Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА ГОНАДОТРОПНОГО ГОРМОНА И РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО НАБОРА ДЛЯ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В СЖК

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА ГОНАДОТРОПНОГО ГОРМОНА И РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО НАБОРА ДЛЯ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В СЖК"

и 6>9&

На правах рукописи

МЕРКУЛОВА МАРИНА ВЛАДИМИРОВНА

Выделение, очистка гонадотропного гормона и разработка иммуноферментного набора для его определения в СЖК

03.00,23. - Биотехнология

Аатореферат

днсоертацни на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКОВСКАЯ ОБЛАСТЬ, п. ДУБРОВИЦЫ , 1997 год

Работа выполнена во Есзросси^ском научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

Научный руководители - доктор биологических наук СОВЕТКИН C.B. Официальные оппоненты • доктор биологических наук,

профессор, ' КЛИНСКИЙ Ю.Д. - кандидат биологических наук, с.н.с., ' РЯБЫХ В.П.

Ведущее учреждение - Биотехцентр по животноводству РАСХН|

Москва-Горки Ленинские

Защита диссертации состоится "-/У ", 199? г.

в иifÛ." часов на заседании диссертационного совета Д 020.16.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142012. Московская область,

Подольский район, п. Дубровицы

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института.

Автореферат разослан - 0$- 1997 г. s

Ученый секретарь диссертационного совета доктор сельскохозяйстве н 1 ï нруг

Н.В.Груэде»

1.0Ы11ЛЯ X Л Р А КГ КР11СТН К А РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Успех», достигнутые в эндокринологии, неразрывно связаны с разработкой и совершенствованием методов контроля качества юрмональных препарат о» используемых как в медицине, так и ветеринарной практике.

Основоположником отечественной ветеринарной эндокринологии М.М.Завадовским н его школой заложены основы применения гормональных препаратов для коррекции гормонального статуса у животных с целью регуляции воспроизводительной функции у самок сельскохозяйственных животных и лечения гинекологических болезней у них.

Сыворотка крови жеребых кобыл (СЖК) является одним из гормональных препаратов, нашедших широкое практическое применение как для лечения гипофункции яичников, так и повышения воспроизводительной функции у самок сс,и «©хозяйственных животных.

Методы, используемые в отечественной биотехнологической промышленности для определения гонадотропной активности СЖК, а также препаратов, получаемых из нес ( гонадотропин очищенный, гравогормон, овариотропин и др.), требуют своего совершенствования. Так. тест на самцах озерных лягушек, применяемый для формирования промышленных серий СЖК, позволяет весьма приблизительно оценивать ее гормональную активность, что в значительной степени снижает ее качество.

Исследование гормональной активности СЖК на неполовозрелых самках белых мышей (мышино-маточный тест) и белых крыс ( по увеличению массы яичников), также имеют рад недостатков, а именно, продолжительность времени нх проведения (от 72 до 120 часов), выраженная индивидуальная чувствительность животных, зависимость от времени года, особенностей кормления, температуры окружающей среды, влажности, а также высокая стоимость работ. Важно также отметить, что ошибка биологического метода контроля гормональных препаратов, в том чнсяе кГСЖК, на-

ходятся в пределах от 10 до 20%.

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА

МОСК

И.,.. 14,

• '„'АМН

Инв. №

Достижения в области препаративной биохимии, иммунологии, биотехнологии позволили на основе получения чистых биологически активных веществ, в том числе и гормонов, разработать радиоиммунологические, нммуноферменгные методы определения их как в биологических субстанциях, та« и в коммерческих препаратах. Эти методы отличаются от ранее известных высокой чувствительностью, воспроизводимостью и временем их проведения. Однако, для реализации одного из этих методов необходимо иметь иммуиохимически чистый гормон и высокоспецнфические антитела к нему.

Поэтому, разработка тест-системы для быстрого и более точного определения гонадотропного гормона в сыворотке крови жеребых кобыл обеспечит получение гонадотропных препаратов (ГСЖК) высокого ка» чсстаа и позволит более эффективно использовать их в практике ветеринарии н животноводства.

В связи с вышеизложенным, цдлью нашей работы являлось: разрабо-гать эффективный способ выделения высокоаггивного н нммукохимкче-ски чистого гонадотропного гормона из натавной сыворотки крови жеребых кобыл, изучить его физико-химические свойства и разработать им-мунофермеитную тест-систему для количественного определения как в СЖК, так и в гонадотропмых препаратах, полученных из нее.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить ene-дующие задачи.

I, Разработать технологичный способ получения высокоактивного н имму-нологически чистого гонадотропного гормона нз сыворотки крови жеребых кобыл,

II. Изучить физико-химические и иммунологические свойства ГСЖК с целью его стандартизации для создания иммуноферменгной тест-систгмы количественного определения.

III. Разработать оптимальную схему получения пшериммуннон сыворотки лабораторных животных к ГСЖК для дальнейшего выделения аффинных антител к гонадотрояному гормону.

IV. Сконструировать иммуноформентиую тест-систему количественного определенна гонадотрогшна в продуктах биотехнологии (СЖК).

