated control of ROS and JNK signaling. Histol Histopathol. 2006 V. 21 P. 69-80.

130. Zheng L., Fisher G., Miller R.E., Peschon J., Lynch D.H., and Lenardo M.J. Induction of apoptosis in mature T cells by tumour necrosis factor. Nature 1995 V. 377 P. 348-351.

131. Chan F.K., and Lenardo M.J. A crucial role for p80 TNF-R2 in amplifying p60 TNF-R1 apoptosis signals in T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 2000 V. 30 P. 652-660.

132. Li X., Yang Y., and Ashwell J.D. TNF-RII and c-IAPl mediate ubiquitination and degradation of TRAF2. Nature 2002 V. 416 P. 345-347.

133. Weber C.K., Liptay S., Wirth Т., Adler G., Schmid R.M. Suppression of NF-kappaB activity by sulfasalazine is mediated by direct inhibition of IkappaB kinases alpha and beta. Gastroenterology. 2000 V. 119(5) P. 1209-1218. *

134. Munro S. Lipid rafts: elusive or illusive? Cell 2003 V. 115(4)P. 377-388.

135. Dykstra M., Cherukuri A., Sohn H.W., Tzeng S.J. and Pierce S.K. Location is everything: lipid rafts and immune cell signaling. Ann. Rev. Immunol. 2003. V. 21. P. 457-481.

136. Legler D.F., Micheau O., Doucey M.A., Tschopp J. and Bron C. Recruitment of TNF receptor 1 to lipid rafts is essential for TNF alpha-mediated NF-kappaB activation. Immunity 2003. V. 18. P. 655-664.

137. Doan J.E., Windmiller D.A. and Riches D.W. Differential regulation of TNF-R1 signaling: lipid raft dependency of p42mapk/erk2 activation, but not NF-kappaB activation. J. Immunol. 2004. V. 172 P. 7654-7660.

138. Algeciras-Schimnich A., Shen L., Barnhart B.C., Murmann A.E., Burkhardt J.K. and Peter M.E. Molecular ordering of the initial signaling events of CD95. Mol. Cell. Biol. 2002. V. 22. P. 207-220.

139. Muppidi J.R. and Siegel R.M. Ligand-independent redistribution of Fas (CD95) into lipid rafts mediates clonotypic T cell death. Nat. Immunol. 2004. V. 5. P. 182-189.

140. Scaffidi C., Fulda S., Srinivasan A., Friesen C., Li F., Tomaselli K.J., Debatin K.M., Krammer P.H. and Peter M.E. Two CD95 (APO-l/Fas) signaling pathways. EMBO J. 1998. V. 17. P. 1675-1687.

141. Siegel R.M., Frederiksen J.K., Zacharias D.A., Chan F.K., Johnson M., Lynch D., Tsien R.Y. and Lenardo M.J. Fas preassociation required for apoptosis signaling and dominant inhibition by pathogenic mutations.Science. 2000. V. 288. P. 2354-2357.

142. Hueber A.O., Bernard A.M., Herincs Z., Couzinet A. and He H.T. An essential role for membrane rafts in the initiation of Fas/CD95-triggered cell death in mouse thymocytes. EMBO Rep. 2002. V. 3. P. 190-196.

143. Wyllie A.H. Apoptosis and carcinogenesis. Eur J Cell Biol 2004 V. 73(3) P. 189-197.

144. Denecker G., Vercammen D., Declercq W., Vandenabeele P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors Cell Mol.Life Sci 2001V. 58(3) P. 356-370.

145. Spinivasula S.M., Ahmad M., Fernandes-Alnemri Т., Alnemri E.S. Autoactivation of procaspase-9 by Apaf-1 -mediated oligomerization. Mol.Cell. 1998. V. 1(7). P. 949-957.

146. Muzio M., Stockwell B.R., Stennicke H.R., Salvesen G.S., Dixit V.M. An induced proximity model for caspase-8 activation. JBC. 1998. V. 273(5). P. 2926-2930.

147. Duan H„ Dixit V. RAIDD is a new 'death' adaptor molecule. Nature. 1997 V. 385(6611). P. 86-89.

148. Hsu H., Xiong J., Goeddel D.V. The TNF receptor 1-associated protein TRADD signals cell death and NF-kappa В activation. Cell 1995 V. 81(4) P. 495-504.

149. Denecker G., Vercammen D., Declercq W., Vandenabeele P. Cell Mol Life Sci. 2001 V. 58(3) P. 356-370.

150. Vercammen D., Brouckaert G., Denecker G., Vandecraen M., Declercq W., Fiers W., Vandenabeele P. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med 1998 V. 188(5) P. 919-930.

151. Kinloch R.A., Treherne J.M., Furness L.M., Hajimohamadreza I. The pharmacology of apoptosis .Trends Pharmacol Sci. 1999 V. 20(1) P. 35-42.

152. Schotte P., Declercq W., Vanhuffel S., Vandenabeele P., Beyaert R. Non-specific effects of methyl ketone peptide inhibitors of caspases. FEBS Lett 1999 V. 442(1) P. 117121.

