Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональная характеристика гранулярных клеток предсердия брюхоногого моллюска Achatina fulica

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональная характеристика гранулярных клеток предсердия брюхоногого моллюска Achatina fulica"

На правахр\копией

ШАБЕЛЬНИКОВ Сергей Владимирович

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГРАНУЛЯРНЫХ КЛЕТОК ПРЕДСЕРДИЯ БРЮХОНОГОГО МОЛЛЮСКА АСНATINA FULICA

Специальность 03.00 25 - Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008

003172231

Работа выполнена в Лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН,

Санкт-Петербург

Научный руководитель доктор биологических наук

Мартынова Марина Георгиевна

Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Кудрявцев Борис Николаевич

Институт цитологии РАН

доктор биологических наук Зайцева Ольга Викторовна

Зоологический институт РАН

Ведущая организация:

ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

Защита состоится 27 июня 2008 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 002 230 01 при Институте цитологии РАН по адресу 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр, 4 Сайт института www cytspb rssi ru

Адрес электронной почты института ceIlbio@mail cytspb rssi ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан Я.С мая 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е В Каминская

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Клеточные механизмы взаимодействия нервной, иммунной и эндокринной систем являются одной из центральных проблем современно» клеточной биологии О наличии функциональной связи между этими системами свидетельствует, в частности, сходный набор сигнальных медиаторов, используемый этими системами (Ottaviani et al, 1991) Так, иммунокомпетситные клетки способны реагировать на медиаторы нервной и эндокринной систем, а медиаторы, продуцируемые иммунокомпетентными клетками, в свою очередь способны влиять на активность нейроэндокринной системы Сведения, о механизмах взаимодействия нервной и иммунной систем, получены в основном при изучении позвоночных животных Информация о нейро-иммуно-эндокршшых взаимодействиях у беспозвоночных представляется скудной и фрагментарной Однако в последнее время наличие подобных взаимодействий у беспозвоночных получает все большее подтверждение

Среди беспозвоночных нейроиммуноэндокринные взаимодействия наиболее глубоко исследуются у представителей двух типов Arthropoda и Mollusca Это связано, по-видимому, с тем, что некоторые представители этих таксонов являются классическим модельными объектами нейробиологии, что обусловлено относительно простым устройством их нервной системы и наличием крупных, легко идентифицируемых нейронов В качестве модельного объекта в настоящем исследовании нами был выбран один из классических объектов нейробиологии - легочный брюхоногий моллюск Achatina fúlica

Моллюски обладают рядом особенностей организации как нервной, так и иммунной систем Например, для решения достаточно сложных поведенческих задач они обходятся намного меньшим количеством нейронов, чем позвоночные В частности, у моллюсков существуют гигантские мультимодальные нейроны, посылающие проекции по всему телу животного, выполняющие как сенсорную, так и моторную функцию и способные осуществлять рефлекторный акт на уровне одной клетки Моллюски обладают развитой системой распознавания «свой - чужой», являющейся аналогом врожденного иммунитета позвоночных, однако приобретенный иммунитет у них отсутствует Внутренняя защитная система моллюсков (ВЗС) состоит m двух основных компонентов клеточного и гуморального Клеточный компонент представлен, как правило, двумя типами клеток амебоцитами, или гиалиноцитами, являющимися эффекторными клетками, осуществляющими реакции фагоцитоза и инкапсуляции, и гранулоцитами, основной функцией которых является продукция гуморальных защитных факторов (ГЗФ) Гуморальный компонент в основном представлен молекулами, обладающими агглютинирующей, опсонизирующей, литической и антибиотической активностями В

отличие от позвоночных, у моллюсков распознающие молекулы имеют не иммуноглобулиновую, а лектиновую природу В большинстве филогенетических групп беспозвоночных основная роль в продукции гуморальных защитных факторов (ГЗФ) принадлежит циркулирующим в гемолимфе гранулоцитам Среди исследованных групп моллюсков гранулярные гемоциты обнаружены у двустворчатых, в то время как у брюхоногих моллюсков наличие подобных клеток ставится под сомнение (Adema et al, 1992, Barracco et al, 1993) В связи с этим представляет интерес популяция гранулярных клеток (ГК), обнаруживаемых в сердце гастропод

Наличие гранулярных клеток в сердце моллюсков отмечено уже в конце XIX - начале XX вв исследователями, так или иначе связанными с изучением анатомии и гистологии этого органа В 70-х годах двадцатого столетия интерес к ГК в сердце моллюсков возрастает, что обусловлено, по-видимому, использованием гастропод в качестве модельного объекта для исследования регуляции сердечной деятельности В 70-х - 80-х гг исследовали ГК только у трех видов улиток Helix pomatia, Н aspersa и Lymnaea stagnalis Это обстоятельство, а также доступный в то время методический арсенал, по-видимому, не позволили полностью раскрыть роль сердечных ГК Более того, в период активного выделения и изучения кардиоактивных соединений из тканей моллюсков исследователи подходили к проблеме функции ГК с определенной парадигмой, характерной для сравнительной физиологии того времени, а именно с идеей нейрогуморалыюго контроля сердца гастропод Совершенно иной взгляд на роль ГК приходит с работами Хоек и Смит (Hoek et al, 1996, Smit et al, 2004), показавшими участие ГК в продукции гуморальных защитных факторов Однако имеющихся в настоящее время данных недостаточно для формирования целостного представления о функциях ГК и механизмах их взаимодействия с интегративными системами организма моллюска Именно отсутствие комплексного исследования ГК брюхоногих моллюсков и предопределило тему данной работы

Цели и задачи исследования Целью настоящей работы являлась морфологическая и функциональная характеристики гранулярных клеток (ГК) предсердия брюхоногого моллюска Achatina fúlica Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи

1 Исследовать ультраструктуру ГК предсердия и их контактов с нервными окончаниями

2 Исследовать локализацию ряда эволюционноконсервативных пептидов и «простых» нейромедиаторов в ГК и контактирующих с ними нервных волокнах

3 Исследовать влияние биологически активных веществ, локализованных в секреторных гранулах ГК, на сердечную деятельность моллюска

4 Разработать экспериментальную модель, позволяющую исследовать влияние нервной системы на секреторную активность ГК

5 Выделить и охарактеризовать белки, секретируемые ГК под влиянием нервной стимуляции

Научная новизна работы Впервые выполнено подробное морфологическое описание ГК предсердия A fúlica и приведены ультраструктурные доказательства существования мультитерминалыюй иннервации ГК Проведена адаптация для улитки методов перфузии сердца и электрической стимуляции сердечного нерва и предложена схема экспериментальной установки для исследования влияния нервной системы на секреторную активность ГК Приоритетными являются полученные данные о выделении клетками сердца белков (не пептидов) в ответ на электрическую стимуляцию сердечного нерва Впервые показано, что гранулы ГК содержат и секретируют в гемолимфу белок, обладающий агглютинирующей активностью по отношению к дрожжевым клеткам Новые данные получены о локализации в ГК ряда медиаторов пептидной и непептидной природы Постулирована важная роль предсердных ГК в нейроиммунных взаимодействиях у брюхоногих моллюсков

