Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

"СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГОНАДОТРОПНОГО ПРЕПАРАТА „ОВАРИТРОПИН"""

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме ""СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГОНАДОТРОПНОГО ПРЕПАРАТА „ОВАРИТРОПИН""""

ШІ

А- 314*З

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ

ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК имени В. И. ЛЕНИНА

1ля служебного [юдьзования

АМЕЛИНА Викторина Васильевна

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГОНАДОТРОПНОГО ПРЕПАРАТА „ОВАРИТРОПШГ

03.00.04 — биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —

I 978

Работа выполнена в лаборатории патологии н фнэ пологіш размножения сельскохозяйственных животных Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарна.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, . профессор

Н. Н. Ми кайло в.

" кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник И. Я. Чистяков.

- Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. Ф. Поляков

{ВИЭВ).

кандидат ветеринарных наук А, Д. Васин

' ' ' (ВГНКИ)

Ведущее учреждение: Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский икстнтут животноводства.

Защита диссертации состоится 1978 г,

в часов на заседании специализированного Совета Д 020,28.02 по

присуждению ученой степени доктора наук во Всесоюзном ордена Ленина институте экспериментальной ветеринарии по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ/

. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан *

1978 г.

Ученый секретарь специализированного Совета — кандидат биологических наук

С П. Рогожин

і 4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Повышение производства продуктов животноводства за счет увеличения продуктивности сельскохозяйственных животных и расширенного воспроизводства стада является одной из главных задач десятой пятилетки.

В связи с этим особое значение приобретает разработка и внедрение методов управления процессами размножения сельскохозяйственных животных, повышения их плодовитости и профилактики бесплодия.

В решении указанных задач, наряду с внешнимн факторами, стимулирующими половую функцию животных, важное место принадлежит применению синтетических и естественных гормонов, в том числе гонадотропных гормонов, полученных из сыворотки крови Жеребых кобыл (СЖК). ^

Применение натнвной СЖК или КЖК связано, как известно, с повторными инъекциями животным значительных количеств чужеродных сывороточных белков, что может привести к появлению, на фоне измененной реактивности организма, различной степени тяжести аллергических реакций.

Первые наблюдения, касающиеся случаев анафилаксии у овец и коров при введении им СЖК во время производственных опытов 1940—1943 гг.* описаны М. М, Завадовским (1963). В-последующем о случаях анафилактического шока у коров, в том числе и со смертельным исходом, сообщали: ВиЬпег; 1958; Н. А. Дудоров, 1963; В. Морев и Е. Малишев-ский, 1964; И. К. Назаренко с соавт., 1964; А. А. Осетров с соавт., 1964; П. И. Шаталов с соавт., 1965 и др. Как следствие анафилактического шока авторы отмечали снижение или утрату коровами молочной продуктивности, ухудшение качества молока. Анафилактические реакции у овец при введении СЖК наблюдали В. В. Волков, 1946; А. Ш. М. Амарбаев, 1963; И. Я- Чистяков, С. X. Убайдов, 1977 и др. Овцы, перенесшие анафилактический шок, как правило, не приходили в охоту и оставались яловыми. Следует особо отметить, что анафилактические реакции при введении СЖК наблюдались, в ряде случаев, на фоне предшествующей вакцинации животных против инфекционных заболеваний, т. е. по типу параллергии.

Реальные возможности предотвращения у животных указанных аллергических реакций связаны с получением ИЗ СЖК

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. сельскохоэ. академик им. К. А» Тимир^мма,

И на.

препаратов очищенных гонадотропных гормонов. Современные методы очистки основываются на работах Cartland a. Nelson, выполненных в J937 г. Авторы предложили способ получения очищенных гонадотропинов из СЖК, включающий последовательное осаждение сывороточных белков с помощью 50% концентрации ацетона или этилового спирта с последующим выделением гонадотропинов при 70% концентрации этих оса-дителей. ; • ' •

В дальнейших исследованиях по очистке гормонов СЖК эта принципиальная схема, применительно к этапу получения первичного концентрата гонадотропниов была, в основном, сохранена. В частности, па ней основываются способы получения гормонов СЖК, разработанные в ЧССР (Quesnerova, 1966) и Советском Союзе (Ф. Ю. Рышка с соавт., 1971).

Широкие испытания на сельскохозяйственных животных отечественного препарата гравогормона, проведенные в СССР и НРБ П. И. Шаталовым, В. 3. Желевым, М. П. Богдановым, А. П. Джуровым, Г. А. Черемисиновым, А. Г. Неждановым, Е. И. Чудиовским, С. П. Беляковым, А. И. Сергиенко с соавт., А. Д. Лельковым, И, Я. Чистяковым, Ч. А.- Рзаевым и др. свидетельствуют о том, что очистка гонадотропинов СЖК не,отражается на их биологической активности, а удаление из гонадотропного препарата значительного количества сывороточных белков снижает сенсибилизацию животного гетерологич-ными белками и, тем самым, предотвращает возможность воз* иикновешш анафилактических реакций, что очень важно в практическом отношеннн.

