Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Способ получения, физико-химическая характеристика и иммунобиологическое действие аминокислотно-пептидного препарата для птиц

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Способ получения, физико-химическая характеристика и иммунобиологическое действие аминокислотно-пептидного препарата для птиц"

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА. И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОЮ ЗНАМЕНИ

академия: сшшжйШственшх наук

ИМЕНИ Б.И.ЛЕНИНА

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА НАУЧВ>-ЙССШОВАШЬСКИЙ • ИНСТИТУТ ЭКМШЕНТАДБНРЙ ВЕТЕРИНАРИИ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ, СЙЗШЗ-ШКЧЕСКШ ХАРАКТЕРИСТИКА. И ШШИБИОЛОБИЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ АКШОККОЮТШ-ПЕПИ'ЩШГО ПРЕПАРАТА ДНЯ ШВД 03»00»04 - биохшин

' ИМЕНИ Я. Р. КОВАЛЕНКО

На драгах рукописи

ВОМШВ МЕШШР АНАТОЛЬЕВИЧ

ХЦК 613:615*5:612.017

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соисканий ученой степени кандидата биологических яаук

Ыосква - 1991

выполнена г лаборатории биохимических методов контроля и стандартизации ветдрепаратов Веесоазаого ордена Трудового ¡фасного Знамени государственного научно-коагрсльного института ветпреда-ратов.

НАУЧНЫЙ РУШЮДИЕЛБ - кандидат биологических наук, ведуний .. научный сотрудник Я.Е.Трусова

НОТНЫЙ ЮКОТЬТШ - заслуженный: деятель науки РСФСР

доктор биологических наук, профессор ' А.Ц. Простяков

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОПШНЕНШ: доктор биологических наук, профессор

ВЖПолякоа /ВИЗЕ/

доктор биологических наук. Р. I. Капаю лгав /1Ш/

В2ОТЕЕ ТЧЕЕЩШЕ! Всесоюзный научно-нссладовательский и техно логический- институт биологической промышленности

Защита диссертации состоится "¿0 " ИОрсьШ 1991 года в Щ часов на заседанш специализированного совета Д 020.28.02. по защите диссертаций на сслсканае ученей стедана доктора яауа при Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институте экспериментальной, ветеринарии иманз Я»Р.КЬваленго

Адрес: 109472, Москва, Кузьминки, ШЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ШЗВ.

Автореферат разослан "30" 1991 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат- бЕслогачесвд. наук

В.В.Амелика

ОЩАЯ Х&РАКГЕРИСГйМ РАБОТЫ

Актуальность теш. Одной из первых отраслей сельского хозяйства, перешедших на промышленную основу, является птицеводство. Промышленная технология все более отдаляет птицу от естественных условий обитания, что способствует снижению резистентности и возникновению заболеваний инфекционного и неинфекционного .характера.

В последние годы проводятся исследования по изысканию биологически активных препаратов, стимулирзтацпс естественную резистентность сельскохозяйственной птицы. Важная роль в этом отводится аминокислотам и биологически -активным веществам пептидной природы.

В связи с этим разработаны различило аминокиелотно-пептидные препараты, получаемый гидролизом'крови человека и животных (И.Р.Пе- ■ тров, Л.Г. Богомолова, З.А. Чаплыгина, 1954; П.Е. Калмыков, Т.Й.Го-лубев, 1956; НЛ. Сйвакоза, 1981).

Эти препарата предназначены в перзуй очередь для использования в медицинской практике,'а объем их изготовления для 1етеринарии незначителен.

До настоящего времени не бшга разработана прошдагенная технология получения аминокислотно-пептвдного препарата в сухой форме, пригодная для использования в птицеводстве.

Первые испытания действия аминокислотно-пептиднюс препаратов на птицу, проведенные в эксперименте, показали положительное их влияние на прирост живой кассы, яйценоскость и другие показатели • продуктивности (Л.С. Колабосая, 1987; К.К. Мовсум-Заде, В.А. Берестов, 1989).

В последние роды накоплен значительный материал, отражающий действие отдельных аминокислот на иммунитет. Показано, что при ферментативном гидролизе.белков образуются пептида, обладающие иммунобиологическим действием (Г.А. Белокрылов с соавг., 1986, 1989;

2.Я. Стан и др., 1988; P. Jolies et al. Д984).

Действие аминокисдотно-пептидных препаратов на иммунитет изучено слабо, что является серьезным препятствием для более дифференцированного и целенаправленного их применения.

Цель к задачи исследований. Целью наших исследований было создание амкнокислотно-пепгидного препарата для птицеводства в сухой форме и изучение его иммунобиологического действия.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

- изучить биологическую полноценность сырья к определить оптимальные условия его гидролиза, обеспечивающие максимальный выход активных компонентов;

- разработать технологи) получения препарата б сухой форме;

- определить его биохимические свойства и предложить методы контроля;

- изучить действие препарата на показатели естественной резистентности и иммунологической реактивности;

- провести испытания влияния препарата на жизнеспособность и продуктивность птицы и разработать нормативно-техническую документацию.

• Научная новизна. Разработаны оптимальные параметры гидролиза: температура, рН, гидромодуль суспензии, концентрация ферментного материала и экспозиция, позволяющие использовать поджелудочную железу кур,с двенадцатиперстной кишкой и химусом, кутикулу мышечных желудков, железистые желудки птиц б качестве ферментного материала для получения препарата с высоким содержанием свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов.