Теоретическая н практическая значимость работы. Работа имеет фундаментальную направленность Полученные данные вносят существенный вклад в малоисследованную область нейро-иммуно-эндокринных взаимодействий у моллюсков Теоретические результаты могут быть использованы в курсах сравнительной гистологии, сравнительной иммунологии и зоологии

Положения, выносимые на защиту

1 Гранулярные клетки и контактирующие с ними аксоны образуют в предсердии Achatina fúlica единый морфофункциональный комплекс, в котором секреторная активность ГК находится под контролем нервной системы

2 Гранулярные клетки предсердия A fúlica являются секреторным компонентом внутренней защитной системы, продуцирующим гуморальные защитные факторы и медиаторы пептидной и непептидной природы

Апробация работы По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ Материалы диссертации представлены на 6-м Международном конгрессе по нейроэндокринологии (США, Питтсбург, 2006), 11-м Международном симпозиуме по нейробиологии беспозвоночных (Венгрия, Тихани, 2007), 2-м съезде Общества клеточных биологов, посвященном 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007) и на научных семинарах Лаборатории морфологии клетки ИНЦ РАН

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 256 источников Иллюстративный материал представлен 47 рисунками и 3 таблицами

Обзор литературы

В главе рассмотрены особенности строения кровеносной системы, иннервации и нейрогуморального контроля сердца брюхоногих моллюсков Особое внимание уделено локализации в центральной и периферической нервной системе кардиоактивных соединений пептидной и непептидной природы Подробно рассмотрены имеющиеся в литературе данные по строению ГК у трех видов гастропод и предполагаемые функции этих клеток Приведена также характеристика гуморальных защитных факторов моллюсков (опсонины, агглютинины, лизины, антимикробные белки и пептиды, компоненты ферментативных каскадов) Обобщены современные данные о нейроиммунных взаимодействиях у моллюсков и рассмотрены медиаторы, участвующие в этих взаимодействиях (нейропептиды, цитокиноподобные медиаторы, биогенные амины, оксид азота) Описаны изменения, происходящие во внутренней защитной системе моллюска при стрессовых воздействиях и опосредованные нервной системой, а также нейроиммунные реакции на вторжение патогена

Материалы и методы

Объект исследования Исследования проводили на наземном легочном моллюске Athatma fuhca Ferussac 1821 (Gastropoda Pulmonata) Улиток содержали в террариуме при постоянном температурном и световом режиме (25 °С, 12-часовой день) на овощной диете с добавлением сухого молока и мела В опыт брали взрослых половозрелых особей Гемолимфу собирали из легочной вены с помощью стерильного шприца

Световая микроскопия. Общую морфологию сердца исследовали при помощи бинокулярной лупы МССО и микроскопа Leica в режиме дифференциального интерференционного контраста по Номарскому Для гистохимической идентификации ГК применяли методику окрашивания парафиновых срезов паральдегидфуксином (ПАФ) (Elftman, 1959)

Иммуногистохимия На светооптическом уровне локализацию Hsp70, SP и FMRFaMHfla исследовали с использованием биотин-экстраведин-пероксидазного комплекса Изолированные сердца фиксировали по Бэкштед (Beckstead, 1994) Локализацию белка 16 кДа исследовали с помощью метода иммунофлуоресценции, при этом вместо

биотинилированных антител использовали РГГС-коньюгированпые вторые антитела Контролем во всех случаях служили срезы, обработанные только вторыми антителами, и срезы, при обработке которых в качестве первых антител использовали неиммунную сыворотку

Антитела. Характеристики использованных в работе первых антителах приведены в таблице 1

Таблица 1 Характеристики первых антител

Название Источник, производитель Иммуноген Титр

Анти-SP Кролик, сыворотка, Peninsula Lab Синтетический пептид, идентичный SP крысы ИГ 1 400 ИЭМ 1 1000 ИБ1 2000

Анти-FMRF Кролик, сыворотка, Peninsula Lab Синтетический пептид ИГ 1 400 ИЭМ 1 2000

Анти-DßH Овца, аффинноочищенные на синтетическом пептиде, Sigma Синтетический фрагмент DßH человека ИЭМ 1 2000

Анти-ANP Кролик, сыворотка, Peninsula Lab Синтетический пептид идентичный ANP крысы ИЭМ 1 2000 ИБ 1 1000

Анти-СЬАТ Кролик, сыворотка, ATS Синтетический фрагмент ChAT свиньи ИЭМ 1 2000

ЗВ5 Мышь, асцит, ЛЗМК ИНЦ РАН Hsp70 из бедренной мышцы быка ИГ 1 100 ИЭМ 1 1000

R2 3 Кролик, сыворотка, ЛЗМК ИНЦ РАН Hsp70 из бедренной мышцы быка ИБ 1 10000

APRAP16 Кролик, аффинноочищенные на белке 16 кДа 16 кДа белок из предсердия A fúlica ИГ 1 10 ИЭМ 1 500 ИБ 1 200

* ЦБ - иммуноблотгинг, ИГ - иммуног истохимия, ИЭМ - иммуноэлектронная микроскопия

Электронная микроскопия. Изолированные сердца улитки фиксировали в 2,5%-ном глутаральдегиде на 0,05 М какодилатном буферном растворе с 10%-ным содержанием сахарозы в течение 2 ч После промывки в какодилатном буферном растворе и постфиксации в 1% 0s04 на какодилатном буферном растворе с 4%-ным содержанием сахарозы в течение 1 ч материал обезвоживали и заливали в смолу (смесь Аралдита и Эпона-812) Срезы контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу Материал просматривали на электронном микроскопе JEM-7 при ускоряющем напряжении 80 кВ

Иммуиоэлектронпая микроскопия. Ультратонкие срезы, помещенные на никелевые сеточки, обрабатывали 3%-ной перекисью водорода в течение 20 мин Затем срезы инкубировали последовательно в растворе первых антител в течение 24 ч при 4 "С и в растворе белка А (1 20), коньюгированного с коллоидным золотом (10 нм) (Sigma), при комнатной температуре в течение 1 ч Контролем служили срезы, обработанные только вторыми антителами

>

Фармакологические эксперименты на изолированном серят A. fúlica. Исследовали действие препарата Hsp70/Hsc70 в концентрациях 25 мкг/мл, 50 мкг/мл и ANP (Sigma, синтетический крысиный) в концентрациях 10"4 М, 10"й М, 10 7 М па частоту сокращений

изолированного сердца A. fúlica. Препарат Hsp70/Hsc70 (далее просто Hsp70) был выделен из бедренной мышцы быка (Guzhova et al., 1998). В качестве отрицательного контроля использовали БСА (Sigma) и овальбумин (Sigma), а в качестве положительного контроля - серотонин. Исследуемые вещества растворяли в физиологическом растворе для ахатины (АФР): 61 мМ NaCl, 3,3 мМ КС1, 10,7 мМ СаСЬ, 10 мМ MgS04x7H20, 10 мМ HEPES, рН 7,4. Сокращения сердца регистрировали с

1-й теплообменник с растворами

Рис. I . Схема экспериментальной установки помощью тензодатчика и дифференциального

для проведения фармакологических усилителя , 1} Применяли проточный экспериментов на изолированном сердце.

метод аппликации растворов исследуемых веществ. Сначала регистрировали фоновую активность при протекании АФР, затем наносили исследуемое вещество, после чего препарат отмывали АФР до восстановления первоначальной активности. Механограммы обрабатывали с помощью программы Origin 7.0 и представляли как изменение длительности межсистолических интервалов во времени до аппликации, при аппликации и после аппликации исследуемого вещества.

Перфузия сердца in situ и электрическая стимуляция сердечного нерва. Для

исследования влияния нервной системы на секреторную активность ГК предсердия ахатины была использована методика перфузии сердца in situ с электрической стимуляцией сердечного нерва и последующим анализом белкового состава перфузата, а также электронномикроскопическим исследованием органа до и после эксперимента. У крупных моллюсков с

Рис. 2. Схема экспериментальной установки для

перфузии сердца с одновременной электрической помощью щипцов снимали раковину. В стимуляцией сердечного нерва.

легочную вену, перерезанную на

электростимул нтор

сердечный нерв перфузата на электродах

расстоянии 1 см от предсердия, вставляли пластиковую канюлю, которую фиксировали наложением лигатуры В перерезанную аорту вставляли отводящую канюлю, которую фиксировали на уровне верхушки желудочка Аккуратно отпрепарированный сердечный нерв (перикардиальная ветвь интестиналыюго нерва) подцепляли на электроды Препарированное таким образом сердце перфузировапи с помощью перистальтического насоса стерильным АФР со скоростью 0,5 мл/мин (рис 2) Для отмывки полости сердца от белков гемолимфы перед стимуляцией собирали две последовательные фракции по 2 мл При электрической стимуляции сердечного нерва (10 В, 10 Гц) собирали 4 мл перфузата Общий белок во фракциях измеряли по методу Бредфорд (Bradford, 1976) Было проведено 12 независимых экспериментов, в каждом из которых использовали по два животных

Электрофорез в ПААГ. Для анализа белковых смесей использовали две электрофоретические системы Glycine-SDS-PAGE (Laemmli, 1970) и Tricine-SDS-PAGE (Schagger, von Jagov, 1987) Так же был использован метод 2-мерного электрофореза Молекулярные массы белков определяли по подвижностям маркерных белков (Weber et al, 1972) Для визуализации белков использовали три методики окрашивания гелей кумасси G250 (Blakesley, Boezi, 1977, Wilson, 1983), нитратом серебра (Gromova, Celis, 2006) и ПАФ (Steinbach, 1977)

Иммуноблоттинг. После электрофоретического разделения в трис-глициновой системе белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Towbm et al, 1979), а после разделения в трис-трициновой системе - на PVDF мембрану "Immobilon PSQ" (Schagger, 2006) Иммунодетекцию проводили по общепринятой схеме (Towbin, Gordon, 1984, Towbin, 1988)

Получение поликлональных антител к белку 16 кДа. Белки перфузата, полученного при стимуляции, разделяли методом электрофореза в ПААГ и окрашивали кумасси G250 Зоны, соответствующие белку 16 кДа, вырезали и использовали для иммунизации кролика по методике Иванова с соавторами (Иванов и др , 1975) Методом аффинной хроматографии из поликлональной сыворотки выделяли антитела, специфичные к белку 16 кДа В качестве аффинного сорбента использовали фрагменты нитроцеллюлозной мембраны с иммобилизованным белком 16 кДа Специфичность поликлональных аффинноочшценных антител (APRAP16) определяли методом иммуноблотинга

Выделение иативного белка 16 кДа из предсердия Изолированные предсердия лизировали с помощью вортекса в холодном гипотоническом буферном растворе, содержащим 0,02 М Tris-HCL, 0,01 М ЭДТА, 0,01 % Тх-100 и ингибиторы протеаз (PIC, Sigma), pH 7,4 Лизат очищали центрифугированием при 14000 об/мин Далее белки супернатанта разделяли методом гельфильтрационной хроматографии на Sephadex G200

Колонку объемом 12 мл (24x8 мм) уравновешивали 0,02 М Tns-HCl буфером рН 7,3, содержащим 0,1 М NaCl и 0,01% Тх-100 После нансссния 100-120 мкл белкового экстракта колонку элюировали стартовым буфером со скоростью 100 мкл/мин Фракции объемом 1 мл собирали с момента вхождения пробы в гель Фракции 9, 10 и 11 подвергали дальнейшему разделению методом ионообменной хроматографии, которую проводили на аиионообменнике QAE Sepharose FF Колонку объемом 180 мкл (9x4,7 мм) уравновешивали стартовым буфером, использовавшимся при гельфильтрации После нанесения фракций 9, 10 и 11 колонку промывали стартовым буфером Ступенчатую элюцию проводили стартовым буфером, содержащим 0,15 М и 0,25 М NaCl Материал на разных стадиях выделения анализировали с помощью электрофореза Для дальнейшего использования фракции диализовали против тысячекратного объема ФСБ ночь при 4 "С Для диализа использовали мембрану с нижним пределом пропускания 1 кДа Концентрацию белка после диализа измеряли по методу Бредфорд

Определение антибиотической активности препарата Е250, Антибиотическую активность фракции, содержащей белок 16 кДа, определяли методом диск-диффузии в агаре (Andrews, 2001, Bauer et al, 1966) Сущность метода заключается в образовании зоны ингибирования бактериального роста при радиальной диффузии антибиотика из носителя (бумажного диска) Диаметр зоны пропорционален концентрации антибиотика и степени восприимчивости используемой тест-культуры к антибиотику В качестве тест-культур использовали Гр+ Pseudomonas aeruginosa и Гр" Escherichia с oil

Определение опсоиизирующей активности препарата Б250 В качестве общей методической основы использовали следующие работы Kelly et al, 1993, Pearce et al, 2001 и Weingart et al, 1999 Меченные FITC дрожжи обрабатывали хроматографической фракцией, содержащей белок 16 кДа (опытная группа) или АФР (контрольная группа), отмывали и добавляли к монослою гемоцитов улитки Фагоцитарный индекс (ФИ) вычисляли как отношение числа фагоцитировавших гемоцитов (Nf) к общему числу учтенных гемоцитов (Nt) по формуле ФИ = (Nh / ni) х 100 % При дифференцированном подсчете гемоциты контрольной и опытной групп были разделены на три подгруппы в зависимости от количества фагоцитированных дрожжевых клеток (I) фагоцитировавшие одну клетку, (II) фагоцитировавшие две клетки и (III) фагоцитировавшие более двух клеток Зная Np и количество гемоцитов в каждой подгруппе (N„), вычисляли дифференцированный фагоцитарный индекс (ДФИ) для каждой подгруппы по формуле ДФИ = (N„ / Nt.) х 100% В эксперименте было использовано четыре животных, от каждого животного готовили по три препарата в опыт и контроль

Определение агглютинирующей активности препарата Е250. Меченные FITC дрожжи отмывали в АФР и делили па две равные аликвоты (опыт и контроль). Опытную аликвоту инкубировали с анализируемой хроматографической фракцией («препарат Е250», 100 мкл. концентрация белка 85 мкг/мл), контрольную аликвоту инкубировали с АФР. Инкубацию проводили в микропробирках на ротационном шейкере в течение 60 мин. Затем дрожжевые клетки заключали под покровное стекло и просматривали на конфокальном микроскопе Leica LSM. Наличие агглютинации определяли визуально.

