Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состав и биологическая активность пептидного препарата из сердца

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Состав и биологическая активность пептидного препарата из сердца"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

Учетный N 8/3

На правах рукописи Для служебного пользования

Экз. N ^

КАЗАНЦЕВА СВЕТЛАНА ТИХОНОВНА

СОСТАВ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕПТИДНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ СЕРДЦА

03. 00. 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1992

Работа выполнена в НИЛ биорегуляторов Военно-медицинской академии им. С. М. Кирова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ :

член-корреспондент Российской АМН

доктор медицинских наук,

профессор ЯКОВЛЕВ ГЕРМАН МИХАЙЛОВИЧ

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ : доктор медицинских наук,

профессор ХАВИНСОН ВЛАДИМИР ХАЦКЕЛЕВИЧ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ :

доктор биологических наук:, профессор

ЯКОВЛЕВА ЕЛЕНА ПАВЛОВНА доктор химических наук, профессор

ШАТАЕВА ЛАРИСА КОНСТАНТИНОВНА

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ : Санкт-Петербургский химико-фармацевтичейкий институт

Защита состоится "кОсС^А^ 1992 года в /¿'часов на заседании специализированного совета Д. 063. 25. 09. в Санкт-Петербургском технологическом институте ( 198013, г. Санкт-Петербург, Московский проспект, 26).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского технологического института.

Отзывы, заверенные гербовой печатью, просим высылать по адресу института.

Автореферат разослан " " 1992 г.

Ученый секретарь специализированного

совета, кандидат биологических наук / / , Т. Б. Лисицкая

-3-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из актуальных задач современной биотехнологии является создание новых лекарственных препаратов на базе пептидных соединений, которые выгодно отличаются высокой биологической активностью и отсутствием побочных эффектов (Овчинников 1Q А. ,1987).

В Российской Военно-медицинской академии успешно развивается направление, связанное с разработкой и внедрением в медицинскую практику пептидных биорегуляторов (цитомеди-нов), полученных экстракцией из тканей и органов животных по методу В. Г. Морозова, В. X Хавинсона (1981 г.). Согласно выдвинутой гипотезе, цитомедины являются биологическими регуляторами, осуществляющими перенос необходимой для нормального функционирования, развития и взаимодействия клеток специфической информации (Морозов В. Г. , Хавинсон В. X. ,1983; Яковлев Г. М., Морозов В. Г. , Хавинсон EX., 1986). К настоящему времени создан новый класс лекарственных средств, которые находятся на различных стадиях экспериментального и клинического изучения. Одним из перспективных направлений является создание и внедрение в производство биорегулирую-щего органопрепарата, выделенного из тканей сердца крупного рогатого скота-кардиалина, что предполагает решение ряда ряда прикладных задач, связанных с разработкой методов контроля качества его производственных серий по составу и био-огической активности.

Цель работы заключалась в изучении состава, биологической активности, разработке физико-химических и биологических методов стандартизации и технологического контроля комплексного пептидного биорегулирущего препарата из сердца - кардиаяина, для чего были поставлены следующие задачи:

- исследовать состав кардиалина;

- осуществить сравнительный физико-химический анализ кардиалина и других пептидных препаратов (цитомеди-нов), полученных по сходной технологии;

- обосновать и отработать физико-химический метод контроля состава кардиалина в условиях производства;

- разработать модель для изучения биологической активности кардиалина in vitro;

- изучить биологическую активность кардиалина in vitn

- обосновать и разработать метод биотестирования, пр: годный для использования в условиях производства

Научная новизна работы. Впервые с использованием ряд современных физико-химических методов (гель-электрофорез изозлектрофокусирование, высокоэффективная жидкостная хро матография, ионообменная тонкослойная хроматография, амино кислотный анализ) проведено детальное изучение состава кар диалина и других пептидных препаратов (цитомединов),полу ченных из различных органов и тканей животных по сходно технологии. Выполнен сравнительный анализ состава препара тов, выявлены характерные особенности компонентного состав кардиалина.

Проведен сравнительный анализ эффективности различны физико-химических методов фракционирования многокомлонент ных пептидных препаратов и обоснована целесообразность ис пользования метода ионообменной тонкослойной хроматографу, для количественной оценки фракционного состава кардиалина учетом особенностей состава препарата для контроля технолс гического процесса производства кардиалина.

Изучены антиоксидантные свойства кардиалина. Проде монстрировано тканеспецифичное подавление кардиалином пере кисного окисления липидов мембран гомогената ткани серде*-ной мышцы.

Продемонстрирован биологический эффект кардиалина i клеточном уровне,который проявляется в прямом воздейств! на метаболизм кардиомиоцитов, приводящем к увеличению рс зистенгности клеток к дефициту кислорода.

Установлено, что для стандартизации и технологически] контроля биологической активности производственных сер] кардиалина целесообразно использование теста на подавлен] сукцинатдегидрогеназной активности гомогената ткани серде1 ной мышцы крысы.

Практическая значимость работы. Впервые проведен сравнительный физико-химический анализ кардиалина и ряда пептидных биорегулируювдх препаратов. Обоснована целесообразность технологического контроля фракционного состава кардиалина методом тонкослойной ионообменной хроматографии и разработан метод контроля биологической активности кардиалина по его влиянию на сукцинатдегидрогеназную активность гомогенага ткани сердечной мышцы крысы. Выявлены интегральные показатели жизнеспособности изолированных кардиомиоци-тов крысы, которые могут служить критерием биологической активности кардиалина.

Апробация работы. Результаты работы доложены на конференциях: "Роль пептидных биорегуляторов (цитомединов) в регуляции гомеостаза" (Ленинград, 1987)/'Биохимия - медицине. Молекулярные механизмы формирования патологических состояний" (Ленинград, 1988), XI конференции "Изобретательство и рационализация в медицине и медицинской промышленности" ■ (Ленинград, 1988), "Вопросы медицинской экологии и проблемы улучшения здоровья населения Забайкалья и КНДР" (Чита,1989), "Применение современных лекарственных препаратов и медицинской техники на крупных промышленных предприятиях" (Тольятти, 1991); на ЬХ сессии общего собрания АМН СССР (Ленинград, 1990); на Первом российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1992), на симпозиуме "Пептидные биорегуляторы - цитамедины" (Санкт-Петербург, 1992).

Материалы диссертационной работы включены в научно-техническую документацию, представленную в Фармакологический комитет для получения разрешения на клинические испытания простатилена, корт'ексина, ретилина (Протокол N 16 от 18.10. 90 г. заседания Фармакологического комитета МЗ СССР о разрешении клинических испытаний кортексина; Протокол N 3 от 14.02. 90 г. заседания Фармакологического комитета МЗ СССР о разрешении клинических испытаний простатилена; Протокол N 1 заседания Фармакологического комитета МЗ СССР отЮ. 01.90 г. о разрешении клинических испытаний ретилина), а также в на-

учно-техническую документацию, представляемую в Российский фармакологический комитет для получения разрешения на клинические испытания кардиалина.

По результатам работы оформлено 20 рационализаторских предложений и изобретение "Способ оценки биологической активности пептидного препарата из сердца (кардиалина)" (решение о выдаче авторского свидетельства по заявке N 4881468 /14/109270 от 31.05.91), которые внедрены в практику работы НИЛ биорегуляторов Российской Военно-медицинской академии и завода медицинских препаратов ПО "Ленмясокомбинат им. С. М. Кирова".

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 215 страницах машинописного текста, включая 23 таблицы и 53 рисунка ; состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Список литературы включает 283 источника (75 отечественных и 208 зарубежных).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследованиях использованы комплексные пептидные препараты, выделенные из различных органов и тканей животных путем уксуснокислой экстракции по методу В. Г. Морозова и В. X Хавинсона (1981): кардиалин (из сердца), тималин (из тимуса), кортексин (из коры мозга), энцефалин (из белого вещества мозга), эпиталамин (из эпифиза); лиелин (из печени) , кристаллин (из хрусталика), ретилин (из сетчатки).

Экспериментальные исследования проведены на 20 белых беспородных крысах-самцах и 50 крысах-самцах линии №1з1аг массой 120-140 г разводки питомника "Рапполово" АМН СССР.

