Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, очистка гонадотропного гормона и разработка иммуноферментного набора для его определения в СЖК

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, очистка гонадотропного гормона и разработка иммуноферментного набора для его определения в СЖК"

На правах рукописи

#

Ч

МЕРКУЛОВА МАРИНА ВЛАДИМИРОВНА

Выделение, очистка гонадотропного гормона и разработка иммуноферментного набора для его определения в СЖК

03.00.23. - Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКОВСКАЯ ОБЛАСТЬ, п. ДУБРОВИЦЫ 1997 год

Работа шполнена во Бсэрэсси^ском научно-иссяедэват ел ь ском ииетитуте ко нт-ро :я, стандартизации и сертификации ь е тери нарных прэ парат о ь

Научный руководитель - доктор биологических наук СОВЕТКИН С.В. Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор, КЛИНСКИЙ Ю.Д. - кандидат биологических наук, с.н.с., РЯБЫХ В.П.

Ведущее учреждение - Биотехцентр по животноводству РАСХН;

Москва-Горки Ленинские

Защита диссертации состоится ". 1997 г.

в " '/О" часов на заседании диссертационного совета Д 020.16.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142012, Московская область,

Подольский район, п. Дубровицы

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института. Автореферат разослан

ОЗ. 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор сельскохозяйственных наук

Н.В.Груздев

1. ОЫЦЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА-РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Успех», достигнутые в эндокринологии, неразрывно связаны с разработкой и совершенствованием методов контроля качества юрмоиальных препарат ов. используемых как в медицине, так и ветеринарной практике.

Основоположником отечественной ветеринарной эндокринологии М.М.Завадовскнм и его школой заложены основы применения гормональных препаратов для коррекции гормонального статуса у животных с целью регуляции воспроизводительной функции у самок сельскохозяйственных животных и лечения гинекологических болезней у них.

Сыворотка крови жеребых кобыл (СЖК) является одним из гормональных препаратов, нашедших широкое практическое применение как для лечения гипофункции яичников, так и повышения воспроизводительной функции у самок ссЛ1 кохозяйственных животных.

Методы, используемые в отечественной биотехнологической промышленности для определения гонадотропной активности СЖК, а также препаратов, получаемых из нее ( гонадотропин очищенный, гравогормон, овариотропин и др.), требуют своего совершенствования. Так, тест на самцах озерных лягушек, применяемый для формирования промышленных серий СЖК, позволяет весьма приблизительно оценивать ее гормональную активность, что в 5начительной степени снижает ее качество.

Исследование гормональной активности СЖК на неполовозрелых самках белых мышей (мышино-маточный тест) и белых крыс ( по увеличению массы яичников), также имеют ряд недостатков, а именно, продолжительность времени их проведения (от 72 до 120 часов), выраженная индивидуальная чувствительность животных, зависимость от времени года, особенностей кормления, температуры окружающей среды, влажности, а также высокая стоимость работ. Важно также отметить, что ошибка биологического метода контроля гормональных препаратов, в том числе и СЖК, находятся в пределах от 10 до 20%.

Достижения в области препаративной биохимии, иммунологии, биотехнологии позволили на основе получения чистых биологически активных веществ, в том числе и гормонов, разработать радиоиммунологические, иммуноферменгные методы определения их как в биологических субстанциях. так и в коммерческих препаратах. Эти методы отличаются от ранее известных высокой чувствительностью, воспроизводимостью и временем их проведения. Однако, для реализации одного из этих методов необходимо иметь иммунохимически чистый гормон и высокоспецифические антитела к нему.

Поэтому, разработка тест-системы для быстрого и более точного определения гонадотропного гормона в сыворотке крови жеребых кобыл обеспечит получение гонадотропных препаратов (ГСЖК) высокого качества и позволит более эффективно использовать их в практике ветеринарии и животноводства.

В связи с вышеизложенным, целью нашей работы являлось: разработать эффективный способ выделения высокоактивного и иммунохимически чистого гонадотропного гормона из нативной сыворотки крови жеребых кобыл, изучить его физико-химические свойства и разработать им-муноферментную тесг-сисгему для количественного определения как в СЖК, так' и в гонадотропных препаратах, полученных из нее.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

I. Разработать технологичный способ получения высокоактивного и имму-ноло! ически чистого гонадотропного гормона из сыворотки крови жеребых кобыл.

II. Изучить физико-химические и иммунологические свойства ГСЖК с целью его стандартизации для создания иммуноферменгной тест-системы количественного определения.

III. Разработать оптимальную с\ему получения гнпернммуннои сыворотки лабораторных животных к ГСЖК для дальнейшего выделения аффинных антител к гонадотропному гормону.

IV. Сконструировать иммунофсрчснтную тест-систему количественного определения гонадотропина в продуктах биотехнолопш (СЖК).

V. Провести апробацию тест-системы для выявления ее диагностической ценности.

VI. Провести сравнительный анализ определения биотогической активности препаратов гонадотропина и нативной СЖК посредством биопробы на неполовозрелых самках крыс и иммуноферментного анализа.

Научная новизна исследования:

Впервые разработан высокоэффективный способ выделения сывороточного гонадотропина из сыворотки крови жеребых кобыл метолом хро-матофокуснрования на Г1БИ-Ч4 и дальнейшей его очистки от примесп.лх сывороточных белков с использованием CN Br-сефарозного иммуиосор-бента с иммобилизованными антителами к сывороточным белкам жеребца (авторское свидетельство № 1374488 от 15.10.87).

Получены моноклональные антитела против ГСЖК. Найдено, что эти антитела, взаимодействуя с гормоном, не оказывают влияния на его биологическую активность. Определена константа ассоциации реакции взаимодействия ГСЖК со специфическими антителами, равная 5,7*10 ш М, что указывает на высокое сродство реагирующих макромолекул.

Обоснованы оптимальные условия для разработки иммунофермент-ной тест-системы для количественного определения гонадотропного гормона в препаратах СЖК.

Практическая ценность работы.

Гонадотропный гормон СЖК стандартизован по аминокислотному и углеводному составу. С- и N- концевым аминокислотам и молекулярной массе, что обеспечивает получение специфических моноклональных кнтн-тел к нему.

Полученные мышиные моноклональные антитела к гонадотропному гормону СЖК являются моноспецнфичными и не интбнруют его гормональной активносги.

Предложена иммуноферментная тест-система для количественного оппеделошя гонадотропного гормона п СЖК, позволяющая определять его концентрацию в сыворотке крови жеребых кобыл и полностью заменить биологические тесты, повысить качество выпускаемых препаратов.

Методические рекомендации по ранней экспресс-диагностике жеребости кобыл иммунологическим методом утверждены Трестом конных заводов и ипподромов МСХ СССР; они нашли также применение в учебном процессе зооинженерного факультета МВД им. К.И.Скрябина.

Апробация работы. Материалы диссертации были рассмотрены на межлабораторном совещании ВГНКИ 28 мая 1997 года и на заседании отдела биотехнологии ВЙЖ 5 июня 1997 года.

Результаты исследований были доложены на Всесоюзной научно-технической конференции молодых ученых "Актуальные вопросы профилактики и лечение болезней сельскохозяйственных животных", г.Москва, 1985 г., на 35-м Всемирном симпозиуме по проблемам диагностики болезней сельскохозяйственных животных, Гаага. 1984 г.

Публикации. Материалы, изложенные в диссертации, опубликованы в 5 работах, список которых приведен в конце автореферата.

Структура н объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, трех глав обзора литературы, главы о материалах и метеках, пяти глав собственных исследований и их обсуждения, выводов и указателя использованной литературы.

Материалы диссертации, включая таблицы, рисунки и список литера-гуры, изложены на 139 страницах текста. Работа иллюстрирована 21 таблицами и 31 рисунком. Список литературы включает 128 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

J

2. Материалы и методы исследований. » В работе использовали сыворотку крови жеребых кобыл с активностью 50 IU/мл Dessau, Германия; СЖК Орской биофабрики с активностью 140 м.е./мл, коммерческий препарат очищенного гонадотропина,- PMSO "Calbiochem" с активностью 5000 Ш (международных единиц); сывороточный гонадотропин жеребых кобыл PMSG "Sigma" с активностью 2000 IU; коммерческий субстандарт сывороточного гонадотропина жеребых кобыл "PMSG - Substandard - Dessau" с активностью 1600 Ш. > Исследованные биоматериалы. В качестве отрицательной контрольной сыворотки использовали смесь 150 индивидуальных сывороток крови жеребцов, полученных на Гомельском конном заводе; • 120 индивидуальных сывороток крови жеребых кобыл с различными сроками жеребости, подтвержденными ректальными исследованиями, полученных на Орской бйофабрике и Гомельском конном заводе; 75 индивидуальных сывороток крови нежеребых кобыл, полученных на Гомельском конном заводе;

Антитела к сывороточным белкам жеребца получали после гиперим-нунизации кроликов сывороткой крови жеребца.

Источником моноклональных антител (МонАТ) к ГСЖК являлась 1сцитная жидкость мыши, полученная после гипериммунизации мышей тинии Balb/c электрофоретически чистым ГСЖК. Выделение МонАТ к ГСЖК из асцитной жидкости мышей проводили с помощью осаждения гульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией.

В качестве метки для приготовления меченых антител использовали пероксидазу из корня хрена марки А, 945-960 единиц активности, Олайн-ясого НПО "Биолар".

Конъюгаты антител с пероксидазой получали по модифицированной методике (Wilson В., Nakane Р., 1978). Ферментативную активность конъ-югатов определяли по RZ=On при 403 нм/ОП при 280 нм и применяли для исследования те конъюгаты, RZ которых была более 0,4. Специфичности

конъюгатов определяли титрованием на планшетах с иммобилизованным гонадотропным гормоном, сывороткой крови жеребца и сывороткой крови нежеребой кобылы в количестве 10 мкг/мл и выбирали те разведения конъ-югата, которые при длине волны 492 им давали величину экстинкции, близкую 1,0.

На первом этапе работы проведен сравнительный анализ основных известных методов выделения гонадотропного гормона: метод спиртового осаждения no Gospodarowicz D., 1967; ионообменная хроматография на QAE-сефадексе А-50 (Moore W„ Ward D„ 1980); гель-фильтрация на сефа-дексе G-200 и хроматография на гидроксилапатите (PapkofT Н., Bewley Т., 1978).

Чистоту полученного препарата ГСЖК контролировали градиентным электрофорезом в полиакриламидном геле от 5 до 20% в присутствии SDS-Na и меркаптоэтанола. Разделение гонадотропного гормона СЖК на субъеднницы проводили с помощью . [ссоциации в ЮМ мочевине. (Bousfield G. et al, 1992)

Определение аминокислотного состава гонадотропного гормона СЖК проводили на аминокислотном анализаторе "Beckman model 120 В". Определение N-концевой аминокислоты проводили с помощью 1-фтор-2,4-динитробензола в щелочной среде с образованием окрашенных в желтый цвет 2,4-динитрофенольных производных (Ward D., 1985).

Углеводный состав гормона определяли хроматографическими методами (Combarnous Y., Salesse R., 1981). Содержание сиаловых кислот определяли тнобарбчтуровой кислотой после гидролиза образцов в 0,1 М серной кислоте при 100°С в течение 1 часа. Содержание глюкозамина и галактозы определяли хроматографически и нингидриновои реакцией в аминокислотном анализаторе. Образцы гликопротеидов предварительно гидролизовали в 6 N HCl в течение 6 часов при 110°С. Определение гексо-замина выполняли методом Calt.( 1992), используя галактозамин - HCl как стандарт.

Иммуноферментные реакции осуществляли в полистироловых планшетах для иммунологических реакций Московского завода медтехникн и планшетах фирмы Linbro (США) по пошаговой методике Voller et al.. 1976.

Для выделения антител к сывороточным белкам крови жеребца uj смеси сывороток крови гипериммунизированных кроликов использовали аффинную хроматографию на CNBr-сефарозе 4В с иммобилизованными белками крови жеребца. Иммуносорбент готовили согласно инструкции фирмы-изготовителя.

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) для качественной характеристики выделенных антител осуществляли по прилагаемой инструкции на приборе Мультифор (LKB, Щвецня). Аналитический диск-электрофорез (ДЭФ) для изучения состава выделенных антител проводили по стандартной методике с SDS-Na по Laemmli, 1979. Концентрирование растворов антител проводили ультрафильтрацией через фильтр ХМ-50 и ХМ-100 фирмы "Amicon".

Для обработки экспериментальных данных использовали методы сравнения средних величин (Роклицкни, 1967) с помощью коэффициента Стьюдента, коэффициента корреляции ( Плохинский,-1970). Данные имму-ноферментного анализа определения гонадотропного гормона СЖК обрабатывались на персональном компьютере Labtam 3003 с помощью программ, разработанных в лаборатории информационно-измерительных систем ИЭК ВКНЦ.

3, Результаты собственных исследований.

3.1. Сравнительная оценка методов очистки гонадотропного гормона

Для получения высокоочищенного гонадотропного гормона СЖК апробированы четыре наиболее известных способа его выделения на основе спиртового фракционирования, хроматографии на QAE-сефадексе, гидро-ксилапатите, а также гель-фильтрации на сефадексе G-200. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Сравнительная оценка эффективности способа очистки гонадотропного

гормона СЖК (п=5)

Метод спиртового осаждения Хроматография на (ЗАЕ-сефадексе Гель-фильтрация Хроматография на гидроксила-патите

Количество стадий очистки 5 4 3 4

Выход гонадо-тропина по белку из 1л СЖК, мг 164 108 20 30

Удельная активность, м.е./мг 597 1300 3000 1600

Выход по белку, % 15 40 20 34

Сохранение исходной активности, % 69 82 76 • 47

Из данных, представленных в таблице, можно сделать заключение, что апробированные методы отличаются многостадийностью, большими потерями от исходного содержания гормона в СЖК, - от 18 до 53%, при достаточно низкой удельной активности от 597 до 3000 м.е./мг. Данные диск-электрофореза (рис. 1, треки 2, 6,7,8) показали значительное содержание сопутствующих белков сыворотки крови в полученных гормональных препаратах, что свидетельствует о невозможности их использования для получения специфической антисыворотки к ГСЖК.

3.2. Разработка нового способа выделения иммунохимичсски чистого препарата гоналотропиого гормона СЖК.

В связи с вышеизложенным, был рлзработан принципиально новый способ получения высокоактивного и высокоочнщенного препарата ГСЖК методом хроматофокусирования на ПБИ-94 при рН=5,0. Условия элюции подобраны таким образом, что большинство сывороточных белков (имеющих р! от 4 до 7) проходило через колонку в растворе фармалита 2,5-5,0, не взаимодействуя с ионообменником, тогда как ГСЖК ( с нзоточ-кой 1,8 - 2,0) количественно сорбировался на нем. Десорбцию гормона проводили, создавая градиент МаС1.

На этой стадии очистки был получен гормональный препарат с удельной активностью 7000 Ш/мг белка, выход гормона составил 92%. По результатам диск-электрофореза (рис. 1, трек разгонки 5) в градиенте ПААГ установлено наличие примесных белков в полученном препарше гонадотропина.

Для дальнейшей очистки препарата ГСЖК от примесных сывороточных белков приготовлен СЫВг-сефарозный иммуносорбент с иммобилизованными аффинными антителами кролика к сывороточным белкам жеребца (т.е. с антителами к видовой сыворотке, в которой отсутствует гона-дотропин). При этом сывороточные белки специфически связываются с антительным сорбентом в то время, как ГСЖК свободно выходит из колонки. Применяя данную схему очистки гонадотропного гормона СЖК, нам удалось получить его гомогенную фракцию, что подтверждается данными диск-электрофореза (рис. 1, трек разгонки 3). Выход гормона от исходного его содержания в сырье составил 80%.

1 г з ч 5 б } £

; 1111 .....«ШИЯН Ч1Ч11|1»И1Ч|||т 1ГПГ.1» и II и

Рис. 1. Стандартный диск-электрофорез в градиенте ПА. * Г 5-20%.

1 - Стандарты мол.весов: а) альбумнн-67 ООО; б) фосфорилаза - 94 ОМ; в) ферритин - 440 ООО; г) фибронектин; д) тнреоглобулнн - 669 ООО.

2 - ГСЖК, полученный на (ЗАЕ-сефадексе; 3 - ГСЖК, полученный по разработанной нами методике; 4- разделение на субъеднницы очищенного препарата ГСЖК; 5- ГСЖК, после хроматофокусирования; 6- ГСЖК, после гель-фильтрации на сефадексе С-200; 7 - ГСЖК, после хроматографии на гидрокенлапатите; 8 - ГСЖК, посте спиртового осаждения.

Гормональную активность полученного препарата проверяли на ин-фантных самках белых крыс линии "\Vistar" ь возрасте 21-22 дней. Испытуемый образец ГС/'СК тестировали, начиная с концентрации 2 мкг/мл. Б качестве референс-стандарга использовали препарат сывороточного гона-дотропипа РМБО БиЬ^ашкп-Осхзаи с активностью 1600 Ш/мл, который тмгронали, начиная с разведения 1/50 ( 32 Ш). Через 120 часов, после убоя животных, проводил» учет результатов но весу яичников у контрольной и опытных групп. Результаты приведены «таблице 2.

Таблица 2.

Результаты биопробы на инфлнтных самках крыс (п= 10)

Доза субстандарта Эевзаи, Ш/мл Вес яичников, мг До:а очищенного препарата ГСЖК. мкг/мл Вес яичников, мг

32.0 325.5 ± 11,8 2.0 321.3+11.2

16.0 320,7 + 12,3 1.0 304,5 + 8,1

8.0 295,5 + 9.4 0,5 245.1 +7,4

4.0 216,2 ± 11.0 0,25 218,7 ± 1,5

2,0 391,2 ± 16,7 0,125 190,9 + 6,7

1.0 157.1+8.5 0.0625 157,8 + 3,3

0.5 102,5 ± 1.0 0,03125 149,7 + 5,1

0.25 91,1+0.8 — -

Контроль 35,2 ±7,7 35,2 ±7.7

При экстраполяции данных веса яичников в зависимости от дозы очищенного препарата ГСЖК на калибровочную кривую титрования субстандарта РМБв. видно, что I мкг полученного препарата ГСЖК демонстрирует биоактивность, равную 10 Ш субстандарга. Таким образом, 1 мг препарата ГСЖК, полученного по нашему методу обладает биологической активностью 10000 Ш.

Обобщая данные экспериментов, можно заключить, что из 500 мл СЖК с исходной гормональной активностью 50 1и/мл по разработанному нами методу было получено 2,0 мг высокоочшценного гонадотропного гормона СЖК с активностью 10 000 Ш/мг. При этом потери гормональной активности препарата составили 20,0% (см. табл. 3).

Таблица 3

Результаты выделения гонадотропного гормона СЖК по нашему методу (п= 10)

Наименова ние образцов Общий белок в образце, мг Активность Суммарная, Удельная, Ш Ш/мг % очистки, по активности

Исходная СЖК. 500 мл 32500 25000 0,76 100

После хро-матофоку-сирования 3,3 23100 7000 92.4

После иммуносорбции 2,0 . 20000 10000 80,0

В результате проведенных исследований установлено, что при сорбции полуочищенного препарата ГСЖК на иммуносорбент с иммобилизованными антителами к сывороточным белкам жеребца удается избавиться от всех примесных белков. Эти данные свидетельствуют о том, что смесь контаминирующих белков, взаимодействующих при сорбции с иммобилизованными антителами к СЖ, полностью удаляется из препарата ГСЖК.

3.3. Физико-химические свойства гонадотропного гормона СЖК.