■ Определены способы высушивания: распыление, контактная сушка, обезвоживание в кипящем слое с напылением на комбикорм, приемлемые для получения аминокислотно-пелтидного препарата в сухой форме и впервые проведена их сравнительная оценка.

Показано, что в сухом препарате содержится 18 аминокислот, в том числе все незаметные для птицы, преимущественно низкомолекудлр-ные пептида с молекулярной массой от 500 до 1000 Д, причем э же составе обнаружено Еысокое содержание иммуноаятивных аминокислот, таких как глутаминовая, аспарагиновая, аланин и валин.

Предложен способ применения препарата, обеспечивающий повышение неспецифической резистентности цыплят з течение первого месяца яизни, когда резистентность птицы находится на низком уровне.

Впервые показано, что аминокислотно-пептидный препарат, полученный путем гидролиза белкоз крови птицы, обладает стимулирующим действием ка гуморальный и клеточный иммунитет.

Практическое,значение работы. Разработана промышленная технология получения из отходов убойных цехов птицефабрик аминокислотно-пептидного препарата в сухой форме, повышающего сохранность и продуктивность сельскохозяйственной птицы.

Модифицирован метод определения сушарного содержания пептидов ' а биопрепаратах, который может использоваться как метод их контроля.

На основании результатов исследований разработана и утверждена. Главным управлением ветеринарии и БПН0 "Союзптицепром" нормативно-техническая документация на препарат "Азиамин сухой", вкдшчавцая:

- технические условия (на опытнута партия) - 10.07.116-91;

- временную инструкция по изготовлению и контролю;

- временное наставление по применения.

По предложенной технологии получены свидетельства на рационализаторские предложения № 179 от 29 ноября 1950" г. и 3 2 от 27 декабря 1590 г.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работа доложены на X, II а! научных конференциях молодых ученых В ГИКИ детпрепаратоз (IS68-I9S0); на Всесоюзной симпозиуме "Биохимия саль-i саохозяйственных низотных и Продовольственная программа" (Ниев,19£9);

на республиканской научно-производственной конференции "Профилактика и мара борьбы с болезнями молодняка сельскохозяйственных животных (Витебск, 1990); на научно-производственной^ конференция молодых ученых и спэциалистов "Взтвранарвдв проблемы птицэводстза" (Ленинград-Ломоносов, 1990); на Всесоюзной научной конференции "Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов" (Москва, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем я структура диссертации. Диссертация изложена на IIО страницах машинописного текста, вкдочаат введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, вывода и практические предложения. Работа шншетрдрована 20 таблицами я 16 рисунками. Список литературы содержит 218 источников, в тем числе 85 - иностранных. Приложение на 23 страницах.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЗДСВШйа

Материалы и ыатовд. Исходам сырьем для получения аминокислот-но-пептидаого препарата елунызга- кровь комически здоровой птищз или сгустки крови - эржгроцитарная масса (SI), остающаяся посла использования сыворотки дяк производства препарата "Авиглабулин неспвци-фичесяай".

•В качество фзрмзнгного материала использовали подаелудочнуа келазу кур с 12-перстаой хшкой и химусом, кутикулу мышечных желудков и ткани пэдэгястах кэлудаоэ кур.

Перед гидролизов сырье подвергали измельчению на ¡электрической мясорубке JQM-500 н гомогенизации в деструкторе-измельчителе тканей пДГ-0,I.

Высушивание препарата осуществляли на распылительных сушилках !"!анар" фирмы "Кзгро-Атомайзер" (Дания), СРФ-2,5 и ПВ2-0,2-РДб,5-2ССЖ-23 (СССР); дзухвадыюзой атмосферной сушилке СДА.-250; сушиль-

ном аппарате кипящего слоя с напылением на комбикорм, разработанном в НВЦ "Аналаб".

Физино-химические свойства гидролизатов и сухого препарата оценивали следующими методами: pH, общий, остаточный'и аминный азот-по ГОСТ 13805-76; остаточнуа влажность - по ГОСТ 240-61-89 (в сухом препарате); углеводы - методом с тимол-серным реактивом по Schmor (1955); нукяеотиды - епектрофогометрически по A.C. Спирину (1958);1 общие липиды - по методу Zollner (1962); триптофан - методом Нот (1945);. суммарные пептида - методом о биуретовкм реактивом согласно ГОСТ 13805-76 в нашей модификации.

Отделение свободных аминокислот от пептидов проводили лигандо-обменной хроматографией на Oi-сефадексе G-25 (Т.А. Телегина, Т.Е. Павловская, 1975).

Анализ фракционного состава.пептидов в. гидрояизатах и сухом препарате осуществляли мэтодом геяь-фильтрацш па сефадексе g-I5.

Содериание свободных аминокислот и аминокислотный состав пептидов препарата определяли ионообменной хроматографией на автоматическом анализаторе аминокислот KlA-5 фирмы "HitachStfoomra). При этом пептиды предварительно гидролизоваДи по методу Hendez end Lai (1975).

Определение наличия патогенных микроорганизмов в сухом препарате проводили согласно ГОСТ 25311-02.

Испытание препарата на безвредность осуществляла по общепринятой методике.