При исследовании состава кардиалина был использован метод электрофореза (ЗФ) в вертикальных пластинах полиакри-ламидного геля в градиенте пористости геля 10-ZZZ (ЬаеттИ и. К. ,1970). Изозлектрофокусирование (ИЭФ) кардиалина и препаратов сравнения осуществляли на коммерческих пластинах "Ра^рШ^е 1ЕГ 3-9" ("□«", Швеция) на приборе "МиШрИог"

("LKB", Швеция) и в ультратонком полиакриламидном геле на пластинах "PHAST GEL IEF 3-9" ("LKB", Швеция). Для визуализации пептидных зон после ЭФ и ИЭФ макрогели окрашивались СВВ R-250 по методу P. Righetti (1986 ) и нитратом серебра (Sanmons V. ,1980).

Денситометрирование окрашенных СВВ R-250 макрогелей осуществляли на приборе "Densitometer CDS-200" ("Beckman", США) в режиме сканирования при длине волны 600 нм.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) на пластинах "Fixion 50x8" (ВНР) проводили по методу Т. Devenyi et al.(1972). ТСХ на пластинах "Silufol UV-254" осуществляли восходящим методом в системе изопропиловый спирт - уксусная кислота - вода (55:25:20). Тонкослойные хромагограммы окрашивали по методу A. Abbasi et al. (1980) и оценивали количественное соотношение нингидринположительных фракций на приборе "Densitometer CDS-200". Пластины "Fixion 50x8" анализировали в режиме сканирования при длине волны 520 нм, пластины "Silufol UV-254" - в режиме отражения. При проведении анализа состава производственных серий препаратов методом ТСХ рассчитывали относительное содержание фракций в Z и значения Rf для п=3.

Анализ аминокислотного состава кардиалина и препаратов сравнения проводили по методу D. Н. Spacha (1958) после исчерпывающего кислотного гидролиза на аминокислотном анализаторе "LKB 3201" ("LKB", Швеция).

'Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) спиртовых экстрактов кардиалина и препаратов сравнения проводили на приборе "Милихром" (СССР). Элюирование осуществляли линейным градиентом 0.1 % фосфорная кислота - ацето-нитрил (0-50 %). Фракции пептидов детектировали при длине волны 210 нм.

Исследование биологической активности кардиалина в условиях модельной гипоксии проводили с использованием суспензии зрелых толерантных к кальцию кардиомиоцитов крысы (КМ), полученных по методу Bendokize Z. et al. (1985) с некоторы-

ми модификациями (Бабенко А. П. , Самойлов В. О. ,1992). Гипоксию моделировали по методу R. Vemuri et al. (1985) с некоторыми модификациями. Суспензию, содержащую 5 млн/мл КМ, инкубировали в базовой солевой среде в присутствии 1 мМ кальция в атмосфере азот-углекислый газ (95:5) при температуре 37°С. Подсчет концентрации клеток в суспензии осуществляли в камере Роряева.

Для контроля зшэнеспособности КМ проводили подсчет количества включающих трипановый синий клеток в камере Горяе-ва; определяли концентрацию АТФ в клеточных экстрактах, полученных по методу Banay-Schwartz М. et al. (1971), при помогал биолюминесцентных наборов ("Behringer mannheim",ФРГ) на приборе "Bioluminometer 1241" ("LKB", Швеция); определяли активность АлТ, АсТ.ЛДГ, КФК в культуральной среде на автоматическом анализаторе "Spektrum" ("Abbot",США); проводили измерение коэффициента формы (КФ) при помощи оригинальной комплексной установки для регистрации оптического изображения, видеозаписи, интерактивного анализа морфомет-рических показателей и автоматической математической обработки данных, на базе анализатора изображения "АИ-1" (СССР). Цитохимическое определение активности сукцинатде-гидрогеназы (СДГ) КМ проводили по методу Ю. М. Зарецкой (1983) с последующей оценкой плотности окрашивания одиночных клеток на цитосиектрофотометре "ФМЭЛ-17"(СССР) при длине волны 540 нм. Антиокислительную активность (АОА) кардиа-лина и препаратов сравнения определяли по методу Г. И. Клебанова и соавт. (1988) с некоторыми модификациями. Измерение светосуммы хемилшинесценции (X®, индуцированной двухвалентным железом, проводили по методу Ю. О. Теселкина и соавт. (1984) на приборе "Bioluminometer 1241" с использованием оригинальной рабочей программы. АОА выражали в % снижения светосуммы ХЛ образца относительно контроля. Исследование параметров индуцированной двухвалентным железом и перекисью водорода ХЛ гомогената ткани сердца проводили с использованием программы "ATP" ("LKB",Швеция) и оригиналь-