Цель и задачи исследований. Известный в настоящее время в СССР способ получения в сухом виде очищенных от балластных белков гонадотропинов из СЖК (препарат гравогор-мои) основан на осаждении неактивных сывороточных белков при 50% концентрации этилового спирта с последующим выделением гонадотропниов при 75% концентрации этилового спирта. Это обеспечивает 25—30-кратную степень очистки го-иадотропных гормонов по белку и конечный выход нх в пределах 60% от исходной биологической активности СЖК. Однако, переход к производству гонадотропинов из СЖК на промышленном оборудовании сопровождается, как правило, снижением качества очистки и количественного выхода гормонов.

В связи с этим целью наших исследований являлась разработка нового способа выделения гонадотропинов из СЖК, позволяющего увеличить выход гормонов по отношению к их содержанию в исходной СЖК и улучшить качество очистки. Представлялось также целесообразным уменьшить, по сравнению с существующими способами, затраты времени на производство препарата, а также отработать условия очистки, обеспечивающие ведение процесса при комнатной температуре.

Научная новизна работы. Анализ данных литературы последних лет показал, что различные модификации метода Cartland a. Nelson (1937), применительно к стадии получения первичного концентрата гоиадотропинов из СЖК, с использованием ацетона или этилового спирта, не обеспечивают существенного улучшения качества очистки. Поэтому нами при разработке способа очистки гонадотропных гормонов из СЖК впервые использована схема, включающая последовательное применение двух видов химических осадителей белков: риванола н ацетона. Кроме того, известные в литературе условия применения каждого из указанных осадителей модифицированы нами, с целью повышения качества очистки, технологичности к экономичности процесса.

В частности, в отличие от применяемых для осаждения сывороточных альбуминов и альфа-бета-глобулниов 0,4% концентрации водного раствора риванола и соотношения объемов СЖК и осадителя белков 1:3—1 :3,5, нами использован концентрированный 15% раствор риванола при соотношении объемов СЖК и осадителя 9:1. Это позволило избежать 4— 4,5-кратного разведения исходной СЖК на первой стадии очистки гормонов. 14

Схема получения первичного концентрата гонадотропинов по Cartland a. Kelson усовершенствована нами за счет сокращения экспозиции отстаивания белков с 16 до 1 часа, исключения второй стадии осаждения белков при 50% концентрации ацетона и рН 6,0 и ведения процесса очистки полностью при комнатной температуре.

Практическая ценность работы. Разработанный нами способ получения в сухом виде очищенных от балластных белков гонадотропинов из СЖК (гонадотропный препарат «Ова-рнтрошш»), обеспечивает ведение процесса очистки гормонов при комнатной температуре п выполнение его в течение одного рабочего дня, вместо 3—4 суток по способу Cartland a. Nelson и двух суток — по способу получения гравогормона {Ф. Ю. Рышка и др. 1971). При этом качество очистки «Овари-тропина» в 5—6 раз лучше, а выход гормонов по гонадотропной активности на 10—15% выше {без удорожания стоимости его производства).

Апробация работы н ее реализация. Государственным комитетом по делам открытий и изобретений при Совете Министров СССР принято решение о выдаче авторского свидетельства на разработанный способ получения «Оваритропи-на» из СЖК-

Полученные новым способом серии препарата прошли комиссионную проверку в апреле-мае 1977 г. во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов МСХ СССР и признаны годными для применения

в качестве стимуляторов половой функции у сельскохозяйственных животных.

Публикация результатов исследований. Материалы исследований, изложенные в диссертационной работе, опубликованы в пяти статьях и доложены на конференции молодых ученых в 1976 году и межлабораторной конференции ВИЭВ 5 декабря 1977 г., а также на заседании методического Совета ВИЭВ в декабре 1977 г.

Объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы. Материал, изложен на 125 страницах машинописи, содержит 21 таблицу и 1 рисунок. Список используемой литературы включает 154 наименования, из них 63 на иностранных языках.

Приложение к диссертации: копни актов проверки «Овари-тропина» на лабораторных и сельскохозяйственных животных на 7 листах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работу выполнили в лаборатории патологии и физиологии размножения сельскохозяйственных животных ВИЭВ. Для получения очищенных гонадотропних гормонов использовали производственные серии СЖК, изготовленные Орской биофабрикой, Реутовской ветлобораторией кормовых антибиотиков, Нуратинским госбиопунктом Самаркандской области, а также сыворотки жеребых кобыл, полученные при нашем участии на Московском конном заводе № 1, со сроками хранения не более 1,5 лег п активностью от 60 до 340 м. е./мл. Всего для разработки способа очистки гонадотропних гормонов использовали 25 литров СЖК, из которой было получено 32 серии препарата.