153. Kuida K., Haydar T.F., Kuan C.Y., Gu Y., Taya C., Karasuyama H., Su M., Rakic P., Flavell R.A. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell 1998 V. 94(3) P. 325-337.

154. Kuida K., Zheng T.S, Na S.Q., Kuan C.Y., Yang D., Karasuyama H., Rakic P., Flavell R.A. Nature 1996 V. 384 P. 368-372.

155. Kuida K., Lippke J.A., Ku G., Harding M.W., Livingston D.J., Su M., Flavell R.A. Altered cytokine export and apoptosis in mice deficient in interleukin-1 beta converting enzyme. Science 1995 V. 267 P. 2000-2003.

156. Zheng T.S., Hunot S., Kuida K., Flavell R.A. Caspase knockouts: matters of life and death. Cell. Death. Differ. 1999 V. 6 (11) P. 1043-1053.

157. Vandenabeele P., Declercq W., Beyaert R., Fiers W. Two tumour necrosis factor receptors: structure and function. Trends. Cell. Biol. 1995 V. 5. (10) P. 392-399. ,

158. Lin Y., Devin A., Rodriguez Y., Liu Z.G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis Genes. Dev. 1999. V.13 (19). P. 2514-26.

159. Pimentel-Muinos F.X., Seed В. Regulated commitment of TNF receptor signaling: a molecular switch for death or activation Immunity 1999 V. 1(6) P. 783-793.

160. Kelliher M.A., Grimm S., Ishida Y„ Kuo F., Stanger B.Z., Leder P. The death domain kinase RIP mediates the TNF-induced NF-kappaB signal. Immunity 1998 V. 8(3) P. 297-303.

161. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis Biochem. J. 1997 V. 326 (Pt 1) P. 1-16.

162. Chao D.T., Korsmeyer S.J. BCL-2 family: regulators of cell death. Ann. Rev. Immunol. 1998 V. 16 P. 395- 419.

163. Screaton G., Xu X.N. T cell life and death signalling via TNF-receptor family members. Curr. Opin. Immunol. 2000 V. 12(3) P. 316-322.

164. Rich Т., Allen R.L., Wyllie A.H. Defying death after DNA damage. Nature 2000 V. 407 P. 777-783.

165. Kerr J., Wyllie A.II., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer 1972.V. 6(4) P. 239-257.

166. Johnson D.E. Programmed cell death regulation: basic mechanisms and therapeutic opportunities. Leukemia 2000 V. 14(8) P. 1340-1344.

167. Utz P.J., Anderson P. Life and death decisions: regulation of apoptosis by proteolysis of signaling molecules. Cell Death. Differ. 2000 V. 7(7) P. 589-602.

168. Squier M., Cohen J.J. Cell-mediated cytotoxic mechanisms. Cell. Death. Differ. 1996 V. 3 P. 275 -283.

169. Pornares М.1., Samali A., Orrenius S. Cleavage of the calpain inhibitor, calpastatin, during apoptosis. Cell. Death. Differ. 1998 V. 5 P. 1028-1033.

170. Hajnoczky G., Csordas G., Madesh M., Pacher P. Control of apoptosis by IP(3) and ryanodine receptor driven calcium signals. Cell Calcium. 2000 V. 28 P. 349-363.

171. Diaz F., Bourguignon L.Y. Selective down-regulation of IP(3)receptor subtypes by caspases and calpain during TNF alpha -induced apoptosis of human T-lymphoma cells Cell .Calcium. 2000V. 27 P. 315-328.

172. James S.Y., Williams M.A., Newland A.C., Colston K.W. Leukemia cell differentiation: cellular and molecular interactions of retinoids and vitamin D. Gen Pharmacol. 1999 V. 32(1) P. 143-154.

173. Brackman D., Lund-Johansen F., Aarskog D. Expression of cell surface antigens during the differentiation of HL-60 cells induced by 1,25-dihydroxyvitamin D3, retinoic acid and DMSO. Leuk. Res. 1995 V. 19, P. 57-64.

174. Tohyama К., Shiga S., Fujimoto H., Hamaguchi Y., Ichiyama S. Automated analysis of differentiation-induced leukemic cells during all-trans retinoic Acid therapy of acute promyelocytic leukemia. Arch. Pathol. Lab. Med., 2003 V. 127 P. e4-e8.

175. Steinman R.A. and Tweardy D.J Granulocyte colony-stimulating factor receptor mRNA upregulation is an immediate early marker of myeloid differentiation and exhibits dysfunctional regulation in leukemic cells. Blood. 1994 V. 183 P. 119-127.

176. Squinto S.P., Doucet J.P., Block A.L., Morrow S.L., Davenport W.D. Jr. Induction of macrophage-like differentiation of HL-60 leukemia cells by tumor necrosis factor-alpha: potential role of fos expression. Mol Endocrinol. 1989 V. 3(2) P. 409-419.

177. Bertagnolo V., Marchisio M., Capitani S., Neri L. M. Intranuclear translocation of phospholipase C-beta2 during HL-60 myeloid differentiation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997 V. 235 P. 831-837.

