Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пептидсодержащий препарат "Пептидамин", его свойства и применение

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Пептидсодержащий препарат "Пептидамин", его свойства и применение"

) г ДО* "

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я. Р. КОВАЛЕНКО

На правах рукописи

МАКСИМЮК Николай Несторович

ПЕПТИДСОДЕРЖАЩИЙ ПРЕПАРАТ «ПЕПТИДАМИН», ЕГО СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов МСХ Российской Федерации.

Научный руководитель — Заслуженный деятель науки Российской Федерации, действительный член Нью-йоркской академии наук США, доктор биологических наук, профессор А. П. Простяков

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Р. В. Боровик (Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (НИЦ ТБП)

кандидат биологических наук Г. И. Устинова (ВИЭВ)

Ведущее учреждение: Московская ветеринарная академия имени К. И. Скрябина

Защита диссертации состоится « » ^^¿сьЪх, 1993 года в /V часов на заседании специализированного совета Д 020.28.02. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я- Р. Коваленко.

Адрес: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан « & » 1993 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Г. А. Трондина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Поиски путей снижения заболеваемости, улучшения продуктивности сельскохозяйственных животных и качества получаемой от них продукции привели к изысканию биологически активных препаратов: специфических юмуностимуляторов, а также препаратов, стимулирующих естественную резистентность животных и птиц, особенно молодняка раннего возраста. Важная роль в этом отводится иммуномодуляторам пептидной природы.

В настоящее время в нашей стране и за рубежом разрабатываются различного вида технологии по переработке непищевого бе-локсодержащего сырья, обеспечивающие получение кормовых добавок, высокоактивных в биологическом отношении. Наибольший интерес в этом плане представляют препараты, полученные путем ферментативного гидролиза белков, результатом которого являются продукты высокой биологической ценности - аминокислоты и пептиды.

Разработаны различные аминокислотно-пептидные препараты, получаемые ферментативным гидролизом крови животных и птиц, тканей внутренних органов и мышц, белков молока и т.д. Эти гидролизаты используют непосредственно в виде добавок к пищевому рациону животных, а также в качестве аминокислотно-пептидной основы питательных сред для культивирования микроорганизмов или перевиваемых клеток при создании специфических препаратов (Н.П.Сивакова, 1981; А.Д.Чудинова, 1986; Л.А.Булашова, 1988; Н.Г.Шептун, 1989; А.П.Простяков, Л.Я.Телишевская, 1989; А.А.Комаров, 1991; К.Род-ригес Ыартинес с соавт., 1993).

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в этом направлении, актуальной остается проблема получения гидролизатов с заданными свойствами.

Исследованиями последних лет изучено влияние аминокислотно-пептидных препаратов на обмен веществ животных, их дезинтоксика-

ционные и плазмозамещающие свойства, лечебно-профилактическое действие при различных патологических состояниях организма, а также действие на иммунитет (П.С.Васильев, В.В.Суздалева, 1982; Г.А.Белокрылов с соавт., 1986, 1989; Д.С.Колабская, 1987; Е.Я. Стан, 1968; К.К.Мовсум-Ззде, В.А.Берестов, 1989; А.А.Комаров, А.П.Простяков, 1991; T.Parker et al, 1984; P.JolleB et al, 1984; C.J.Heijnen et al, X988).

Однако роль и значение пептидов из состава белковых гидролизатов изучены еще недостаточно. Поэтому все большее значение приобретает изучение биологически активного действия отдельных компонентов гидролизатов, что важно для создания новых пептидных и аминокислотно-пептидных препаратов для лечебных и профилакти-чесих целей.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлось разработать способ получения гидролизатов из белкового сырья животного происхождения с применением различных протеоли-тических ферментов, изучить биохимический состав и биологическую активность аминокислотно-пептидных препаратов с учетом их целевого назначения.

В связи с этим необходимо было решить следующие частные задачи:

- определить оптимальные условия гидролиза белоксодеряиицего сырья при использовании различных ферментов;

- сравнить полученные гидролизаты по аминокислотному и пептидному составу, и основным биохимическим показателям;

- определить биологическую активность гидролизатов на разных биологических моделях с проведением опытов в лабораторных и производственных условиях;

- разработать и представить к утверждению нормативно-техническую документацию (Н"Щ) на изготовление пептидного препарата

для сельскохозяйственных животных "Пептидамин".

Научная новизна. Иэтодом гель-фильтрации (ГФ) на сефадексе 6 -15 изучен пептидный состав гидролизатов крови, полученных с помощью различных ферментов.

Разработал метод определения биологической активности пептидных фракций из состава белковых гидролизатов на модели тест-штаммов микроорганизмов и показано значение для микроорганизмов пептидов с молекулярной кассой (¡¿.м.) выше 1000 Д.

Методом последовательной хроматографии изучен состав ГФ-фракции с М.м. 1250 Д. Идентифицированы биологически активные пептиды, входящие в состав фракции 1250 Д. Изучен аминокислотный состав этих пептидов. Определено, что максимум биологической активности проявляют гидрофильные пептиды, содержащие большие количества основных аминокислот.