V. Провести апробацию тест-системы для выявления ее диагностической ценности.

VI. Провести сравнительный ашшиэ определения биочогнческой активности препаратов гонадотропина и нативной СЖК посредством бнопробы на неполовозрелых самках крыс и иммуноферментного анализа.

Научная иовнзиа исследования;

Впервые разработан высокоэффективным способ выделения сывороточного гонадотропина из сыворотки крови жеребых кобыл методом хро-матофокусирования на ПЕИ-Ч4 и дальнейшей его очиспги от примесных сывороточных белков с использованием СЫ Вг-сефарозного иммуносор-бекта с иммобилизованными антителами к сывороточным белкам жеребца (авторское свидетельство Хв 1374488 от 15,(0.87),

Получены моноклональные антитела против ГСЖК. Найдено, что эти аититела, взаимодействуя с гормоном, не оказывают влияния на его биологическую активность. Определена константа ассоциации реакции взаимодействия ГСЖК со специфическими антителами, равная 5,?*10,° М. что указывает на высокое сродство реагирующих макромолекул.

Обоснованы оптимальные условия для разработки иммунофермент-ной тест-системы для количественного определения гонадотропного гормона в препаратах СЖК.

Практическая ценность работы.

Гонадотропный гормон СЖК стандартизован по аминокислотному и углеводному составу. С- и Ы- концевым аминокислотам и молекулярной массе, что обеспечивает получение специфических моноклональиых кнти-тел к нему.

Полученные мышиные моноклональные антитела к гонадотропному гормону СЖК являются моноспецифичны мм и не ингибируют его гормональной активности.

Предложена иммуноферментная тест-система для количественного оипоеления гонаяотропного гормона в СЖК, позволяющая определять его концентрацию в сыворотке крови жеребых кобыл и полностью заменить биолога четкие тесты, повысить качество выпускаемых препаратов.

Методические рекомендации по ранней экспресс-диагностике жеребости кобыл иммунологическим методом утверждены Трестом конных заводов и ипподромов МСХ СССР; они нашли также применение в учебном процессе зооинженерного фахуггьтета М НА им. К.И .Скрябина.

Апробация работы. Материалы диссертации были рассмотрены на межлабораторном совещании ВГНКИ 28 мая 1997 года н на заседании от* дела биотехнологии ВИЖ 5 июня 1997 года.

Результаты исследований были доложены на Всесоюзной научно-технической конференции молодых ученых "Актуальные вопросы профилактики и лечение болезней сельскохозяйственных животных", г.Москва, 1985 г.. на 35-м Всемирном симпозиуме по проблемам диагностики болезней сельскохозяйственных животных, Гаага, 1984 г.

Пуб ликации, Материалы, изложенные в диссертации, опубликованы в 5 работах, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, трех глав обзора литературы, павы о материалах и методах, пяти глав собственных исследований и их обсуждения, выводов и указателя использованной литературы.

Материалы диссертации, включая таблицы, рисунки и список литературы, изложены на 139 страницах текста. Работа иллюстрирована 21 таблицами и 31 рисунком. Список литературы включает 128 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

2. Материалы н методы исследований.

• В работе использсшилн сыворотку крови жеребых кобыл с активностью 50 IU/мл Dessau, Германия; СЖК Орской биофабрики с активностью 140 м.еЛш, коммерческий препарат очищенного гонадотропин а PMSO "Calbiochem" с активностью 5000 Ш (международных единиц); сывороточный гонадотропин жеребых кобыл PMSG "Sigma" с активностью 2000 IU; коммерческий субстандарт сывороточного гонадотропина жеребых кобыл "PMS^ - Substandard - Dessau" с активное ч>ю 1600 IU.

• Исследованные биомапрфи^лц, В качестве отрицательной контрольной сыворотки использовали смесь 150 индивидуальных сывороток крови жеребцов, полученных на Гомельском конном заводе;

• 120 индивидуальных сывороток крови жеребых кобыл с различными сроками жеребости, подтвержденными ректальными исследованиями, полученных на Орской биофабрике и Гомельском конном заводе; 75 индивидуальных сывороток крови нежеребых кобыл, полученных на Гомельском конном заводе;

Антитела к сывороточным белкам жеребца получали после гипериммунизации кроликов сывороткой крови жеребца.

Источником моноклональных антител (МонАТ) к ГСЖК являлась асцитная жидкость мыши, полученная после гнпериммуиизации мышей линии Balb/c электрофорегнчески чистым ГСЖК. Выделение МонАТ к ГСЖК кз аецнтной жидкости мышей проводили с помощью осаждения сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией.

В качестве метки для приготовления меченых антител использовали пероксидазу из корня хрена марки А, 945-960 единиц активности, ОлаЙн-

* ского НПО "Биолар\

* Коньюпггы антител с перохеидазой получали по модифицированной методике (Wilson В., Nakane Р., 1978). Ферментативную активность конъ-югатов определяли по RZ=On при 403 нм/ОП при 280 нм и применяли для исследования те коныогаты, RZ которых была более 0,4. Специфичности

коаъюгатоа определяли титрованием на планшетах с иммобилизованным гонадотропным гормоном, сывороткой крови жеребца и сывороткой крови нежеребой кобылы в количестве 10 мкг/мл к выбирали те разведения конъ-югата, которые при длине волны 492 нм давали величину зкетинкцнн, близкую 1,0.

lía первом этапе работы проведен сравнительный анализ основных известных методов выделения гонадотропного гормона: метод спиртового осаждения no Gospodarowicz D,, 1967; ионообменная хроматография на QAE-сефадексе А-50 (Moore W., Ward D., 1980); гель-фильтрация на ссфа-дексе G-200 и хроматография на пшроксилапатите (PapkofF Н-, Bewley Т., 1973).