178. Marchisio M., Bertagnolo V., Colamussi M. L., Capitani S., Neri L. M. Phosphatidylinositol 3-kinase in IIL60 nuclei is bound to the nuclear matrix and increases during granulocytic differentiaton. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998 V. 253 P. 346351.

179. Bertagnolo V., Neri L. M., Marchisio M., Mischiati C., Capitani S. Phosphoinositide 3-kinase activity is essential for all-trans-retinoic acid-induced granulocytic differentiation of HL-60 cells. Cancer Res. 1999 V. 59 P. 542-546.

180. Bertagnolo V., Brugnoli F., Marchisio M., Celeghini C., Carini C., Capitani S. Association of PI 3-K with tyrosine phosphorylated Vav is essential for its activity in neutrophil-like maturation of myeloid cells, Cell. Signal. 2004 V. 16 P. 423- 433.

181. Beyaert R., Heyninck K., Devalck D., Boeykens F., Vanroy F., Fiers W. Enhancement of tumor necrosis factor cytotoxicity by lithium chloride is associated with increased inositol phosphate accumulation. J Immunol. 1993 V. 151(1) P. 291-300.

182. Yorek M.A., Dunlap J.A., Thomas M.J., Cammarata P.R., Zhou C., Lowe W.L. Effect of TNF-alpha on SMIT mRNA levels and myo-inositol accumulation in cultured endothelial cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 1998 V. 43. P. 58-71.

183. Williams M. A., Newland A. C. and Kelsey S.M. Monocyte-mediated killing of human leukaemia is enhanced by administration of granulocyte-macrophage colony stimulating factor following chemotherapy. Br. J. Hematol. 1997 V. 98 P. 960-968.

184. Witsell A. L., and Schook L. B. Tumor necrosis factor alpha is an autocrine growth regulator during macrophage differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992 V. 89 P. 4754-4758.

185. Hachiya M., Shimizu S., Osawa Y., Akashi M. Endogenous production of tumour necrosis factor is required for manganese superoxide dismutase expression by irradiation in the human monocytic cell line THP-1. Biochem J. 1997 V. 328 P. 615-623.

186. Zyad A., Benard J., Tursz Т., Clarke R., Chouaib S. Resistance to TNF-alpha and adriamycin in the human breast cancer MCF-7 cell line: relationship to MDR1, MnSOD, and TNF gene expression. Cancer Res. 1994 V. 54 P. 825-831.

187. Rogers R.J., Monnier J.M., and Nick H.S. Tumor necrosis factor-alpha selectively induces MnSOD expression via mitochondria-to-nucleus signaling, whereas interleukin lbeta utilizes an alternative pathway. J. Biol. Chem. 2001 V. 276 P. 20419-20427.

188. Ketley N.J., Allen P.D., Kelsey S.M., Newland A.C. Mechanisms of resistance to apoptosis in human AML blasts: the role of differentiation-induced perturbations of cell-cycle checkpoints. Leukemia 2000 V. 14 P. 620-628.

189. Laskin D.L., Sirak A.A., Laskin J.D. Differentiation of HL-60 myeloid leukaemia cells is associated with a transient block in the G2 phase of the cell cycle. Cell Prolif. 1991 V. 24, P.341-353.

190. Vermeulen L., Wilde G. D., Notebaert S., Berghe W. V., Haegeman G. Regulation of the transcriptional activity of the nuclear factor-kappaB p65 subunit. Biochemical Pharmacology. 2002. V.64. P. 963-970.

191. Wolf B.B., Green D.R. Suicidal tendencies: apoptotic cell death by caspase family proteinases. J. Biol. Chem. (1999 V. 274 P. 20049-20052.

192. Arora A. S., Jones B. J., Patel Т. C. Bronk S. F., Gores G. J. Ceramide induces hepatocyte cell death through disruption of mitochondrial function in the rat Hepatology. 1997. V. 25(4). P. 958-963.

193. Quillet-Mary A., Jaffrezou J. P., Mansat V., Bordier C., Naval J. Implication of mitochondrial hydrogen peroxide generation in ceramide-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 21388-21395.

194. Ghafourifar P., Klein S. D., Schucht O., Schenk U., Pruschy M., Rocha S., Richter C. Ceramide induces cytochrome с release from isolated mitochondria. Importance of mitochondrial redox state J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 6080-6084.

195. Hengartner M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature. 2000. V. 407. P. 770-776.

196. Y.A. Hannun. Functions of ceramide in coordinating cellular responses to stressi

197. Science. 1996. V.274. P. 1855-1859.

198. Yuan H., Williams S.D., Adachi S., Oltersdorf Т., Gottlieb R.A. Cytochrome с dissociation and release from mitochondria by truncated Bid and ceramide. Mitochondrion. 2003. V. 2(4). P. 237-244.

199. Thannickal V.J. and Fanburg B.L. Reactive oxygen species in cell signaling Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2000 V. 279 P. 1005-1028.

Информация о работе

Гибанова, Наталья Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Сравнение механизмов протекторного действия L-глутаминовой кислоты и гексапептида TGENHR на TNF-индуцированную гибель клеток линии HL-60 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы