Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Специфические особенности инициации трансляции на РНК вируса гепатита С

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Специфические особенности инициации трансляции на РНК вируса гепатита С"

Московский Государственный Университет Имени М.В. Ломоносова

ФАКУЛЬТЕТ БИОИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ

На правах рукописи

БОЧКАЕВА (АДЬЯНОВА) Занда Владимировна

Специфические особенности инициации трансляции на РНК вируса

гепатита С

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

004607101

Работа выполнена на Факультете биоинженерии и биоинформатики Московско Государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор кандидат химических наук

Шатский Иван Николаевич

Теренин Илья Михайлович

Официальные оппоненты:

кандидат биологически наук доктор биологических наук, профессор

Гмыль Анатолий Петрович Аграновский Алексей Анатольев!

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им.В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «25» июня 2010 года в 16-00 на заседании Диссертационно совета Д 501.001.76 при Московском Государственном Университете им. М. Ломоносова по адресу: 119234 Москва, Воробьевы горы, МГУ, НИИ физико-химичесю биологии им, А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «25» мая 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Трансляция мРНК в клетке это сложный процесс, который с точки зрения механизмов обычно разделяют на три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Лимитирующей стадией процесса биосинтеза белка является в подавляющем числе случаев инициация - стадия, на которой происходит присоединение рибосомы к мРНК и поиск стартового кодона. Регуляция процесса трансляции в эукариотической клетке за редкими исключениями направлена именно на регуляцию стадии инициации, поэтому неудивительно, что как раз инициация трансляции привлекает внимание ученых, изучающих регуляцию биосинтеза белка, в первую очередь.

В клетках эукариот помимо канонического кеп-зависимого механизма, когда рибосома привлекается на мРНК с помощью метилированного остатка гуанозина на 5'-конце мРНК - кепа (от англ. cap), инициация трансляции может осуществляться за счет посадки рибосомы непосредственно внутри мРНК (так называемые участки внутренней посадки рибосомы или IRES'bi от англ. Internal Ribosomal Entry Site). По кеп-зависимому механизму транслируются если не все, то, по крайней мере, подавляющее большинство всех мРНК эукариот, тогда как lRES-зависимая инициация характерна в первую очередь для мРНК тех вирусов, жизненный цикл которых полностью протекает в цитоплазме. Не имея на 5'-конце собственных мРНК кеп-структуры, они не могли бы эффективно конкурировать за компоненты инициаторного аппарата с клеточными матрицами, не будь у них специальных механизмов инициации трансляции. Считается также, что в некоторых клеточных мРНК также существуют IRES-элементы, однако в последние годы было опубликовано немало работ, ставящих это под сомнение.

Одним из вирусов, использующих IRES-зависимый механизм инициации для трансляции своей мРНК в клетках, является высокопатогенный вирус гепатита С. В настоящее время по некоторым оценкам им инфицировано более 3% населения Земли (170 млн человек), и как причина смерти гепатит С выступает даже чаще, чем вирус иммунодефицита человека. При заражении вирус в основном поражает клетки печени, но причины такой тканеспецифичности пока неизвестны. Одна из наиболее вероятных гипотез - регуляция жизненного цикла вируса специфическими компонентами клеток печени.

Понятно, что со времени своего открытия в 1989 году вирус гепатита С является одним из самых изучаемых вирусов, однако многие аспекты его жизненного цикла остаются малоизученными в силу отсутствия адекватных in vivo систем, где бы вирус эффективно реплицировался. Некоторые важные детали трансляции его мРНК также

остаются неразгаданными: как осуществляется регуляция трансляции мРНК вируса, каки рибосомные белки участвуют во взаимодействии рибосомы с IRES'ом, какова poi отдельных доменов в 5'-нетранслируемой области и высоко консервативной 3' нетранслируемой области мРНК, какова причина тропизма вируса к клеткам печени? Вс это далеко не полный перечень вопросов, которые до сих пор остаются открытым1 Ответы на них, возможно, позволили бы в перспективе хотя бы снизить риск развития больных тяжелых заболеваний, таких как цирроз и рак печени. По структуре функциональной роли 5'- и 3'- нетранслируемых областей РНК HCV уже опубликован сотни работ. И, тем не менее, все время остаются неясными некоторые моменты в и организации, механизме взаимодействия с 40S рибосомными субчастицами и друг другом. Три части этой диссертационной работы и посвящены отдельным, активн дискутируемым в литературе аспектам организации и функционирования 5'- и 3' нетранслируемых областей РНК вируса гепатита С.

Цели исследования:

1. Исследование роли рибосомного белка р40 в образовании бинарного комплекса 40 рибосомной субчастицы с IRES'om мРНК вируса гепатита С.

2. Определение роли домена I 5'-нетранслируемой области мРНК вируса гепатита С в инициации трансляции.

3. Определение роли З'-нетранслируемой области мРНК вируса гепатита С в инициации трансляции

Научная новизна и практическая значимость. В ходе работы было показано, что антитела к рибосомному белку р40, который расположен в районе места связывания IRES'a вируса гепатита С на 40S рибосомной субчастице, подавляют трансляцию бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика. При этом было показано, что добавление антител не влияет на стадию элонгации и терминации трансляции. Эти результаты совместно с результатами наших коллег из Новосибирска являются первыми, указывающими на роль рибосомного белка р40 в кеп-независимой трансляции.

Методом внесения делеционных мутаций в 5'-нетранслируемую область вируса гепатита С было показано, что наличие домена I в 5'-нетранслируемой области мРНК ингибирует трансляцию, направляемую IRES'om, в 4 раза в клетках печени и в 2 раза - в непеченочных клетках. Причем основной вклад в это ингибирование вносит область между доменом I и доменом II, который уже входит в состав IRES-элемента.

С помощью модельной мРНК, содержащей два инициаторных кодона для одной рамки считывания: AUG-кодон HCV и AUG-кодон люциферазы, было показано, что IRES вируса гепатита С направляет трансляцию исключительно со «своего» инициаторного

кодона. При кепироваиии IRES'a он может направлять инициацию трансляции и по классическому сканирующему механизму. В этом случае инициация может осуществляться как с IRES-ного, так и с расположенного ниже AUG-кодона. Впервые экспериментально показано, что молекула мРНК, содержащая одновременно кеп и IRES-элемент, может направлять трансляцию или по сканирующему, или по IRES-зависимому механизму. Это наблюдение представляет интерес с точки зрения возможных вариантов инициации трансляции в эукариотических клетках, но не имеет прямого отношения к реальной трансляции РНК HCV, которая, как известно, не кепирована. Поэтому данный раздел работы приводится в диссертации, но не в автореферате.

Наконец, в ходе исследования специальных химерных конструкций показано, что З'-НТО мРНК вируса гепатита С аналогично поли(А)-последовательности стимулирует как IRES-, так и кеп-зависимую трансляцию in vivo и совершенно не влияет на эффективность трансляции in vitro. Важно отметить, что стимулирующий эффект не является тканеспецифичным.

Полученные данные объясняют наиболее спорные вопросы трансляции на мРНК вируса гепатита С: в частности, вопрос о роли З'-нетранслируемой области и домена I 5'-нетранслируемой области мРНК вируса в инициации трансляции. Кроме того, полученные данные впервые указывают на роль рибосомного белка р40 в IRES-зависимой трансляции, и впервые исследован сканирующий механизм на IRES-содержащей РНК и показан его фактический вклад в общую трансляцию на IRES-содержащей мРНК.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии Биологического факультета МГУ 14 мая 2010 года. Материалы работы были представлены на международной конференции Ribosomes 2010, Италия, 2010.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 83 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждения, материалы и методы, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 28 рисунками и 1 таблицей. Библиографический указатель включает 234 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Открытая рамка считывания генома вируса гепатита С кодирует один полипептид, который после синтеза клеточные и вирусные протеазы разрезают на 3 структурных и 7 неструктурных белков. По краям ОРС располагаются высококонсервативные 5'-НТО и

З'-НТО (рис. 1). Хотя в целом геном вируса отличается довольно большой вариабельностью, 5'-и З'-НТО очень консервативны, что, возможно, указывает на важность их первичной структуры в жизненном цикле вируса.

HCV pc^ívoinarKÍ фнтото

.. х .....\ \ \

fíOtM» \ Blj® \ «рЮЙКЯ \

ЛЯо

Рис. I Схематическое изображение генома вируса гепатита С.

1. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: роль рибосомиого бел к р40 в связывании IRES-элемента с 40S субчастицей рибосомы

Белок р40 малой субчастицы рибосомы млекопитающих был идентифицирован кг один из компонентов, находящихся вблизи участка связывания IRES-элемента вирус гепатита С[Е Lalcün:l еи1-20061. Всего в совместной работе с лабораторией Г.Г. Карповой районе этого участка было найдено 5 рибосомных белков: S3a, S5, S14, S16 и р40. Наш внимание привлек именно белок р40, поскольку у него имеется прокариотический гомолог - белок S2, являющийся функционально важным компонентом рибосомы E.coli, многие мутации по нему детальны. Было показано, что он связывает белок Si'1 Мо"Ма| 20uí', который играет ключевую роль в связывании мРНК у прокариот. Кроме того, недавно было установлено, что белок S2 непосредственно взаимодействует с дуплексом ШД-антиШД, образуемого мРНК и 16S рРНК при инициации трансляции у прокариот[G Vusupola

ct.al 2006)

С другой стороны, о роли эукариотического белка р40 в трансляции ничего не было известно. И лишь совсем недавно в указанной совместной работе с группой Г.Г. Карповой было показано, что р40 находится в непосредственной близости от домена Ше IRES-элемента HCV.

На данном этапе работы нашей целью было выяснить, участвует ли напрямую белок р40 в связывании IRES-элемента вируса гепатита С, а также в связывании других матриц, и по возможности изучить роль белка в процессе трансляции. В соответствии с

поставленной целью, проделанную экспериментальную работу по изучению роли рибосомного белка р40 в трансляции мРНК вируса гепатита С можно разделить на 2 стадии:

1. Изучение влияния белка р40 на образование бинарного комплекса между 1RES-элементом вируса гепатита С с 40S субчастицей,

2. Исследования роли белка р40 в трансляции различных мРНК.

1.1 Изучение влияния белка р40 на образование бинарного комплекса между IRES-элементом вируса гепатита С с 40S субчастицей рибосомы

1.1.1. Получение белка р40

Нашими коллегами из Новосибирского института биотехнологии и фундаментальной медицины (лаб. проф. Г.Г. Карповой) была любезно предоставлена плазмида рЕТ-15Ь, содержащая ген белка р40 человека с гексагистидиновым хвостом для гетерологической экспрессии данного белка в клетках Escherichia coli. С помощью этой плазмиды мы в нативных условиях выделили рекомбинантный белок р40.

В результате был получен раствор белка р40 с концентрацией ~ 0.4 мкг/мкл (рис.2 а).

1.1.2. Исследование малых субчастиц рибосом на наличие белка р40 и насыщение им Известно, что белок р40 довольно слабо ассоциирован с малой субчастицей

рибосомы, поэтому нам необходимо было оценить его наличие в имеющихся у нас

препаратах рибосом.

Как видно на рисунке, белок р40 присутствует в рибосомных 40S субчастицах (рис.2б) в нестехиометрических количествах (примерно 0,5:1).

Чтобы проверить, возможно ли полностью насытить рибосомные 40S субчастицы белком, их инкубировали с 5-кратным избытком рекомбинантного р40, после чего рибосомы отделяли от несвязавшегося белка центрифугированием смеси через подушку 10% сахарозы. Осевшие рибосомы ресуспендировали и анализировали методом электрофореза в ПААГ (рис. 3).

Рис.2 а) Фотография геля с результатами электрофореза (ЗОЭ-ПААГ). 1 - белковые маркеры молекулярного веса, 2 - образец очищенного белка р40 (0.5 мкл), 3 - то же, но для 1 мкл р40; б) Фотография геля. окрашенного серебром, с результатами электрофореза (ДСН-ПААГ). I - рекомбинантный белок р40 (0.4 мкг), выделенный в нативных условиях, 2 - белковые маркеры молекулярного веса, 3 - малые субчастицы рибосом 40Б (0,5 мкл

Как видно из рисунка, насыщение действительн происходит, причем количество белка в рибосома увеличивается, как и ожидалось, примерно в 2 раза (ctoi заметить, что из-за наличия гексагистидинового хвосп i подвижность рекомбинантного белка при электрофоре: несколько меньше подвижности нативного). Положительный результат данного эксперимента позволил нам проверить, влияет ли наличие белка р40 в 40S субчастице на эффективное! образования бинарного комплекса 40S с IRES'ом HCV, и так» ; на трансляцию ряда мРНК.

1.1.3. Исследование влияния р40 на эффективность связывания малых субчастиц рибосом с мРНК вируса гепатита С

Для проведения этого исследования мы синтезировали фрагмент мРНК вируса гепатита С методом транскрипции in vitro с использованием радиоактивно меченнного a-[32P]-UTP. После этого насыщенные белком р40 рибосомные субчастицы инкубировали с меченной мРНК с добавлением разных количеств белка р40: брали 1х-, 2х- и 5х-кратные молярные избытки белка по отношению к субчастицам. В качестве контроля инкубировали меченную мРНК с 40S субчастицами рибосомы, не насыщенными р40. После этого рибосомные субчастицы и все, что с ними связалось, отделяли от всех остальных компонентов методом центрифугирования в градиентном растворе сахарозы (5-20%). Содержимое пробирок фракционировали и анализировали профили радиоактивности. Как видно из рис. 4, никакого влияния добавления белка р40 на эффективность образования бинарного комплекса не обнаруживается.

Рис. 4 Влияние насыщения малых субчастиц рибосом белком р40 на связывание с (КЕБ-элеменгом

НСУ.

Рис.3 Фотография геля, окрашенного Кумасси 11250, с результатами электрофореза (ДСН-ПААГ). 1 - 408, не прошедшие инкубацию с белком р40, 2 -очищенный

рекомбинантный белок р40, 3 - рибосомные субчастицы 408,

проинкубированные с белком р40, 4 - 408, проинкубированные без добавления белка.

Из этого нами был сделан вывод, что добавление белка р40 если и увеличивает константу связывания, то не настолько, чтобы это сказывалось на количестве связанного с субчастицами IRES'а. Теоретически, можно было бы предположить, что при данных концентрациях компонентов мы просто не могли этого увидеть, поскольку константа диссоциации комплекса IRES-элемента с 40S субчастицей составляет около 2 нМ. И действительно, изотермы адсорбции, полученные нашими новосибирскими коллегами для данной системы, показали, что белок р40 увеличивает константу связывания IRES-элемента с 40S рибосомной субчастицей всего в 5 раз. Таким образом, белок р40 не является тем ключевым компонентом 40S субчастиц, который определяет уникальную особенность IRES-элемента РНК вируса гепатита С давать с ними прочные бинарные комплексы. Естественно, данный факт никак не исключает того, что р40 влияет на следующие после образования бинарного комплекса стадии образования инициаторного комплекса на мРНК вируса гепатита С.

1.2 Исследование необходимости белка р40 для трансляции различных мРНК

Данное исследование мы проводили методом трансляции in vitro. Эффективность трансляции оценивалась по включению [355]-метионина в репортерный белок. Трансляцию проводили в лизате ретикулоцитов кролика (Promega) с добавлением различных количеств моноклональных антител к исследуемому белку, любезно предоставленных нашими коллегами из Новосибирска. В качестве контроля параллельно проводили трансляцию без добавления антител.

Матричные РНК получали методом транскрипции in vitro. В ходе исследования мы использовали мРНК с 5'-нетранслируемыми областями мРНК вируса гепатита С и р-актина, кодирующие люциферазу светлячка (ок. 80 кДа), а безлидерная мРНК (cllacZ) кодировала начало белка с 1 фага X, слитого с р-галактозидазой (ок. 60 кДа). Следует отметить, что эти матрицы используют разные способы инициации трансляции: как неоднократно указывалось выше, 5'-нетранслируемая область мРНК вируса гепатита С содержит IRES-элемент, мРНК р-актина - стандартной клеточной матрицы -относительную короткую последовательность, направляющую трансляцию исключительно по кеп-зависимому сканирующему механизму. Безлидерная мРНК с llacZ устроена следующим образом: после инициаторного триплета, который находится на самом 5' конце этой мРНК (не считая одного остатка G для более эффективного проведения Т7-транскрипции) расположены 13 первых триплетов открытой рамки считывания белка cl фага 1, после которой следует кодирующая часть р-галактозидазы.

1.2.2. Трансляция мРНК актина с добавлением различного количества моноклональнь антител к белку р40

Мы добавляли к трансляционной системе, не содержащей мРНК, 0, 200, 500 и ЮС нг антител против белка р40. Реакционную смесь преинкубировали, после чего добавлял мРНК и проводили трансляцию в течение 1 часа.

На рисунке 5 представлены результаты проведенного эксперимента. Видно, что пр повышении концентрации антител количество синтезированного белка значительн уменьшается. Следовательно, антитела к исследуемому белку р40 подавляют трансляции протекающую по кеп-зависимому механизму. На данном этапе, мы не можем делат вывод о необходимости белка р40 именно для кеп-зависимой трансляции. Вполн возможно, что, связавшись с белком-мишенью, антитела чисто стерически мешают связыванию малой субчастицы рибосомы с мРНК и трансляции в целом.

Тем не менее, данный эксперимент уже позволяет сделать некоторые выводы: 1) мишенью на 40Э субчастицах для используемых моноклональных антител является эпитоп, который располагается на поверхности белка р40, обращенной в раствор; 2) антитела к белку р40 мешают трансляции мРНК р-актина.

1.2.3. Трансляция мРНК вируса гепатита С с добавлением различного количества антител к белку р40

Трансляцию проводили так же, как и эксперимент с мРНК актина. Как мы видим на рисунке 5, здесь наблюдается та же зависимость, что и при использовании матричной РНК актина: при повышении концентрации антител количество белка-продукта понижается. На основе проделанного эксперимента мы можем сделать вывод, что антитела против рибосомного белка р40 подавляют трансляцию, протекающую и по Ш.Е5-зависимому механизму. Этот факт подкрепляет ранее сделанные наблюдения, что белок р40 в малой субчастице рибосомы находится в области связывания субчастицы с ШЕЗ-элементом РНК вируса гепатита С.

1.2.4. Трансляция безлидерной мРНК фага А. с добавлением различного количества антител к белку р40

Как уже было сказано ранее, безлидерная мРНК перед инициаторным кодоном не имеет никакой последовательности, кроме одного гуанилового остатка. Ее трансляция может инициироваться двумя различными способами: путем канонического образования 485-инициаторного комплекса и путем прямого связывания с 805-рибосомой. Во втором случае инициация осуществляется без участия каких-либо факторов инициации трансляции.

Трансляцию безлидерной мРНК проводили при тех же условиях, что и две предыдущие матрицы, с добавлением таких же количеств антител.

120

0 200 500 1000

количество антител, нг

Рис.5. Эффективность трансляции безлидерной мРНК, либо мРНК, содержащей 5'-НТО HCV или актина, при добавлении различных количеств моноклональных антител против белка р40.

Результаты эксперимента показали, что антитела к р40 совершенно не способны ингибировать трансляцию безлидерной мРНК (рис.5). Из этого можно сделать два важных вывода. Во-первых, антитела против белка р40 не мешают ни элонгации, ни терминации трансляции, ни стерически, ни как-либо другим способом. Во-вторых, результаты выполненных экспериментов показали, что, несмотря на довольно умеренный вклад белка р40 в образование бинарного комплекса, его блокирование в малых субчастицах рибосом подавляет IRES- и кеп-зависимую трансляцию.

Что касается более конкретной функциональной роли белка р40, то следует еще раз вспомнить, что трансляция безлидерной мРНК может протекать в отсутствие каких-либо факторов инициации трансляции. Следовательно, можно предположить, что роль р40 как раз и заключается в связывании одного из факторов инициации трансляции. В пользу этого говорит тот факт, что его дрожжевой гомолог - белок SO - может взаимодействовать с двумя субъединицами фактора инициации eIF3: Tif32 и Nipl. С другой стороны, вряд ли в лизате ретикулоцитов инициация трансляции на безлидерной мРНК осуществляется исключительно по бесфакторному механизму. Известно, что область мРНК в 5'-сторону от инициаторного кодона контактирует в составе 485-комплекса с факторами инициации eIF2 и eIF3, а также рибосомной мРНК и рибосомными белками S5, S14, S26 и S28. В то же время, как следует из последних моделей малой субчастицы эукариотических рибосом, RpsO расположен в области «выхода» мРНК и, возможно, даже способен с ней

контактировать. Таким образом, более реалистичным выглядит предположение о том, чт связывание антител к р40 с рибосомой препятствует корректному взаимодействию 5' НТО мРНК с 40S субчастицей и/ или факторами инициации.

Полученные результаты, вкупе с результатами наших коллег, представленными опубликованной статье, являются первыми свидетельствами, указывающими на рол белка р40 в инициации трансляции по кеп-независимому механизму.

2. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: влияние области нт. 1-41 на работу IRES'a

Традиционно IRES-элементом мРНК вируса гепатита С принято считать участок 5' НТО с 42 по 342 нуклеотид, который включает домены И, III и IV этой 5'-НТО. Важная роль предшествующих IRES'y 5'-проксимальных 40 нуклеотидов (так называемый домен I 5'-НТО) в репликации вируса ни у кого не вызывает сомнений, однако возможное участие их в трансляции вирусной мРНК до сих пор остается предметом дискуссий. В последнее время роль домена стали рассматривать с новой стороны в связи с нахождением в нём сайтов связывания специфичной печеночной микроРНК miR-122, которая по одним данным стимулирует работу IRES-элемента, а по другим данным - нет. В литературе в ряде работ домен I ингибировал трансляцию, в некоторых - стимулировал, поэтому целью наших исследований было разобраться в вопросе о роли домена I в функции IRES-элемента РНК HCV и проверить различные выдвигаемые в литературе гипотезы о механизме регуляции трансляции этим участком 5'НТО HCV.

2.1 Исследование влияния различных мутаций домена I на работу IRES'a HCV

2.1.1. Создание мутантных конструкций

Чтобы изучить роль домена I в инициации трансляции мРНК HCV мы создали на основе плазмиды pGL3R ряд молекулярно-генетических конструкций, содержащих в качестве репортерного ген люциферазы светлячка, вирусную З'-НТО HCV и различные варианты вирусной 5'-НТО со введенными делениями:

1) HCV-3'utr- полноразмерная немутированная конструкция;

2) HCV-Ala-3'utr - конструкция с удаленным субдоменом 1а (удалена только шпилька домена I);

3) HCV- AIab-3'utr - конструкция с полностью удаленным доменом I (удалены и шпилька и спейсер, конструкция начинается ровно с домена II IRES'a, с нт 42);

Матрицы для транскрипции in vitro получали методом ПЦР.

2.1.2. Удаление домена I повышает эффективность IRES-зависимой трансляции в in vitro. Первоначально мы проанализировали эффекты введенных мутаций на трансляцию in vitro. Полученные мРНК транслировались в цитоплазматическом экстракте асцитной карциномы Кребс-2. Данная система пригодна для изучения трансляции эукариотических мРНК в гораздо большей степени, чем традиционно используемый лизат ретикулоцитов кролика. Эффективность трансляции определяли по ферментативной активности гена-репортера при помощи набора фирмы Promega. Чтобы отличать специфическую HCV IRES-зависимую трансляцию от других способов инициации трансляции, в качестве одного из контролей использовалась та же система, но с добавлением доминантно-

негативного мутанта хеликазы eIF4A R362Q. Он полностью подавляет трансляцию, включающую процесс сканирования. Эффект добавления белка R362Q смотрели при параллельной контрольной трансляции всех мРНК с добавлением эквимолярного количества очищенного eIF4A дикого типа, чтобы убедиться, что само по себе добавление белка (или каких-либо компонентов буферного раствора) не влияет на работу трансляционной системы.

Как видно на диаграмме, полное удаление домена I стимулирует трансляцию почти в 2 раза, причем добавление в трансляционную смесь белка R362Q не меняет этого соотношения. Удаление же одной шпильки 1а мало влияет на работу IRES'а.

Из этих данных, можно однозначно сделать вывод, что домен I 5'-НТО HCV не является необходимым для трансляции элементом. И даже наоборот ингибирует ее.

2.1.3. Удаление домена I повышает эффективность IRES-зависимой трансляции в 4 раза -в клетках печени человека и в 2 раза - в непеченочных клетках.

Одинаковые количества (по 400 нг) А-кепированных мРНК трансфицировали в клетки НЕК293Т (клетки почек эмбриона), а также HepG2 и Huh7 (обе линии - клетки гепатомы) человека. Трансфекцию осуществляли липофильным агентом Унифектин-56. Чтобы учесть возможную разницу в эффективности трансфекции и лизисе клеток, вместе с исследуемой мРНК мы котрансфецировали по 20 нг кепированной мРНК, кодирующей люциферазу Renilla reniformis.

2,5 2 1,5 1

0,5

0

п

w/t

п

¿13 ¿lab + elF4A

I !

I i

!

i s

N !!

ri'i.,-1— тлил

Д1а : ¿lab + R362Q

Рис. 6 Диаграмма результатов трансляции в экстракте БЗО асцитной карциномы Кребс-2. Все результаты нормированы к значениям эффективности трансляции конструкции НСУ-

з'итя.

В соответствии в результатами экспериментов in vitro полное удаление домена I повышает уровень трансляции и in vivo. мРНК HCV-AIa-3'utr ведет себя менее однозначно: как и in vitro мы наблюдаем незначительное подавление трансляции в клетках НЕК293Т, тогда как в обеих линиях клеток гепатомы человека она транслируется практически на одном уровне с мРНК дикого типа. В любом случае из совокупности данных in vitro и in vivo можно заключить, что ингибирующий эффект домена I на трансляцию связан в основном с межшпилечной областью (нуклеотиды 21-41), то есть с областью Ib, при этом, вопреки некоторым предположениям в литературе, наличие начала

открытой рамки

считывания вирусного полипептида не влияет на трансляцию.

Можно было бы предположить, что

наличие домена I или только lb влияет на способность IRES'a связывать малую

субчастицу рибосомы,

Рис. 7, Сравнение трансляционной эффективности IRES'a HCV с

удаленными доменами la и lab в присутствии и отсутствие кодирующей ЧТО ЯВЛЯСТСЯ первым части.

этапом в инициации

трансляции на мРНК HCV. Чтобы проверить это предположение, мы сравнили эффективности образования бинарных комплексов соответствующих фрагментов мРНК HCV с малой субчастицей рибосомы методом связывания рибонуклеопротеидных комплексов с нитроцеллюлозной мембраной: 40S субчастицы рибосом инкубировали с радиоактивно меченными мРНК HCV, после чего полученные комплексы пропускали через нитроцеллюлозную мембрану. При этом, как известно, несвязанная с рибосомами РНК мембраной не задерживается. Проанализировав радиоактивность, задержанную мембраной, можно определить количество связавшейся РНК, иколичественно оценить сродство разных РНК к рибосомным субчастицам в исследуемых комплексах.

Ч»

■ Huh-7 яHepG2 кНЕК293Т

■120К-

-*-НО/-Д1а

■ НСУ-Д1аЬ

нсу

-12

-11.5

11

10,£

-10 ■О([405)

8

Рис.8 Изотермы связывания малых субчастиц рибосом с ШЕЗ-злементами НСV дикого типа и его мутантными вариантами Д1а и Д1аЬ.

Как следует из данных, приведенных на рис.8, наличие полноразмерного домена I либо только лишь его субдомена 1Ь не влияют на аффинность ШЕБ'а к малой субчастице рибосомы. Таким образом, мы можем заключить, что домен I 5'-НТ0 мРНК НСУ ингибирует трансляцию мРНК от 2 (в непеченочных клетках) до 4-5 (в печеночных клетках) раз, причем удаление домена не влияет на способность 1КЕ8'а взаимодействовать с малой субчастицей рибосомы. Различный уровень стимуляции трансляции в печеночных и непеченочных клетках наводит на мысль о возможной тканеспецифичности его работы. Можно предположить, что с доменом I связываются специфические белки, что приводит к снижению эффективности трансляции. Причем, следует отметить, что конструкция НСУ-Д1а-3'иЦ- транслируется практически наравне с РНК дикого типа, что указывает на важность именно межшпштечной области (1Ь). Эти данные противоречат имеющемуся в литературе предположению о стимуляции трансляции НСУ печеночной микроРНК т1КЛ22, взаимодействующей с удаленной нами межшпилечной областью.

3. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: роль З'-НТО

Роль З'-НТО мРНК НСУ в трансляции до сих пор однозначно не определена. Если же З'-НТО стимулирует ШЕЗ-зависимую трансляцию, то ничего неизвестно о возможном механизме такой стимуляции. З'-НТО вируса гепатита С уникальна среди вирусов, содержащих гепатитоподобные Ш.Е8'ы. Она чрезвычайно консервативна и имеет уникальную трехчастную структуру: поли(11/иС) тракт, вариабельную часть и так называемую область X-region, представляющую собой 3 шпильки. Учитывая эти

обстоятельства, мы решили посмотреть, насколько специфична стимуляция З'-концом для IRES'a именно гепатита С, а также проверить гипотезу о тканеспецифичности такой стимуляции. Последний аспект особенно важен, поскольку вирус HCV реплицируется в клетках печени.

3.1 Создание химерных конструкций

Мы создали несколько химерных моноцистронных мРНК, содержащих в качестве репортерного ген люциферазы светлячка. В 5'-НТО такие конструкции содержали либо IRES вируса гепатита С, либо схожий по вторичной и третичной структуре [RES PTV-1, либо совершенно отличный от HCV и PTV-1 IRES EMCV, либо же кепированную 5'-НТО канонической эукариотической мРНК ß-актина. Следует особо подчеркнуть, что хотя IRES PTV-1 и похож на IRES HCV, этот вирус относится к совершенно другому семейству - семейству пикорнавирусов. Таким образом, мы предполагали проверить, является ли стимуляция З'-НТО специфичной для HCV-подобных IRES-элементов. В 3'-НТО наши конструкции содержали либо исследуемую З'-НТО HCV, либо случайную последовательность длиной ок. 200 нуклеотидов, либо ее же, но содержащую также поли(А)-хвост, характерный для эукариотических мРНК (рис. 9).

рту г/-нто

S'-HTO

Рр по рте р н ы Г|

ГРИ

5' •"•" Го н л lo ц иферз зы с вотл яч ка | [•;:•—

и/с 3*

114 »гкд*

(тио.1*до»^т*льыисть : 200 ИТ

в ч <•<'►, л ч 3

5'-НТО

Рис. 9 Схематическое изображение созданных химерных конструкций.

я 1> » лт«л ь м о гт ь 1 200 кт

з'-нто

3.2 З'-НТО вируса гепатита С не стимулирует трансляцию, направляемую как IRES'om

HCV. так и IRES'ом PTV-1 in vitro

Для начала нам необходимо было определиться с трансляционной системой, в которой проводились бы дальнейшие исследования. В первоначальных опытах,

проведенных в стандартных in vitro системах, таких как лизат ретикулоцитов кролика или цитоплазматический экстракт клеток мышиной асцитной карциномы Кребс-2, З'-НТО мРНК HCV не стимулировал трансляцию, направляемую IRES'om HCV (рис.10).

Таким образом, эти трансляционные системы не подходят для наших исследований, т.к. мы не наблюдали эффекта стимуляции З'-НТО HCV in vitro.

3.3 З'-НТО вируса гепатита С стимулирует трансляцию, направляемую как IRES'om HCV. так и IRES'om PTV-1 in vivo

Мы трансфицировали химерные мРНК, содержащие IRES HCV или PTV-1 в 5'-НТО и неспецифическую последовательность или З'-НТО HCV с З'-конца, в клетки линии Huh7, HeLa и НЕК293Т. Эффективность трансфекции анализировали стандартным описанным ранее способом: контрансфекцией кепированной мРНК Renilla reniformis.

Результаты показали, что З'-НТО HCV в 5-6 раз стимулирует трансляцию, направляемую как IRES'om HCV, так и IRES'om PTV-1 (рис. 11). Кроме того, мы не обнаружили и

тканеспецифичности этого эффекта. З'-НТО HCV почти так же эффективно стимулирует трансляции обоих IRES'ob и в непеченочных клетках: в 4-6 раз в HeLa и в 3,5-5 раз - в НЕК.293Т.

Относительные значения активностей Flue

Рис. 10 Результаты трансляции конструкции HCV+/-3'UTR in vitro.

HeLa

емН «IRES HQ/

■.'(■'■■ ш IRE5 PTV

Huh7 НЕК293Т

Рис. /1 Стимуляция трансляция мРНК 3 'НТО НСV in vivo клетках линий Huli7. HeLa и НЕК293Т.

Полученные результаты представляют интерес и потому, что РТУ является представителем не семейства Е1амптс1ае, а Р1сотам1г1йаг и, помимо различий в структуре кодируемого полипептида, отличается от НСУ структурой З'-НТО: она полиаденилирована, что характерно для пикорнавирусов. Поэтому результаты наших экспериментов показывают, что нет никакого специфического взаимодействия между структурами 5'-и З'-нетранслируемых областей НСУ.

3.4 Удаление разный областей З'-НТО НСУ снижает эффективность ШЕЗ-зависимой трансляции

Как мы уже говорили, З'-НТО НСУ сильно структурирована и состоит из трех частей: вариабельной части, поли(и/иС)-тракта и Х-области, образующей три шпильки на самом конце РНК. Мы решили изучить вклад каждой из областей в стимуляцию трансляции З'-НТО НСУ. Для этого у РНК удаляли различные фрагменты З'-НТО по отдельности либо вместе и смотрели, как эти делеции сказываются на стимуляции трансляции.

Рис. 12 Влияние удаления различных частей З'-НТО HCV на стимуляцию трансляции: ВО -вариабельной области, U/UC - поли(и/иС)-тракта. и X - Х-области.

Как мы видим на рисунке, удаление Х-области снижает стимуляцию трансляцию, направляемую как IRES'om HCV (в 3 раза), так и PTV-] (в 2 раза) обоих линиях клеток, HeLa и Huh7. Удаление поли(и/иС)-тракта как индивидуально, так и совместно с удалением вариабельной части также в обоих случаях сказывается на стимуляции трансляции, хотя и в меньшей степени (снижение на -30-40%), чем удаление Х-области.

Что касается удаления вариабельной части, то здесь мы наблюдаем небольшое подавление трансляции, направляемой IRES'ом HCV (-30%) и практически отсутствие какого-либо эффекта в стимуляции трансляции РНК, содержащей IRES PTV-1.

Данные эксперимента позволяют сделать вывод, что Х-область и поли(и/иС)тракт неспецифически задействованы в процессе трансляции. К наличию же вариабельной части чувствительна лишь трансляция, направляемая IRES'ом HCV. Возможно, это указывает на специфичность взаимодействия 5'-и З'-нетранслируемых областей. Однако, никаких данных о специфической роли вариабельной части в трансляции мРНК вируса гепатита С в литературе нет. Предположить же механизм по результатам этого эксперимента довольно сложно.

3.5 Стимуляция трансляции З'-НТО HCV не является следствием разной стабильности мРНК

Давно известно, что вклад в трансляционную эффективность могут давать два фактора: собственно эффективность трансляции и стабильность мРНК. Вполне естественно, что когда речь идет о сравнении эффективности трансляции трансфицированных мРНК, сразу встает вопрос: не может ли разный уровень трансляции быть обусловленным различной их стабильностью? Чтобы изучить возможную роль З'-НТО в стабилизации исследуемых мРНК, мы использовали метод ПЦР в реальном времени. Мы трансфицировали мРНК, содержащие IRES HCV, в клетки линии Huh7

Рис. 13 Анализ стабильности репортерных мРНК количественным ПЦР'ом в реальном времени. На этом же графике представлен аналю стимуляции трансляции во времени.

нелипофильным реагентом (ЕхОеп 500), а затем через разное время (2, 4, 6 и 8 часов) после трансфекции экстрагировали суммарную РНК из половины клеток, в то время как вторую половину использовали для измерения активностей репортерных белков.

1,6

- отношение

6 Т 1 л

X 7 ».......т..............................................................I 1,4 х трансляции мРНК с

° ' ' 3'MTOHCVK

трансляции

5 • — - SL^ .....1 й контрольной мРНК

— "Относительное количество

3 -.......т............ т т 0.6 о * контрольной мРНК

4 • i 0.8

0-4 g

Н

1 --------------------------------------------------- 0,2 g ^ А-** Относительное

количесгоомРНК с

0

З'ИТО IICV

время, часы

Как видно на рисунке, стабильность исследуемых мРНК примерно одинакова, несмотря на различный уровень их трансляции (рис. 13).

Таким образом, эффекты, оказываемые З'-НТО РНК HCV на трансляцию, не связаны с различиями в стабильности, а связаны именно с трансляцией, как таковой.

3.4 Стимуляция трансляции З'-НТО HCV не зависит от механизма инициации.

Мы заменили вирусную З'-НТО на кепированную 5'-НТО мРНК р-актина и обнаружили, что в клетках линии Huh7 З'-НТО вируса гепатита С также стимулирует и кеп-зависимую трансляцию. Причем, стимуляция примерно на том же уровне и

стимуляции полиА-хвостом (рис.14).

Такие же результаты были получены и для трансляции, осуществляемой не родственным гепатиту IRES'om EMCV.