Методы статистического анализа. Статистический анализ экспериментальных данных проводили с помощью программ Origin 7.0 и Statistica 6.0. Использовали двусторонний t-критерий Стьюдента для независимых выборок и непараметрический критерий Вилкоксона для зависимых вариант. В качестве интервальной оценки величины приводится выборочное среднее ± СКО.

Результаты и обсуждение

Локализация ГК в сердце ахатины. Исследование тотального препарата сердца ахатины позволило выявить общую морфологию органа и локализацию ГК. Стенка предсердия настолько тонкая, что через неё хорошо различима губчатая структура миокарда. Миокард предсердия организован в тонкие, длинные трабекулы. Наличие ветвления и анастомозов между трабекулами создаёт эффект губчатости миокарда. На поверхности трабекул расположены многочисленные ГК (рис. 3). ГК имеют округлую форму; их диаметр

Рис. 3. Тотальный препарат предсердия A. fúlica, т - трабекулы, стрелки - гранулярные клетки. Дифференициальный интерфернционный контраст по Номарскому.

варьирует от 20 до 50 мкм В желудочке ГК не обнаружены Из всех клеток сердца улитки только предсердные ГК демонстрируют положительную ПАФ-реакцию

Особенности ультраструктурпой организации ГК (рис 4) Со стороны просвета органа ГК покрыты эндотелиальными клетками, образующими прерывистую выстилку предсердия Расстояние между ГК и соседними кардиомиоцитами варьирует от 100 до 300 нм, а между ГК и эндотелиальными клетками - от 200 до 500 нм На некоторых срезах между ГК, эндотелиальными клетками и кардиомиоцитами можно видеть неплотный внеклеточный матрикс с коллагеновыми фибриллами ГК предсердия ахатины содержат крупные, округлые, ограниченные мембраной гранулы трех морфологически хорошо обособленных типов (I) темные гранулы с тонкозернистым содержимым, (II) светлые гранулы с гомогенным содержимым и (III) светлые гранулы с зернистым содержимым Для зрелой ГК характерно заполнение гранулами всего объема цитоплазмы с вытеснением ядра на периферию, при этом ядро и гранулы теряют правильную, округлую форму Выделение содержимого гранулы во внеклеточную среду происходит через отверстие, образуемое при слиянии мембраны гранулы с плазматической мембраной ГК В процессе секреции содержимое гранулы светлеет, разрыхляется и становится хлопьевидным Часто секреция сопровождается слиянием гранул Следует отметить, что слияние наблюдали только между гранулами III типа Очевидно, что при больших размерах ГК слияние гранул позволяет значительно ускорить процесс экзоцитоза Важной особенностью ГК предсердия ахатины является образование клеточной мембраной многочисленных микровыростов и микровезикул неправильной формы, электронопрозрачных или заполненных зернистым материалом Поверхность ГК окружена базальной пластинкой

Обнаруженное в настоящей работе взаимодействие ГК с нервной системой на морфологическом уровне носит характер тесных, но неспециализированных контактов Нервные волокна проникают под базальиую пластинку ГК и аксолемма вплотную прилегает к плазматической мембране ГК Расстояние между мембранами в зоне контакта варьирует от 20 до 30 нм Характерной особенностью является одновременное образование контактов несколькими, морфологически различными типами волокон с одной ГК Нервные волокна, контактирующие с ГК, по форме, размеру и плотности нейросекреторных гранул можно разделить, по крайней мере, на восемь морфологических типов (табл 1) Неспециализированные нейромьгшечные контакты в целом характерны для моллюсков, а образование специализированных контактов периферическими нервными волокнами является скорее исключением для этих животных У моллюсков характер пептидэргической иннервации периферических мишеней, включая миокард и железистые элементы, напоминает иннервацию гладкой мускулатуры позвоночных аксонами автономной нервной

Рис. 4. Ультраструктура нейросекреторного комплекса предсердия A. fúlica.

б/т - базальная пластинка, в - ворсинкоподобные выросты на поверхности гранулярной клетки (гк), ги - глиоинтерстициальная клетка, км - кардиомиоциты, кф - коллагеновые фибриллы, м -митохондрии, не - нервные волокна, п - полость предсердия, шэр ~ шэроховатый эндоплазматический ретикулум, э - эндотелиальная клетка, я - ядро. Секреторные гранулы гранулярной клетки: сг - светлые гомогенные, сз - светлые зернистые, тз - тёмные зернистые.

Таблица 2. Типы нервных волокон, контактирующих с ГК

Характеристики нейросекреторных _гранул_

Т1 Варьирующие по форме и плотности гранулы диаметром от 50 до 90 нм и длиной до 100 нм

Характеристики нейросекреторных _гранул_

Т5 Округлые электроноплотные гранулы диаметром 100 160 нм

Т2 Овальные варьирующие по плотности гранулы со средним диаметром 65 нм и длиной 100 нм

Т6 Округлые электроноплотные гранулы диаметром от 50 до 75 нм

ТЗ Умеренно электроноплотные гранулы диаметром от 60 до 90 нм и длиной до 160 нм

Т7 Округлые гранулы с электроноплотной сердцевиной, светлым ободком и диаметром до 140 нм

Т4 Овальные электроноплотные гранулы диаметром от 100 до 120 нм и длиной до 180 нм

Т8 Кластеры крупных (до 175 нм) и мелких(до 80 нм) электронноплотных гранул

системы: контакт образует не терминальный участок нервного волокна, а так называемые «варикозные» расширения, расположенные по ходу аксона и являющиеся местом наиболее активного выделения нейросекрета (Е1екеБ, Ше, 1994; Е1екез, 2000). Вполне вероятно, что ГК имеют сходный характер иннервации (рис. 5).

Полученные в настоящей работе морфологические данные свидетельствуют о мультитерминальной иннервации ГК и о существовании в предсердии ахатины особых нейросекреторных комплексов, образованных ГК и контактирующими с ними нервными волокнами.

Локализация пептидных медиаторов (Шабельников и др., 2008). Методами иммуногистохимии и иммуноцитохимии исследовали локализацию в предсердии ахатины субстанции Р (БР). РМЯРамида и атриального натрийуретического пептида (АКР). Иммунопероксидазиая гистохимия выявила наличие вР- и РМКРамид-подобного иммунореактивного материала в ГК. Иммуноэлектронная микроскопия показала, что БР- и

РМЯРамид-подобный иммунореактивный материал локализован главным образом в светлых гомогенных гранулах ГК. А№-подобный иммунореактивный материал был выявлен в светлых гомогенных и тёмных зернистых гранулах. Антитела к 5Р и РМЯРамиду реагируют также с нейросекреторньгми гранулами

некоторых нервных волокон,

контактирующих с ГК. Отдельные нервные окончания, к онтактирующие с кардиомиоцитами, содержат РМЯРамид-и ЭР-подобный иммунореактивный материал.