Использованный метод может быть предложен для изучения пептидных компонентов белковых гидролизатов. Сочетание методов гель-фяльтрации, ВЗЖХ в обращенной фазе и хроматографии аминокислот позволяет получить наиболее полную информацию по пептидному составу белковых гидролизатов.

Модифицирован метод определения бактерицидной активности сыворотки крови цыплят при изучении естественной резистентности.

Практическое значение работы. Разработан способ получения пептидно-аминокислотного препарата с помощью щелочной грибной протеазы (протокрин) и определена технологическая схема производства пептидно-аминокислотного препарата пепсиновым гидролизом из отходов производства Московского завода сычужного фермента.

Показано, что препараты глубокого гидролиза (трипсиновые, панкреатиновне) могут быть использованы как аминокислотная основа для бактериальных питательных сред, а также как аминокислот-

но-пептидные добавки при вырацивании молодняка сельскохозяйственных животных.

Препараты частичного гидролиза (пепсиновые, микробнопротеаз-ные, протокриновые) могут быть использованы для получения пептона или как пептидные добавки для бактериальных питательных сред, а также как пептидные препараты для повышения резистентности животных, особенно молодняка раннего возраста.

На основании результатов проведенных исследований разработана и утверждена нормативно-техническая документация на изготовление пептидного препарата "Лелтидамин".

Апробация -работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Ж научной конференции молодых ученых Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (1992); на Всероссийской конференции "Культуры клеток в биотехнологии и ветеринарии" (Москва, ВИЭБ, 1993); на заседаниях Ученого совета и проблемно-методических комиссий ВГНКИ (I99I-I993).

Публикации. По тем« диссертации опубликовано 2 печатные работы и 3 статьи находятся в печати.

(У.-ьрм и структура диссертации. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы и практические предложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 10 рисунками. Список литературы содержит 282 источника, в том числе 92 -иностранных. Приложение на 37 страницах.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

.'¿атериалы и методы. Исходным сырьем для получения гидролиза-тов служили кровь и внутренние органы крупного рогатого скота, полученные с Раыенского мясокомбината. При проведении гидролиза

в производственных условиях (завод сычужного фермента) в качестве сырья использовали отходы производства сыроварения: бараньи сычуги и лизат куриных железистых желудков после извлечения основной массы пепсина.

Кроме того, использованы 3 производственные серии гидроли-затов биофабричного производства (Краснодарской и Приволжской биофабрик).

Для гидролиза применяли следующие ферменты: трипсин фирмы Дифко; панкреатин Московского мясокомбината; пепсин непищевой говяжий Бакинского завода эндокринных препаратов; протосубтилин нейтральный (Г 20х) и щелочной (Г 10х) Ладыжинского завода ферментных препаратов; щелочную грибную протеазу (протокрин) Бердского завода биологических препаратов.

Гидролиз з лабораторных условиях проводили в термостате типа ЗЦ-И25 при оптимуме рН и температура (42+0,5) °С до стабилизации уровня ¡шинного азота. Гидролизуецую смесь нагревали до 95 °С для инактивации фермента, центрифугировали и лиофильно высушивали, используя оублнмационную сушилку СУБ-25 (ВШКИ ветпрэ-паратов).

Гидролиз в производственных условиях осуществляли в вертикальных реакторах (НИИХИШШ, завод сычужного фермента).

Гидролизаты высушивали методом распыления в сушилках "!4шор" фирмы "Ниро-Атонайзер" (Дания) и СРФ - 2,5 (СССР).

Гидролизуемую смесь и сухие препараты анализировали следующими методами: концентрацию водородных ионов (рН) - электрометрически; общий, аминньй азот, пептиды, азот нуклеотидов - по ГОСТ "Гидролизаты панкреатические для бактериальных питательных сред"; остаточную влажность в сухом препарате - по ГОСТ 240-61-89.

Фракционный состав гидролизатов определяли методой гель-фильтрацнн на сефадексе 6 -15 хроыатогрзфгсчзской системы Фарма-

ция-LKB (Швеция),

Фракционирование ГФ-пептидов осуществляли методом ВЭЖХ о использованием обратно-фазовой хроматографии (ХОф) в ион-парном варианте на хроматографе Altex Gradient Chromatograph Itodel 334 с -SA-).

Аминокислотный состав фракций определяли в солянокислотных гидролизатах методом ионообменной хроматографии на автоматическом анализаторе аминокислот KLA-5 фирмы "Хитачи" (Япония).

Высушенные гидролизаты испытывали на биологическую активность на модели тест-штаммов микроорганизмов и в опытах' на цыплятах; пептидные фракции - на бактериальных культурах.

В качестве тест-культур использовали 5 штаммов микроорганизмов: Staphylococcus aureus "Лоссманов"j Shigella flexneri ia Ь51в| Escherichia coli 675 5 Coryiiebacteriim dlphtheroid.es I9II| Streptococcus faeoalle 6783.