Как мы видим, З'-НТО HCV наравне с полиаденилированным хвостом стимулирует как кеп-зависимую трансляцию, так и трансляцию, направляемую IRES'-ом EMCV, что указывает на полное отсутствие специфического взаимодействие со структурами в З'-НТО мРНК.

Интересно, что мы наблюдали и обратный результат: полиА-хвост стимулирует трансляцию,

направляемую JRES'om HCV, хотя и в чуть меньшей степени, чем З'-НТО HCV.

Полученные нами результаты опровергают довольно широко распространенное мнение о специфичности стимуляции трансляции З'-НТО HCV. Возможно, наличие З'-НТО HCV, подобно полиА-хвосту, вовлекает в процесс трансляции дополнительные

Рис.14 Стимуляция трансляции мРНК, содержащих 5'НТО мРНК бета-актина и вируса энцефаломиокардига, У-нетранслируемой областью мРНК HCV и поли(А)-хвостом.

Рис. 15 Диаграммы стимулации трансляции мРНК HCV и PTV поли(А)-хвостом в различных клеточных линиях.

факторы. Однако стоит отметить, что несмотря на множество гипотез о значении взаимодействия З'-НТО HCV с различными РНК-связывающими белками, ни одна из них не получила однозначного экспериментального подтверждения. Это касается в первую очередь таких белков как Ьа-аутоантиген и РТВ. Хотя, возможно, оба белка могут взаимодействовать как с 5'-НТО HCV, так и с полипиримидиновым участком З'-НТО, их участие в вирусной трансляции довольно сомнительно.

Интересно, что в отличие от экспериментов in vivo, трансляции in vitro в двух разных системах не показали даже слабой стимуляции З'-нетранслируемой областью HCV. Этот факт наводит на мысль о том, что роль З'-НТО в трансляции может заключаться не во взаимодействии с какими-либо специфическими или неспецифическими факторами, способствующими трансляции, а в доставке мРНК в определенный клеточный компартмент. На это указывает и стимуляция IRES-зависимой трансляции in vivo полиА-хвостом (рис.15).

Таким образом, результаты этой части работы показали, что З'-НТО вируса гепатита С стимулирует как IRES-зависимую, так и кеп-зависимую трансляцию in vivo в клетках различных тканей человека от 2 (в случае актина и IRES'a EMCV) до 6 (в случае IRES'ob HCV и PTV-1) раз. Эта стимуляция не является тканеспецифичной. В свою очередь полиА-хвост также неспецифически стимулирует трансляцию, направляемую IRES'om HCV в печеночных и непеченочных клетках в -3,5 раза.

Это ставит вопрос о существовании в живых клетках механизмов стимуляции трансляции, которые совершенно не проявляются в бесклеточных системах. Одним из таких механизмов, как уже указывалось выше, может быть направление РНК в компартмент, благоприятный для инициации трансляции, например из-за того, что там концентрируются какие-то ключевые факторы трансляции. Другое объяснение, совместимое с только что приведенным, состоит в том, что 3' НТО HCV способен неспецифически "привлекать" фактор(ы) трансляции, тем самым создавая их повышенную концентрацию в гипотетическом компартменте, где происходит инициация трансляции на тестируемой мРНК.

выводы

1. Исследовано взаимодействие IRES-элемента РНК вируса гепатита С с 40S субчастицами рибосом человека. Показано, что блокирование рибосомного белка р40 моноклональными антителами практически полностью подавляет трансляцию, направляемую этим IRES-элементом.

2. Первые 40 нуклеотидов 5'-нетранслируемой области РНК вируса гепатита С не являются необходимыми для трансляции и даже, наоборот, ингибируют работу IRES-элемента HCV в 2-4 раза. Основной вклад в это ингибирование вносит область между доменом I и доменом II, который уже входит в состав IRES-элемента.

3. Показано, что в случае кепирования 5'-нетранслируемой области РНК вируса HCV она может направлять трансляцию как по IRES-зависимому, так и по сканирующему механизму.

4. Показано, что в отличие от экспериментов in vivo З'-нетранслируемая область мРНК HCV не стимулирует IRES-зависимую трансляцию in vitro в различных бесклеточных системах.

5. З'-нетранслируемая область мРНК HCV стимулирует трансляцию in vivo независимо от того использует ли тестируемая мРНК кеп-зависимый или IRES-зависимый механизм инициации синтеза белка. Стимулирующий эффект не является тканеспецифичным и наблюдается как в печеночных, так и в клетках другого происхождения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. С.Е. Дмитриев, Д.Е. Андреев, З.В. Адьянова, И.М. Теренин, И.Н. Шатский (2009). Эффективная кеп-зависимая трансляция мРНК млекопитающих с длинными и сильно структурированными 5'-нетранслируемыми областями in vivo и in vitro. Мол. Биол., 43(1), 119-125.

2. А.А. Малыгин, З.В. Бочкаева, Е.И. Бондаренко, O.A. Косинова, В.Б. Локтев, И.Н. Шатский, Г.Г. Карпова (2009).

Связывание IRES-элемента РНК вируса гепатита С с 40S субчастицей рибосомы: роль белка р40. Мол. Биол., 43 (6), 1070-1076.

3. С. Bung, Z. Bochkaeva, I. Terenin, R. Zinovkin, I. Shatsky, M. Niepmann (2010). Influence of the hepatitis С virus 3'-untranslated region on IRES-dependent and cap-dependent translation initiation. FEES Lett., 584(4), 837-842.

4. Z. Bochkaeva, I. Terenin, D. Andreev, S. Dmitriev, I. Shatsky (2010).

Two modes of translation of single mRNA. The meeting "Ribosomes 2010", 3-7 May 2010, Italy.

Подписано в печать 24 мая 2010 г. Заказ 666. Формат 60 х 90/16 Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Центр интерактивных технологий и маркетинга» Москва, 1-й Коптельский пер., 2/7.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бочкаева (Адьянова), Занда Владимировна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

1. Инициация трансляции у эукариот.

1.1 Ken-зависимый механизм инициации трансляции.

1.2 IRES-зависимые механизмы инициации трансляции.

1.3 5'-зависимая трансляция на мРНК, содержащих гепатитный и гепатитоподобный IRES.

2. Вирус гепатита С.

2.1 Геномная организация вируса гепатита С.

2.2 IRES вируса гепатита С.

2.3 Белки 40S субчастицы рибосомы, взаимодействующие с IRES'ом вируса гепатита С: белок р40.

2.3.1 Белок малой субчастицы рибосомы р

2.4 Домен I 5'-нетранслируемой области мРНК HCV.

2.5 Регуляция трансляции на мРНК вируса гепатита С.

2.5.1 Регуляция трансляции мРНК вируса гепатита С: клеточные белки: Антиген La

Полипиримидиновый тракт-связывающий белок (РТВ) Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин L (hnRNP L) Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин D (hnRNP D) Белок, ассоциированный cNSl 1 (NSAP 1)

Белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF2BP1)

2.5.2 Регуляция трансляции мРНК вируса гепатита С: вирусные белки: Белок core

Неструктурные белки 4А и 4В

2.5.3 Регуляция трансляции мРНК вируса гепатита С: РНК-структуры: Специфическая печеночная микроРНК miR

2.6 З'-нетранслируемая область.

Результаты и обсуждение.

1. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: роль рибосомного белка р40 в связывании IRES-элемента с 40S субчастицей рибосомы.

1.1 Изучение влияния белка р40 на образование бинарного комплекса между IRES-элементом вируса гепатита С с 40S субчастицей рибосомы.

1.1.1 Получение белка р

1.1.2 Исследование малых субчастиц рибосом на наличие белка р40 и насыщение им

1.1.3 Исследование влияния р40 на эффективность связывания малых субчастиц рибосом с мРНК вируса гепатита С

1.2 Исследование необходимости белка р40 для трансляции различных матричных мРНК.

1.2.1 Пробные трансляции для проверки зависимости интенсивности трансляции от количества мРНК

1.2.2 Трансляция мРНК актина с добавлением различного количества моноклональных антител к белку р

1.2.3 Трансляция мРНК вируса гепатита С с добавлением различного количества антител к белку р

1.2.4 Трансляция безлидерной мРНК фага X с добавлением различного количества антител к белку р

2. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: влияние области нт. 1-40 на работу IRES'a.

2.1 Исследование влияния различных мутаций домена I на работу IRES'a HCV.

2.1.1 Создание мутантных конструкций

2.1.2 Удаление домена I повышает эффективность IRES-зависимой трансляции в 1,5-2 раза in vitro

2.1.3 Удаление домена I повышает эффективность IRES-зависимой трансляции в 4 раза в клетках печени человека и в 2 раза - в непеченочных клетках

2.1.4 Удаление домена I не влияет на способность IRES'a связывать малую субчастицу рибосомы

2.1.5 Ken-структура стимулирует IRES-зависимую трансляцию конструкции дикого типа в 2 раза и не стимулирует трансляцию конструкции с удаленным доменом I

2.2 Два механизма трансляции на одной мРНК.

IRES HCV может направлять трансляцию только со своего инициаторного кодона

3. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: роль 3 '-НТО.

3.1 Создание химерных конструкций.

3.2 З'-НТО вируса гепатита С не, стимулирует трансляцию, направляемую как

IRES'ом HCV, так и IRES'om PTV-1 in vitro.

3.3 З'-НТО вируса гепатита С стимулирует трансляцию, направляемую как IRES'om HCV, так и IRES'om PTV-1 in vivo.

3.4 Удаление разный областей З'-НТО HCV снижает эффективность IRES-зависимой трансляции.