Исследования по выбору оптимальных доз и схем применения пре-• парата, а также изучения его влияния на естественную резистентность птицы проводили на цыплятах яичного направления, (моюдках) кросса-"Беларусь-9" и цыплятах-бройлерах кросса "Бройлер-б" при клеточном содержании в условиях вивария и на Константиновской птицефабрик© Томилинского НПО Московской области.

Для контроля влияния препарата на состояние естественной резистентности птицы, в сыворогке крови цыплят изучали возрастную динамику следующих показателей: бактерицидной активности - по методу О .В. Смирновой и Т.А. Кузькиной (1966); литической активности лизоцима - по В.Г. Дорофейчук в модификации ВНИЗШ (1980}; активности в-лизина - по методу О-В. Бухарина, Б.А. Фролова, АЛ. Луда . (1972); активности комплемента - колориметрическим методом по A.B. ГУставу е модификации ВНИВЙП (1980); активности АсАТ и АлАТ - спек-трофзтомегрическда методом на анализаторе активности ферментов системы Ts фирмы "Bectaian" (США); общего белка - методом Lowry (1953); содержания гамма-глобулинов — методом электрофореза на пленках ацетата целлюлозы; содержания igG- по. методу Манчини в модификации ВНИВЙП (1980). Гемоглобин определяли в крови цыплят геыиглобин-ци-анидным методом.

Влияние препарата на гуморальное звено иммунитета оценивали на модели иммунного ответа мышей на гетерологичные эритроциты. Иммунный ответ оценивали по количеству антителообразутаих клеток (AQK) в селезенке мыши на 5-не Сутки после иммунизации методом локального гемолиза в модификации Cuaniagham . (1965) и титру антител к эритроцитам барана в сыворотке крови мыши на 7-ые сутки после иммунизации в микротесге гемагтлюгинацик.

Влияние препарата на гуморальный иммунитет цыплят оценивали на примере напряженности иммунитета птицы к вирусу болезни Ньюкасла в реакции задержки темагглютинации (КЗГА).

Для изучения действия-препарата на клеточное звено иммунитета, использовали модельные системы, дающие представление о (функциональной активности лимфоцитов Т-ряда - реакцию гиперчувствителькости замедленного типа (ПЗТ) ( y.Ii.Thoizg, а.Ре:ггапгеД980) и реакцию "трансплантат против хозяина" (РГПХ) ( E.E.Emerson, D.P.Trureb.1973).

г

Оценку влияния препарата на жизнеспособность и продуктивность сельскохозяйственной птицы проводили на Томилинском и Щелковском ППО,- ШПЗ "Большевик", Няндомской и Банкирской птицефабриках Птицепрома БСФСР.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Стыэдента с учетом рекомендаций И.П. Ашмарина с соавт.V1971}, Г.Ф. Лакина $990) и XI издания Государственной Фармакопеи СССР.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Разработка технологии получения аминокислотно-пептидного.

препарата

Физико-химические свойства сырья. С целью определения биологической полноценности используемого сырья и обеспечения заданных свойств конечного продукта, были изучены физико-химические свойства крови кур и ЗМ. Исследованное сырье содержало значительное количество белка - 14,47^2,43% (по сырому протеину) - для цельной крови и 21,94^3,67% - для ЗМ. Концентрация сухих веществ составила соответственно 17,3±0,1 и 21,0^0,2%.

Содержание незаменимых для птицы аминокислот (свободных и связанных) , таких как лизин, гистидин, аргинин, треонин, валин, метио-нин, изолейцин, лейцин и фенилаланин в крови кур и ЗМ было соответственно 68,16 и 97,62 г/л, т.е. 56 и 57% от общего содержания аминокислот, что по заключению экспертной группы ФАС/ВОЗ является критерием биологической полноценности исследуемого сырья й позволяет использовать его для производства аминокислотно-пептидного препарата.

Определение оптимальных условий получения препарата. Влияние температуры на процесс гидролиза изучали в широком диапазоне значений от 40 до 70°С при гидромодуле суспензии равном 2. 3 качестве ■ферментного материала использовали поджелудочную делезу кур с 12-перстной кишкой и химусом в концентрации 25%. Оптимальной была температура обеспечивающая максимальное накопление амикногс

азота (6,0-6,1 г/л за 4 часа гидролиза). ..

Для. стабилизации рН в оптимальной области (7,8-8,0) в суспензию добавляли гидрокарбонат натрия в различных концентрациях. Максимальный эффект достигался при-концентрации гидронарбоната н&грия 20 г/л; рН в этом случае через 4 часа гадролйза' составил 7,75, через 24 часа -7,70, а в контроле соответственно 6,90 и 6,20.

Прирост аминного азота при концентрации гидрокарбоната натрия 20 г/л через 4 часа гидролиза составил 0,6 г/л, 24 часа - 0,94 г/л, по сравнен®) с системой без гмдрокарбоната натрия. • 4

Таким образом, стабилизация рН обеспечивала более выеоку® активность ферментов на протяжении гидролиза.'

Для оптимизации условий проведения гидролиза определяли накопление аминного азота при различных соотношениях объема крови к весу ферментного материала. Оптимальным было•соотношение 1:1. При дальнейшам его увеличении до .1:1,2 й вша прирост аминного азота был незначительным. :

Изучение зависи:.>остл выхода активных компонентов препарата от величины гидромодуля суспензии показало,' что чем выше концентрация ферментного материала, тем меньше гидромодуль, при котором достигался максимальный вюсод аминного. азота.