Локализация ацетилхолина и норадреналина. Методом иммуноэлектронной микроскопии была исследована локализация в предсердии двух нейромедиаторов: ацетилхолина и норадреналина. В качестве маркеров их локализации использовали антитела к ферментам, участвующим в синтезе этих медиаторов, холинацетилтраисферазе (СЬАТ) и дофамин-р-гидроксилазе (0(ЗН). Из этих двух ферментов только БрН-подобный иммунореактивный материал обнаружен в светлых гомогенных гранулах ГК. СЬАТ- и ОрН-подобный иммунореактивный материал обнаружен также в нейросекреторных гранулах некоторых нервных волокон, контактирующих с ГК. СИАТ-подобный иммунореактивный материал обнаружен и в нейросекреторных гранулах аксонов, контактирующих с кардиомиоцитами.

Локализация белка тепловою шока 70 кДа (МаПупоуа, Вуэтзуа, БЬаЬеЫкоу е1 а1.. 2007; ЭИаЬеЫкоу е! а1., 2006). Методом иммунопероксидазной гистохимии Нзр70-иммунореактивный материал обнаружен в ГК предсердия. Иммуноэлектронная микроскопия позволила показать локализацию Н5р70-иммунореактивного материала в гранулах ГК и нейросекреторных гранулах некоторых аксонов в составе нервных стволиков.

Рис. 5. Схематический рисунок показывающий иннервацию гранулярных клеток (гк) и кардиомиоцитов (юи). «Я - «варикозные» расширения нервных волокон, сг - секреторные гранулы.

Анализ лнзата предсердия методом иммуноблотинга. Для проверки специфичности иммуноцнтохимических реакций тканей предсердия ахатины с антителами к SP, ANP и Hsp70 лизат предсердия был подвергнут анализу методом иммуноблотинга Поликлональные антитела к SP крысы на иммуноблоте лизата предсердия улитки каких-либо зон не выявили К настоящему времени установлено, что пептиды, выделенные из тканей беспозвоночных и идентифицированные как SP-иммунореактивный материал, хотя и имеют общий С-концевой участок (-FXiGXjRaMim), однако схожи с тахикининами позвоночных не более чем по 40% аминокислотных остатков Эти пептиды беспозвоночных были объединены в группу тахикинин-подобных пептидов (Nassel, 1999) Учитывая эти данные, можно предположить, что обнаруженный нами в предсердии улитки SP-иммунореактивный материал относится к тахикинин-подобным пептидам и имеет некоторую степень гомологии с SP млекопитающих Поликлональные антитела к ANP выявили на иммуноблоте лизата предсердия шесть зон с электрофоретической подвижностью намного меньшей, чем подвижность ANP крысы Таким образом, использование данных антител не позволяет дать однозначный ответ относительно локализации этого пептида в ГК предсердия ахатины Поликлональные антитела к Hsp70 (R 2 3) выявили па иммуноблоте лизата предсердия зону, по электрофоретической подвижности соответствующую Hsp70 быка

Исследование влияния Hsp70 и ANP на частоту сердечных сокращений При длительной работе изолированного сердца наблюдали постепенное уменьшение частоты сердечных сокращений (ЧСС) и общего тонуса органа Часто наблюдали непериодические колебания ЧСС длительностью до нескольких минут При аппликации серотонина, использовавшегося в качестве положительного контроля, регистрировали дозозависимое увеличение ЧСС Первое достоверное увеличение ЧСС происходит при концентрации 10"8 М При тестировании ANP в концентрациях 10"9 М, 10 8 М, 10 7 М достоверного изменения ЧСС обнаружить не удалось При аппликации Hsp70 в концентрациях 25 и 50 мкг/мл, наблюдали увеличение ЧСС, сопоставимое с эффектом аппликации БСА Эти колебания начинались до аппликации тестируемого раствора и не носили дозозависимого характера При использовании в качестве контроля овальбумина наблюдали сходные изменения ЧСС Таким образом, можно сделать вывод, что в данной модели ANP и Hsp70 не влияют на ЧСС у ахатины Однако не исключено, что эти вещества оказывают на сердечную деятельность опосредованное действие т situ, как это показано в отношении ANP для позвоночных

Влияние стимуляции сердечного нерва на секреторную активность ГК (Шабельников и др , 2007, Shabelmkov et al, 2007) Для исследования влияния нервной системы на секреторную активность ГК были совмещены и адаптированы методика перфузии сердца т situ и электрическая стимуляция сердечного нерва Представлялось

ci 140 "в-

5 40 ю

О !0

-ь

Промывка перед стимуляцией Стимуляция

необходимым ответить на несколько вопросов. Во-первых, происходит ли увеличение содержания белка в перфузате при стимуляции сердечного нерва, во-вторых, как изменяется

белковый состав перфузата при стимуляции и, в-трстьих, какие морфологические изменения происходят с ГК при стимуляции сердечного нерва.

Анализ содержания общего белка во

фракциях перфузата показал, что стимуляция

сердечного нерва ведёт к выделению белков

сердцем (рис. 6). Анализ фракций, полученных

при промывке полости сердца от белков

Рис. 6. Содержание общего белка во гемолимфы, показал резкое уменьшение (Р < фракциях перфузата. X ± SD. N = 12.

0,005, N=12) содержания общего оелка с 116,0 ± 82,7 мкг в первой фракции, полученной сразу после препарирования, до 9,4 ± 6,9 мкг во второй фракции, полученной при промывке полости сердца. В третьей фракции, полученной после стимуляция нерва, было обнаружено возрастание (Р < 0,005, N = 12) содержания

общего белка до 46,1 ± 29,7 мкг, по сравнению с его содержанием во второй фракции.

Электрофоретический анализ фракций показал, что увеличение общего белка в третьей фракции происходит за счёт выделения белков с ММ 16 кДа, 22 кДа и 57 кДа (рис. 7). При сравнении зон с одинаковой подвижностью в разных фракциях перфузата можно заметить, что в первой фракции основная нагрузка приходится на высокомолекулярные белки, тогда как интенсивность зон 16 кДа и 22 кДа значительно меньше, чем в третьей фракции. Характер распределения и интенсивность зон высокомолекулярных белков гемолимфы интактного моллюска и первой фракции сходен, а зоны с подвижностью 16 кДа и 22

Рис. 7. SDS-PAGE анализ фракций перфузата и

белков гемолимфы. Первые три дорожки кДа на электрофореграмме гемолимфы окрашены серебром, четвёртая-ПАФ. отсутствуют. Окрашивание белков третьей

ММ, кДа

67

45

29

20

14.4 ■

22

16

фракции ПЛФ показало положительную реакцию только для зоны 16 кДа. Данный факт позволяет предположить, что наличие именно этого белка в ГК обуславливает характерную для них положительную ПАФ реакцию. Присутствие белков с ММ 16 кДа, 22 кДа и 57 кДа в первой фракции перфузата обусловлено, по-видимому, активацией таких секреторных элементов предсердия как ГК, нервные терминали или глиоинтерстициальные клетки при препарировании животного. Более того, мы предполагаем, что препарирование как мощный стрессорный фактор, может приводить и к специфической активации этих секреторных элементов предсердия. Исследование морфологических изменений в предсердии показало, что при стимуляции сердечного нерва ГК претерпевают тотальную дегрануляцию, но и при препарировании животного с последующей перфузией также происходит дегрануляция ГК, хотя и умеренная.