Определение общей гонадотропной активности серий препарата проводили по методике, разработанной в МВА П. И. Шаталовым с сотрудниками (1970) на неполовозрелых белых мышах-самках 21—25-дневного возраста, массой 7—8 г.

Лютеинизирующую активность определяли по методике, основанной на принципе суперовуляции, усовершенствованной Ю, Д. Клинским (1971), на неполовозрелых белых мышах-самках массой 9—10 г, В опытах был использован стандартный препарат от кобылы «Чайка» с соотношением фолли-кулостимулирующей (ФСҐ) и лютеинизирующей (ЛГ) активностей ISO: 60 (м. е.), полученный из ВИЖ'а от К>. Д. Клин-ского, В опытах использовано 170 мышей-самок.

Определение анафилактогенностн гормональных препаратов, полученных из СЖК, проводили на морских свинках мас-

сой от 300 до 450 г. с помощью реакций активной и прямой пассивной анафилаксии по общепринятым методикам, описанным в работах А. Д. Лдо (1964, 1970), О. Е. Вязова (1967). При этом использована 51 морская свинка.

Содержание общего белка в сыворотках и препаратах определяли рефрактометрически (на рефрактометре RL № 2831), а также сульфосалициловой пробой и мнкробиуре-товым методом (Д. Бейли, 1965).

Определение сухого остатка СЖК и полученных из нее препаратов проводили путем высушивания определенной навески до постоянного веса при 105е.

Общий азот препаратов определяли, пол у микрометодом Къельдаля; концентрацию общих углеводов — по Хагедорну-Иенсену. Определение общего количества лнпидов проводили с помощью метода экстракции алкогольно-эфирной смесью Блюра.

Препараты, предназначенные для испытания на животных, предварительно проверяли на стерильность (питательные среды: МПА, МП Б, МППБ, среда Сабуро) и безвредность (белые мыши массой 18—20 г).

Испытания полученных из СЖК серий препарата «Оварн-тропнн» проводили на каракульских овцах (30), коровах (41) и кобылах (27), соответственно, в совхозе «Галаба» Бухарской области, ферме «Сычево» совхоза «Коломенский» Московской области и Московском конпом заводе № 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка способа очистки и концентрирования гонадотропинов СЖК

В процессе отработки первого этапа очистки гонадотроп-ных гормонов из СЖК нами последовательно решались следующие вопросы: •

— обоснование возможности использования риванола для очистки гормонов СЖК;

— определение условий {температуры, экспозиции) осаждения и отделения балластных белков;

— снижение разведения исходной СЖК за счет использования более концентрированных растворов риванола.

В результате проведения первого этапа исследований при использованных экспозициях воздействия риванола на СЖК установлено отсутствие и и активирующего эффекта этого оса-дптеля на гонадотропные гормоны. Гормональная активность СЖК после осаждения альбуминов и альфа-бета-глобулннов снижалась незначительно пли была аналогичной исходной. Прн отработке метода осаждения балластных белков выявле-

на также предпочтительность центрифугирования перед фильтрацией через бумажные фильтры.

Одновременно нами испытано сочетание различных концентраций растворов риванола и объемов смешения их с СЖК. Прк этом мы исходили из необходимости снизить используемый объем раствора риванола, за счет повышения его концентрации. В результате проведенных опытов было установлено, что применение 15% раствора риванола, при соотношении его объема к СЖК 1 :9, обеспечивает снижение содержания белка с 7,4 г% "до 0,7—0,9 г%,.т. е. 8—10-кратную степень очистки по белку. При указанном соотношении объемов осади-теля и СЖК, ее разведение не превышает 1,1 раза (против 4—4,5-кратного разведения сывороток по методам, описанным в литературе).

На основании проведенных исследований нами была разработана новая схема осаждения сывороточных белков СЖК риванолом включающая следующие этапы:

— добавление .15% водного . раствора- риванола (рН 5,8) к СЖК в соотношении 1 : 9 при перемешивании;

— отстаивание смеси при комнатной температуре (18— 20е) в течение 15—20 минут; -

— отделение осадка сывороточных белков центрифугированием при 4000—5000 об/мин в течение 30 минут;

— добавление к надосадочной жидкости натрия хлористого в порошке из расчета 10 г на литр, тщательное перемешивание раствора;

— отстаивание раствора при температуре 4° в течение 30 минут или при охлаждении на льду— 10—15 минут;

— отделение риванола центрифугированием при 2500— 3000 об/мин в течение 15 минут; /

— отделение гормонсодержащей надосадочной жидкости.