При оптимальном соотношении объема крови к весу ферментного материала, равном 1:1, наилучшими бели следующие значения гидромодуля: 2 - для крови к 3 - для ЗД. Дальнейшее увеличение гидромодуля существенного влияния на выход аминного азота не- оказывало.

Исследования по определению оптимальной продолжительности гидролиза показали, что наиболее интенсивно процесс протекал в течение ■первых 3-4-х часов, при этом накопление аминного азота составило 5,96-6,05 г/л. В дальнейшем, за 20 часов его прирост был в среднем 0,46 г/л, а в последующие 24 часа - только 0,28 г/л.

Содержание пептидов достигало максимума через 3-4 часа и составляло 46-55 г/л. Аминный коэффициент в этот период был в пределах 0,50-0,51.

Получение жидкого гидролизата с более высокой концентрацией аминосодеркалзих компонентов имеет важное значение, так как позволяет увеличить выход препарата при высушивании и одновременно сократить рабочие объемы технологического.оборудования и энергоемкость производства.

Для решения этой задачи в технологический процесс вводили дополнительную стадию гомогенизации сырья до среднего размера частиц

,05 мм. Использование гомогенизации позволило увеличить накопление аминного азота в процессе гидролиза на 10%.

Использование дополнительных источников Ферментов. При организации производства препарата в. условиях птицефабрик имевщихся ресурсов поджелудочной железы птиц может • быть Недостаточно для переработки всей крови. В качестве дополнительного источника ферментов мы использовали ткани железистых •желудков кур или-кутикулу мышечных желудков, являВДиеся отходами убойяых .цехов птицефабрик.

Для достижения необходимой глубины гидролиза его необходимо проводить в 2 стадии. На первой стадии оптимальными условиями1 являются: гидромодуль 2-дня крови кур и 3 - для ЭМ, концентрация тканей железистых, желудков или кутикулы мышечных желудков кур - 7-10%, рН -1,8-2,0, температура - 47£2°С, экспозиция - 12 часов; на второй стадии гидромодуль и температуру не изменяли, гидролиз проводили поджелудочной железой кур с 12-перстной кишкой и химусом в концентрации 8-10%, :рН -'7,8-8,0, экспозиция - 3 часа.

При таком способе гидролиза достигается накопление аминного азота 9,00^0,47 г/я, в 2,раза уменьшается, расход ггодкелудочной железы, однако он более трудоемок к менее производителен, чем одностадийный. . . ' -•'•

Факторы, влияшгие на содержание свободных аминокислот и фрак-•дконны'л состое пептидов б гидролизатах.. В большинстве работ главным критерием оптимальности выбранного режима гидролиза является концентрация аминнэго азота. По нашему.мнению, оценивать процесс ферментативного гидполиэа белка необходимо не только по общему выходу амин-ного азота, но и по содержание веществ, которые определяют назначение готового препарата и, в первую очередь, по уровню аминокислот и низкомолекулярных пептидов.

Установлено, что при использовании в качестве ферментного-материала поджелудочной железы кур с12-персгкой кишкой и хшгусом накопление свободных аминокислот было выше, чем при гидролизе исходного сырья тканями железистых желудков или кутикулой мышечных желудков кур. При этом содержание в гидролизате таких незаменимых для птицы аминокислот как кзолейцин увеличивалось в 5,7-7,6; фенилаленив - в 2.7-3,0; валин - в 2,8-3,9; лейцин - в 2,5;' треонин - в 2,0-2,4; цистин - в 2,0; аргинин - в 1,8 и мегионин - в 1,6 раз.

3 первок случае в гидролизатах преобладали низкомолекулярные пептиды с молекулярной массой (ММ) от 500 до 1000 Д (55,58±3,34%), а также менее 500 Д (35,79*3,35%}; во втором,пептиды с ММ от 1000 до 1500 Д (37,76^2,98%), значительным было в этом случае и содержание пептидов с более 1500 Д (1?,ЗЙ2,45?2).

Исследование влияния температуры на выход свободных аминокислот при гидролизе показало, что увеличение температуры с 20 до 47°С повышало концентрацию большинства аминокислот б гидролизатах в 1,22,5 раза. Одновременно в гидролизатах возрастало количество низко-колекулярных пептидов с Ш менее 500 и от 500 до 1000 Д при снижении доли высокомолекулярных с Ш от IOOO до 1500 и более 1500 Д, что связано с увеличением активности ферментов в температурном оптимуме.

Изучение влияния продолжительности гидролиза и стабилизации pH

на аминокислотный и пептидный состав гидролизатоз показало, что увеличение продолжительности гидролиза приводило к повышения концентрации большинства аминокислот как при стабилизации рН, так и без нее, но в первом случае уровень аминокислот был более высоким. 3 го 'чсе время, после 4-х часов гидролиза происходило частичное разрушение серусодержацих аминокислот - метионина и шгетина.

Что касается пептидов, то на начальном этапе гидролиза (в первые 1-2. часа) образовывались преимущественно пептиды с ММ от 500 до 1500 и более 1500 Д.'В дальнейшем они гидролизовались пептидазами до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот, поэтому к концу 3-го часа наблюдалось увеличение относительного содержания фракция с ¡&1 менее 500 Д при одновременном уменьшении количества пептидов с ММ более 1500 Д, причем при стабилизации рН звшеописан-ные процессы были более выражены.