Чистоту полученного препарата ГСЖК ко1ггролнровали градиентным электрофорезом в полиакриламидном геле от 5 до 20% в присутствии SDS-Na и меркаптоэтанола. Разделение гонадотропного гормона СЖК на субъединнцы проводили с помощью . ассоциации в 10 М мочевине, (Bousfield G. et al. 1992)

Определение аминокислотного состава гонадотропного гормона СЖК проводили на аминокислотном анализаторе "Beckman model 120 В". Определение N-концевой аминокислоты проводили с помощью 1-фтор-2.4-динитробензола в щелочной среде с образованием окрашенных в желтый цвет 2,4-диннтрофенолъных производных (Ward D., 1985).

Углеводный состав гормона определяли хроматографнческими методами (Combarnous Y., Salesse R., 1981). Содержание сиаловых кислот определяли тиобарбчтуровой кислотой после гидролиза образцов в 0,1 М серной кислоте при lOOC в течение 1 часа. Содержание гаюкозамина и галактозы определяли хроматографически и иинп1дрнновой реакцией в аминокислотном анализаторе. Образцы гликопротендов предварительно гидролизовалн в 6 N HCl в течение б часов при I IOC. Определение гексо-замкна выполняли методом Calt,( 1992), используя галактозами» - HCl как стандарт.

Иммунофермеитные реакции осуществляли в полнстнроловых планшетах для иммунолошческих реакций Московского завода медтехникн и планшетах фирмы Linbro (США) по пошаговой методике Voller et al., 1976.

Для выделения антител к сывороточным белкам крови жеребца tu смеси сывороток крови гнпериммуннзированных кроликов использовали аффинную хроматографию на CNBr-сефарозе 4В с иммобилизованными белками крови жеребца. Иммуносорбе1гг готовили согласно инструкции фирмы-изготовителя.

Иммукоэлектрофореэ (ИЭФ) для качественной характеристики выделенных антител осуществляли по прилагаемой инструкции на приборе Мулътифор (LK.B, Швеция). Аналитический джк-злектрофорез (ДЭФ) для изучения состава выделенных антител проводили по стандартной методике с SDS-Na по Laemmli, 1979. Концентрирование растворов антител проводили ультрафильтрацией через фильтр ХМ-50 и ХМ-100 фирмы "Amicon".

Для обработки экспериментальных данных использовали методы сравнения средних величин (Роклицкнй, 1967) с помощью коэффициента Стъюдента, коэффициента корреляции ( Плохинский,-1970). Данные иммуноферментного анализа определения гонадотропного гормона СЖК обрабатывались на персональной компьютере Labtain 3003 с помощью программ, разработанных в лаборатории информационно-измерительных систем ИЭКВКНЦ.

3. Результаты собственных исследований, 3.1. Сравнительная оценкя.меш 'о» очистки гонадотропного гомона

Для получения высокоочищсиного гонадотропного гормона СЖК апробированы четыре наиболее известных способа его выделения на основе спиртового фракционирования, хроматографии на QAE-сефадексе, гндро-ксилапаткге, а также гель-фильтрации на сефадексе G-200. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Сравнительная оценка эффективности способа очистки гонадотропного

гормона СЖК (п=5)

Метод спиртового осаждения Хроматография на С^АЕ-сефадексе Гель-фильтрация Хро матографи я на гидроксида-патите

Количество стадий очистки 5 4 з , 4 '■;

Выход гонадо-тропкна по белку из 1л СЖК, мг 164 108 20 30

Удельная активность, м.е./мг 597 1300 3000 1600

Выход по белку, % 15 40 20 ■ 34 -

Сохранение исходной активности, % 69 82 76 • 47

Изданных, представленных в таблице, можно сделать заключение, что апробированные методы отличаются многостадийностью, большими потерями от исходного содержания гормона в СЖК, - от 18 до 53%, при достаточно низкой удельной активности <гг 597 3000 м.с./мг. Данные ;■ диск-электрофореза (рис. I, треки 2,6,?,8) показали значительное содержа* нне сопутствующих белков сыворотки крови в полученных гормональных препаратах, что свидетельству«' о невозможности их использования для получения специфической антисыворотки к ГСЖК.

»

3.2. Разработка нового способа выделения иммунохнмнюски чистого препарата гоналотропного гормона СЖК.

В связи с вышеизложенным, был разработан принципиально новый способ получения высокоактивного и высокоочищениого препарат^ ГСЖК методом хроматофокусироваиия на ПБИ-94 при рН=5,0. Условия элюцни подобраны таким образом, что большинство сывороточных белков (имеющих р1 от 4 до 7) проходило через колонку в растворе фармалита 2,5-5,0, не взаимодействуя с иоиообменииком, тогда как ГСЖК ( с изоточ-кой 1,8 - 2,0) количественно сорбировался на нем. Десорбцию гормона проводили, создавая градиент ЫаС1.