За основу второго этапа очистки гормонов из СЖК нами

принята схема Cartland a. Nelson (1937), применительно к стадии получения первичного концентрата гонадотропинов, включающая осаждение белков при 50% концентрации ацетона. Б качестве возможных вариантов усовершенствования этой схемы предусматривали: сокращение -времени отстаивания осадка балластных белков, исключение стадии повторного осаждения белков при рН 6,0 и ведение очистки в условиях комнатной температуры.

Для этой цели нами проведен ряд сравнительных опытов, включающих следующие варианты схемы получения первичного концентрата гормонов из СЖК.

Вариант!. (Carttand a. Nelson):

— доведение рН сыворотки до 7,4 и осаждение белков СЖК при 50% концентрации в ней ацетона в течение 16 часов при комнатной температуре, центрифугирование при 3000 об/мин 15 мин для отделения осадка белков;

— повторное осаждение белков при 50% концентрации ацетона из смеси, подкисленной до рН 6,0, в течение 16 часов на холоде (+4°), центрифугирование при 3000 об/мин 15 мин и отделение надосадочной жидкости;

— осаждение гормонов из СЖК при 70% концентра* ции в ней ацетона в течение 16 часов при температуре +4% центрифугирование при 3000 об/мин 15 мин., последовательное промывание осадка гормонов этиловым спиртом и эфиром, высушивание препарата на воздухе в течение 30 мин.

Вариант 2. Все операцин'по схеме Cartland a. Nelson, но с экспозицией отстаивания смесей, равной 1 часу.

Вариант 3. С исключением из схемы Cartland a. Nelson стадии повторного осаждения балластных белков при 50% концентрации ацетона и рН 6,0.

Вариант 4. С исключением из схемы стадии повторного осаждения белков -и прн сокращенных до 1 часа экспозициях отстаивания смесей.

Результаты опытов представлены в таблице 1. .

Та блица 1

Выход препарата по весу прн различных вариантах схемы очистки '

Вариант схемы очистки / Кол-во: . проб Объем СЖК, использовании П для очистки {литры) ' Выход препарата • на 1 литр СЖК ^граммы)

Ni 1 4' 0,4 3,35±0,45

vNi 2 4 0,4 2,36 ±0,08

№ 3 ■ 4 ,0.4 5,03 ±0,69

№ 4 4 ; 0,4 2,88 ±0,20

Критерием оценки для сравнения условий в этих опытах являлся вес полученных сухих препаратов гормонов. ;

Б результате проведенных сравнительных опытов (таблица 1) установлено, что вес препаратов, полученных в условиях одночасового отстаивания (варианты №№ 2 и 4) в 1,4— 1,8 раза меньше, чем при отстаивании в течение 16 часов (варианты №№ 1 и 3).

Сравнение схем очистки (варианты №Кэ 3 и 1, 4 и 2) с использованием одно- и двукратного осаждения белков при 50% концентрации ацетона выявило малую значимость повторного осаждения в суммарном эффекте очистки. По результатам опытов кратность отличия препаратов по весу с повторным осаждением и бе;з него составляла 1,2—1,5 раза (с учетом доверительного интервала — в пределах от 0 до 2 раз).

Сокращение схемы очистки за счет исключения стадии повторного осаждения белков 50% ацетоном и уменьшения экс-

позиции отстаивания до 1 часа (вариант № 4) сопровождалось некоторым уменьшением веса препаратов, по сравнению с вариантом Ка 1. Однако найденные отличия не являются статистически достоверными.

Активность проверенных-биопробой гонадотропных препаратов, полученных во всех 4-х вариантах, практически совпадала. Это свидетельствует о том, что препараты из СЖК с меньшим выходным весом обладали, соответственно, более высокой степенью очистки (по показателю гонадотропной активности, приходящейся на единицу веса препарата — м. е;/мг).

Следующим этапом этого раздела работы являлось изучение возможности проведения очистки гормонов из СЖК при комнатной температуре. Получение препаратов проводили по сокращенной схеме (вариант № 4), показавшей преимущества в предыдущих опытах. Заметных различий в выходе гормонов по весу и гонадотропной активности в зависимости от температурного режима отстаивания смесей СЖК и ацетона (при +4 и +20°) установить не удалось. Это связано, очевидно, с сокращением экспозиций отстаивания осадка до 1 часа. За указанный срок заметной инактивации гормонов не происходит. Кроме того, следует учитывать, что центрифугирование смесей проводили на рефрижераторной центрифуге. В целом, переход к осаждению белков и гормонов при комнатной температуре упрощает последующую технологию производства препарата, поскольку отпадает необходимость в оборудовании специальных холодильных камер. В связи с этим следует отметить, что технически операция по удалению остатка риванола на предыдущем этапе очистки может выполняться в условиях обычного захолажнвания жидкости льдом или снегом. Все же основные технологические операции по обеим стадиям очистки осуществляются при комнатной температуре.

На основании проведенных исследований нами была определена в окончательном виде следующая схема второго этапа очистки гонадотропных гормонов СЖК с помощью ацетона:

— доведение рН сыворотки до 7,4, осаждение сывороточных белков из СЖК при 50% концентрации в, ней ацетона в течение I часа при комнатной температуре,.центрифугирование в течение 15 мин на рефрижераторной центрифуге при 3000 об/мин, отделение надосадочной жидкости от осадка неактивных белков;

— осаждение гормонов из СЖК при 70% концентрации ацетонатВ течение 1 часа при комнатной температуре, центрифугирование при 3000 об/мин 15 мин, отделение надосадочной жидкости, последовательное промывание осадка гормонов этиловым спиртом и эфиром, высушивание препарата на воздухе в течение 30 мин до порошкообразного состояния.

Изучение качества очистки препарата на стадии ацетонового осаждения показало результаты, в основном, совпадаю* 3

щие с данными литературы. В частности, по результатам 4-х опытов с использованием указанной схемы очистки средний вес препаратов составил (в расчете на 1 л СЖК)—2,86± 0;1 г., их гормональная активность 60 м. е./мг и выход гонадо-тропинов по отношению к исходной активности СЖК — 86%, С учетом содержания белка в исходной СЖК 74 г/л (7,4 г°/о) и веса полученных сухих препаратов — 2,86, кратность очистки препаратов по белку составила около 25 раз. При сопоставлении гормональной активности исходной СЖК (200 м. е./мл или 0,2 м е./мг) и полученных из нее препаратов — 60 м. е./мг, отличие по этому показателю составляло 300 раз.

После раздельной отработки этапов очистки гонадотропных гормонов из СЖК и оценки их значимости в суммарном эффекте мы воспроизвели схему очистки в целом. Практически для перехода от первого ко второму этапу осаждения белков потребовалось лишь доведение рН до 7,4.

Воспроизведение способа очистки гормонов СЖК в лабораторных условиях показало, что количество используемой для этого сыворотки лимитируется, в основном, рабочим объемом центрифуги. В частности, при использовании рефрижераторной центрифуги ЦЛР-1 с общим объемом центрифужных стаканов в 1 литр за один рабочий день удавалось обработать около 1,5 литров СЖК.

Способ получения очищенных гонадотропных гормонов из СЖК разработан с использованием отечественного лабораторного оборудования и химических реактивов и может быть использован в бнопромышленности.

Отработка условий стерилизации и высушивания очищенных гормональных препаратов

При отработке способа стерилизации гонадотропного препарата нами вначале был взят за основу метод фильтрации через пластины СФ под вакуумом. Для этой цели осадок гормонов растворяли в объемах 0,2% раствора лактозы, равных 1/20—1/30 исходного количества СЖК. чго обусловливало концентрацию белка в фильтруемых растворах в пределах 10—15 мг/мл. При этом рН растворов достигал 9,5—9,8. Фильтрацию растворов гормонов проводили при значениях рН 9,0; 7,0 и 6.0.

В результате проведенных опытов было установлено резкое снижение гормональной активности (более 50%), вне зависимости от рН среды фильтруемых растворов.

В связи с этим в последующих исследованиях были проверены фильтры МЛПроге (0,22 мкм). При этом мы исходили из возможности использования в дальнейшем фильтров «Влади-пор» отечественного производства. В этих опытах была выяв-

лена определенная зависимость между концентрацией белков в растворе и скоростью прохождения через фильтр: наименьшую скорость фильтрации, а в отдельных случаях и ее прекращение, отмечали при. растворении осадка гормонов в 1/30 исходного объема СЖК. Снижение гонадотропной активности, находящихся в фильтрате гормонов не превышало 4—9%. Увеличение разведения осадка гормонов при растворении в 1/20 исходного объема СЖК улучшило фильтруемость растворов и практически устранило потерю их активности.

'Высевы из фильтратов на МПА, МПБ и среду Сабуро показали стерильность полученных препаратов.

При отработке условий лиофильной сушки препаратов, мы определили среду высушивания — 0,2% раствор лактозы и освоили методику работы на установке «Ё(1\уаг5». Полученные серии сухих препаратов проверены нами на гонадотропную активность. Данные представлены в таблице 2,

Таблица 2

Результаты определения активности очищенных препаратов из СЖК после лиофильной сушки

№№ Серия 1'онадотропная активность препарата (м. е.) Снижен не

опытов препаратов исходная СЖК после лнофиль-ноЛ сушки * активности <%>

1 25 2800 2300 17,9

2 27 5400 4400 18.6

3 -88 2400 2000 ■ 16,7

4 -У-ЗО : 2800 .: 2200 . 21.4

б 31 3500 3300 5,7

■ ' б" 32.-' 5100 4100 19.6

• Из приведенных в таблице 2 данных по шести сериям гормональных препаратов видно, что суммарные потери гонадотропной активности за счет очистки, стерилизации и лиофили-зацни варьируют в пределах от 5,7 до 21,4% (в среднем 16,6%).