Опыты на цыплятах проводили при клеточном содержании в условиях вивария ВГОКИ ветпрепаратов, птицефермы биобазы Черновицкого госуниверситета; на молодняке сельскохозяйственных животных (цыплятах, поросятах) в хозяйствах Алтайского края.

Действие препарата определяли по показателям роста и сохранности животных, естественной резистентности и клинической картины крови.

В качестве показателей естественной резистентности выбраны, как наиболее информативные, активность лизоцима - по В.Г.Доро~ феЯчуку в модификации ВШВИП (IS80); бактерицидная активность -по О.В.Смирновой и Т.А.Кузьминой (1966) в нашей модификации; содержание белковых фракций в сыворотке крови - методом электрофореза в полиакриламидном геле в приборе фирмы "Рваная" (Венгрия) с использованием количественного анализа диск-электрофореграмм сканированием в лазерном денситометре nitro scan *L фирмы 1KB

с подключением персонального компьютера ОИтеШ 1Г-290.

Гематологические показатели (количество эритроцитов, лейкоцитов, лейкограмма, концентрация гемоглобина, цветной показатель крови) определяли общепринятыми методами лабораторных клинических исследований.

Статистическув обработку полученных результатов проводили по методу Стьюдента с учетом рекомендаций Г.Ф.Лакина (1980) и XI издания Государственной Фармакопеи СССР (1987), РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ I. Разработка технологии изготовления пептидного

препарата (гидролизата) Гидролиз крови крупного рогатого скота разными протеолити-ческими ферментами в лабораторных условиях проводили до стабилизации уровня анинного азота.

Наиболее высокое накопление аминного азота достигалось при протеолизе крови трипсином (681+34,2 их%) и панкреатином (650+ ¿32,8 ыг£). Процесс накопления аминного азота при гидролизе этими протеазаыи увеличивался до II часов, после чего его содержание несколько снижалось.

При гидролиза пепсином уровень аминного азота был наименьшим (190+10,7 ыг^) и стабилизировался к 6-8 часам гидролиза. Добавление 0,5 % панкреатина позволило увеличить содержание аминного азота при дополнительном гидролизе пепсинового гидролизата до 427±22,4 иг#.

При гидролизе бактериальными протеазаыи (протосубтилином щелочным и нейтральным) содержание аминного азота практически достигало максимума и стабилизировалось через 6-8 часов гидролиза.

Бра гидролизе протокрином процесс нарастания аминного азота продолжался до 9 часов, после чего прлгратилсл. Содержание его составляло 550^23,3 иг%,

Гидролиз крови протокрином в условиях НИИХИММАШ проводили при температуре 50 °С и рН 10,0-11,0. Для подщелачивания реакционной смеси в нее вносили суспензии Са( СН)^. После окончания гидролиза рН доводили до 6,5-7,0 концентрированной фосфорной кислотой.

Сычужное сырье (завод сычужного фермента) гидролизовали при условиях, оптимальных для действия пепсина: температуре (45+0,5) °С, рН - 1,7+0,1. Исходный рН устанавливали концентрированной фосфорной кислотой. По окончании гидролиза смесь нейтрализовали суспензией гидроксида кальция.

В результате проведенных исследований установлены оптимальные условия проведения гидролиза, которые легли в разработку технологической инструкции на изготовление препарата "Пептидамин".

2. Характеристика гидролизагов по физико-химическим показателям

Физико-химические свойства экспериментальных серий гидроли-затов. Результаты исследования показателей, характеризующих содержание соединений азота в гидролизатах, а также суммарные данные по аыинокисдотноцу и пептидному составу представлены в таблице I.

Как видно из таблицы I, при использовании для гидролиза трипсина и панкреатина можно получить более глубокий гидролиз (с большим содержанием аминокислот). Остальные протеазы дают выход аминокислот в пределах 10 5&, при более высоком уровне пептидов. В случае двустадийного гидролиза был получен гидролизат с высоким содержанием обеих фракций азота. При этом гидролизаты, полученные с помощью пепсина и панкреатина, щелочной и нейтральной бактериальных протеаз, а также щелочной грибной протеазы (проток-рин&) по содержанию аминного азота соответствовали требованиям ГОСТ 13805-76 на "Пептон сухой ферментативный".

Таблица I

Характеристика гидролизатов, полученных о разными протеазами по содержанию соединений азота, суккэ аминокислот и пептидов, г на 100 г сухого гидролизата (х + s х, п = 4)

I______________ .______________________

Показатели, % | трипсин Iпанкреатин! пепсин !пепоин + tпро?осубтилинIпротосубтклинIпротокрин _ _____________________ нейт^льный J. _1целовдой. _ J______

0бЧкй азот 13,2+0,5 13,8fQ,б 15,3*0,8 15,5+0,8 14,040,7 14,0+0,7 14,7¿p,7 Аминный азот 6,3+0,3 6,3jO,3 2,2+0,1 4,440,2 2,B±Q,I 4,1+0,2 3,6+0,1

^кислот 22,1+1,0 31,6+1,5 1,840,09 19,3*0,9 7,5^0,3 10,3*0,5 10,0*0,5 .