В ядре ГК после стимуляции наблюдали появление большого количества округлых осмиофильных структур двух типов - с плотной сердцевиной, диаметром 27 ± 7 нм, и со светлой сердцевиной, диаметром 26 ± 7 нм (рис. 8). Эти образования встречаются в ядрышке и эухроматине, но не наблюдаются в гетерохроматине. В ядрах других клеток предсердия, таких как мышечные, эндотелиальные, глиоинтерстициальные и эпикардиальные, подобные образования не были обнаружены. Возникновение этих структур может быть связано с

Рис. 8. Осмиофильные структуры в эухроматине и ядрышке (я) гранулярной клетки предсердия ахатины. На вставках А и Б данные структуры приведены при большем увеличении.

функциональными и морфологическими перестройками ядерного аппарата ГК, происходящими при воздействии специфических нервных медиаторов.

Исследование изменения белкового состава фракций перфузата методом иммуноблотгинга с использованием поликлональпых антител против Hsp70 позволило проверить предположение о выделении Hsp70 ГК. Поскольку стимуляция ведёт к тотальной дегрануляции ГК, мы ожидали обнаружить увеличение уровня Hsp70 в третьей фракции. Однако Hsp70 присутствовал только в первой фракции и только в следовых количествах. Поскольку именно в первой фракции, полученной при промывке сердца, присутствуют гемоциты, то вполне вероятна контаминация этой фракции внутриклеточным Hsp70 при лизисе незначительного их количества в процессе центрифугирования. Таким образом, мы не можем однозначно утверждать выделение Hsp70 в гемолимфу ГК и (или) нервными терминалями. Тем не менее, проблема существования внеклеточного Hsp70 у беспозвоночных заслуживает дальнейшего изучения.

Иммунолокализация белка 16 кДа (Shabelnikov et al., 2007). Среди трёх мажорных белковых зон, обнаруженных в третьей фракции перфузата, наибольший интерес вызвал i к? белок 16 кДа. К белку 16 кДа были получены поликлональные

лУ" 'С ,>N

антитела APRAP16. В лизате предсердия и третьей фракции перфузата антитела APRAP16 распознают одну зону с подвижностью около 16 кДа (рис. 9). При анализе гемолимфы интактного животного иммунореактивпой 16 кДа-белковой зоны не обнаружено. Иммунофлуоресцентная микроскопия показала наличие АРКАР16-иммунореактивного материала в ГК предсердия улитки. Ультраструктурное исследование позволило выявить локализацию АРКАР16-иммунореактивного материала в гранулах ГК. Интенсивность распределения метки варьировала в зависимости от типа гранул: наибольшую реактивность наблюдали в светлых гомогенных гранулах и лишь единичные зёрна метки обнаружили над светлыми и темными зернистыми гранулами. Клеточную локализацию двух других белков с ММ 22 кДа и 57 кДа, появляющихся в перфузате после нервной стимуляции, ещё предстоит выяснить.

Таким образом, тесные морфологические контакты ГК с нервной системой отражают их глубокую функциональную связь. Секреторная функция ГК находится под прямым контролем нервной системы и заключается в выделении в гемолимфу белка 16 кДа и, вероятно, ряда других веществ,

Рис. 9. Анализ препарата Е250, 3-й фракции перфузата, лизата предсердия и гемолимфы методом иммуноблотинга.

локализованных в гранулах, в процессе дегрануляции, вызванной активирующим действием нервной системы Мы предполагаем, что белок 16 кДа является иид\цибельпы 1/, то есть в норме его уровень в гемолимфе низкий, но возрастает при активации сердечного нерва Конкретные нейроны, участвующие в регуляции секреторной активности ГК, еще предстоит определить

Выделение нативиого белка 16 кДа из предсердия Для определения функции белка 16 кДа была разработана методика его выделения в нативной форме из лизата предсердия Методом двумерного электрофореза в ПААГ было выявлено, что изоэлектрическая точка белка 16 кДа лежит в кислой области в пределах 3,5 - 4,5 ед pH, и что зона 16 кДа, обнаруживаемая одномерным электрофорезом, действительно содержит только один белок и достаточно удалена от других белков лизата При гельфильтрации максимум элюции белка 16 кДа наблюдали иа 9-м миллилитре с момента нанесения белкового экстракта предсердия при общем объеме колонки 12 мл и мертвом объеме 3 мл С анионообменной колонки элюция белка 16 кДа начиналась при 200 мМ NaCl Исходя из характера элюции белка 16 кДа с гельфильтрационной колонки и учитывая селективность среды Sephadex G200, можно предположить, что данный белок в нативном состоянии образует высокомолекулярный комплекс массой около 200 кДа Этот комплекс, по-видимому, является гомомерным, поскольку дальнейшая его очистка при неденатурирующих условиях позволила получить препарат белка 16 кДа высокой степени очистки Очищенный белок 16 кДа с небольшим количеством белковых примесей при дальнейшем изложении будет упоминаться как «препарат Е250» Из литературы известно о существовании у ахатины трех лектинов, состоящих из субъединиц с ММ 15 кДа и массой нативных молекул 210-240 кДа (Basu et al, 1986, Mitra, Sarkar, 1988, Biswas et al, 2000) Учитывая эти данные и принимая во внимание возможный индуцибельный характер выделения белка 16 кДа в гемолимфу, можно предположить, что обнаруженный белок входит в группу лектинов, выделенных из ахатины, и подобно этим лектинам может участвовать во внутренних защитных реакциях

Антибиотическая активность препарата Е250. Метод диск-диффузии в агаре показал, что препарат Е 250 не обладает антибиотической активностью по отношению к Гр+ Pseudomonas aeruginosa и Гр Escherichia coli Не было обнаружено различий между диаметром зон ингибирования бактериального роста вокруг дисков, содержащих препарат Е250 и содержащих ФСБ В контроле вокруг дисков, содержащих гентамицин, формировались крупные, отчетливые зоны ингибирования бактериального роста

Опсонизирующая активность препарата Е250 Уровень фагоцитарной активности гемоцитов A fullea зависит от наличия в среде опсонизирующих факторов Предварительная инкубация дрожжевых клеток с препаратом Е250 не влияла на уровень

фагоцитарной активности гемоцитов ахатины (рис 10), что свидетельствует об отсутствии опсонизирующих свойств у белка 16 кДа Дифференцированный подсчет гемоцитов, 50 т фагоцитировавших одну (первая подгруппа), две