Для высушивания препаратов иа воздухе осадок, промытый этиловым спиртом и эфиром выдерживали в центрифужных стаканах, закрытых бумажными колпачками, в течение 2— 3 часов до превращения в сухой порошок, после чего его осторожно счищали со дна и стенок стаканов и переносили в стерильный флакон из темного стекла с резиновой пробкой.

При этом установлено, что очистка гормонов СЖК с использованием 15% раствора риванола, 50 и 70% растворов ацетона, 10

промывание преципитата 100% ацетоном или 96° этиловым спиртом и медицинским эфиром стерилизует препараты от возможной микрофлоры. Поэтому при соблюдении необходимых мер предосторожности на заключительном этапе промывания осадка гормонов удавалось получать стерильные препараты. Эти препараты предназначались, как правило, для использования вскоре после их приготовления. При хранении их в течение месяца при температуре +4° растворимость несколько ухудшалась, однако, снижения гонадотропной активности препарата за этот срок ие происходило.

Физико-химическая и биологическая характеристика гокадотропкого препарата из СЖК

В период с ноября 1975 по март 1977 гг. по разработанному способу проведена очистка 25 литров СЖК. В зависимости от целей опытов и назначения выделенных препаратов использовали объемы СЖК от 0,1 до 1,5 литра. Очистку серий СЖК в пределах указанных объемов выполняли в течение одного рабочего дня. Полученные препараты охарактеризованы по физико-химическим показателям и биологическим свойствам в опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

В частности, 10 образцов препарата, полученных из разных партий сывороток, были проверены по содержанию общего белка с помощью микробиуретового метода. При этом было установлено, что его количество варьирует в пределах от 42 до 77%, составляя в среднем 54±8,3%, Один из. препаратов с исходной активностью СЖК, равной 140 м. е./мл, и имеющий типовые характеристики по выходу гормонов (76%) и активности (180 м. е./мг) , был использован для проведения химических анализов.

Данные по химическому составу препарата представлены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты определения, химического состава гонадотропного препарата, ' очищенного риванол-ацетоновым способом

Содержание (%)

тъ

п/п.

Показатели

СЖК

препарат

1 Сухой остаток

2 Азот общий

3 Белки

4 Углеводы общие

5 Лнпнды

7'7 л

1,008 6.4 0.2 0,13

96.0 8.8 40.0 7.1 0.3

При исследовании препаратов с помощью электрофореза на бумаге обнаружена только одна полоса, соответствующая электрофоретической подвижности гамма-глобулинов. Проверка элюата фракций СЖК и препарата на неполовозрелых белых мышах показала гонадотропную активность, которая находилась только в зоне расположения гамма-глобулинов. Наличие гонадотропной гормональной активности в суммарной альфа- 4- бета-глобулиновой и отдельно в альбуминовой фракциях СЖК в наших опытах не выявлено.

В результате определений, проведенных по 25 образцам, средний получаемый вес препаратов в расчете на 1 л СЖК составил 0,47±0,06 г. При этом степень очистки СЖК от балластных белков, с учетом его содержания в нативной СЖК 60— 80 г/л (6—8 г%), достигала 120—160 раз, а выход гормонов по гонадотропной активности в расчете на использованный объем СЖК составил в среднем 75±4,1%. При сопоставлении гормональной активности исходных СЖК <60—340 м. е./мл или 0,06—0,34 м. е. на мг) и полученных из них препаратов — 80— 600 м. е.Умг отличие по этому показателю достигало 1000— 2235 раз, что свидетельствует о высокой степени концентрирования гонадотропинов на единицу веса очищенных препаратов.

Оценку анафилактогенности полученных препаратов (таблица 4) проводили с помощью биопробы на морских свинках в реакциях активной и прямой пассивной анафилаксии.

В результате проведенных опытов установлено, что СЖК (в реакции прямой пассивной анафилаксии) вызывает клинически выраженные явления анафилаксии у морских свинок при расчетных разрешающих дозах сывороточных белков в интервале от 0,36 до 1,35 мг на инъекцию. Тяжелые признаки анафнлаксии и гибель всех животных отмечены при разрешающих дозах сывороточного белка в пределах от 5,4 до 15,2 м г. Близкие результаты получены в реакции активной анафилаксии, где при разрешающей дозе сывороточного белка 11,1 мг отмечена гибель половины взятых в опыт животных. У оставшихся в живых' морских свинок наблюдали тяжелую форму анафилактического шока.