3.5 Стимуляция трансляции З'-НТО HCV не является следствием разной стабильности мРНК.

3.6 Стимуляция трансляции З'-НТО HCV не зависит от механизма инициации.

Выводы.

Материалы и методы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Специфические особенности инициации трансляции на РНК вируса гепатита С"

Трансляция мРНК в клетке - это сложный процесс, который разделяют на три основные стадии: инициация, элонгация и терминация. Лимитирующей стадией всего процесса биосинтеза белка является инициация трансляции - стадия, на которой происходит присоединение рибосомы к мРНК и поиск стартового кодона с последующей элонгацией. В силу этого, регуляция процесса трансляции в эукариотической клетке обычно направлена именно на регуляцию стадии инициации. Поэтому неудивительно, что как раз инициация трансляции в первую очерель привлекает внимание ученых, изучающих регуляцию биосинтеза белка.

В клетках эукариот помимо канонического кеп-зависимого механизма, когда рибосома привлекается на мРНК с помощью метилированного остатка гуанозина на 5'-конце мРНК - кепа (от англ. cap), инициация трансляции может осуществляться за счет посадки рибосомы непосредственно внутри мРНК (так называемые участки внутренней посадки рибосомы или IRES, от англ. Internal Ribosomal Entry Site). По кеп-зависимому механизму транслируются если не все, то, по крайней мере, подавляющее большинство всех мРНК эукариот, тогда как IRES-зависимая инициация характерна для РНК вирусов, чей жизненный цикл протекает в цитоплазме. Не имея на 5'-конце собственных мРНК кеп-структуры, они не могли бы эффективно конкурировать с клеточными матрицами, не будь у них специальных механизмов инициации трансляции. Также уже почти два десятка лет продолжается дискуссия о существовании IRES'ob в клеточных мРНК, однако, однозначного мнения по этому вопросу пока нет.

Одним из вирусов, использующих IRES-зависимый механизм инициации для трансляции своей мРНК в клетках, является высокопатогенный вирус гепатита С. В настоящее время по приведенным в литературе оценкам им инфицировано около 3% мирового населения (170 млн человек), и как причина смерти гепатит С выступает даже чаще, чем вирус иммунодефицита человека. При заражении вирус в основном поражает клетки печени, но причины такой тканеспецифичности пока неизвестны. Одна из наиболее вероятных гипотез - регуляция жизненного цикла вируса специфическими белками клеток печени.

Со времени своего открытия в 1989 году вирус гепатита С является одним из самых изучаемых вирусов, однако многие аспекты его жизненного цикла остаются малоизученными в силу отсутствия хороших in vivo систем, где бы вирус эффективно реплицировался. Некоторые важные детали трансляции его мРНК также остаются неразгаданными: как осуществляется регуляция трансляции мРНК вируса, какие 5 рибосомные белки участвуют во взаимодействии рибосомы с IRES'ом, каковы роли отдельных доменов 5'-нетранслируемой области и высоко консервативной 3'-нетранслируемой области мРНК, чем обоснованна такая тканеспецифичность вируса? Все это далеко не полный перечень вопросов, которые до сих пор остаются открытыми и ответы на которые, возможно, позволили бы в перспективе хотя бы снизить риск развития тяжелых заболеваний (цирроз и рак печени) после инфицирования вирусом гепатита С.

В частности по структуре и функциональной роли 5'- и 3'- нетранслируемых областей РНК HCV уже опубликованы сотни работ. И, тем не менее, все время остаются неясные моменты в их организации, механизме взаимодействия с 40S рибосомными субчастицами и друг с другом. Три части этой диссертационной работы и посвящены отдельным, наиболее спорным, аспектам организации и функционирования 5'- и 3'-нетранслируемых областей РНК вируса гепатита С.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Бочкаева (Адьянова), Занда Владимировна

Выводы

1. Было показано, что блокирование белка р40 малой рибоеомной субчастицы, несмотря на довольно умеренный вклад белка в образование бинарного комплекса, практически полностью подавляет трансляцию, направляемую IRES'om вируса гепатита С.

2. Домен I 5'-нетранслируемой области мРНК вируса гепатита С не является необходимым элементом трансляции и даже, наоборот, ингибирует работу IRES'a в 2-4 раза. Причем критичным для трансляции является именно наличие межшпилечной области домена I.

3. На основе мРНК HCV была создана модельная РНК, трансляция на которой может осуществляться как по IRES-зависимому, так и по сканирующему механизму. Также было показано, что трансляция может осуществляться только по одному из механизмов. Трансляция, основанная на совокупности механизмов, невозможна.

4. З'-нетранслируемая область мРНК HCV не стимулирует IRES-зависимую трансляцию in vitro в различных бесклеточных системах.

5. З'-нетранслируемая область мРНК HCV неспецифически стимулирует трансляцию in vivo как в печеночных, так и в непеченочных клетках.

Материалы и методы

1. Реактивы и материалы.

В работе были использованы следующие реактивы и материалы: немеченые дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты фирмы Хеликон (Россия), рибонуклеозид-5'-трифосфаты фирмы Promega (США), у-[32Р]-АТР и а— [32Р]-АТР из Обнинска, кеп-аналог (Promega (США)) и ApppG (NEB (США). 1,4-дитио-0,Ь-треитол (DTT); Р-меркаптоэтанол фирмы Serva (Германия); акриламид и NjN'-метиленбисакриламид фирм Serva (Германия); агароза фирмы Sigma (США) и нитроцеллюлозную мембрану (). В качестве красителей для электрофореза использовали бромфеноловый синий фирмы Merck (Германия), ксиленцианол фирмы Chemicals (Англия). Использовали неорганические реагенты фирм Sigma (США) и Merck (Германия). В работе использовали бактоагар, бактотриптон, дрожжевой экстракт фирмы DIFCO (США); ампициллин завода "Синтез" (Пенза). Все использованные в данной работе олигонуклеотиды были синтезированы на фирме Synthol (Россия).

Биопрепараты: ингибитор рибонуклеаз, полинуклеотидкиназа фага Т4, ДНК-лигаза фага Т4, РНК-полимераза фага Т7 фирмы Fermentas (Литва), эндонуклеазы рестрикции фирм Fermentas (Литва) и Сибэнзим (Россия), маркеры молекулярного веса ДНК фирм Fermentas (Литва) и Хеликон (Россия), свободная от РНКаз ДНКаза RQ1 фирмы Promega (США) и обратная транскриптаза SuperScript II (Invitrogen (США)). При клонировании использовали штамм Е. coli JM109. Для получения рекомбинантных белков использовали штаммы Е. coli BL21(DE3) и Rosetta (DE3) фирмы Novagen (США).

При проведении центрифугирования в градиенте сахарозы использовалась сахароза фирмы MP Biomedicals (США). При проведении трансляции в * бесклеточной системе in vitro использовали [358]-метионин фирмы Amersham Biosciences (США) и смесь аминокислот без метионина и с метионином фирмы Promega (США). При проведении ПЦР в реальном временно использовали флуоресцирующую смесь EvaGreen Basic Mix фирмы Biotium (США).

При работе с клеточными линиями использовалась среда DMEM (Gibco, США), сыворотку, трипсин и смесь антибиотиков фирмы Sigma (США). В качестве трансфецирующих реагентов использовали Унифектин-56 (Росбиолинк) и ExGen 500 фирмы Fermentas (Литва). Для измерения активности генов репортеров Renilla luciferase и Firefly luciferase использовался набор реагентов фирмы Promega (США).

2. Плазмидные конструкции

Использованная в разделе работы по изучению рибосомного белка р40 плазмидная конструкция была предоставлена коллегами из Новосибирска. Она сконструирована на основе вектора рЕТ-15Ь, и содержит кодирующую часть белка р40 человека, вставленную по сайтам Ndel и BamH I.

Конструкцию HCV-3'utr, содержащую полноразмерные 5'-и З'-НТО HCV, создали на основе имевшейся в лаборатории плазмиды T7-HCV-Fluc (содержала 40-341 нт 5'-НТО HCV сшитые с геном Flue под контролем Т7-промотора в векторе pGL3R). Из плазмидной конструкции, любезно предоставленной нашими немецкими коллегами (описана как pHCV+3'-utr в [11]), мы последовательно клонировали в нашу плазмиду полноразмерную 5'-НТО HCV (по сайтам StuI и Mlul вставили фрагмент Stul-Hindlll из плазмиды pHCV+3'utr) и З'-НТО HCV (по сайтам Xbal и Hpal вставили ПЦР-продукт с праймерами UTRdir и UTRjrev с плазмиды pHCV+3'utr, порезанный по Xbal). Плазмиды PTV-3'utr, EMCV-3'utr и actin-3'utr, содержащие Т7-промотор, соответсвующие названиям 5'-нетранслируемые области, ген люциферазы светлячка и З'-нетранслируемую область HCV в векторе pGL3R, получали путем аналогичного клонирования З'-НТО HCV в имеющиеся в лаборатории конструкции PTV-Fluc, EMCV-Fluc и actin-Fluc.

Конструкции HCV-AIa-3'utr и HCV-AIab-3'utr были созданы на основе конструкции HCV-3'utr путем ПЦР-мутагенеза, используя праймеры HCV-9 rev и HCV-9a dir и HCV-9b dir соответственно с последующим лигированием.