(вторая подгруппа) и более двух (третья подгруппа) дрожжевых клеток, обнаружил (рис 11), что значения дифференцированного фагоцитарного индекса (ДФИ) для гемоцитов первой опытной подгруппы (64,0 ± 9,3) ниже (Р < 0,001 при N = 12), чем для гемоцитов первой контрольной подгруппы (78,3 ± 4,7) Различий между значениями ДФИ для вторых подгрупп обнаружено не было Значения ДФИ для гемоцитов третьей опытной 1 подгруппы гемоцитов (18,4 ± 8,6) были выше (Р < 0,001 при N = 12), чем для гемоцитов третьей контрольной

1 о

<\з ta в

Е250

Рис

10

Влияние обработки подгруппы (6,2 ± 2,1) Поскольку обработка дрожжевых дрожжевых клеток препаратом

Е250 на фагоцитарную активность клеток препаратом Е250 не влияет на фагоцитарную гемоцитов А ¡икса X ± 80, N = 12 активность гемоцитов, то значения ДФИ в трех подгруппах указывают на вероятность столкновения гемоцита с одной, с двумя или более чем с двумя дрожжевыми клетками за время инкубации Мы предположили, что увеличение вероятности встречи гемоцита более чем с двумя дрожжевыми клетками происходит за счет образования последними агрегатов, и, следовательно, обработка препаратом Е250 вызывает

100 90 80706050 40 3020 100

подгруппа 1

подгруппа 2

подгруппа 3

Рис 11 Результаты дифференцированного подсчета гемоцитов в опыте (Е250) и контроле (АФР) X ± БО, 12

агглютинацию дрожжевых клеток

Агглютинирующая активность препарата Е250 При проведении теста на агглютинацию было обнаружено, что инкубация дрожжевых клеток с препаратом Е 250 приводит к образованию крупных агрегатов При инкубации дрожжей с АФР образования подобных агрегатов не происходит При исследовании фагоцитоза крупные агрегаты в опытной группе отсутствовали, что можно объяснить их фрагментацией при трехкратной

промывке центрифугированием с последующим ресуспендированием

Таким образом, как показывают полученные данные, ГК предсердия способны выделять в гемолимфу белок с массой нативной молекулы порядка 200 кДа, состоящий из субъединиц с ММ около 16 кДа и обладающий агглютинирующей активностью по отношению к дрожжевым клеткам.

Роль ГК в нейроиммунных взаимодействиях у брюхоногих моллюсков. В завершение, обобщая по лученные нами данные относительно ГК предсердия и информацию, почерпнутую из литературных источников, можно предложить схему, наглядно поясняющую предполагаемую роль ГК в нейроиммунных взаимодействиях у брюхоногих моллюсков (рис. 12). Мы предполагаем, что дегрануляция ГК может запускаться двумя различными путями. В первом случае дегрануляцию ГК при повреждении тканей моллюска запускают механосенсорные ноцицептивные нейроны (прямо или опосредованно через другие нервные клетки). Во втором случае активация ГК запускается при обнаружении патогена циркулирующими гемоцитами. При этом гемоциты выделяют в гемолимфу ряд

медиаторов (цитокиноподобные

ноцицептивная афферентация

выделение ГЗФ

элиминация патогена

'жение патогена

медиаторы, оксид азота, некоторые

нейропептиды, биогенные амины),

которые с одной стороны

вызывают привлечение и

активацию самих гемоцитов, а с

другой - модулируют активность

определённых нейронов ЦНС, что,

в свою очередь, может запускать

дегрануляцию ГК. Не исключено,

что медиаторы, выделяемые

гемоцитами, могут действовать

непосредственно на ГК. Обе схемы

могут быть задействованы

Рис. 12. Предлагаемая модель взаимодействия гранулярных одновременно, обеспечивая как клеток предсердия (ГК) с нервной и защитной системами быструЮ1 так и отставленную во моллюска. ЦНС - центральная нервная система, IЗФ -

гуморальные защитные факторы. времени активацию ГК.

Дегрануляция ГК, в свою очередь, приводит к увеличению в гемолимфе уровня ГЗФ, что способствует в случае повреждения повышению резистентности по первому пути и (или) элиминации патогена по второму пути. Выделяемые ГК медиаторы могут, в свою очередь, модулировать активность элементов, вовлечённых в реализацию защитной реакции.

Заключение

В работе морфологически и функционально охарактеризована популяция ГК, интегрированных в ткань предсердия A fúlica В гранулах ГК были обнаружены агглютинин и ряд медиаторов пептидной и непептиднои природы Отличительной особенностью ГК является их тесная морфологическая связь с нервной системой Нам удалось создать экспериментальную модель для изучения регуляторного влияния на ГК со стороны нервной системы С помощью этой модели было показано, что ГК под действием нервной стимуляции способны к индуцибелыюму выделению в гемолимфу содержимого секреторных гранул Тесная морфологическая и функциональная связь ГК с нервными волокнами и их способность секретировать ГЗФ свидетельствуют о важной роли этих клеток в нейронммунных взаимодействиях A fúlica

Дальнейшие исследования ГК и регуляторных взаимодействий между ними и нервной и внутренней защитной системами, проведенные в сравнительном плане на моллюсках разных классов, позволят не только более детально раскрыть механизм функционирования нейроиммунной системы у брюхоногих моллюсков, но и понять становление взаимодействия основных регуляторных систем в типе моллюски

Выводы

1 Гранулярные клетки и контактирующие с ними аксоны образуют в предсердии Achatma fullea единый морфофункциональный комплекс, в котором секреторная активность ГК находится под контролем нервной системы

2 Гранулярные клетки получают мультитерминальную иннервацию с различной медиаторной специфичностью аксонов

3 Гранулярные клетки содержат в секреторных гранулах эволюционноконсервативные медиаторы пептидной и непептидной природы

4 Гранулярные клетки предсердия A fuhea являются секреторным компонентом внутренней защитной системы ГК способны к индуцибельному выделению в гемолимфу высокомолекулярного белкового комплекса, обладающего агглютинирующей активностью по отношению к дрожжевым клеткам

Список работ опубликованных по теме диссертации

1 Шабелышков СВ, Быстрова OA, Мартынова МГ 2008 Иммунолокализация субстанции Р и FMRFaMn/ia в предсердии брюхоногого моллюска Achatina fuhca Цитология 50 388-393

2 Шабелышков С В, Быстрова О А , Мартынова МГ, Парфенов В Н 2007 Необычные осмиофильные структуры в ядре гранулярных клеток предсердия брюхоногого моллюска Achatma fuhca Сборник тезисов докладов 2-го съезда Общества клеточных биологов, посвященного 50-летию Института цитологии РАН с 806

3 Martynova MG, Bystrova OA, Shabelmkov S.V., Marguhs В A, Prokojjeva DS 2007 Hsp70 in the atrial neuroendocrine units of the snail, Achatma fuhca Cell Biol Int 31 413419

4 Shabelmkov S V, Bystrova OA , Ivanov V A , Marguhs В A , Maitynova MG 2007 Nerve stimulation of snail heart evokes releasing of proteins into circulation Abstracts of 11th Symposium on Invertebrate Neurobiology P 70