В сопоставимых условиях опытов препараты гормонов, выделенных из тех же серий СЖК, при разрешающей дозе белка в препаратах, равной 6—8 мг, вызывали лишь легкую (под-острую) форму анафилактической реакции. При разрешающих дозах белка в препаратах, равных 2—4 мг, заметных симптомов анафнлаксии не зарегистрировано.

Кроме того, препараты серия 27 и 28 проверены комиссионно в ВГНКИ на аллергенность с помощью реакции активной анафилаксии. В сопоставимых условиях опытов при разрешающей дозе СЖК (2 мл), содержащей 200 м. е., погибло 2 из 3-х морских свинок, сенсибилизированных сывороткой от нежеребой кобылы. Оставшаяся в живых свинка перенесла тяже-

Результаты проверки анафнлаитогенности; препаратов для морских свинок

Гор мои содержащие материалы _ Я"я Й к О а> и« *— к 2 о О Н cq £ О V с3 * Т = X о О Ji = D. ґіо Ї Реакция на введение разрешающей дозы белка

гибель от шока тяжелая анафилаксия подострая (легкая) : анафилаксия отсутствие признаков анафилаксии

Реакция прямой пассивной анафилаксии

СЖК цельная 7,6 15,2 3/3 — — -3

Разведенная 2/3

1 :40 0,19 0,38 1/3 — —

» 1:2 3,6 5,4 2/2 — —. —

» 1:' 18 2,7' 1/2 1/2 — —

» 1:8 0,9 1,35 — 2/2 — —

» ): 15 0,45 0,67 1/2 1/2 — —

Очищенный

препарат сер. 12 __ 8,0 _ 3/3 _

4,0 — — — 3/3

2,0 — — — 3/3

Реакция активной анафилаксии

СЖК 1:2 3,7 11,1 2/4 2/4 _ —.

Очи шейные

препараты: 6,0 2/4 2/4

Сер, 8 — — —

Сер. 6 ~** - 6,0 — 3/4 1/4

лую форму анафилактического шока. При введении разрешающей дозы очищенных гонадотропинов, содержащей 150 и 195 м. е. в 2 мл физиологического раствора, анафилактических реакций у 6 сенсибилизированных морских свинок не отмечено.

В процессе очистки СЖК происходит удаление различных белковых фракций, перераспределение соотношения, их в конечных препаратах и концентрирование гормонов. В связи с этим нами было проверено соотношение фолликулостимули* рующей и лютеинизирующей активностей в полученных препаратах.

В результате проведенных опытов (таблица 5) установлено, что соотношение ФСГ: ЛГ-факторов в исходных СЖК и полученных из нее препаратах существенно не изменяется. Имеющиеся небольшие отклонения по величине соотношений как в сторону повышения, так и в сторону уменьшения следует отнести за счет точности биологического метода титрования на белых мышах.

Лютеннязнрующая активность СЖК н полученных гонадотропных -препаратов и расчет соотношения ФСГ : Л Г

Гори о нсодер жа-щпе препараты Общая гона до-тройная активность (м. е./мл) Л ютеннизи ру юща я активность (у. е./мл) Соотношение ФСГ:ЛГ

Сер. 7 Исходная СЖК 80 60 40 30 2: 1 .2:1

Сер. 13 1 300 Исходная СЖК | 200 80 60 ■ 3,7: 1 3.6; 1

Сер. 12 1 180 Исходная СЖК | 160 60 1 3:1 50 [ 3,2: 1

Сер. 23 1 180 Исходная СЖК 140 80 1 2,2: 1 70 | 2:1

Полученный из СЖК по разработанному в лаборатории патологии и физиологии размножения животных ВИЭВ способу сухой гонадотропный гормональный препарат назван «Ова-ригропнн», т. е. воздействующий на яичники.

Испытание препарата «Оваритропин» на сельскохозяйственных животных

Проверку препарата в совхозе «Галаба» Бухарской области, ферме «Сычево» совхоза Коломенский Московской области и Московском конном заводе № 1 проводил старший научный сотрудник лаборатории патологии и физиологии размножения сельскохозяйственных животных И. Я- Чистяков с участием местных ветеринарных врачей. В некоторых из них принимала непосредственное участие автор настоящей диссертационной работы.

Показания для применения «Оваритропина» в отдельности или с другими препаратами, а также использованные дозировки были тождественны рекомендованным для СЖК.

Испытание «Оваритропина» в опытах на овцах, коровах и кобылах показало полное отсутствие анафилактических реакций при сохранении гонадотропной активности, свойственной исходным сериям СЖК- В частности, применение нового препарата для повышения плодовитости у 30 каракульских овец (в срок объягнилось 28) обеспечило получение 140 ягнят нз условного расчета на 100 овцематок, В результате введения пре-14

парата коровам в дозе 2400—2500 м. е., на фоне предварительного скармливания ацетата мегестрола, было плодотворно осеменено 28 из 41 коров, имевших различные формы нарушения половых функций. При комбинированном применении тривн-тамина и «Оваритропина» в дозе 2000—2500 м. е. получен высокий процент зажеребляемости кобыл (10 из 11) с ановулятор-ными половыми циклами.