ных рабочих программ на приборе "В1о1и!ШпотеЬег 1241" ("ЬКВ", Швеция).

Исследование влияния кардиалина на процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) гомогената ткани сердца крысы проводили по методу Е. А. Нейфаха (1966) за исключением того, что динамику интенсивности ПОЛ оценивали по уровню спонтанной ХЛ при помоши оригинальной рабочей программы на приборе "Вю1ит1поте1ег 1241" ("ЬКВ",Швеция). Фракции кардиалина получали дробной спиртовой экстракцией.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием параметрических (Ь-критерий Стью-дента, Г-критерий Фишера) методов статистического анализа (Лакин Г. Ф. ,1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Исследование состава кардиалина Физико-химический анализ экстрактивных пептидных препаратов представляет собой довольно сложную проблему, т.к. в силу особенностей технологии получения лекарственная форма содержит комплекс веществ пептидной природы, а также продукты частичного кислотного гидролиза белков и пептидов. В настоящей работе для анализа состава кардиалина был использован ряд физико-химических методов (ЭФ, ИЭФ, ВЭЖХ, ионообменная ТСХ, аминокислотный анализ), позволивших проанализировать различные составляющие пептидных экстрактов.

В результате проведения гель-электрофореза кардиалина было получено количественное распределение компонентов препарата по значениям молекулярной массы. В составе кардиалина было выявлено 28 фракций (Рис.1), из них 10% полипептидов имели молекулярную массу от 75 до 50 КДа; 7. 8% - от 50 до 27 КДа; 42. 8 - от 27 до 17 КДа и 39.1 - менее 17 КДа. Следует отметить, что при проведении ЗФ после предварительного диализа и концентрирования соотношение компонентов исследуемого образца меняется в сторону относительного увеличения концентрации высокомолекулярных примесей, составляющих незначительную долю общего количества полипептидов пеп-

- 10 -

тидных биорегуляторов. Кроме того, низкомолекулярные фрак ции пептидов дают размытые зоны вследствие высоког коэффициента диффузии этих компонентов. Т.о., этот лодхо, обладает высокой чувствительностью по отношению к высокомо декудярным компонентам препаратов, но имеет нижний преде, обнаружения по молекулярной массе, который составляет приблизительно 10 КДа при окрашивании СВВ R-250 и около 2 КД; при использований методов окрашивания серебром. Как показали исследования, метод ЭФ в полиакриламидном геле пригоде! для технологического контроля пептидных биорегуляторов, выделенных из различных органов и тканей, т. к. различные серии препаратов дают сходное распределение фракций и существенно отличаются при изменении вида ткани, использованной для получения пептидных экстрактов.

<о

ЗЕНЕ

9.5

3. 5 ,~£

Рис.1. Денситограммы ЭФ разделения кардиалина в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием СЕВ 1?-250. А - электрофорез; В - иэоэлектрофокусирование.

Низкомолекулярная фракция кардиалина была охарактеризована в результате проведения обращенно-фазовой ВЭЖХ спиртового экстракта лекарственной формы (Рис. 2). Очевидно, что использование ВЭЖХ целесообразно для контроля состава низкомолекулярной компоненты кардиалина по наличию пиков с определенным временем выхода, присутствующем с стандартной серии препарата

у.:.; алина методом ОФ ВЭЖХ.