На этой стадии очистки был получен гормональный препарат с удельной активностью 7000 Щ/мг белка, выход гормона составил 92%. По результатам диск-электрофореза (рис. 1, трек разгонки 5) в градиенте ПААГ установлено наличие примесных белков в полученном препарате гонадотрогшна.

Для дальнейшей очистки препарата ГСЖК от примесных сывороточных белков приготовлен СМВг-сефарозный нммуносорбент с иммобилизованными аффинными антителами кролика к сывороточным белкам жеребца (т.е. с антителами к видовой сыворотке, в которой отсутствует гона-дотропин). При этом сывороточные белки специфически связываются с антительным сорбентом в то время, как ГСЖК свободно выходит из колонки. Применяя данную схему очистки гонадотропного гормона СЖК, нам удалось получить его гомогенную фракцию, что подтверждается данными диск-электрофореза (рис. I, трек разгонки 3). Выход гормона от исходного его содержания в сырье составил 80%.

i i з ч 5 & г $

Рис.1. Стандартный диск-электрофорез а градиенте ПА. .Г 5-20%. J - Стандарты мол.весов: а) альбумин-67 ООО; б) фосфорнлаза - 94 0Э0; в) ферритин - 440 ООО; г) фибронектин; д) тиреоглобулнн - 669 ООО. 2 • ГСЖК, полученный на QAE-сефадексе; 3 - ГСЖК, полученный по разработанной нами методике; 4- разделение на субъеднницы очищенного препарата ГСЖК: 5- ГСЖК, после хроматофокусирования; 6- ГСЖК, после гелъ-фкгитрацнн на сефадексе G-200; 7 - ГСЖК, после хроматографии на гидрокенлапатите; 8 - ГСЖК, после спиртового осаждения.

Гормональную активность полученного препарата проверяли на ин-фантных самках белых крыс линии "Wistar" в возрасте 21-22 дней. Испытуемый образец ГСТСК тестировали, начиная с концентрации 2 мкг/мл. В качестве рефч>енс-сгандарга использовали препарат сывороточного гона-дотротшна PMSO Sub-stand art-Dessau с активностью 1600 JU/мл, который титровали. начиная с разведения 1/50 ( 32 IU). Через 120 часов, после убоя жшютмы*. проводили учет результатов по весу яичников у контрольной и опытных групп, ¡'езультаты приведены в таблице 2.

Таблица 2,

Результаты биопробы на инфантных самках крыс (п=!0)

Доза субстандарта Оевзаи, Ш/мл Вес яичников, МГ До ;а очищенного препарата ГСЖК. мкг/мл Вес яичников, мг

52.0 325.5+ П.8 2.0 321.3+11.2

16,0 320,7+ 12.3 1,0 304,5 + 8,1

8.0 295,5 + 9.4 0,5 245,1 + 7,4

4.0 216.2 ±11.0 0.25 218,7+1,5

2.0 1^1.2 ± 16,7 0,125 190,9 + 6,7

1,0 157.1+8.5 0.0625 157,8 + 3,3

0.5 102.5 ± 1.0 0,03125 149,7 + 5,1

0.25 91,1+0.* — _ {

Контроль 35,2 + 7,7 35,2 + 7.7 I

/

При экстраполяции данных веса яичников в зависимости от доэы очищенного препарата ГСЖК на калибровочную кривую титрования субстандарта РМ50. видно, что I мкг полученного препарата ГСЖК демонстрирует биоактивность, равную 10 Ш субстандарта. Таким образом, 1 мг препарата ГСЖК, полученного по нашему методу обладает биологической активностью 10000 Ш.

Обобщая данные экспериментов, можно заключить, что из 500 мл СЖК с исходной гормональной активностью 50 Ш/мл по разработанному нами методу было получено 2.0 мг высокоочкщенного гонадотропного гормона СЖК с активностью 10 000 I и/мг. При этом потери гормональной активности препарата составили 20,0% (см. табл. 3).

Таблица 3

Результаты выделения гонадотропного гормона СЖК по нашему методу (п=!0)

Наименова нне образцов Общий белок в образце, мг Активность Суммарная, Удельная, Ш Ш/мг % очистки, по активности

Исходная СЖК, 500 мл 32500 25000 0.76 100

После хро-матофоку-сирования 3,3 23100 7000 92.4

После нм-муносорб-ции 2.0 . 20000 10000 80,0

В результате проведенных исследований установлено, что при сорбции полуочищенного препарата ГСЖК на иммуносорбенг с иммобилизованными антителами к сывороточным бедкам жеребца удастся избавиться от всех примесных белков. Эти данные свидетельствуют о том, что смесь конта м и ни рующих белков, взаимодействующих при сорбции с иммобилизованными антитепамн к СЖ, полностью удаляется из препарата ГСЖК.

3.3. Физико-химические свойств! гонадотропного гормон» СЖК.