Таким образом, изучение динамики накопления пептидов и свободных аминокислот з зависимости от продолжительности протеолиза показало, что наиболее интенсивно реакция протекает в течение первых

3-4-х часов, по истечении которых наиболее легко атакуемые пептидные связи практически исчерпаны. Дальнейший гидролиз белка б производственных условиях продолжать нецелесообразно, так как это существенно уменыяает производительность технологической линии л снижает рентабельность производства.

Основные физико-химические свойства гидролизатоз. Сравнительное изучение биохимического состава гидролизатов крови кур, полученных

4-х часовым и 48-часовым гидролизом показало, что содержание в них пептидов (35,0*2,0 и 31,0*1,0 г/л) и углеводов (1,2*0,1 и 1,1*0,1 г/л' достоверно не отличалось. При этом концентрация общего, остаточного

и аминиого азота, а также липндов (0,50*0,01 и 0,80*0,01 г/л) была несколько зыше в 48-часовом гидролизате, а белка (3,7^0,2 и 1,9*0,1 г/

и нуклеотидов (8,9^0,4 я 6,2±0,3 г/л) - в 4-х часовом гидролизате. Коэффициенты протзолиза и.аминные коэффициенты в обоих случаях отличались незначительно.-Полученные данные еще раз подтверждают целесообразность использования в производственных"условиях 4-х часового гидролиза.

Сравнительный анализ содержания свободных аъйнокислот в полученных нами гидролизатах и таких коммерческих препаратах как гид- . ролизин Л-103, аминотаптид-2 и гидропрот показал, что концентрация лизина, аспарагановой кислоты, треонина, глучаминовой кислоты, аланина, вазшна, изолейцина и лейцина в гидролизатах крови кур была значительно выше, чем в этих препаратах.

Все вышеизложенное доказывает высокое, качество порченных гидролиэатов и их приторность для производства аминокислотно-пеп-тидного препарата в сухой форме. ..

Фильтрация и высушивание. Гидролизаты фильтровали через капроновое или' металлическое сито с диаметром ячеек 0,5-1,0 мм и ва-тно-марлевый фильтр. При необходимости достижения более высокой степени очистки^ получанный фильтрат подвергали осветляющей фильтрации на нутч-фильграх через мезгу различной плотности»

Высушивание гидролизатов проводили тремя способами г распылением, контактной с устной и в кипящем слое в напылением на комбикорм.

При высушивании распылением оптимальной была температура воздуха на входе 145-150°С и выходе - 75-80°С. При более низких температурах существенно снижалась производительность сушки и увеличивалась остаточная влажность сухого продукта. Повышение темпера-

туры воздуха на входе до 185°С приводило к частичному разрушению " серусодержащих аминокислот: метионина и цистина.

Высушивание распылением, наряду с положительными качествами, такими как высокая производительность, однородность получаемого продукта, имеет и ряд недостатков: высокая стоимость сушильных установок и их большие размеры, требующие для своего размещения значительных производственных помещений. .

Высушивание конгактным методом проводили на двухвальцовой

►а

атмосферной сушилке при давлении пара в вальцах 4,558- 10 Па. Сушильные установки этого типа имеют небольшие размеры и менее высокую стоимость, чем распылительные, причем не требуется фильтрации гидролизата перед сушкой. Однако получаемый•продукт неоднороден и требует дополнительного измельчения, а процесс высушивания достаточно энергоемок.

Высушивание в кипящем слое с напылением на комбикорм обеспечивало наиболее эффективное и удобное получение, хранение и применение препарата е условиях птицеводства. В качестве носителя при сушке использовали гранулированный комбикорм или пшено, при этом на каждый килограмм комбикорма напыляли 10 л гидролизата. Оптимальной была температура воздуха на входе П0-П5°С, выходе- 70-80°С, внутри сушильной камеры- 48-55°С.

Полученный в сухой форме аминокиелотна-пептидный препарат из крови кур и ЭМ получил название "Авиамин сухой". На рисунке I представлена принципиальная схема основных этапов получения этого препарата. Данная схема легла в основу технологических линий по производству авиамина сухого на птицефабриках "Башкирская", "Благовар-ская " и "Няндомская".

?ис. I. Схема производства прет para "Авиамин сухой"

2. Физико-химические свойства препарата "Авиамин-сухой".

Данные по физико-химическому составу препарата представлены в табл. I.

Таблица I

Физико-химические свойства препарата "Авиамин сухой"

(х Р«0,05)