Пептиды 52,8+2,6 52,0+2,5 93,0+4,6 70,0+3,5 78,4+3,9 75,0+3,7 79,2+3,9 ^ Из них о М.м. Д, %

более 1500 5,72 . 7,7 15,5 6,73 18,3 25,5 10,4

X000-1500 18,9 15,2 48,1 45,5 50,0 48,9 53,8

500-1000 42,8 45,5 36,3 32,5 19,8 21,5 22,5

менее 500 32,6 31,3 - 15,1 11,4 3,0 13,0

Аминокислотный анализ показал, что гидролизаты, полученные с помощью трипсина и панкреатина близки по качественному и количественному аминокислотному составу. Содержание аминокислот в них составляло более 20

Наименьшее количество свободных аминокислот содержал пепсиновый гидролизат крови (1,8 %). После дополнительного гидролиза продуктов пепсинного расщепления панкреатином выход аминокислот значительно увеличивался и достигал 19 %.

Аналогичные по аминокислотному составу гидролизаты были получены с помощью бактериальных и грибной протеаз. Содержание аминокислот в них на превышало 10,5 %, аминного азота - 4,1 %.

Исследование гидролизатов на содержание пептидов позволило установить, что в гидролизатах, полученных С помощью трипсина и панкреатина основную массу составляли пептиды с Ы.м. в интервале 500-1000 Д. Достаточно высокий процент имели фракции с М.м. до 500 Д (ди— тетрапептиды).

Пепсиновый гидролизат содержал фракции высоко- и среднеыолв-кулярных пептидов 1000-1500 Д. Олигопептиды (ниже 500 Д) в нем отсутствовали.

заты, полученные с помощью бактериальных и грибной протеаз, имели преобладающее содержание фракций 1000-1500 Д (от 48 до 54 %), однако содержали меньше пептидов с П. и. 500-1000 Д и от I до 4-х фракций олигопептидов. Эти гидролизаты характеризовались довольно высоким содержанием пептидов с М.м. выше 1500 Д, что свидетельствует о неполном расщеплении белков протеазами. При двустадийном гедролизе (пепсин-панкреатин) количество высокомолекулярных соединений резко уменьшалось, однако превалирующей оставалась фракция с И.«» 1000-1500 Д.

Таким образом, с помощью трипсина и панкреатина можно достигать более глубокого гидролиза и получать гидролизаты с большим

содержанием аминокислот, небольшим количеством полилептидов выше 1500 Д, преобладанием фракция с М.н. 500-1000 Д и наличием низкоиолекулярных соединения. Такие гидролизати обчно используются как аминокислотные основы для бактериальных питательных сред.

Гидролизати, получаемые с помощью пепсина и протеаз микроб ного синтеза, по физико-химическим показателям более соответствуют коммерческим препаратам пептонов, используемым в качестве пептидных добавок к питательным средам, а также нормативам на препараты, применяемые для повышения резистентности животных. Они имеют преобладающее содержание пептидов, концентрацию аминокислот в пределах 10 %, аминного азота - 2,2 — 4,1 %.

Использование в качестве гидролизущего реагента щелочной грибной протеазы <протокрина) было нами испытано впервые. Фермент обеспечивал большую глубину гидролиза, чем протосубтилины и в более короткие сроки, чем трипсин и панкреатин. Полученный продукт имел высокое содержание пептидов (79,2 %) и низкое свободных аминокислот {10 %). Гидролизати, полученные о ясмсщьо пепсина и пр ото крина получили название препарат "Пептвдамин".

физико-химическая характеристика производственных серий гидролизатов. Производственные серии гвдрояизатов, полученные с помощью сычужного фермента и щелочной грибной протеазы (про-токрина) практически не отличались по показателя«, регламентируемым для препаратов: {Я, сстатсчзгая влажность, аминный азот, содержание иеятздов.

Результата проведенных исследований были предложены в качества ко^атквяо-техничеекиг требований к препарату "Пептид-ампя" (таблица 2) я включены в ТУ и технологическую инструкцию на производство препарата "Пеятцдашш".

Таблица 2

Нормативно-технические требования к препарату "Пептидамин"

Наименование показателя

I Характеристика и нормы

Сухой аморфный порошок

Соломенно-желтый до коричневого

Характерный без гнилостного 6,0-7,5 ... 7,0

70,0

' 1'5 • '' '

Должен быть безвредным Не допускается

Внешний вид Цвет

Запах

Концентрация водородных ионов (рН)

Массовая доля влаги, % не более

Массовая доля пептидов, % не менее

Массовая доля аминного азота, % не менее

Безвредность

Наличие патогенных микроорганизмов

3. Изыскание методов определения биологической

активности пептидов Определение биологической активности гкдролизатов с использованием тест-штаммов микроорганизмов. С целью определения биологической активности гидролизатов для микроорганизмов Из них готовили растворы о содержанием £50-180 мг$£ аминного азота, рН 7,6-7,8. На полученных средах культивировали 5 тест-штаммов микроорганизмов, Контролем служили бульон Хоттингера из гидролизата, изготовленного отделом питательных сред ВГНКИ и мясо-пептонный бульон с коммерческий пептоном производства Семипалатинского мясокомбината. Рос* бактериальных культур определяли в единицах оптической плотности турбвдиметрически.