Чистоту препарата ГСЖК контролировали градиентным диск-электрофорезом в неленатурирующих условиях. (Рис. 1, трос разгонки 3) Па дисколектрофорегрзмме в образце ГСЖК после кммуносорбции мигрирует одной полосой, что указывает на его гомогенность полученного гормона. Установлена молекулярная масса, полученного гонадотропного гормона оказавшаяся равной 58 кДа. При проведении диск-электрофореза в

присутствии SDS-Na и 2-меркаптоэтанола очищенный препарат ГСЖК мигрирует двумя полосами (рис.1, трек разгонки 4). что указывает на субъединичный характер белка. В денатурирующих условиях величина молекулярной массы соответствует 23 и 37 кДа. Таким образом, молекула гонадо-тропного гормона состоит из 2-х неодинаковых субъеднниц. Такие же результаты были получены при определения молекулярной массы гонадо-тропного гормона СЖК методом гель-фильтрации на сефадексеС-150.

. Разделение гоиадотропного гормона СЖК на субъединицы мы проводили с помощью диссоциации в ЮМ мочевине с добавлением в него 0,1 М 2-меркаптоэтанога при рН 8,6. Применение восстановителей днеульфид-ных связей позволило улучшить хроматографическое разделение а- и Р-субъеяиннц. Их молекулярный вес, определенный методом гель-фильтрации по калибровочной кривой стандартов, составил 23 кДа для а- и 37 кДа для Р-субъедитшы соответственно, что подтверждает данные, полученные я диск-электрофорезе.

Для очищенного гоиадотропного гормона методом хроматофокуси-рования на ПБИ 94 бьша определена величина нзоэлектрической точки. Найденное значение р! равнялось 2,0 - 2,2, что указывает на сильнокислый характер сывороточного гонадотропина жеребых кобыл.

Оп ^деление аминокислотного состава гонадотропного гормона СЖК проводили на аминокислотном анализаторе "Beckman model 120В". Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4

Определение аминокислотного состава ГСЖК 111=5)

Аминокислота Мкг/мг сухого вещества

Лнш» 29.» ± 0.02

I 'исгидии 2.4 + 0.04

Аргипнн 32.4 + 0,07

■ Асиарашноваи к-га 23,6 + 0.08

Треонин 45.3 ± 0,1

Серии 42.6 + 0,07

Гдутаминовая к-та 44,8 + 0,02

Пролин 68.5 + 0.06

Г.-нщ)щ 27,3 ± 0.07

Алании 38.8 + 0.09

1/2 Цистин 41.1 ±0.04

Валин 24.5 + 0.03

Мешонин 9,72 ±0,01

Изолейцин 25,3 ±0.05

Лейцин 31,1 ±0.01

Тирозин 13.5 ±0.07

Феннналаннн 22.1 ±0.02 .

Из данных, представленных в таблице видно, что в гонадотропноы гормоне СЖК имеется большое количество днхарбоновых аминокислот, а также циетииа, треонина и серина. Особенностью аминокислотного состава гонадотропина сыворотки крови жеребых кобыл является высокое содержание пропана по отношению к известным сывороточным белкам. Исследование амнно-конг "»ых остатков очищенного препарата ГСЖК вы-

п

«вило фенил ал анин и сернн в качестве таковых. Карбокси -концевые аминокислоты представлены одним остатком изоленцнна.

Результаты исследования углеводного состава гормона показа™, что в молекуле ГСЖК присутствуют всс сахара, обычно встречающиеся о гш-гунтзр^ы* гликопротенднмх гормонах. Общее содержание углеводов в ГСЖК колеблется от 41,5 до 46,6%. Важно отмстить низкое содержание фукозы (0.6-0,8%) по сравнению с известными гликопротеидными гормонами при высоком содержании сиаловой кислоты (10,8-14,9%), Сочетание больших концентраций кислых днкарбоновых аминокислот и сналовых кислот, по-видимому, объясняет низкую изозлекгрическую точку гормона <р!=1,8-2,2).

Таблица 5

Углеводный состой ГСЖК (мг/100 мг сухого вещестпа, п=3)

Углеводы Эксперимент Среднее

1 2 3

Сиаловые кислоты 10,2_+0.03 13,7 + 0.1 13.8+0.2 12.9 ± 0,15

Ь-фукоза 0,6 + 0.02 0.8 + 0,0 0.7+0,05 0,7 + 0,04

1>маниоза 2.5 + 0,01 2.3 + 0,04 2.7 + 0.03 2,5 + 0.02

Ц-галактоза П.6 + 0,4 8,5 + 0,1 9.7 + 0,7 10,2 ±0,4

Гексозамины 20.6 ± 0,2 19,5 + 0,3 20,0 + 0,1 20,2 ±0.2

Общее содержание угле^- ВОДОЙ 45,5 + 0,25 44.8 ± 0,26 46,9 + 0,4 45.5 ± 0.25

3.4. Получение мышиных монок-чонал^ны* а щи тел к ГСЖК.

Наличие высокоочищенного препарата гонадотропного гормона позволило нам, используя метод Кеплера и Мильштейна, получить мышиные моиоклональные антитела против этого гормона.