Чистоту препарата ГСЖК контролировали градиентным диск-электрофорезом в неденатурирующих условиях. (Рис. 1, трек разгонки 3) На диск-электрофоре! рамме в образце ГСЖК после иммуносорбции миг-рир>ет одной полосой, что указывает на его гомогенность полученного гормона. Установлена молекулярная масса, полученного гонадотропного гормона оказавшаяся равной 58 кДа. При проведении диск-элехтрофореза в

присутствии SDS-Na и 2-меркаптоэтанола очищенный препарат ГСЖК мигрирует двумя полосами ( рис.1, трек разгонки 4). что указывает на субъ-единнчный характер белка. В денатурирующих условиях величина молекулярной массы соответствует 23 и 37 кДа. Таким образом, молекула гонадо-тропного гормона состоит из 2-х неодинаковых субъединиц. Такие же результаты были получены при определения молекулярной массы гонадо-тропного гормона СЖК методом гель-фильтрации на сефадексе G-150.

. Разделение гонадотропного гормона СЖК на субъединицы мы проводили с помощью диссоциации в 1 ОМ мочевине с добавлением в него 0,1М 2-меркаптоэтанога при рН 8,6. Применение восстановителей дисульфид-ных связей позволило улучшить хроматографическое разделение а- и р-субъединиц. Их молекулярный вес, определенный методом гель-фильтрации по калибровочной кривой стандартов, составил 23 кДа для а- и 37 кДа штя р-субъединнцы соответственно, что подтверждает данные, полученные в диск-электрофорезе.

Для очищенного гонадотропного гормона методом хроматофокуси-рования на ПБИ 94 была определена величина изоэлектрической точки. Найденное значение р! равнялось 2,0 - 2,2, что указывает на сильнокислый характер сывороточного гонадотропина жеребых кобыл.

Оп еделение аминокислотного состава гонадотропного гормона СЖК проводили на аминокислотном анализаторе "Beckman model 120В". Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4

Определение аминокислотного состава ГСЖК (п=5)

Аминокислота Мкг/мг сухого веществ;!

Лизин 29,8 + 0.02

Гистиднн 2.4 + 0.04

Аргинин 32.4 ± 0.07

0 Аснаригиновая к-та 28.6 + 0.08

Треонин 45.3 + 0,1

Серии 42,6 + 0,07

Глугаминовая к-та 44.8 + 0.02

Пролин 68,5 ± 0.06

Глицин 27,3 + 0,07

Алании 38.8 + 0,09

1/2 Цистин 41,1 +0.04

Валин 24,5 + 0.03

Метионин 9.72 + 0,01

Изолеицин 25,3 + 0,05 \ 1

Лейцин 31,1+0,01 |

Тирозин 13,5 + 0,07 | |

Фенилаланин 22.1+0,02 ?

Из данных, представленных в таблице видно, что в гонадотропноь гормоне СЖК имеется большое количество дикарбоновых аминокислот.; также цистина, треонина и серина. Особенностью аминокислотного соста ва гонадотропина сыворотки крови жеребых кобыл является высокое со держание пролина по отношению к известным сывороточным белкам. Ис следование амино-конг "вых остатков очищенного препарата ГСЖК вы

»вило фенилаланин и серии в качестве таковых. Карбокси-концсвыс аминокислоты представлены одним остатком изолейцнна.

Результаты исследования углеводного состава гормона показали, что в молекуле ГСЖК присутствуют все сахара, обычно встречающиеся в интуитивных глнкопротеидных гормонах. Общее содержание углеводов в ГСЖК колеблется от 41,5 до 46.6%. Важно отметить низкое содержание фукозы (0.6-0.8%) по сравнению с известными гликонротеидными гормонами при высоком содержании сиаловон кислоты (10,8-14,9%). Сочетание больших концентраций кислых дикарбоновых аминокислот и сиаловых кислот, по-видимому, объясняет низкую изоэлектрическ\то точку гормона (р! = 1,8-2.2).

Таблица 5

Углеводный состав ГСЖК (мг/100 мг сухого вещества, п =3)

Углеводы Эксперимент Среднее

1 2 3

Сналовые кислоты 10,2_+ 0,03 13.7+0.1 13.8+0,2 12.9 + 0,15

Ь-фукоза 0,6 + 0,02 0,8 + 0,0 0.7+0,05 0,7 ± 0.04

1>манноза 2.5 + 0,01 2.3 + 0,04 2,7 + 0,03 2.5 ± 0,02

О-галактоза 11,6 + 0,4 8.5 ± 0,1 9,7 + 0,7 10,2 ±0,4

Гексозамины 20,6 ±0,2 19,5 ± 0.3 20,0 + 0,1 20,2 ±0.2

Общее содержание угле- 45,5 + 0.25 44.8 ± 0,26 46,9 + 0,4 45.5 + 0,25

3.4. Получение мышиных моноклональных антител к ГСЖК.

Наличие высокоочищенного препарата гонадотропного гормона по зволило нам, используя метод Келлера и Мильштейна, получить мышиньк моноклональные антитела против этого гормона.