При использовании в качестве основы питательной среды наилучшие результаты позволили получить трипсиновый и панкреатино-вый гидролизаты белков крови. Гидролизаты с низкой степенью расцепления были непригодны для этой цели, но обеспечивали хороший :

рост микроорганизмов при применении их в качестве пептидгелс добавок (вкесто коммерческого пептона).

Для идентификации активного ростстимулирующего начала .в гид-ролизатах было проведено препаративное выделение Гф-фракций из трипсин-пашгреатиновнх гздролизатов: I и 2-й - гидролизаты белков крови; 3 и 4-й - гидролизаты мышечных белков. Пептидные фракции ввделяли из расчета 25 иг сухого гидролизата, лиофильно высу-пивади и растворяли в 25 ил среды (I % раствор в расчета на исходный гидролизат). В качестве основы для добавления пептидов брали синтетическую среду 199, содержащую аминокислоты и витамины (факторы роста). Контролем служила исходная среда без добавок. Среда засевали 24-часовши культурами тест-штаммов микроорганизмов в ЖБ и через 20 часов инкубирования турбедиметркчески определяли рост микроорганизмов. Результаты представлены в таблице 3.

Знак "+" в таблице соответствует наличии стимулирования роста в опытной среде в сравнении с исходной (199); "О" - отсутствию достоверных различий; - ингибированип роста в опытных пробах. Пептиды, не включенные в таблицу, оказывали преимущественно ингибирущее действие на рост тест-штаммов.

Из таблицы 3 следует, что стимулирующее действие на рост отдельных тесг-итаммов, в основном, оказывали пептиды с И. и. вше 1000 Д, выделенные из обоих глдролиэатов. Всего из состава каздого гадролизата положительной активностью для изучаемых штаммов обладали 2-4 пептидные фракции. Рост всех испытанных цультур стимулировала фракция с М.и. 770 Д из гидролизата мышечных белков. Одна яизкомолекулярная фракция из гемогндродкзата несколько стимулировала рост стрептококка. В остальных случаях пептиды менее 1000 Д или не влияли на концентрацию микробных клеток в культуре, или оказывали ингибирущее действие. Было отмечено, что пептиды одной и той ие величины, выделенные из

Таблица 3

Влияние пептидов на накопление микроорганизмов в культурах

Пептиды, 1Источник1% содержание! ___Тест-штаымы______-—

.. п Iпептидов!, пептида в ! s.aure- ^fles Е coll. S;diPh".

~~ I 5,7 .+ + + + +

2 4,45 + - + - -

3 Л 5,5 0 + 0 0

4 9,71 + 0 +

более 1500

1430 I 4,45 0 + 0 + +

2 • 5,19 + - + + +

3 ; 9,0 + 0 - 0

4 16,44 - 0 - - -

1350 I 4,7 - + - + +

2 3,95 - 0 + - +

3 3,3 + 0 0 0

4 ' 8,93 - 4 + - 0

1250 I ; 7,6 0 0 0 - -

2 22,5 + + + + +

3 II.I - - + . + - 0

4 12,0 - 0 - - -

1100 I 2,1 - - - - -

2 4,1 + + + 0 .

3 •5,4 + + - - -

- 4 12,5 &■ - 0 - -

980-1020 I 7,0 - - 0 -

2 .15,1 - — - 0 0

3 17,7 - 0 - ■

4 7,46 - - - - -

740 - 780 I 10,3 0 - . + - -

2 6,7 - 0 - + 0

3 1,1 + + + +

4 0,91 - - - - -

350 I 3,7 - - - - «

2 1,1 - - • ш - »

If* I, 2 - гидролизатн белков крови; Ш 3, 4 - гидролизаты мышечных белков^

разных гидролиэатов, не всегда имели одинаковое влияние на накопление микроорганизмов. На этом основании сделали предположение, что биологическая активность пептидов связана не только с их размером, но и с аминокислотным составом.

Изучение аминокислотного состава пептидных фракций гидролиэатов показало, что все фракции гидролизата белков крови характеризовались большим содержанием лизина и аспарагиновой кислоты, чем соответствующие фракции из гидролизата мышечных белков. В некоторых фракциях последнего лизин вообще отсутствовал. При этом пептиды из гемогидролизата были дефицитны по аргинину, метионину и цистину.

Фракции с различными М.м. отличались по набору аминокислот. Весь метионин из мышечных белков выходил во фракциях 1350 и 1250 Д, тирозин - 1350 и 890 Д.