Общее количество полученных гибридных клонов, способных расти на селективной среде ДМЕМ с амнноятеркном, гипоксантином и тимидн-HÎM , - около ?00. При скрининге гибридных клеток мы считали положительными те лунки, из которых пробы культуральиой жидкости давали в ИФА ответ, в 3 и более раз превышающий фон. Такое превышение было выявлено в пробах из 24 лунок, которые были пересажены на свежую пластину с перитонеальными макрофагами и фибробластами н через 1 неделю вновь проанализированы. Клетки из 13 лунок, характеризовавшиеся активный ростом и высоким уровнем продукции специфических антител, были отобраны для дальнейшее работы и клонированы в мягком агаре и методом разведений. Огклонированные клетки наращивали, а затем вводили их в брюшную полость сенсибилизированных сингенных мышей линии Balb/c для получения исцитных опухолей.

После первичного клонирования гибридных линий было проведено предварительное изучение специфичности продуцируемых ими монокло-нальных антител. Кондиционированную гибридомами культуралькуто среду анализировали методом непрямого ИФА на наличие антител к набору антигенов. На основании данных ИФА гибридные клоны были разделены на четыре группы. Мы выявили, что моиоклональные антитела клонов А9, В7, С12, F71 взаимодействуют и с гонадотропным гормоном, приготовленным нами, и с международным стандартом сывороточного гонадотропина, а также специфичны к антигенам сыворотки крови жеребых кобыл, и вместе с тем не взаимодействуют с сывороточными белками жеребца ( табл. 6).

МонАТ клонов F72, H12, F8 реагировали как с ГСЖК различного происхождения, так и сывороткой крови жеребца, т.е. препаратом, не содержащим гонадотропин, и, следовательно, являлись непригодными для

разработки иммунноферментного метода количественного определения го-налотролного гормона.

МонАТ С102, С103 взаимодействовали только с препаратами очищенных гонадотропных гормонов, но с сывороткой крови жеребой коб шы не реа! ировалн. МонАТ Е12, Н5,~А2 взаимодействовали только с препаратом гонадотропного гормона СЖК, которым проводилась иммунизация, т.е. являлись не специфичными по заданным параметрам.

Таблица 6

Первичный анализ специфичности к ГСЖК моноклональных антител из полученных гибридных клонов

Клоны Антигены

ГСЖК РМЗС-сгакдарт Сыворотка жеребца Сыворотка жеребой кобылы

А9 + о + ■■ ■ ■'.. — +

В7 ■.. + ■■ , — +

С12

Р71 ■:,/ + —■ ' +

Р72 , ■ +■; + . +

Н12 +

'■".■. : ГО + ч-.- ..' + ..'■■■. + ■ +

СЮ2 ,..■ + ■ ... ■ ■ — . ■ —

С10Э : . ■ +■'."■:■■■■ * ■ —

Е12 ■:;■ —- ■. — —

Н5 + ■. — ■ —

А2 ■ —■ '— —

С целью определения специфичности полученных МонАТ все они были исследованы методом иммуноэлектрофореза в агаровом геле с помощью специфических гипериммунных сывороток против белков сыворот-

ки крови мыши. Кик видно из представленной на рис. 2 нммуноэлектрофо-реграммы выявляется одна линия иммунопрецинитата в области, характерной дли иммуноглобулинов класса б.

Анализ полученных препаратов МонАТ в диск-электрофорезе в ПЛАГ в присутствии ЗОБ и меркаптоэтанола выявил два основных компонента. При сравнении их с треком стандартов молекулярных масс установлено, что см» имеют вес около 25 и 50 кДа, следовательно, это легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина О.

I Я

■ " М Г ■ тя

Рис.2. Иммуноэлектрофорез; Лунки 1,3 - МонАТ к ГСЖК; траншеи 1, 2 - гипериммунная сыворотка кролика к сыворотке крови мыши; Диск-электрофорез: 1. Моиоклональные антитела к ГСЖК, П. Стандарты молекулярных весов.

Изотопический анализ показал, что эти моиоклональные антитела относятся к подклассу 1йС1. Оценивая прочность комплекса антиген-антитело, мы установили, что константы ассоциации равны, для двух наиболее реактивных клонов, 5,7*10* М-' и 1Л*10Ч М-', что указывает на высокое сродство реагирующих макромолекул.

Таким образом, нами выделен препарат высокоактивного и иммуно-химически чистого гонадотропного гормона СЖК, и впервые получены моиоклональные мышиные антитела к нему. Это дало нам возможность

приступить к конструированию иммуноферментнон тест-системы для количественного определения гонадотропного гормона СЖК. 3.5. Конструирован ну нммуноферчсн гього набора для количественного определения 1СЖК.

Конструирование нммуноферментной тест-системы для количественного определения ГСЖК осуществлялось по следующей схеме: иммобилизация связывающего агента,- мышиных моноклоналышх антител к ГСЖК, на твердую фазу путем физической сорбции; комплементарное присоединение лиганда,- ГСЖК из исследуемой сыиоротки или калибрующего материала; маркирование образовавшегося иммунного комплекса с помощью коньюгата мышиных моноклональных антител к ГСЖК с пероксидазой: детекция реакции по экстинкции раствора хромогена, изменяющего свою окраску в зависимости от количества кислорода, выделенного из перекиси водорода при разложении ее пероксидазой. Основными параметрами ^ест-системы являлись:

• Концентрация антител для иммобилизации на твердую фазу;

• рН комплектующего буферного раствора, температура и время иммобилизации антител на полистироловый планшет;

• Калибровочная кривая количественного определения ГСЖК.