Общее количество полученных гибридных клонов, способных расп на селективной среде ДМЕМ с аминоптерином, гипоксантином и тимиди нбм , - около ?00. При скрининге гибридных клеток мы считали положи тельными те лунки, из которых пробы культуральной жидкости давали i ИФА ответ, в 3 и более раз превышающий фон. Такое превышение бьик выявлено в пробах из 24 лунок, которые были пересажены на свежую плас тину с перигонеальными макрофагами и фибробластами и через 1 неделк вновь проанализированы. Клетки из 13 лунок, характеризовавшиеся ак тивным ростом и высоким уровнем продукции специфических антител, бы ли отобраны для дальнейшет работы и клонированы в мягком агаре и ме тодом разведений. Отклонированные клетки наращивали, а затем вводил! их в брюшную полость сенсибилизированных сингенных мышей лини! Balb/c для получения асцитных опухолей.

После первичного клонирования гибридных линий было проведен« предварительное изучение специфичности продуцируемых ими монокло нальных антител. Кондиционированную гибридомами культуральную сре ду анализировали методом непрямого ИФА на наличие антител к набор; антигенов. На основании данных ИФА гибридные клоны были разделень на четыре группы. Мы выявили, что моноклональные антитела клонов А9 В7, С12, F71 взаимодействуют и с гонадотропным гормоном, приготовлен ным нами, и с международным стандартом сывороточного гонадотропинн а также специфичны к антигенам сыворотки крови жеребых кобыл, и вмес те с тем не взаимодействуют с сывороточными белками жеребца ( табл. 6).

МонАТ клонов F72, H12, F8 реагировали как с ГСЖК различной происхождения, так и сывороткой крови жеребца, т.е. препаратом, не со держащим гонадотропин, и, следовательно, являлись непригодными дл:

разработки иммунноферментиого метода количественного определения гонадотропного гормона.

МонАТ С102, С103 взаимодействовали только с препаратами очищенных гонадотропных гормонов, но с сывороткой крови жеребой коб шы не реа! провали. МонАТ Е12, Н5, А2 взаимодействовали только с препаратом гонадотропного гормона СЖК, которым проводилась иммунизация, т.е. являлись не специфичными по заданным параметрам.

Таблица б

Первичный анализ специфичности к ГСЖК моноклональных антител из

полученных гибридных клонов

Клоны Антигены

ГСЖК РМБв-сгандарт Сыворотка жеребца Сыворотка жеребой кобылы

А9 + о + — +

В7 + + — +

С12 + + — +

¥1\ + + — +

¥12 + + + +

Н12 + + + +

Р8 + + - + +

С102 + + — —

С103 + + — • —

Е12 + — — —

Н*5 + — — —

А2 + — — —

С целью определения специфичности полученных МонАТ все они были исследованы методом иммуноэлектрофореза в агаровом геле с помощью специфических гипериммунных сывороток против белков сыворот-

ки крови мыши. Как видно из представленной на рис. 2 иммуноэлектрофо-реграммы. выявляется одна линия иммунопреципитата в области, характерной для иммуноглобулинов класса в.

Анализ полученных препаратов МонАТ в диск-электрофорезе в ПААГ в присутсгвии и меркаптоэтапола выявил два основных компонента. При сравнении их с треком стандартов молекулярных масс уста-[Мвлено, что очи имеют вес около 25 и 50 кДа, следовательно, это легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина С.

Ф

«8

•ч Щ

£

ц.

т

Рис.2. Иммуноэлектрофорез: Лунки 1,3 - МонАТ к ГСЖК; траншеи 1, 2 - гипериммунная сыворотка кролика к сыворотке крови мыши; Диск-электрофорез: I. Моноклональные антитела к ГСЖК, И. Стандарты молекулярных весов.

Изотопический анализ показал, что эти моноклональные антитела относятся к подклассу 1. Оценивая прочность комплекса антиген-антитело, мы установили, что константы ассоциации равны, для двух наиболее реактивных клонов, 5,7*10® М-' и 1,1*Ю9 М-', что указывает на высокое сродство реагирующих макромолекул.

Таким образом, нами выделен препарат высокоактивного и иммуно-химически чистого гонадотропного гормона СЖК, и впервые получены моноклональные мышиные антитела к нему. Это дало нам возможность

приступить к конструированию иммуноферментнои тсст-смстсмы для количественного определения гонадотроиного гормона СЖК. 3.5. Конструирование и^муноферментього набора для количественного определения Г СЖК.

1\онструирование иммуноферментнои тест-системы для количественного определения ГСЖК осуществлялось по следующей схеме: иммобилизация связывающего агента,- мышиных моноклональных антител к ГСЖК, на твердую фазу путем физической сорбции; комплементарное присоединение лиганда,- ГСЖК из исследуемой сыворотки или калибрующего материала; маркирование образовавшегося иммунного комплекса с помощью конъюгата мышиных моноклональных антител к ГСЖК с пероксидазой; детекция реакции по экстинкции раствора хромогена, изменяющего свою окраску в зависимости от количества кислорода, выделенного из перекиси водорода при разложении ее пероксидазой.