Неподвижная фаза - нукле--v¡ : ос ил С18. Элюент - ТФУ -ггр; ацетонитрил 5-80% за 20 /\ минут. Объемная скорость

спиртового экстракта ле-'L- i •;' карственной формы карди-

Ёг.Ьг 100 мкл мин . Температу-

Ш. ра 20° С.

j • Рис. 2. Фракционирование

Метод TGX позволяет количественно проанализировать распределение нингидринположительных компонентов пептидных препаратов по хроматографической подвижности в широком диапазоне молекулярных масс. В результате проведения ТСХ на пластинах "Fixion 50x8" в составе кардиалина было выявлено 9 фракций со значениями Rf0; 0,07; 0,14; 0,21; 0,32; 0,55; 0,76; 0,85; на пластинах "Silufol UV-254" - 9 фракций, имеющих Rf 0,04; 0,22; 0,35; 0,44; 0,49; 0,55; 0,58; 0,79. В результате сравнения различных производственных серий одних и тех же препаратов (Табл. 1) и сравнительного анализа средних показателей фракций пептидных биорегуляторов, выделенных из различных тканей, были продемонстрированы различия состава препаратов. Для каждого препарата было получено характерное количественное соотношение компонентов при фракционировании методом ионообменной ТОХ (Рис.3).

Дополнительнаяя информация о составе кардиалина и других биорегулирующих препаратов была получена при использовании методов ИЭФ и аминокислотного анализа. В результате проведения ИЭФ кардиалина с последующим окрашиванием СВВ R-250 было зафиксировано 34 .фракции в диапазоне pl 3,5-9,5; 65,9 % полипептидов имели изоэлектрические точки в щелочной области (Рис. 1,В). Изучение аминокислотного состава различных пептидных препаратов показало, что характерной особенностью кардиалина является сравнительно высокое содержание лизина - 20,5 М%.

Таблица 1.

Относительное содержание основных фракций препарата кардиалин, . полученных после проведения ионообменной ТСХ на пластинах "р1ХЮп 50x8" (Венгрия).

Номер Франции Иг Относительное содержание фракций кардиалина в % ( X + ш )

Серии кардиалина

I 2 3 4 5

I 0 5,5+0,5 2,4+0,3 5,$+0,5 7,3+0,7 7,7+0,8

П 0,07 7,5+0,7 6,7+0,7 9,3+0,8 7,7+0,8 10,0+1,0

ш 0,14 2,7+0,3 7,3+0,7 6,9+0,7 2,7+0,4 9,3+0,3

1У 0,21 10,7+1,1 8,5+0,8 5,4+0,5 5,7+0,6 12,5+1,3

У 0,32 3,9+0,5' 5,4+0,4 2,8+0,3 6,6+0,7 7,0+0,6

л 0,55 12,1+1,2 13,0+1,3 11,5+1,1 16,8+1,7 14,7+1,5

УП 0,76 37,3+3,8 38,6+3,8 40,5+4,1 40,1+4:,0 30,7+3,1

УШ 0,85 15,8+1,6 15,6+1,6 13,0+1,3 Ю, 4+1,1 ' 9,1+0,8

о

CM

ю <

Рис. 3. Сравнительный анализ композиционного состава лекарственной формы пептидных биорегуляторов методом ионообменной ТСХ на пластинах "Fixion 50x8". Денситограммы получены в результате сканирования хроматограмм при длине волны 520 нм 1 -кардиалин; 2 - тималин; 3 - кор-тексин.

2. Биологическая активность кардиалина в условиях модельной гипоксии in vitro

Результаты анализа состава кардиалина определили общий подход к изучению биологической активности препарата. С учетом предполагаемого синергизма компонентов кардиалина были выбраны методы, позволяющие получать интегральные показатели ответа модельных систем на воздействие кардиалина.

На первом этапе для исследования биологической активности кардиалина в качестве объекта исследования были использован ы суспензии изолированных КМ, что давало возможность исследования свойств клеток вне влияния нейрогумо-ральных факторов, обеспечивало свободный доступ тестируемых веществ к клеточной мембране, позволяло количественно оценивать динамику интересующих показателей на клетках одного животного СГуревич М. И. , Прончук Е Ф. ,1986; Barry W.N. et al. ,1985).