Пр выборе оптимальной концентрации связывающего агента на полистироловых планшетах сорбировали мышиные моноклональные антитела к ГСЖК из 0,0 !М карбонат-бикарбонатного буферного раствора рН 9,5 в концентрациях от О, I до 50 мкг/мл. В качестве лиганда использовали СЖК. Максимальные значения экстинкции получены при концентрации беЛка 10 мкг/мл. Увеличение концентрации антител не приводит к увеличению интенсивности реакции, что, по-видимому, связано с пространственными затруднениями при сорбции антител к ГСЖК на полистирол.

Для определения оптимального рН иммобилизующего буферного раствора мышиные моноклональные антитела к ГСЖК в концентрации 10 мкг/мл разводили в 0,01 М цитратных буферных растворах, фосфатных бу-

ферных растворах, карбонатных буферных растворах рН от 4,0 до 10,5, Максимальные значения зкстинкцин получены при рН 8,5 и 9,5. В дальнейшей работе в качеств^ комплексирующего использовался карбонатный буферный раствор рН 9,5, поскольку реакция при этом значении протекает более интенсивно.

Оптимальный температурный режим н время иммобилизации связывающего агента определяли прн+4"С и при +37°С в интервале от I часа до 24 часов. Установлено, что максимальные значения эксгинкцяи получены при 3-часовоЙ сорбции МонА'Г при +37°С, Однако, учитывая возможность энзиматической инактивации антител, их иммобилизацию на полнети-роловых планшетах целесообразно проводить при +4°С в течении 16 часов.

Для построения калибровочной кривой использовали препарат полуденного нами сывороточного гонадотропнна жеребых кобыл с удель-i.jfl активностью 10000 lU/мг, титруя его кратно двум, начиная с концентрации 4 мкг/мл, или 40 Ш/мл.

3.6, Применение ИФД ада уачнчутвенного определения гонядопгропння в

cwftwtgngjamaamtfwx .

Лабораторные испытания иммуноферментной тест-системы проводили на образцах сыворотки крови, полученных от 97 жеребых кобыл с различными сроками жеребости. В качестве контроля использовали сыворотку крови жеребца. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Из таблицы видно, это наименьшее увеличение концентрации гона-дотропного гормона в крови жеребых кобыл, по сравнению с холостыми, наблюдается на сроках .. 35 по 40 день. Содержание гонадотропина возрастает начиная с 60 дня жеребости, достигая максимальных величин на 70-90 дни жеребости. Снижение количества гонадотропного гормона отмечается в сроки с 110 по 130 н с 130 по 150 дай: 4,5 + 0,79 и (.31 ±0,09 мкг/мя соответственно.

Таблица 7

Уровень гонадотрошюго гормона в СЖК в зависимости от срока жеребости (п=7)

Группы по сроку жеребости Кол-во животных Средний уровень ГСЖК. мкг/мл Средний уровень бноактивносгн, Ш/мл

35-40 дне и 12 2,15 + 0,7 22

45-60 дней 15 5,31+1.02 53

60-70 дней 10 7,74+1,79 77

70-40 дней 24 9.2+ 1.68 92

90-Ц0 дней 17 6,3 + 1.0 63

110-130 дней 12 4,5 ± 0,79 45

130-150 дней 7 1 ¡,31+0,09 13

холостые кобылы 60 0,05 +.0,01 0

Гормональная активность выборочных образцов сывороток жеребых кобыл, исследованных в ИФА, была оценена также в биотесте на инфант-ных самтх крыс, что продемонстрировало практически полное соответствие результатов иммуноферментиого анализа результатам биопробы.

На основании экспериментальных исследований установлено, что разработанная нами иммуноферментная тест-система количественного определения гонадотропного гормона в СЖК, позволяет полноценно заменить трудоемкие биотесты определения гормональной активности проб СЖК, что очень важно в условиях производства при комплектовании коммерческих серий СЖК. сократить этим брак и повысить качество препарата: оперативно проводить коррекцию технологических процессов на разных стадиях очистки гормона.

выводы

1. Разработан высокоэффективный способ выделения гонадотропного гормона из сыворотки крови жеребых кобыл методом хроматофокусирова-ния на ИБИ-94, позволяющий получить препарат с гормональной актии-ностыо 7000 1и/мг с минимальным содержанием примесей сывороточных белков.

2?Метод иммз'чосорбшш на СК'Вг-еефарозном сорбенте с иммобилизованными антителами к белкам сыворотки крови жеребца обеспечивает получение высокоочищенного гонадотропного гормона СЖК с активностью (0 000 Ш/мг.

Аффинно очищенный препарат гонадотропного гормона позволяет получать моноклинальные мышиные антитела к нему.