Основными параметрами 1ест-системы являлись: » Концентрация антител для иммобилизации на твердую фазу; ► рН комплексирующего буферного раствора, температура и время иммобилизации антител на полистироловый планшет; » Калибровочная кривая количественного определения ГСЖК.

Пр выборе оптимальной концентрации связывающего агента на голистироловых планшетах сорбировали мышиные моноклоналыше анти-■ела к ГСЖК из 0,01 М карбонат-бикарбонатного буферного раствора )Н 9,5 в концентрациях от 0,1 до 50 мкг/мл. В качестве лиганда использова-1и СЖК. Максимальные значения экстинкции получены при концентра-щи беЛка 10 мкг/мл. Увеличение концентрации антител не приводит к уве-[ичению шгтенсивности реакции, что. по-видимому, связано с простран-твенными затруднениями при сорбции антител к ГСЖК на полистирол.

Для определения оптимального рН иммобилизующего буферного детвора мышиные моноклоналыше антитела к ГСЖК в концентрации 10 1кг/мл разводили в 0,01 М цигратных буферных растворах, фосфатных бу-

ферных растворах, карбонатных буферных растворах рН от 4,0 до 10,5. Максимальные значения зкетинкции получены при рН 8,5 и 9,5. В дальнейшей работе в качеств^ комплексирующего использовался карбонатный буферный раствор рН 9,5, поскольку реакция при этом значении протекает более интенсивно.

Оптимальный температурный режим и время иммобилизации связывающего агента определяли при+4°С и при +37°С в интервале от 1 часа до 24 часов. Установлено, что максимальные значения экстинкции получены при 3-часовой сорбции МонАТ при +37°С. Однако, учитывая возможность энзиматической инактивации антител, их иммобилизацию на полистироловых планшетах целесообразно проводить при +4°С в течении 16 часов.

Для построения калибровочной кривой использовали препарат положенного нами сывороточного гонадотропина жеребых кобыл с удель-ь jh активностью 10000 IU/мг, титруя его кратно двум, начиная с концентрации 4 мкг/мл, или 40 IU/мл.

3.6. Применение ИФА для количественного определения гонадотропина в сыворотке крови жеребых кобыл.

Лабораторные испытания иммуноферментной тест-системы проводили на образцах сыворотки крови, полученных от 97 жеребых кобыл с различными сроками жеребости. В качестве контроля использовали сыворотку крови жеребца. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Из таблицы видно, что наименьшее увеличение концентрации гона-дотропного гормона в крови жеребых кобыл, по сравнению с холостыми, наблюдается на сроках о 35 по 40 день. Содержание гонадотропина возрастает начиная с 60 дня жеребости, достигая максимальных величин на 70-90 дни жеребости. Снижение количества гонадотропного гормона отмечается в сроки с 110 по 130 и с 130 по 150 дни: 4,5 ± 0,79 и 1,31 ± 0,09 мкг/мл соответственно.

Таблица 7

Уровень гонадотропного гормона в СЖК в зависимое! и от срока жеребости (п=7)

Группы по сро- Кол-во жи- Средний уровень Средний уровень

ку жеребости вотных ГСЖК, мкг/мл биоактивности,

IЬ'/мл

35-40 дней 12 2,15 + 0,7 22

45-60 дней 15 5,31 ± 1.02 53

60-70 дней 10 7,74+1,79 77

70-90 дней 24 9.2+ 1.68 92

90-110 дней 17 6,3 ± 1.0 63

110-130 дней 12 4.5 + 0,79 45

130-150 дней 7 1,31 +0.09 13

холостые кобы- 60 ' 0,05 +.0,01 0

лы

Гормональная активность выборочных образцов сывороток жеребых собыл, исследованных в ИФА, была оценена также в биотесте на инфант-шх самгах крыс, что продемонстрировало практически полное соответ-гтвие результатов иммуноферментного анализа результатам бнопробы.

На основании экспериментальных исследований установлено, что разработанная нами иммуноферментная тест-система количественного определения гонадотропного гормона в СЖК, позволяет полноценно заме-пгть трудоемкие бнотесты определения гормональной активности проб ГЖК, что очень важно в условиях производства при комплектовании коммерческих серий СЖК, сократить этим брак и повысить качество препарата: оперативно проводить коррекцию технологических процессов на раз-шх стадиях очистки гормона.

22

ВЫВОДЫ

1. Разработан высокоэффективный способ выделения гонадотропноп гормона из сыворотки крови жеребых кобыл методом хроматофокусирова ния на ПБИ-94, позволяющий получить препарат с гормональной актин ностыо 7000 Ш/мг с минимальным содержанием примесей сывороточны белков.

2?Метод иммучосорбции на СЫВг-сефарозном сорбенте с иммобилизован ными антителами к белкам сыворотки крови жеребца обеспечивает полу чение высокоочищенного гонадотропного гормона СЖК с активности 10 ООО Ш/мг.

Аффинно очищенный препарат гонадотропного гормона позволяе получать моноклональные мышиные антитела к нему.