Конструкция с двумя инициаторными AUG-кодонами HCV 11 представляет собой конструкцию HCV-3'utr, из нее методом ПЦРа всей плазмиды и последующим лигированием синтезировали остальные конструкции. Для этого использовали праймеры HCV4-UAG и HCV4-rev для замены 1-го AUG кодона и HCV10dir и HCV10rev для замены 2-го AUG-кодона. Соответствующие конструкции с мутированным субдоменом IHe IRES'a HCV получали ПЦРом всей соответствующей плазмиды с помощью праймеров HCV7-dir и HCV7-rev и последующим лигированием. Использованные праймеры:

3-UTR-rev ACATGATCTGCAGAGAGGCCAG для амплификации 3'-конца и ПЦР-транскрипции

3-UTR-dir CGTGTCTAGAGGTTGGGGTAAACACTCCG для амплификации З'-конца HCV7-dir AAGGTGCTTGCGAGTGCCC 20 nt \

HCV7-rev TCGGCAGTACCACAAGGCC 20 nt / для мутации в домене IHe HCV-9 rev CTATAGTGAGTCGTATTAAAAGC \

HCV-9a dir ACACTCCACCATAGATCACTCC | Удаление доменов la и Ia+Ib HCV-9b dir CCCTGTGAGGAACTACTGTC /

HCV4-UAG TAGAGCACGAATCCTAAACC \

HCV4-rev GGTGCACGGTCTACGAGACC /для замены 1-го AUG-кодона HCVlO-dir TACGAAGACGCCAAAAACATAAAG \

HCV 10-rev GGTTTTTCTTTGAGGTTTAGG / для замены 2-го AUG-кодона

3. Генноинженерные манипуляции

Все операции с ДНК плазмид: расщепление эндонуклеазами рестрикции, кинирование 5'-концов, лигирование, ПЦР, очистку ДНК в агарозном геле, трансформацию клеток Е. coli, выделение плазмид и прочее проводили в соответствии со стандартными протоколами. Секвенирование ДНК осуществляли в фирме ЦКП "Геном" (Россия).

4. Буферные растворы

1) Раствор ТЕ для растворения и хранения ДНК и РНК (рН 7.5)

10 шМ трис-HCl, рН 7.5; 1 шМ ЭДТА рН 8.0.

2) Электрофорезный трис-боратный (ТВЕ) буфер для проведения электрофореза ДНК и РНК:

0.089 М трис-борат; 0.089 М борная кислота.

3) Электрофорезный трис-глициновый буфер для проведения электрофореза белков в ПААГ:

Трис 0.025 М;

Глицин 0.2 М;

SDS 0.1 %.

4) 10х-ный буфер для нанесения при электрофорезе ДНК в агарозном геле:

0.25% бромфеноловый синий; 0.25% ксиленцианол; 50% глицерин.

5) 5х-ный буфер для нанесения при электрофорезе белка в SDS-ПААГ:

50% глицерин; 500 мМ Р-меркаптоэтанол; 0.25% бромфеноловый синий: 250 мМ трис-HCl рН 6.8.

6) Буфер А100:

100мМКС1; 10% глицерин; 0.1 мМ ЭДТА;

20 мМ трис-HCl рН 7.5; 0.5 мМ PMSF; 1 мМ DTT.

5. Трансформация клеток E.coli:

200 мкл суспензии компетентных клеток размораживали во льду, смешивали с 1-5 нг плазмидной ДНК и инкубировали во льду 40-50 минут. Затем проводили тепловой шок выдерживанием клеток в течение 30 секунд в водяной бане при 42°, добавляли 0,8 мл среды LB и инкубировали 1 час при 37°. После к клеткам добавляли антибиотик выращивали при 37° в течение ночи.

Среда LB (Luria-Bertani) для выращивания клеток E.coli. На 1 л: Бакто-триптон 10 г;

Бакто-дрожжевой эксракт 5 г;

NaCl Юг; рН доводили до 7.5 с помощью NaOH. Автоклавировали при давлении 0.5 атм 30 мин.

Антибиотик - ампициллин.

500 мг натриевой соли ампициллина растворяли в 10 мл воды. Рабочая концентрация - 50 мкг/мл.

6. Выделение плазмид:

Клетки осаждали в центрифуге 30 сек. на 14000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора I и инкубировали 10 мин при комнатной температуре, добавляли 150 мкл раствора II и инкубировали 5 мин во льду, затем добавляли 150 мкл раствора III и держали еще 10 минут во льду.

После центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин, отбирали супернатант, депротеинизаровали раствор фенол-хлороформной экстракцией и осаждали нуклеиновые кислоты добавлением 2.5 объемов EtOH, инкубировали 1 час при -20°. Центрифугировали при комнатной температуре 10 мин 13000 об/мин, осадок промывали 300 мкл 70% EtOH и сушили. После осадок растворяли в ТЕ с панкреатической РНКазой и инкубировали 1 час.

После наносили на агарозный гель и смотрели, правильно ли все получилось. Раствор I: 50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ ЭДТА. Раствор II: 1 мл 10% SDS, 1 мл 2н. NaOH, 8 мл воды.

Раствор III: 60 мл 5 М КО Ас, 11.5 мл уксусная кислота (ледяная), 28 мл воды.

7. Экспрессия белка в трансформированных клетках E.coli:

Колонию с чашки пересевали в LB и растили в течение ночи (40 мл среды, 40 мкл ампициллина и 100 мкл культуры, ~ 16 часов на качалке, 22°)

Утром клетки пересаживали в большой объем среды (800 мл среды, 800 мкл ампициллина и 20 мл культуры) и выращивали в течение 3 часов при 22° на качалке. Добавляли 800 мкл IPTG (1М) и выращивали еще 3 часа. После клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в буфере и разрушали ультразвуком (6 циклов по 30 секунд). Дебрис осаждали, а супернатант наносили на колонку, содержащую Ni-NTA агарозу. Буфер для ресуспендирования клеток: 50 мМ трис-HCl рН 7.5; 5% глицерин; 0.5 М NaCl; 2 мМ PMSF.

8. Выделение нативного белка р40:

Колонку перед нанесением промывали сначала 2 V I-EB, затем I-WB, после наносили на нее полученный супернатант. После промывали снова 2 V I-WB и элюировали белок 2 V I-EB. Все собирали фракциями по 0.5 мл. Все манипуляции производили на холоду (при 4°). Полученные фракции анализировали электрофорезом. Имидазол-washbuffer:

50 мМ трис-HCl рН 7.5; 0.5 М NaCl; 20 мМ имидазол. Имидазол-elutionbuffer:

50 мМ трис-HCl рН 7.5;

0.5 М NaCl;

300 мМ имидазол.

9. Получение РНК-транскриптов

РНК получали с помощью Т7-транскрипции. Реакцию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 80 мМ Hepes-KOH рН 7.4, 12 мМ Mg(CH3COO)2, 2 мМ спермидина, 10 мМ DTT, по 10 мМ ATP, UTP, СТР и GTP, 3-5 мкг линеаризованной ДНК, 20 ед. акт. рибонуклеазного ингибитора HPRI и 20 ед. акт. РНК-полимеразы фага Т7. После смешивания всех компонентов смесь инкубировали при 37°С в течение 1ч. Для получения кепированных и акепированных мРНК использовали смесь рибонуклеотидтрифосфатов по 10 мМ ATP, UTP, СТР, и 5 мМ m7GpppGTP или ApppG, после предынкубации при 37°С в течение 5 мин добавляли GTP до концентрации 0.5 мМ и инкубировали еще 1 ч. Для получения изотопно-меченой мРНК концентрацию UTP снижали до 1 мМ и добавляли 10

65 мМ a-[32P]-UTP. ДНК разрушали обработкой 3 мкл RQ DNase в течение 5 мин. После фенольной депротеинизации реакционную смесь очищали от солей и нуклеотидов гель-фильтрацией на сефадексе G50, РНК осаждали этанолом и растворяли в воде. Для получения мРНК, используемых для трансляции или РНК-трансфекции (РНК больше 2000 нт) реакционную смесь после разрушения ДНК инкубировали 1 час во льду с LiCl, добавленным до концентрации 2М, после инкубации РНК центрифугировали на охлажденной центрифуге 10 мин при 14000 об/мин, промывали 70% этанолом и растворяли в воде.

10. Трансляция в лизате ретикулоцитов кролика

Для трансляции использовали обработанный нуклеазой лизат ретикулоцитов кролика фирмы "Promega". Реакционная смесь содержала 4.3 мкл лизата, дополненного смесью ос аминокислот и [ SJ-метионином согласно рекомендации изготовителя, и 1 мкл водного раствора мРНК разной концентрации.

Электрофорез продуктов трансляции проводили по Лэммли в 12%-ном полиакриламидном геле. Радиоавтографы гелей получали с помощью прибора "Phosphorimager".

11. Сборка бинарного комплекса:

Собственно сборка бинарных комплексов проводилась в 20 мкл смеси, содержащей 20 мМ трис-HCl (рН 7.4), 120 мМ КС1, 1.5 мМ Mg(OAc)2, 0.25 спермидин-НС1, 1 мМ DTT, 0.4 мМ GTP, 2.5 пмоль 40S субчастиц и 0.1 мкг мРНК и разное количество белка р40 (0 -0.25 мкг). Смесь готовили во льду, затем инкубировали 10 минут при 30°С. Реакционная смесь наносилась на градиент сахарозы (5-20%), и центрифугировалась (ротор Beckman

SW41) в течение 4 часов при 33000 об/мин. Градиент раскапывали по 440 мкл и измеряли радиоактивность в каждой фракции.