В некоторых пептидных фракциях отмечены отличительные особенности в отношении отдельных аминокислот. Так, концентрации лизина во фракциях 1350 Д из обоих гидролиэатов, фенилаланина во фракции 1100 Д из гидролизата мышечных белков и 1000 Д из гемогидролизата отличались от концентраций остальных аминокислот на 1-2 порядка, фракции 800-900 Д характеризовались высоким содержанием тирозина.

Для более детального исследования биологически активных фракций одну из них (1250 Д из гидролизата мышечных белков) подвергали дальнейшему фракционированию методом В&ЙХ.

Элюирование проводили в градиенте концентрации ацетонитрила с 0,1 % трифторуксусной кислоты: от 0 до 8,4 % за 20 мин и 8,4 -25,2 % (10 мин) со скоростью 2 мл/мин. Детекцию осуществляли в Уф при 214 нм.

Методом ВЭЖ5С фракция 1250 Д разделялась на 24 компонента с различной степенью гидрофобности. Из них пики 2 и 3 по плодах.-»*

в суше составляли 38 %..

Полученные фракции пептидов также лиофильно высушивали и использовали для дальнейших исследовании.

При определении влияния пептидов на рост двух тес¿-штаммов ( Euoherichia coll, Streptococcus faecalie ) установлено, ЧТО ИХ рост стимулировали не все пептиды, входящие в состав фракции и, следовательно, имеющие одну и ту же длину цепи. Максимальное стимулирование обеих культур было получено с пептидами второго пика» Они обеспечивали рост обоих тест-штаммов более высокий, чем сама исходная фракция. На рост е. coli положительное влияние оказывали пептеды 2-8 пиков; s.iaecaiie - 2,5,7,8. Остальные в большей или меньшей степени тормозили рост«

Поскольку все эти пептиды имеют одну и ту се молекулярную массу, различие их действия на рост микроорганизмов мбзшо объяснить содержанием аминокислот в молекулах.

Данные аминокислотного состава ростстиыулируидих пептидов .приведены в таблице 4.. • •

Представленные в таблица 4 данные показали, что годрофпль-ность пептидов 2-го и 3-го пиков объясняется высоквд содержанием основные аминокислот (77 % лизина, 52 % гистидина, 42 % аргинина). Крона того, во 2-м пике выходило около 27 % пролина. В пептидах 4-го пика содержание метионина составляло болео 17 %. Практичзски все остальное количество этой еминокиолош содер.-заяооь в пептидах 7-го пика.

Таким образа? подтвервдено сначвняа вминошуготкого состава пептидов для кх действия на рог? кикрооргашзкоа. 1&кеедум биологической активности проявляли накбодоя пвдрофильныэ пепгцды, в ' частности, содершщие высокие количества основных шэшокяояох, Сги-цулирувдии действием обладали такяо меЕкоиинсодергащиа фракции.

Таблица 4

Аминокислотный состав ВЭЖХ-пептидов М.м.1250 Д, % от содержания в исходной фракции (С = 2,48 %, п=б)

IИсходная 1 Ж? ВЭЖХ-пептидов (пиков)

Аминокислоты} ФР^ЦИЯ,_! ¡дролизата! г ! 3 ! 4 ! 5 ! 6 I 7 1 8

Лизин 140 76,8 6,9 1.2 1.8 1.3 1,6 1.7

Гистидин 180 52,3 29,0 1,6 4,3 1,2 0,3 0,8

Аргинин 220 42,5 41,0 0,5 3,3 0,8 0,8 0,7

Аспарагиновая отс кислота 1,1 1.0 0,3 0,9 0.2 0,3 0,2

Треонин 748 0,8 1,1 0,2 0,6 ■0,2 . 0,3 0,3

Серии 548 0,6 1,4 1,0 1.3 0,2 0,5 0,5

Глутамино-вал кислота 1525 0,9 1,2 0,3 0,8 0,1 0,4 0,3

Пролин 799 26,6 0,3 0,1 0,2 0,7 0,2 0,3

Глицин 819 1,2 2,0 0,7 1,2 ' 1.4 0,7 0,7

Алании 1049 0,9 1.1 0,4 0,8 0,4 0,4 0,3

Цистин следы - - - - - - -

Валин 899 0,3 5,2 0,3 2,8 0,4 1.4 1.0

Мзтионин 420 0,6 0,9 17,2 0,2 0,3 68,6 2,5

Изолейцин 586 0,3 0,4 0,2 0,2 0,3 0,5 0,1

Лейцин 1019 0,3 0,2 0,2 0,2 0,2 0,6 0,3

Тирозин следы - - - - - -

Фенилаланин следы - - - - - - -

Определение биологической активности гидролизатов на цыплятах раннего возраста. Для определения влияния гидролизатов на физиологический статус и неспецифическую резистентность цыплят раннего возраста были сформированы 4 группы цыплят 5-дневного возраста: три опытных и одна контрольная. Опытным группам в течение 14 дней на фоне обычного кормления скармливали гидролизаты, полученные с помощью ферментов: группа I - трипсин, панкреатин (гидролизаты № I и № 2); группа П - протеазы микробного синтеза, проток-рин (гидролизаты Ш 4-6); группа Ш - пепсин (гидролиза* »3), сычужный фермент. Контрольная группа (1У) препарата не получала.