Рядом исследователей было показано, что одним из интегральных показателей состояния клеток миокарда в первичной культуре является коэффициент формы (КФ)- отношение площади к периметру клетки, взятое с некоторым нормирующим

- 14 -

коэффициентом (Rais J. et al. , 1980). При ухудшении пере? вания клеток происходит увеличение КФ. При этом конкреп механизм "округления" клеток может быть различен, наприк "кальциевый парадокс", осмотическое повреждение, гипоксия др. (Brierley Q. Р. et al. ,1986). Во всех случаях КФ выст пает в качестве надежного интегрального показателя клето ного повреждения.

При исследовании биологической активности кардиали установленно, что инкубация КМ с кардиалином в концентрац 1Ö6-10"4 МГ/МЛ В условиях модельной ГИПОКСИИ приводит К УВ1 личению резистентности клеток к дефициту кислорода, ч' подтверждено данными о динамике значений КФ (Рис.4, А), д] намике выхода цитоплазматических ферментов кардиомиоцитов культуральную среду, количестве клеток, включающих витал! ный краситель.

С использованием клеточной модели была изучена динам* ка активности еукцинатдегидрогеназы (СДГ) - одного из клк чевых ферментов аэробной продукции макроэргических соедине ний КМ, входящего в состав цикла Кребса. Установлено, чт инкубация изолированный'кардиомиоцитов в условиях нарастаю щей гипоксии приводит к увеличению активности СДГ, что яв ляется одним из проявлений компенсаторного механизма (Мань ковская И. Е , Юрченко 0.0. , 1990). Кардиалин в указанны: условиях в концентрациях 10ß- 104 мг/мл снижает активност] фермента до уровня, сопоставимого с исходным (Рис.4, В).

Учитывая, что эффект кардиалина заключается в положительном влиянии на целый ряд показателей функционально* активности КМ , можно предположить, что препарат проявляет эффект антигшоксанта прямого действия (Лукьянова Л. Д. ,1986 3. Антиоксидантная активность кардиалина Основные' свойства сердечной ткани (автоматизм, возбудимость, сократимость), а также нейрогуморальная регуляция в значительной мере зависят от состояния клеточных мембран. Один из механизмов, способных изменить биохимический состав

количество клеток,

я • L 1(1

я. а ■ " г-<

в " П Г

os i.o т,

усл. ед.

3 *

Рис. 4. Влияние !сардиалина на значение КФ (А) и активность СДР (В) изолированных кардиомиоцитов в условиях гипоксии. 1 -норма; 2 - гипоксия; 3 -инкубация с кардиалином в концентрации 10 мг/ мл в условиях гипоксии.

о,Г I

я540

л , о. е.

а также структуру и электрические свойства мембран кардиомиоцитов, связан с интенсификацией процесса перекисного окисления липидов (ПОД) при развитии различных патологиче-ких процессов, в том числе ишемии миокарда (Меерсон Ф. 3. , 1984; 1988; Marklund S. L.,1988; Kan&ko М. et al. ,1989); Одним из методологических подходов, позволявших оценить интенсивность процесса ПОЛ в ткани крови является применение хемилюминесцентного (ХЛ) метода. В результате проведенных исследований нами было выявлено влияние кардиалина на процесс ПОЛ различных модельных систем in vitro,что было показано при изучении показателей спонтанной и индуцированной XJL

При использовании модельной системы, содержащей белко-во-липидные комплексы, подобные липопротеидам плазмы крови,

антиокислительный эффект кардиалина был сопоставим с такс вым для 10~5 М антиоксиданта ионола.

Инкубация гомогената ткани сердца крысы с кардиалинс приводила к изменению профиля кривой XJ1 и дозозависимому снижению светосуммы ХЛ в диапазоне концентраций 1(5^- 4.0 мгУмл. В указанных условиях эффект кардиалина превышал таковой у антиоксиданта пептидной природы - карнозина в равных весовых концентрациях. Выявлена максимальная АОА карди алина в сравнении с простатиленом, тималином и карнозином при инкубации гомогената ткани сердца крысы в аскорбат-зависимой системе системе окисления.