3. Установлено, что моноклональные антитела клонов А9, В7, С12 взаимс действуют с высокоочнщенным гонадотропным гормоном СЖК и ангин нами сыворотки крови жеребых кобыл, и не взаимодействуют с сыворс точными белками жеребца.

4. Все полученные моноклональные антитела принадлежат к классу иыы) ноглобулинов в. Это подтверждается тем,что электрофоретнческая пс движность полученных моноклональных антител в ПААГ одинакова соответствует молекулярному весу около 160000, что является характерны значением для О.

5. Содержание специфических антител в каждом из препаратов монокле нальных антител составило 99% от общего содержания белка.

Определена константа ассоциации реакции взаимодействия ГСЖК с Мс нАТ к ГСЖК, которая равна 5,7* Ю8 М-' , что указывает на высокое сро; ство реагирующих макромолекул.

6. Определены физико-химические характеристики выделенного гонаде тропика. Гонадотропный гормона СЖК - это димер с молекулярным вето около 58 кДа. Под влиянием мочевины и меркаптоэтанола димер ГСЖ! расщепляется на две субъединицы с примерным молекулярным весом 23

57 кДа. При диссоциации в ЮМ мочевине с восстановлением на колонке с гефадексом С-150 удается добиться четкого разделения этих субъединиц. Определена нзоэлектрнческая точка очищенного гонадотропного гормона рН 2.0 - 2,2).

К Установлен аминокислотный состав очищенного ГСЖК. Показано, что I его состав в больших количествах входят кислые дикарбоновые амино-сислоты. Особенностью аминокислотного состава ГСЖК является высокое содержание пролина. N-концевые аминокислоты - фенилаланин и серин. С-сонцевая аминокислота - изолейцнн.

8. Углеводный состав гонадотропного гормона представлен всеми саха-зами, которые обычно обнаруживаются в питуитарных гликопротеидных ормонах. Однако, в отличие от других, в нем содержится значительно юльшее количество сиаловой кислоты. Общее содержание углеводов в "СЖК нахо/вггся в пределах от 41,5 до 46,6%.

>. Разработана иммуноферментная тест-система количественного опреде-генил ГСЖК в сыворотке крови жеребых кобыл, позволяющая полностью аменить собой трудоемкие биотесты определения гормональной актив-юсти проб СЖК в практической биотехнологии. Установлено, что совпа-1ение между иммуноферментным методом определения ГСЖК и бно-естом а тавляет 97%.

Практические предложения: . Разработанный метод выделения гонадотропного гормона СЖК хрома-офокуснрованнем на ПБИ-94 с последующей иммуносорбциен на СЫВг-ефарозном сорбенте с иммобилизованными антителами к сывороточным >елкам* жеребца позволяет использовать его для приготовления высоко->чищенных и высокоактивных стандартных препаратов ГСЖК. !. Предложенная иммуноферментная тест-система количественного опре-(еления гонадотропного гормона в СЖК может быть использована для :онтроля потерь гормональной активности в процессе очистки ГСЖК с [елью быстрой коррекции технологического процесса.

3. Учитывая простоту, скорость и информативность разработанной тесг-системы количественного определения гонадотропина в сыворотке крови жеребых кобыл, рекомендовать ее дчя определения гормональной активности при формировании производственных серий СЖК на биофабрикач что значительно повысит качество препарата. Рекомендации по раним" экспресс-диагностике жеребости кобыл одобрены Трестом конных заводов.

Опубликованные работы:

1. Выделение гонадотропного гормона из сыворотки жеребых кобыл. Тезн сы доклада на Всесоюзной научно-технической конференции молодых уче ных "Актуальные вопросы профилактики и лечения болезней сельскохоэяй ственных животных", 1985 г., Москва, стр. 65-66.

2. Иммуноферментный метод диагностики жеребости кобыл. Тезисы до кпдда на Всесоюзной научно-технической конференции молодых учены? ' Актуальные вопросы профилактики и лечения болезней сельскохозяй г-венных животных", 1985 г., Москва, стр. 189-190. (Соавторы В.А.Гуревич).

3. Определение жеребости кобыл по изменению уровня сывороточного го надотропина в крови. Тезисы доклада на Международной конференцш "35th Annual Meeting of the EAAP". 1984, Гаага. (Соавторы: И.Ф.Бобылев В.А.Гуревич, Г.А.Ермолин).

4. Экспресс-диагностика жеребости. Журнал "Коневодство и кониьн спорт", № 4, 1987, стр.34-35. (Соавторы: И.Ф.Бобылев, В.А.Гуревич Г.А.Ермолин).

5. Способ выделения гонадотропина из сыворотки жеребой кобылы. Ав торское свидетельство № 1374488, 15.10.1987. (Соавторы: Г.А.Ермолин Е.Е.Ефремов).

6. Рекомендации по ранней экспресс-диагностике жеребости кобыл имму нологическим, газохроматографическим и ультразвуковым методами. Ти пография МВА им. К.И.Скрябина, Москва, 1985. (Соавюры: Б.Ф.Бобылев В.А.Гуревич, Г.А.Ермолин).