Способ_Еысгшивани^_

Контактная сушка

п= б

г кипящем слое с напылением на комбикорм г= 9

I. рН 5,43 + 0,20 6,23 + 0,50 5,80 + 0,07

2. Выход стаого препарата, г/л 67,6 + 6,4 70,8 + 6,2- -

3. Остагоч. влажность, % 4,76 + 0,38 - 5,02 + 0,40 3,83 + 0,56

4. Общий азот, % 13,16 + 0,13 13,06 + 0,25 4,42 + 0,38

5. Остаточный азот, % 12,71 + 0,27 9,31 + 0,38 3,77 0,31

6. Аминный азот, % 7,76 + 0,22 7,45 0,20 2,24 т 0,12

7. Пептиды, % 40,3 + 1,6 42,7 + 2,5 10,2 + 2,2

8. Белок, % 1,80 + 0,17 2,34 + 0,25 4,08 + 0,59

9. Углеводы, % 1,37 + 0,11 2,01 + 0,20 -

10. Лшиды, % 0,68 + 0,08 . 2,31 + 0,15- 2,67 + 0,37

И. Нуклеотиды, %■ 7,29 + 0,25 7,19 + 0,30 2,89 + 0,33

12. Коэффициент протеолиза 0,96 + 0,01 0,71 + 0,01 0,85 + 0,01

13. Аминный коэффициент 0,59 + 0,03 0,57 + 0,02 0,51 •г 0,02

Такие показатели как. рН, остаточная влажность, общий азот, амин-ный азот, пептиды, нуклеотиды и аминный коэффициент.в сериях препарата, полученных распылением и. контактной сушкой достоверно не. отличались. Содержание белка, липидов и углеводов было несколько ниже в препарате, полученном распылением, по сравнению с контактной сушкой.

Это связано с тем, что во втором случае гидролизат высушивали без предварительной фильтрации.

Концентрация свободных аминокислот в сериях препарата, полученных распылением и контактной сушкой, существенно не отличалась. При зтом все 18 аминокислот, содержащиеся в жидком гидролизате, сохранялись после высушивания.

Наиболее нестабильными при сушке были мегиошн и цистин, однако выбранные режимы и способы высушивания сохраняли 95-97% серусо-деряащих аминокислот.

Изучение пептидного состава препарата показало, что в нем .преобладали пептиды с ММ от 500 до 1000 Д, их относительное содержание составляло 58,46-2,12%. Высоким было в препарате содержание низкомолекулярных пептидов с ММ менее 500 Д - 30,06^2,44%. Пептиды с ММ от 1000 до 1500 и более 1500 Д присутствовали в количестве 10,26^1,56 к 1,17±0,26%.

Исследование аминокислотного состава пептидов препарата показало, что в них в высоких концентрациях содержатся иммуноактивные аминокислоты: глутаминовая в количестве 18,6%, аспарагиновая - 12,6%, аланин - 7,6% и валин - 5,4%.

3. Биологические свойства препарата

Влияние авиамина сухого на показатели естественной резистентности цыплят. Для обеспечения повышения естественной резистентности и продуктивности птицы была проведена работа по выбору оптимальных доз и схем применения авиамина сухого.

Наиболее эффективным оказалось применение препарата в дозе 190 мг/кг ежедневно однократно с кормом в течение 10-30 и 60 дней в различные сроки откормочного .периода. Применение препарата цыплятам-бройлерам-в указанной дозе повышало содержание общего.белка и гемоглобина на 60-й день жизни соответственно в 1,3 (Р<0,001) и 1,2

(Р<0,0Г),, бактерицидную активность сыворотки крови - в 2. раза (Р<0,001), активность комплемента - в 1,9 раза (Р<0,01), а содержание - в 1,7 раза (Р<0,001) по сравнению с контролем. Максимальный прирост живой массы-цыплят-бройлеров наблюдали при применении препарата з дозе 190 мг/кг в течение 30 и 60 дней лизни (соответственно 187 и 326 г/гол).

Известно, что естественная резистентность цыплят в течение первого месяца жизни находится на низком уровне. Дяя ее повышения в течение всего критического периода препарат назначали ежедневно однократно с кормом в дозе 190 мг/кг в первые пять дней жизни цыплят и с 18-го по 22-й день.

Таблица 2

Динамика биохимических показателей сыворотки крови цыплят при применении авиамина сухого

(х ± вх; а=Ю)

Группы цыплят

:Воз- _Биохимические показатели___

:раст .':общий"бе-:гаглма-глооу-Тактйзность :актйвность :в днях:лок, г/л :лины, г/л :АсАТ, :АлАТ,

: : : :мкмось/мин"л :мкмоль/мин*л

Опытная 8 28,1*0,4х 7,4*0,2ХХХ 256,0*3 .г50051 11,0*0,7^

Контрольная 25,3*0,7 5,6*0,2 210,0*3,5 5,0*0,4

Опытная 18 32,9*1,1 8,5*0,2 278,0*6,8 7,0*0,7х

Контрольная —"я. 31,9-1,1 8,0*0,2 273,0*5,7 5,0*0,4

Опытная 23 35,6-1,4 9,3*0 .З^* ' 336,0*7,3х 9,0*0,7х

Контрольная 32,5*1,1 7,0*0,3 316,0*5,9 7,0*0,4

Опытная 38 39,7-1,4 10,6*0,б*** 2С2,0*4,7ХХ 3,0*0,1^

Контрольная 37,4-1,4 . 7,7*0,3 179,0*4,9 4,0*0,3

Примечание здесь и далее: х - Р4_0,05; хх - Р„$0,01; ххх - Р^0,0С в сравнении с контрольной группой.

Изучение динамики общего белка, гамма—глсб\глинов, лизоцима, бета-лизина , комплемента, бактерицидной активности сыворотка крови, активности АсАТ я АлАТ з течение первого месяца жизни цыплят показало, что применение препарата обеспечивало повышение естественной резистентности птицы в этот период (табл. 2, рис. 2).