Таким образом, результаты опытов на сельскохозяйственных животных свидетельствуют о биологической полноценности препарата «Оваритропин», полученного из СЖК риванол-ацетоновым способом очистки гонадотропннов.

Гонадотропное действие «Оваритропина» на самок животных аналогично воздействию гормонов иативной СЖК (фол-ликулостимулирующему и лютеинизнрующему), но при этом не вызывается аллергнзацня организма, поскольку при изготовлении препарата по разработанному способу из него удаляются балластные сывороточные белки! 1

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ получения гонадотропного препарата «Оваритропин» путем очистки гормонов СЖК, основанный на последовательном осаждении балластных сывороточных белков прН 15% концентрации риванола и 50% концентрации ацетона с выделением гонадотропннов на заключительной стадии при 70% концентрации ацетона.

При разработке способа использованы только отечественные химические реактивы и оборудование,

2. Использование разработанного способа обеспечивает на конечном этапе:

— 120—160-кратную степень очистки гонадотропных гормонов из СЖК от балластных белков;

— 1000—2235-кратное увеличение гонадотропной активности гормонов на единицу веса (мг) в препарате «Оваритропин» по сравнению с иативной СЖЮ,

— выход гормонов по гонадотропной активности в пределах 71—79%. . • ■■

3. Очистка гормонов из СЖК по разработанному способу не сопровождается изменением в них соотношения фолликуло-стнмулирующей и л ютси и и з и р у ю ще й активностей.

4. Очистка и выделение гонадотропных гормонов из СЖК проводится в условиях комнатной температуры (18—20°) и занимает по времени один рабочий день, при эток количество СЖК, которое может быть использовано для очистки, зависит только от рабочего объема ■ ротора имеющейся в наличии центрнфугн.

5. Разработанный способ фильтрации очищенных гормонов на фильтрах МПНроге обеспечивает стерильность полученных

препаратов при минимальной потере гонадотропной гормональной активности (не более 5—9%).

6. Гормональная активность препарата «Оваритропин», высушенного лиофильным способом на среде с 0,2% лактозы, снижается в течение одного года хранения не более, чем на 10%.

7. Препарат «Оваритропин» стимулирует половую функцию самок животных в дозах — 1200 м. е. у овец, 2500 м. е. — у коров (в условиях предварительного скармливания ацетата мегестрола) и 2000—2500 м. е.— у лошадей (на фоне предшествующего введения тривитамина),

8. Препарат «Оварнтропин» при использовании на сельскохозяйственных животных безвреден и не вызывает у них аллергических реакций.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы, полученные диссертантом, включены в заявку на изобретение «Способ получения концентрата гонадотропи-нов («Оваритропина») из сыворотки крови жеребых кобыл», по которой Государственным комитетом по делам открытий и изобретений при Совете Министров СССР принято решение о выдаче авторского свидетельства (от 31 марта 1977 г.).

Предложенный способ используется при разработке технологии препарата «Оваритропин» в биофабричных условиях.

Полученные материалы включены во «Временные методические указания по контролю качества сухих гонадотропных гормональных препаратов» (находятся на рассмотрении в в ГУВ МСХ СССР),

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Получение специфических иммунных сывороток к гонадотропинам СЖК. Билл. ВИЭВ. 1974, XIX, 51—55 (соавтор: И. Я- Чистяков).

2. Использование реакции торможения гемагглютинацнн для определения гормонов СЖК. Труды ВИЭВ, 1975, 43, 341—345 (соавтор: И, Я. Чистяков).

3. Изучение свойств гормонального препарата «Оваритропин». Бюлл. ВИЭВ, 1976, XXVI, 83..

4. Получение п примененне гормонов из СЖК. Веетннк сельхоз. науки, 1977, 3, 47—49 (соавторы: Н, Н. Михайлов, И. Я- Чистяков).

5. Новый гонадотропный препарат.

Коневодство и конный спорт, 1977, 4, 30—31 (соавторы: И. 5[. Чистяков, Н, Н. Михайлов, А, И. Алиев, Т, К- Илькнна). !

Материалы диссертации доложены:

1, Па конференции молодых ученых ВИЭВ, февраль 1976 г.

■ 2, На межлабораторной конференции ВИЭВ, декабрь 1977 г.

3. На заседании методического Совета ВИЭВ, декабрь 1977' г.

Ответственный за выпуск — научный руководитель доктор ветеринарных наук, профессор Н. Н. Михайлов

Подписано в печать 10/1V 1978 г. Заказ 1024 Тираж 100

Типография ВАСХНИЛ