5 Shabelmkov S V, Bystwva OA , Margulis В A , Prokojjeva DS, Maitynova MG 2006 The presence and localization of Hsp70 in the atrial neuroendocrine complex of snail Achatina fuhca Abstracts of 6th Congress on Neuroendocnnology / Frontiers m Neuroendocnnology 27 P 13

Список цитированной литературы

Иванов В A , Фечь В Я, ОченовЮМ 1975 Цитология 17 24-29

Adema С М, Harns R А , \ап Deutecom-Muldei ЕС 1992 J Invert Pathol 59 24-32

Anchens J М 2001 J Antimic Chemother 48, Suppl 43-57

Banacco MA , Steil A A , Gargiom R 1993 Mem Inst Oswaldo Cruz 88 73-83

Basil S, Sarcai M, Mandate 1987 Mol CellBiochem 71 149-157

Bauer A IV, Kirby W MM, ShenisJC, TurckM 1966 American J Clin Pathol 45 493-496

Becbtead, J H 1994 J Histochem Cytochem 42 1127-1134

Biswas, C, Sinha, D, Mandal, С 2000 Mol Immunol 37 745-754

Blakesley R W, BoeziJA 1977 Anal Biochem 82 580-582

Bradfoid M M 1976 Anal Biochem 72 248-254

Elehes К 2000 Microsc Res Tech 49 534-546

ElekesK, UdeJ 1994 J Neurocyte! 23 758-769

Elftman H, 1959 Hist Cytochem 7 2

Gromova I, Celts J E 2006 Protein detection m gels by silver staining A procedure compatible with mass-spectrometry In Cell Biology A Laboratory Handbook 3rd Edition Cells J E , Carter N , Hunter T , Simons K , Small J V , Shotton D (Eds) Elsevier, Academic Press, vol 4 Guzhova I V, Ainhokl A C V, Darieva ZA , Kinev A V, Lasunskaia E B , Ndsson K, Bozhkov

V M, Voromn A P, Margahs B A 1998 Cell Stress Chaper 3 67-77 Hoek, RM, Smit, AB, Frings, H, Vmk, JM, de Jong-Bunk, M, Geiaeits, WP, ¡996 Eur J

Immunol 26 934-944 Kelly K L , Cooper E L , Raftos D A 199} Dev Comp Immunol 17 29-39 LaemmliUK 1970 Nature 227 680-685 Mitra D, Saicar M 1988 Dev Comp Immunol 12 33-42 NasselDR 1999 Peptides 20 141-158

Ottaviam E, Caselgiandi E, Bondi M, Cossarizza A, Mondi D, Franceschi C 1991 Adv

Neuroimmunol 1 27-39 Pearce S, Newton RA, Nan SV, Raftos DA 2001 Dev Comp Immunol 25 377-385 SchaggerH 2006 Nature protocols 1 16-22 Schagger H, von Jagov G 1987 Annal Biochem 166 368-379 StembachP, 1977 Cell Tiss Res 181 91-103

Stmt, AB, de Jong-Brink, M, Li, KW, Sassen, MM, Spijker, S, Van Elk, R, Btnjs, S, Van

Minnen, J, Van Kesteien, R E, 2004 FASEB J 18 845-847 TonbmH, 1988 Biochem Soc Trans 16 131 TowbinH, Got don J 1984 J Immunol Methods 72 313-340 Towbin H, Staehelm T, Gordon J 1979 Proc Natl Acad Sei USA 76 4350-4356 Weber K, Pringle J R, OsbomM, 1972 Methods Enzymol 26 23-27

Weingart CL, Broitman-Maduro G, Dean G, Newman S, Peppier M, Weiss A A 1999 Infection

and Immunity 67 4264-4267 Wilson C, 1983 Methods Enzymol 91 236-247

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 21 05 2008 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 3007Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел /факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шабельников, Сергей Владимирович

Список принятых сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Кровеносная система брюхоногих моллюсков.

Особенности организации кровеносной системы брюхоногих моллюсков.

Строение сердца брюхоногих моллюсков.

Иннервация и нейрогуморалъный контроль сердца брюхоногих моллюсков.

Гранулярные клетки брюхоногих моллюсков.

Гуморальные защитные факторы моллюсков.

Нейроиммунные взаимодействия у моллюсков.

Молекулярные основы нейроиммунных взаимодействий.

Реакции гемоцитов на медиаторы.*.

Стрессорные реакции моллюсков.

Нейроиммунные реакции на вторжение патогена.

Материалы и методы.

Объект исследования.

Световая микроскопия.

Антитела.

Иммуногистохимия.

Электронная микроскопия.

Иммуноэлектронная микроскопия.

Фармакологические эксперименты на изолированном сердце A. fúlica.

Перфузия сердца in situ и электрическая стимуляция сердечного нерва.

Приготовление тотального нейрокардиального препарата.

Экстракция белка из перфузата.

Электрофорез в ПААГ.

Окрашивание электрофоретических гелей.

Окрашивание кумасси G250.

Окрашивание нитратом серебра.

Окрашивание ПАФ.

Иммуноблотинг.

Получение поликлональных антител к белку 16 кДа.

Получение сыворотки.

Аффинная очистка поликлональных антител.

Выделение нативного белка 16 кДа из предсердия.

Гелъфилыпрационная хроматография.

Ионообменная хроматография.

Определение антибиотической активности препарата Е250.

Определение опсонизирующей активности препарата Е250.

Получение гемолимфы.

Приготовление монослоев гемог/итов.

Приготовление дрожжей меченых FITC.

Исследование фагоцитарной активности гемоцитов in vitro.

Определение агглютинирующей активности препарата Е250.

Методы статистического анализа.

Результаты.

Морфологическая характеристика ГК.

Локализация ГК в сердце ахатины.

Особенности ультраструктурной организации ГК.

Иммунолокализация нейромедиаторов в предсердии.

Локализация пептидных медиаторов.

Локализация ацетилхолина и норадреналина.

Иммуноцитохимическая локализация белка теплового шока 70 кДа.

Анализ лизата предсердия методом иммуноблоттинга.'.

Исследование влияния Hsp70 и ANP на частоту сердечных сокращений у моллюска.

Влияние стимуляции сердечного нерва на секреторную активность сердца.

Содержание общего белка в перфузате.

Белковый состав перфузата.

Морфологические изменения ГК при стимуляции сердечного нерва.

Иммунолокализация белка 16 к Да.

Выделение нативного белка 16 кДа из предсердия.

Характеристика белка 16 кДа.

Антибиотическая активность.

Опсонизирующая активность.

Агглютинирующая активность.

Обсуждение.

Секреторная функция ГК.

Морфологическая характеристика ГК.

Иммунолокализация пептидных медиаторов в ГК.

Иммунолокализация норадреналина в ГК.

Иммунолокализация белка теплового шока 70 кДа в ГК.

Взаимодействие ГК с нервной системой.

Морфологическая характеристика контактов ГК с нервными терминапями.

Иммунолокализация пептидных медиаторов в нервных терминалях.

Иммунолокализация ацетилхолина и норадреналина в нервных терминалях.

Влияние стимуляции сердечного нерва на секреторную активность ГК.

Участие ГК в продукции гуморальных защитных факторов.