Вяияние авиамина сухого на иммунологическую реактивность. Исследование влияния препарата на гуморальное звено иммунитета показало, что он стимулирует образование антителообразуших клеток (АОК) в селезенке мыши и синтез гемагглютининов. в крови. При однократном введении препарата максимальная стимуляция АОК (в 1,9 раза) наблюдалась в дозе 100 мг/кг (Р<0,001), при пятикратном - в .дозе 0,1 мг/кг (в 1,8-раза, Р<0,001) (табл. 3).

Таблица 3

Показатели гуморального Иммунитета мышей при введении различных доз авиамина

(х ±,

.= 20)

т-у^-пд :Доза пре-:Кратность:___ показатели июдгнного_ответа___

группа :парата, ¡введения количество**ШГ~ .: о5ратный-титр : мг/кг

животных

¡препарата: на селезенку

гемагГлютининов

Контрольная 81000-2500' 34,0±2,1

Опытная 0,1. Однократно ' 40400-Ю20Х5ЭС 32,8^2,0

То же ■ 1,0 ' То же ЮЬООО^ОО*3*.. 96,7±7,1яас

п 10,0 Ю8000±4200ххх

и 100,0 154000^6200ххх гбб.о^гг.е3^

Контрольная — 73920^2450 32,4^3,1

Опытная 0,1 Пятикратно 133340-2400ххх

То же 1,0 То же 84240^2370хх аг.б^д30®

10,0 — 70200^2480 50,3*4,6**

100,0 ' 66960-1800х 39,0*2,9

Увеличение дозы препарата до 100 мг/кг при пятикратном введении приводило к понижению, показателей иммунореактивности опытных тавотных.

Таким образом, проявлялась выраженная дозозависимость иммунологической активности, авиамина сухого.

При изучении влияния авиаыина на гуморальный иммунитет цыплят установлено, что.препарат оббспечнвал-повышение.напряженности иммунитета птицы к вирусу болезни Ньюкасла при'плановых вакцинациях на птицефабрике. Прй этом максимальный титр гемагглютининов в сыворотке крови цыплят, получавших препарат, составил 1:128, а в контроле -1:32. ;

Что касается клеточного звена иммунитета, то препарат в дозах 1,0; 10,0 и 100,0 мг/кг увеличивал активность Т-лимфоцигов, участвующих в реакции ГЗТ; при этом авиамин более сильно влиял на сенсибилизированные клетки на стадии активации Т- клеток и формирования повышенной чувствительности (после сенсибилизации), где он проявлял активность уже в дозе 0,1 мг/кг (Р<0,05) (табл. 4).

.Таблица 4

'Показатели клеточного иммунитета мышей

при введении различных доз авиамина _ +

\х — £ ^, —— то)

Группа :Доза препа-: Время введения :Индекс

животных ■ :рата, мг/кг:- препарата :реакции

Реакция гияерчувствительносги замедленного типа. (ГЗТ)

Контрольная - - 9,5^0,9

Опытная , 0,1 ' До сенсибилизации 12,3-1,2

То же 1,0 То же 12,5±0,9х

' 10,0 ' 1&,3^.1дзасх

100,0 -"- ' . 17,2^1,8^

Контрольная - -

Опытная 0,1 . После сенсибилизации 12,4±1,0Х

Тоже 1,0 'Тоже. 15,9±0,

10,0 -"- к^о^э33*

100,0 17,^З^ ■

Реакция "трансплантат против хозяина" (ЕГПХ)

Контрольная - • . - 6,1-0,4

Опытная 0,1 ' Совместно с трансплантацией 6,4-0,5

Токе 1,0 '' клеток^ же б,4±0,6

10,0 • 7,2±0,3Х

100,0 7,4-0,4х

В дозах 10,0 и 100,0 мг/кг препарат вызывал повышение индекса РШХ у подопытных'мышей (Р<0,05) (табл. 4)..

Таким образом, авиамин обладает имвдтости^глиругадими свойствами в отношении,гуморального и клеточного иммунитета.

4. Влияние авиамина на жизнеспособность и продуктивность сельскохозяйственной птицы

При испытании аминокислотно-пептидного препарата в птицеводческих хозяйствах установлено, что он является эффективным средством улучшения роста, повышения продуктивности и сохранности птицы. Применение его вызывало увеличение сохранности птицы в среднем на 0,5%, живой массы цыплят-бройлеров - на 14,7%, яйценоскости кур-несушек -на 5,5%.

3 зависимости от различных условий: типа хозяйств, технологии выращивания птицы, способа применения препарата, экономический эффект для цыплят составил 7,4-11,7 коп/гол, кур-несушек - 34,043,0 коп/гол.

ВЫВОДЫ

1. Определены оптимальные условия гидролиза белков крови кур, обеспечивающие получение аминокислотно-пептидного препарата из отходов переработки птица: гидромодуль суспензии 2 - для крови кур и 3 - эритроцитарной массы; концентрация поджелудочной железы кур с 12-перстной кишкой и химусом 20-25/5; рН - 7,8-8,0; температура -47*2°С; экспозиция - 4 часа.

2. Обоснована возможность использования кутикулы мышечных желудков и тканей железистых желудков кур в качестве дополнительного источника ферментов для получения аминокислотно-пептидного препарата.