Можно предположить, что наблюдаемая АОА кардиалина in

vitro опосредована различными механизмами. Так, выраженное

2*-

торможение индуцированной Fe хемилюминесценции на стадии зарождения свободных радикалов можно объяснить комплексооб-разующей способностью пептидов (Гуляева Н. В. ,1987). Полученные наш,а также опубликованные ранее экспериментальные данные (Андреева ЛИ. .Кожемякин JL А. ,1987) указывают на то, что наряду с непосредственным^антиокислительным эффектом, возможным при дозах не менее 10 иг/ мл в модельных системах in vitro, кардиалин способен оказывать опосредованное воздействие на систему антирадикальной зашиты организма. Следует также отметить,что уровни как окислительных, так и антирадикальных процессов in vivo и in vitro не сопоставимы по интенсивности (Гуляева ЕЕ и др. ,1989) и in vivo эффект кардиалина даже при меньших концентрациях может быть гораздо более выраженным.

4. Разработка метода контроля биологической активности кардиалина в условиях производства Внедрение новых лекарственных препаратов в серийное производство предполагает решение ряда прикладных задач, связанных с проверкой качества получаемых партий по их биологической активности.

В следующей серии экспериментов нами было изучено влияние кардиалина на активность СДГ в гомогенате ткани сердца

крысы. Было показано, что кардиалин тканеспецифично тормозит активность СДГ в указанной модельной системе,и следовательно, эффект подавления кардиалином активности СДГ в го-могенате ткани сердца может быть использован для контроля биоактивности производственных серий лекарственной формы кардиалина.

Таблица 2.

Влияние пептидных препаратов на СДГ - активность гомогенага ткани сердца крысы.

Препарат Остаточная активностьД

Кардиалин 19. 2 ± 2. 8*

Тималин 100. 0 *

Простагилен 39. 3 ± 3. 2*

Кортексин 37. 3 + 2. 5*

(Концентрация всех препаратов в гомогенате 1 мг/мл). * Статистически достоверно для р<0. 005.

Таблица 3.

Влияние кардиалина на СДГ-активность гомогенатов ткани тимуса, предстательной железы и сердца крысы

Гомогенаг ткани Остаточная активностьД

Тимуса Простаты Сердца 26. 4 ± 3. 9* 74. 5 ± 9. 8* 10. 0 ± 1. 8*

* Статистически достоверно для р<0. 05. •

В заключительной части работы представлены результаты апробации метода контроля биологической активности производственных серий кардиалина по подавлению активности СДГ в

гомогенате ткани сердца крысы, а также показано, что указанный тест может использоваться для первичного скрининга фракций препарата, полученных методом спиртовой эктракции.

ВЫВОДЫ

1. Кардиалин представляет собой комплекс веществ пептидной природы и является специфическим по составу препаратом. отличным по количеству входящих компонентов и их физико-химическим характеристикам от аналогичных препаратов пептидной природы, полученных из других органов и тканей.

2. Специфические особенности состава кардиалина позволяет охарактеризовать комплексная оценка с применением методов гель-электрофореза, изоэлектрофокусирования, высокоэффективной жидкостной хроматографии, тонкослойной хроматографии, аминокислотного анализа. Указанными методами в составе препарата зарегистрировано от 9 до 34 фракций. Аминокислотный анализ выявляет самое высокое по сравнению с другими пептидными биорегуляторами (цитомединами) содержание лизина в составе кардиалина.

3. Комплекс полипептидов, входящих в состав кардиалина, обладает выраженным антиокислительным эффектом в экспериментальных условиях in vitro. В модельной системе, содержащей белково-липидные комплексы, подобные липопрогеидам плазмы крови, и гомогенате ткани сердца крысы, антиокислительная активность кардиалина сопоставима с таковой для ан-тиоксиданта пептидной природы карнозина.

4. В условиях модельной гипоксии кардиалин оказывает воздействие на метаболизм кардиомиоцитов, приводящее к увеличению резистентности клеток к дефициту кислорода, что выражается в нормализации показателей жизнеспособности кардиомиоцитов (коэффициент формы, динамика выхода цитоплазмати-ческих ферментов во внеклеточную среду, количество включающих витальный краситель клеток) и снижении активности сук-цинатдегидрогеназы.