3. Установлено, что моиоклональные антитела клонов А9, В7, С12 взаимодействуют с высокоочишеиимм гонадотроггным гормоном СЖК и ан пи сками сыворотки крови жеребых кобыл, и не взаимодействуют с сывороточными белками жеребца.

4. Все полученные моноклональные антитела принадлежат к классу иммуноглобулинов О. Это подтверждается тем,что электрофоретическая подвижность полученных моноклональных антител в ПААГ одинакова и соответствует молекулярному весу около 160000, что является характерным значением для й.

5. Содержание специфических антител в каждом из препаратов моноклональных антител составило 99% от общего содержания белка. Определена константа ассоциации реакции взаимодействия ГСЖК с Мо-нАТ к ГСЖК. которая равна 5,7*10® М-', что указывает на высокое сродство реагирующих макромолекул.

6. Определены физико-химические характеристики выделенного гонад о-тропика. Гонадотропный гормона СЖК - это димер с молекулярным весом около 58 кДа. Под влиянием мочевины и меркаптозтанола димер ГСЖК расщепляется па две субъединицы с примерным молекулярным весом 23 и

:з

37 кДа. При диссоциации в ЮМ мочевине с восстановлением на колонке с сефадексом й-150 удается добиться четкого разделения этих субъединиц. Определена изоэлектрическая точка очищенного гонадотропного гормона (рН 2.0 - 2.2).

7. Установлен аминокислотный состав очищенного ГСЖК. Показано, что в его состав в больших количествах входят кислые дикарбоновые аминокислоты. Особенностью аминокислотного состава ГСЖК является высокое содержание продана. N-концевые аминокислоты - фенилаланин и серин. С-концевая аминокислота • изолейцин.

8. Углеводный состав гонадотропного гормона представлен всеми саха-рами. которые обычно обнаруживаются в питуитарных гликопротеидных гормонах. Однако, в отличие от других, в нем содержится значительно

'.Г. .'

большее количество сиаловой кислоты. Общее содержание углеводов в ГСЖК находится в пределах от 41,5 до 46,6%.

9. Разработана иммуноферментная тест-система количественного определения ГСЖК в сыворотке крови жеребых кобыл, позволяющая полностью заменить собой трудоемкие биотесты определения гормональной активности проб СЖК в практической биотехнологии. Установлено, что совпадение между иммуноферментным методом определения ГСЖК и биотестом оставляет 97%,

Практические предложении:

1. Разработанный метод выделения гонадотропного гормона СЖК хрома-тофокуенрованием на ПБИ-94 с последующей иммуносорбцией на СЫВг-сефарозном сорбенте с иммобилизованными антителами к сывороточным белкам* жеребца позволяет использовать его для приготовления высоко-очищенных и высокоактивных стандартных препаратов ГСЖК.

2. Предложенная иммуноферментная тест-система количественного определения гонадотропного гормона в СЖК может быть лепользована для контроля потерь гормональной активности в процессе очистки ГСЖК с целью быстрой коррекции технологического процесса.

и

3, Учитывая простоту, скорость и информативность разработанной т«т-системы количественного определения гонадотропина в сыворотке крови жеребых кобыл, рекомендовать се для определения гормональной активности при формировании производственных серий СЖК на бнофаСрикач, что значительно повысит качество препарата. Рекомендации по раиной экспресс-дна гностике жеребости кобыл одобрены Трестом конных заводов. Опубликованные работы:

1. Выделение гонадотропного гормона из сыворотки жеребых кобыл. Тезисы доклада на Всесоюзной научно-технической конференции молодых ученых "Актуальные вопросы профилактики и лечения болезней сельскохозяйственных животных", 1985 г., Москва, стр. 6>6б,

2. Иммуноферментный метод диагностики жеребости кобыл. Тезисы доклада на Всесоюзной научно-технической конференции молодых ученых ' Актуальные вопросы профилактики и лечения болезней ссльскохозяй-с-венных животных", 1985 г., Москва, стр. 189-190, (Соавторы: В.А.Гуревич).

3. Определение жеребости кобыл по изменению уровня сывороточного гонадотропина в крови. Тезисы доклада на Международной конференции "35th Annual Meeting of the EAAP", 1984, Гаага. (Соавторы: И.Ф.Бобылев. В.А.Гуревич, Г.А.Ермолин).

4. Экспресс-диагностика жеребости. Журнал "Коневодство и конный спорт". № 4, 1987, стр.34-35. (Соавторы: И.Ф.Бобылев, В.А.Гуревич, Г.А.Ермолин).

5. Способ выделения гонадотропина из сыворотки жеребой кобылы. Авторское свидетельство ,Nq 1374488, 15.10.1987, (Соавторы: Г.А.Ермолин, Е.Е.Ефремов).

6. Рекомендации по ранней экспресс-диагностике жеребости кобыл иммунологическим, газохроматографическим и ультразвуковым методами. Типография МВА им. К.И.Скрябина, Москва, 1985. (Соавюры: Б.Ф.Бобьшев, В.А.Гуревич, Г.А.Ермолин).

Подписано 1 печать Формат 60 * 8 У//А Заказ Я, 5 9

Уса. веч. я. 4.$ / Тираж

Тгощифм Россспьхоздшдемии