12. Насыщение 40s субчастиц рибосом белком р40:

К 100 пмолям 40S добавили 20 мкг белка (5х-ный избыток), объем довели до 0.5 мл буфером А100, содержащим Mg, и инкубировали 10 мин при 37°С. После наносили на 1 мл 10%-го раствора сахарозы и центрифугировали в течение б часов 40000 об/мин (ротор Beckman SW50). Осажденные рибосомы ресуспендировали и анализировали электрофорезом.

13. Трансляция в лизате клеток асцитокарцинома Кребса-2 S30:

Для приготовления лизата клетки асцита Кребс-2 4 раза промыли центрифугированием (Beckman JA-20, 1200 rpm, 10 min) в изотоническом буфере (150 тМ NaCl, 35 тМ Tris-HCl рН 7.5). После четвертого цетрифугирования клетки ресуспендировали в 1,5-ном объеме гипотонического буфера (10 mM Tris-HCl рН 7.5, 10

66 шМ КСНзСОО, 1.5 mM Mg(CH3COO)2, 2.5 шМ DTT) и инкубировали во льду 20 мин. После разрушали гомогенизатором Даунса и лизат центрифугировали 20 мин на 15000 об/мин. Супернатант разаликвотили и хранили на -75°.

Трансляцию осуществляли в объеме 10 мкл, который содержал 5 мкл лизата, 1 мкл 10-кратного трансляционного буфера (200 шМ Hepes-KOH рН 7.6, 10 mM DTT, 5 mM spermidine-HCl, 6 шМ Mg(CH3COO)2, 80 mM creatine phosphate, 10 mM ATP, 2 mM GTP и 25 цМ каждой аминокислоты), отдельно добавленный КСНзСОО до 120 шМ и транслируемую мРНК нужного количества (обычно 200 нг), реакцию проводили на 30° в течение 1 ч. Для наблюдения эффекта подавления трансляции мутантом eIF4A, R362Q, в трансляционную смесь без мРНК добавляли XXX пмоль белка, инкубировали 5 минут, добавляли мРНК и инкубировали еще 1 час.

14. Связывание малых субчастиц рибосом полноразмерной и мутантной 5'-НТО HCV на нитроцеллюлозной мембране

Связывание проводили в специальном буфере (20 mM Hepes-KOH рН 7.6, 60 гпМ КСНзСОО, 60 mM КС1, 1,1 шМ Mg(CH3COO)2, 0,1 mM EDTA и 1 mM DTT) в суммарном л объеме 20 мкл в течение 15 минут на 37". [~P]-UTP -меченой мРНК для связывания брали 10 пмоль, а малых субчастиц рибосом от 0,003 до 20 пмоль. После инкубирования эппендормы держали во льду.

Нитроцеллюлозную мембрану нарезали кружочками, размером с 5-рублевую монету и помещали на вакуумный коллектор. Перед нанесением бинарного комплекса каждый кружочек промывали 1мл буфера для связывания и после нанесения промывали 3 мл того же буфера.

Радиоавтографы мембран со связавшимся бинарным комплексом получали с помощью прибора "Phosphorimager".

15. РНК-трансфекции

Клетки растили до конфлюэнтности 80% на 24-луночной планшете, и трансформировали по 420 нг мРНК на лунку с помощью реагента унифектин 56 согласно протоколу изготовителя. Через 3 часов после трансфекции клетки лизировали с помощью буфера, входящего в состав набора Dual Luciferase Assay (Promega), значения активностей firefly и renilla люцифераз измеряли с помощью реагентов из того же набора на люминометре.

16. Сравнение стабильностей мРНК

Трансфекцию клеток для сравнения стабильностей трансфецированных мРНК осуществляли нелипофильным реагентом ExGen. Через 2, 4, 6 или 8 часов часов клетки промывали фосфатнонатриевым буфером и снимали с поверхности бунки трипсином.

67

Суспензию клеток с каждой делили на 2 равные части: одна для измерения активностей люцифераз, вторая — для выделения суммарной клеточной РНК. Суспензии центрифугировали на 800 об/мин в течение 5 минут и отбирали буфер от клеток. Половину для измерения активностей люцифераз лизировали соответственно стандартному протоколу.

Для выделения суммарной клеточной мРНК клетки . Осадок растворяли в 10 мкл бидистиллированной воды и измеряли концентрацию РНК в растворе.

Перед обратной трансцрипцией проводили отжиг праймеров. Для этого использовали случайные гексамеры и олиго(дТ), которые содержались в специально предварительно приготовленном «миксе 3» (mix3: случайные гексамеры 0,1 мкг/мкл, олиго(дТ) 0,1 мкг/мкл и dNTPs 10mM). К одинаковому количеству РНК добавляли по 4 мкл «микса 3» и доводили объем до 13 мкл - отжигали 6 минут на 66°, после сразу помещали в лед. Обратную транскрипцию осуществляли набором SuperScript II Reverse Transcriptase в суммарном объеме 20 мкл согласно предложенному протоколу, т.е. добавляли по 4 мкл 5-кратного буфера, по 2 мкл 0, 1 М DTT, 0,5 мкл воды и 0,5 мкл SS II RT . Реакционную смесь инкубировали 10 минут на 25°, 55 минут на 43° и 15 минут на 70°. Полученную смесь разводили в 50 раз - матрица для ПЦР в реальном времени.

ПЦР в реальном времени осуществляли на приборе iCycler iQ5 (Bio-Rad) в суммарном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл матрицы, полученной обратной транскрипцией, 10 мкл 2,5-кратного специального буфера EvaGreen, по 5 пмоль специфической пары праймеров и mQ до нужного объема. Использовали следующие специфические праймеры (использованная ТПлавления-560):

RTFd 5' GAGGTTCCATCTGCCAGGTA 3' и RTFr 5' CCGGTATCCAGATCCACAAC 3' - для Flue;

RTRd 5' AACGCGGCCTCTTCTTATTT 3' и RTRr 5' ATTTGCCTGATTTGCCCATA 3' - для Rluc.

Обсчет результатов производили по формуле Xo/Ro=2exp(CtR-CtX), где Хо=количество мРНК Flue, Ro=KonH4ecTBo мРНК Rluc, С1Х=цикл, на котором люминисценция в лунке с праймерами к Flue пересекает пороговое значение, CtR=UHKn, на котором люминисценция в лунке с праймерами к Rluc пересекает пороговое значение.

Благодарности

Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Ивану Николаевичу Шатскому за организацию работы, грамотное руководство и всестороннюю поддержку. Искренне признательна своему второму научному руководителю Илье Михайловичу Теренину за обучение методам, обсуждение результатов и всевозможную помощь в выполнении и написании работы, выражаю отдельную благодарность Дмитрию Евгеньевичу Андрееву и Сергею Евгеньевичу Дмитриеву - сотрудникам нашей лаборатории - за обсуждение результатов, ценные советы и поддержку.

Благодарю проф. Карпову Г.Г. и Малыгина А.А. из Новосибирского института биотехнологии и фундаментальной медицина за предоставление плазмиды, содержащей ген белка р40, и антител к белку.

Также искренне благодарю проф. Нипмана М. и Бунг К. из Института биохимии (Гиссен) за хорошее сотрудничество и теплое гостеприимство.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бочкаева (Адьянова), Занда Владимировна, Москва

1. Iborra F.J., Jackson D.A., Cook P.R.(2004) The case for nuclear translation. J.Cell Sci. 117, 57135720.

2. Brogna S, Sato ТА, Rosbash M. (2002) Ribosome components are associated with sites of transcription. Mol Cell. 4, 93-104.

3. Banerjee A.K.(1980) 5'-terminal cap structure in eucaryotic messenger ribonucleic acids. Microbiol.Rev. 44, 175-205.

4. Lim L., Canellakis E.S.(1970) Adenine-rich polymer associated with rabbit reticulocyte messenger RNA. Nature 227, 710-712.

5. Kozak M.(1978) How do eucaryotic ribosomes select initiation regions in messenger RNA? Cell 15, 1109-1123.

6. Asano K., Clayton J., Shalev A., Hinnebusch A.G.(2000) A multifactor complex of eukaryotic initiation factors, elFl, eIF2, eIF3, eIF5, and initiator tRNA(Met) is an important translation initiation intermediate in vivo. Genes Dev. 14, 2534-2546.

7. Fekete C.A., Applefield D.J., Blakely S.A., Shirokikh N., Pestova Т., Lorsch J.R., Hinnebusch A.G.(2005) The elFIA C-terminal domain promotes initiation complex assembly, scanning and AUG selection in vivo. EMBO J. 24, 3588-3601.

8. Olsen D.S., Savner E.M., Mathew A., Zhang F., Krishnamoorthy Т., Phan L., Hinnebusch A.G.(2003) Domains of elFIA that mediate binding to eIF2, eIF3 and eIF5B and promote ternary complex recruitment in vivo. EMBO J. 22, 193-204.

9. Jackson R.J., Hellen C.U.T., Pestova T.V.(2010) The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Mol. Cell Biol. 10, 113-127.

10. Rogers G.W., Jr., Richter N.J., Merrick W.C.(1999) Biochemical and kinetic characterization of the RNA helicase activity of eukaryotic initiation factor 4A. J.Biol.Chem. 274, 12236-12244.

11. Rogers G.W., Jr., Lima W.F., Merrick W.C.(2001) Further characterization of the helicase activity of eIF4A. Substrate specificity. J.Biol.Chem. 276, 12598-12608.

12. Rogers G.W., Jr., Richter N.J., Lima W.F., Merrick W.C.(2001) Modulation of the helicase activity of eIF4A by eIF4B, eIF4H, and eIF4F. J.Biol.Chem. 276, 30914-30922.15,16,17,18,19,20,21,22,23.