5. Для контроля биологической активности серийно выпускаемых партий препарата целесообразно использовать ме-

год, основанный на эффекте тканеспецифичного подавления кардиалином активности сукцинатдегидрогеназы в гомогенате ткани сердца крысы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Андреева JL И., Казанцева С. Т. Влияние пептидов, выделенных из сердца, на сократительную способность изолированного сердца // Роль пептидных биорегуляторов (цитомеди-нов) в регуляции гомеостаза : Тез. докл. науч. конф. - Л , 1987 - С. 8.

2. Андреева Л И. , Казанцева С. Т. Способ тестирования биологической активности пептидов, выделенных из сердца // Там же. - С. 9.

3. Казанцева С. Т. Сравнительное изучение физико-химических свойств цитомединов // Там же. - С. 46.

4. Андреева JL И. , Казанцева С. Т. Свойство цитомединов регулировать гомеостаз // Биохимия - медицине. Молекулярные механизмы формирования патологических состояний: Тез. докл. науч. конф. - Л. , 1988. - С. 26.

5. Андреева JL И. , Казанцева С. Т. Способ тестирования биологической активности пептидов, выделенных из серд

ца // Сб. изобр. и рац. предлож. / Воен. - мед. акад. - Л , 1988. - Вып. 19. - С. 26.

6. Казанцева С. Т. , Богатова Г. П. Способ определения биологической акивности препарата // 11 Конф. "Изобретательство и рационализация в медицине и медицинской промышленности": Тез. докл. - JL ,1988. - С. 138.

7. Казанцева С. Т., Андреева JL И. Биохимическая характеристика пептидного биорегулятора из сердца // Цитомедины: Сб. науч. трудов / Под ред. Б. И. Кузника. - Чита, 1988. - С. 37-38.

8. Казанцёва С. Т. Антиоксидантная активность препарата из сердца // Вопросы медицинской экологии и проблема улучшения здоровья населения Забайкалья и КНДР : Тез. докл. науч. - практ. конф. - Чита, 1989. - С. 131-132.

9. Казанцева С. Т. Способ стандартизации цитомединов //

Сб. изобр. и рац. предлож. / Боен. -мед. акад. - Л , 1989. -Вып. 20. - С. 59.

10. Ершов В. И. , Казанцева С. Т. Метод моделирования различной степени гипоксии в средах инкубации кардиомиоци-тов // Сб. изобр. и рац. предлож. / Воен. - мед. акад. - Л. , 1990. - Вып. 21. - С. 43.

И. Ершов В. И. , Казанцева С. Т. Метод оценки жизнеспособности изолированных кардиомиоцитов по дыхательной активности // Там же . - С. 44.

12. Евтихиева Т. А. , Казанцева С. Т. , Долинова О. И. Контроль качества пептидного препарата из сердца // Применение современных лекарственных препаратов на крупных промышленных предприятиях: Мат. конф. - Л.-Тольятти, 1391. -С. 22.

13. Павленко В. С. , Ершов В. Л , Андреева Л. И. , Казанцева С. Т. , Хавинсон В. X. Влияние полипептидного препарата на состояние энергетического метаболизма клеток миокарда, находящихся в условиях гипоксии и ишемии // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1991. - Т. 112, N 7. - С. 24-27.

14. Самойлов О. В. , Бабенко А. П. , Казанцева С. Т. , Хавинсон В. X , Бигдай Е. В. , Сясин Е И. , Кропотов С. П. Проведение фармакологического скрининга с использованием тест-систем клеточного уровня // Первый российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - М. , 1992. - С. 553.

15. Бабенко А. П., Казанцева С. Т. , Хавинсон В. X Активе ция АГФ-чувствительных К+-каналов кардиомиоцитов эндогенными кардиопептидами // Бет. эксперим. биологии и медицины. -Т. 114, N 7. - С. 54-56.

16. Бабенко А. П. , Казанцева С. Т. Возможность модулящи калиевой проницаемости сарколеммы кардиомиоцитов эндогенны ми кардиопептидами // Пептидные биорегуляторы - цитомедины Тез. докл. симп. - СанктПетербург, 1992. - С. 15-16.

17. Казанцева С. Т., Евтихиева Т. А. , Бабенко А. П. Комп лексная оценга влияния биорегулирующего препарата сердца н показатели, отражающие уровень метаболизма кардиомиоцитов при гипоксии //.Там же. - С. 72.