3. Определены "способы высушивания: распыление, контактная сушка, обезвоживание з кипящем слое с напылением на комбикорм, приемлемые для получения аминокислотно-пептидного препарата в сухой форма и проведена их сравнительная оценка. Наиболее перспективным является высушивание з кипящем слое с напылением на комбикорм, обеспечивающее эффективное и удобное применение и хранение препарата в птицеводетзе; при этом температура воздуха на входе должна быть П0-115°С, выходе -

70-80°С, в сушильной камера - 48~55°С.

4. Б&зработана промышленная технология получения ашнокислотно-пептидного препарата в сухой форме. Определены методы контроля и нормативно-технические требования к препарату, обеспечивающие его стандартность и качество.

5. Установлено, что авиамин сухой содержит 18 свободных аминокислот, в том числе все незаменимые для птицы, пептиды, нуклеотиды, липиды и углеводы. 3 препарате преобладают низкомолекулярные пептида

с О от 500 до 1000 Д, причем в их составе обнаруязка высокая концея- ' грация иимунсактивных аминокислот: глутекикозой, аспарагкнозой, ала— нина и валина.

6. Показано, что препарат повышает естественную резистентность-цыплят. При втом достоверно увеличивается содержание общего белка, IgGJ гаыма-глобулиноа, бактерицидной активности, активности лизоци-ма, комплемента, бета-лизина, АсАТ, АлАГ в сыворотке крови и гемоглобина в крови цыплят.

7. Установлено, что авиамин сухой обладает стимулирующими свойствами в отношении гуморального я клеточного иммунитета. При однократном введении препарата максимальная стимуляция А0Н наблюдается'

в дозе 100 иг/кг, при пятикратном - ОД иг/кг. В реакции ГЗТ авиамин проявляет-более васокуи активность при введении его на .стадии активации Т-клеток и формирования повышенной чувствительности. Б дозах 10,0 и 100,0 мг/кг препарат повышает индекс FTTDC у лабораторных ки-зогных. Применение препарата вызывает повышение напряженности иммунитета цыплят к вирусу болезни Ньядеасла.

8. Для промышленного птицеводства предложен аминокислотно-пеп-гпдный препарат з сухой форме, обеспечивающий улучшение роста, повышение продуктивности и сохранности птицы. Применение его вызывало увелэтоние сохранности птица в среднем на -0,£Й, живой массы цыплят-бройлеров - на 14,7%, яйценоскост;: кур-несушек - на 5,6%.

- 23 -

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Обоснована возможность использования отходов убойных цехов птицефабрик (крови,' поджелудочной железы с 12-перстной кишкой и химусом, кутикулы мышечных желудков и тканей железистых желудков птицы) в качестве сырья и ферментного материала для производства амино-кислотно-пептидных препаратов.

2. Разработана промышленная технология получения аминояислотно-пелтидного препарата для птицеводства в сухой форме.

3. На основании проведенных исследований разработана и утверждена ГУВ и ВПНО "Союзптицепроы" нормативно-техническая документация на препарат "Авиамин сухой", включающая:

- технические условия (на опытнув партию) - 10.07.1X6—91;

- временную инструкций по изготовлению, и контролю;

- временное наставление по применению.,

4. По предложенной технологии получены свидетельства на рацио- нализаторские предложения № 179 от 29 ноября 1990 г. и № 2 от 27 декабря 1990 г.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Комаров A.A. Анализ стинулирувщего действия препаратов ави -глобулин неспецифический и авиамин на резистентность цыпляг//Приме-нение химиотерапевтических препаратов в ветеринарии и разработка методов их контроля/ Сб. науч. тр. ВГНКИ ветпрепаратов. - М., 1989. -С. 83-87.

2. Цыганкова С.И., Комаров A.A.. Физико-химические свойства сухой' формы препарата авиамин // Там же. - С. 120-125.

3. Комаров A.A., Трусова Л.И. Препарат авиамин для повышения резистентности и продуктивности сельскохозяйственной птицы // Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка с/х животных. Тезисы докладов республиканской научно-производственной конференции. - Минск, 1990. - С. 153-154.

— 2А - -

4. Трусова Л.И., Комаров A.A., Простяков А.П. Белковые препараты для профилактики заболеваний молодняка птицы // Там же. -С. 155-156.

,5. Комаров A.A. Биохимические свойства препарата "Авиамин су, хой" // Ветеринарные проблемы птицеводства. Тезисы докладов научно-производственной конференции молодых ученых и специалистов. - Ленинград-Ломоносов, 1990. - С. 64-66.

6. Эффективность препарата авиамин / A.A. Комаров, С.И. Цыганкова, Л.К. Трусова, Л.С. Колабская, H.A. Попова/УПтицеводство. - 1990. -К- 12. -С. 29-31.

7. КомароБ A.A., Простяков А.П. Изучение иммуностимулирующего действия белковых гидролизатов // Доклады ВАСХНИЛ. - 1991. - № I. -С. 47-50. /

В. Получение, свойства и применение препарата "Авиамин сухой"/ A.A. Комаров, А.П. Простяков, С.И. Цыганкова,'Л.И. Трусова // Бете-, ринария. - 1991. - № 4. - С. 52-55.

9. Телишевская Л.Я., Комаров A.A. Разработка метода контроля бактериальных питательных сред и гидролизатов по содержанию полипептидов // Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов. Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции. -Москва, 1991. - С. 239-241.

заказ !i 441 Тира-.: ЮС Деч.л.1. ХЦ."

ЦНТИ 1991