Гидролизаты примешивали к корму в концентрации 50 мг на голову.

Цыплят взвешивали перед началом скармливания гидролизатов и после срока кормления. В 20-дневном возрасте их обескровливали и, полученную от каждого цыпленка,сыворотку исследовали на бактерицидную и лизоцимную активность, а также фракционный состав белков.

Результаты исследований по привесам показали, что наибольший среднесуточный привес наблюдался у цыплят третьей группы, получавших с кормом пепсиновый гидролизат, и был на 2,6 г вше, чем в контроле. У цыплят I и П-й групп соответственно на 0,98 и 1,4 г .выше контрольной (Р<0,05).

Данные исследования бактерицидной активности и активности лизоцима сыворотки крови цыплят отображены на рисунке I.

Как видно из рисунка, максимум бактерицвдной активности {.% угнетения роста тест-культуры E.coli 0^) имела сыворотка крови цыплят Ш-й группы, в то время как сыворотка контрольной группы вызывала стимуляцию роста тест-культуры (бактерицидное действие отсутствовало).

Наибольшая активность лизоцима {% лизиса культуры ¡Догоолэ-uus- iiooicc-ticue) была установлена в сыворотке крови цыплят П-й группы, получавших гидролизаты №№ 4-6 и была достоверно выше, чем в контроле.

Содержание гамма-глобулинов в сыворотке крови цыплят I, II и Ш групп было соответственно в 1,07; 1,14 и 1,25 раза вше, чем в сыворотке контрольной группы (R;0,0I).

Данные, подученные при скармливании цыплятам разных гидролизных препаратов, показали, что наилучшие результаты давали пептидные препараты, т.е. препараты, полученные путем частичного гидролиза: бактериальными и грибной протеазаш; ферментами с пепсинной активностью (г-л!синси и сычужным £эрм8Н?см). Они обеспечивали

Рис.1. Бактерицидная активность (А) и активность лизоцима (Б) сыворотки крови цыплят: 1-Ш - опытные группы; 1У - контрольная группа

более высокие привесы цыплят; максимум бактерицидной активности наблюдался в группе с пепсинным гидролизатом; максимум активности лиэоцима - в группе с микробнопротеазным гидролизатом. Оба пептидных препарата выбывали накопление гамма-глобулинов в сыворотке кро> ви более высокое, чем трипсин-панкреатиновый гидролиз*т.

Испытание пептидного препарата на животных. Препарат "Пептид-ашн" был испытан в широком производственном опыте в хозяйствах Алтайского края и Черновицкой области на молодняке сельскохозяйственных животных (цыплятах, поросятах).

Эффективность препарата определяли по сохранности поголовья, влиянию на увеличение привесов и по гематологическим показателям, также отражающим состояние резистентности организма. Изучалось влияние препарата на организм ослабленных животных.

В таблице 5 представлены результаты исследований действия препарата "Пептидамин" на цыплятах с 5- по 30-дневный возраст.

Таблица 5

Энергия роста, сохранность и гематологические показатели

цыплят-бройлеров после скармливания препарата "Пептидаьмн" (х +ЗХ, п = 300)

Показатели • 1 Контрольная ! Опытная I Р4

______________1_ _ 1 _ 1Кгпйа_ _ 1____

Средняя касса I головы, Г 4?? 0 502,5+9,0 0,05 Среднесуточные привесы, г 16,9+1,2 . 20,1+1,0 0,05

Падеж,_ _ __________15,3__;___5,9_______

Эритроциты, ЛО1^ 2 ,(Ж),09_ 2,3+0,03 ~ ОД

Лейкоциты, ЛО9 25,6+1,2 ' 29,9+1,9 0,2

Гемоглобин, г/л , 83,2+2,2 94,0+1,6 0,05

Цветной показатель 1,15+0,04 ' 1,2(Ж),02 0,05

Лейкограмма крови, % :

Вазофилы 4+0,02 5+0,01

Эоэинсфилы 8+0,06 9+0,02

ядерн2еЫ св™ен,°- ЭТ+0,09 28+0 ,СУ7 .

Лимфоциты 52^1,0 ' 50+0,9

Моноциты ' 9+0,2 8+0,4

Как показывают данные.таблицы 5, применение препарата "Пептид-амин" 5-дневным цыплятам в течение 15 дней способствовало увеличению прироста живой массы у цыплят опытной группы к 30-суточному возрасту на 19 снижению падежа в 2,6 раза в сравнении с цыплятами контрольной группы, а также увеличивало концентрацию гемоглобина и другие гематологические показатели в пределах физиологической нормы, что свидетельствует об интенсификации обменных процессов и повышении реактивности организма цыплят.

Скармливание "Пептидамина" группе ослабленных цыплят позволило снизить их падеж в 17 раз (Р<0,05).

Положительные результаты были получены также-при скармливании препарата поросятам. Применение "Пептидамина" 528 поросятам разного возраста позволило снизить падеж поросят в 3-11 раз и увеличить среднесуточные привесы живой массы в среднем на 30 % (Р^0,05). Ослабленные поросята при 10-дневном скармливании препарата достигали физиологического развития возрастных аналогов.

Таким образом, исходя из вьшеизложенных результатов определения биологической активности препарата "Пептидамин" на животных можно заключить, что пероральное его применение стимулирует резистентность, снижает падеж при увеличении привесов, т.е. благотворно влияет на сохранность и продуктивность молодняка сельскохозяйственных животных (цыплят, поросят). •

Препарат может быть широко применен в животноводстве и ветеринарной практике.

выводы

I. Определены оптимальные условия гидролиза белоксодержащего сырья при использовании различных протеолитических ферментов (трипсина, панкреатина, пепсина, протосубпиинои) и впервые разработан способ получения гидролизатов с помощью щелочной грибной протеаэы (протокрин).

2. Разработала промышленная технология получения пептидного препарата "Пептидамин" из непищевого белоксодержащего сырья. Препарат содержит 79,2 % пептидов (из них 53,8 % - с М.м. 1000 -1500 Д) и 10 % аминокислот.

3. Препараты глубокого гидролиза (трипсиновые, панкреатино-вые) могут быть использованы как аминокислотная основа для бактериальных питательных сред, а также как аминокислотно-пептидные добавки при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных.

Препараты частичного гидролиза (пепсиновые, микробнопротеаз-ные, протокриновые) могут быть использованы для получения пептона или как пептидные добавки для бактериальных питательных сред, а также как пептидные препараты для повышения резистентности животных, особенно молодняка раннего возраста.

4. Разработан метод определения биологической активности пептидов из состава белковых гидролизатов на модели тест-штаммов микроорганизмов и определено, что на рост микроорганизмов стимулирующее влияние оказывают пептиды с М.м. вше 1000 Д.

Максимальной стимулирующей активностью обладали гидрофильные пептиды, содержащие большие количества основных аминокислот, а также метионинсодержащие. пептидные фракции.

5. Предложен метод последовательной хроматографии для изучения компонентов белковых гидролизатов. Использование сочетания гель-фильтрации, высокоэффективной кидкостной хроматографии в обращенной фазе и хроматографии аминокислот позволяет получить наиболее полную информацию по пептидному составу белковых гидролизатов.

6. Применение препарата "Пептидакин" достоверно увеличивало со,дергание общего белка и его гамма-глобуяиновых фракций, бактерицидную активность, активность лизоцима в сыворотке крови; концентрацию гемоглобина и другие гематологические показатели в крови.

7. Пероральное назначение препарата молодняку сельскохозяйственных животных: цыплятам - 1,0 г на кг живой массы, поросятам -3,0 г на кг живой массы способствовало повышению резистентности, увеличению среднесуточных привесов: цыплят в среднем на 18 %, поросят - 30 %', а также снижало падеж: цыплят в 2,6 - 3 раза, поросят - 3 - II раз.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПВДЛОКЕНИЯ

1. Разработан способ получения пептидно-аминокислотного препарата с помощью щелочной грибной прогеазы (протокрина).

2. Предложена технологическая схема производства пептидно-аминокислотного препарата пепсиновым гидролизом из отходов производства Московского завода сычужного фермента.

3. На основании проведенных исследований разработана и утверждена Главным управлением ветеринарии ИЗХ Российской Федерации нормативно-техническая документация на препарат "Пептидамин", включающая:

- технические условия - 10.07-021-92;

- технологическую инструкцию на производство препарата;

- наставление по применению.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Максимюк H.H.,Телишевская Л.Я.,Простяков А.П.,Комаров A.A. Значение пептидов при искусственном культивировании микроорганиз-мов//Доклады РАСХН.-1993.-№ 4.-С.70-73.

2. Максимюк H.H. ,Телшевская Л.Я. .Комаров A.A. Испытание про-теолитических ферментов для получения белковых гидролизатов// Ветеринария.-I993.-№ 7.-С.28-30.

3. Максимюк Н.Н.,Телишевская Л.Я..Комаров A.A. Изучение ростстимулирупцей активности пептццов//Культуры клеток в биотехнологии и ветеринарии. Тезисы докладов конференции.-Москва, ВИЭВ.-1993. - в печати.

4. Максимок H.H. Влияние биологически активных пептидов белковых гидролизатов на воет ыикроорганизмов//Газисы докладов научно-производственной конференции, посвященной 120-летию со дня основания Казанского ветеринарного института им.Н.Э.Баумана.-Казань, 1993,- в печати.

5. Максимюк H.H., Тедииевская Л.Я., Рукавишников A.B. Испытание препарата "Лептидамин" на цыплятах раннего возраста//Сбор-ник научных трудов ВШКИ,- Ы., 1993,- в печати.

Подписано в печать 30. /О.тР-

малое предприятие «петит»

Зак. 6/S Тщ.100