Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Специализированные датчики 31Р-ЯМР для исследования биологических объектов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Специализированные датчики 31Р-ЯМР для исследования биологических объектов"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Физический факультет

На пр«аах рукописи

ШКАРИН Павел Юрьевич

УДК 578.084: 616—066.8 :615.28+ 578.084 : 616.127: 616—005.4

СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ ДАТЧИКИ зф-ЯМР ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

(03.00.02 — биофизика)

. , ; \

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1900

и-'"

)

Работа выполнена в Институте химической физики им. H.H.Се менова АН СССР в лаборатории ЯМР гетерогенных химических и био логических систем.

Научный руководитель: доктор биологических наук-,

профессор Л.А.СИБЕЛЩНА Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

С.Н.С. А. V. ^анин: кандидат физико-математических наук А. ГУревич Ведущая организация: Институт биофизики, г. Пущино

• Защита диссертации состоится - И" м&ш Л 991 г. в '{(> ^часов на заседании специализированного совета Ш ОФТТ (К.053.05.77) в МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, ПШ, Москва, Ленинские горы, ИГУ, физический факультет, аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физическог Факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан

"И « МШМх г.

Ученый секретарь специализированного совета J63 ОФТТ (К.053,05.77) в Ш йм. М.В.Ломоносова кандидат физико-математических наук

/Т.М.Козлое

/

/

ОЩАЯ ХАРАКТЕШСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Спектроскопия ядерного магнитного резо-щса находит все более широкое применение в биологии и медици-! благодаря принципиальной неинваз явности метода, быстроте поучения и разнообразию биохимической информации, доступной этому

1ТОДУ.

¥-ШР позволяет проследить содержание в живой ткани низ-молекулярных фосфорсодержащих метаболитов, к числу которых инадлежат макроэргические соединения, неорганический фосфат, .зличные фосфомоноэфиры и др. По положению сигнала фосфатной |уппы, присоединенной к какой-либо молекуле, можно определять епень связывания ее с катионами (Н*, Мдн" и т.д.) в том слу-е, если это связывание меняет химический сдвиг сигнала. В част-сти, можно контролировать внутриклеточный рН по положению сиг-ла неорганического фосфата.

Метод ^Р-ЯМР широко используется для обнаружения различий рмальной и патологической ткани в целях диагностики, а также я изучения реакции органа или ткани на различные воздействия -оксия, ишемия, терапия и т.д. Это приводит к успеху,, если изу-емые процессы влияют на энергетику клеток (меняется уровень еатинфосфата, АТФ, АД35, фосфатов Сахаров, неорганического фос-та) или на метаболизм мембран (накапливаются продукты синтеза и деградации фосфолипидов: различные фосфомоноэфиры и фосфоди-иры). В экспериментальной биологии и медицине практикуются два дхода: I) исследуемый орган или ткань находятся непосредствен-в живущем организме (при этом отклик на какое-либо воздейст-е опосредован организмом); 2) орган изолирован и перфузирован.

В серийных датчиках ЯМР, предназначенных для получения спек-ов образцов в ампулах диаметром 10 и 20 мм, во многих случаях удно, а подчас, невозможно, осуществить эксперименты в рамках их двух подходов. Поэтому экспериментатору необходимо иметь со-ветствукпще датчики "^Р-ЯМР, обладающие достаточно высокой чув-вительностью (спектр должен быть получен за время, удовлетворя-ее задачам эксперимента) и обеспечивающие удобство выполнения сперимента.

-г -

II ель-работа. Настоящее исследование связано с разработкой датчиков Е-ЯИР с поверхностной катушкой для получения спектра органа, находящегося в живущем организме, и датчиков для исследования перфорированных органов. В задачи работы входило использование разработанных датчиков для решения конкретных бпологичес ких задач. Лдтчик с поверхностной катушкой был применен для исследования энергетического метаболизма солидной опухоли мелано-ма Ш6, привитой мышам внутрибршинно, в течение роста опухоли, а также после однократного курса химиотерапии. Датчик дош исследования перфузированных органов был использован для изучения вли яния остановки сердца кардиоплегическим раствором и предваритель ного введения крысам витамина Е на протекание ишемии нормальных и гипертрофированных сердец крыс в нормотермин и гипотермии.

Научная новизна. В диссертационной работе впервые:

- предложен экран Фарадея оригинальной конструкции, позволяющий существенно (в 5 раз) улучшить временное разрешение в изу чении динамики поведения уровней фосфорсодержащих метаболитов в шпемизированноы миокарде;

- получена динамика изменения уровня макроэргов в опухоли ме-ланома В16 мышей при развитии опухоли и химиотерапии да показано, что изменение энергетического метаболизма* меланомы при химиотерапии отражает эффективность этой терапии;

- получены и проанализированы подробные кинетики изменения уровней макроэргов при ишемии в контрольном и гипертрофированном миокарде крысы с применением предварительного введения витамина Е и остановки сердца кардиоплегическим раствором в нормотермии и гипотермии.

Практическая ценность. В работе рассмотрены вопросы, связан ные с созданием чувствительных приемных контуров датчиков магнит ного резонанса на' частотах сотни мегагерц. Даны практические рекомендации для изготовления радиочастотных катушек индуктивности принимающих сигнал ядерной индукции образца. Рассмотрены вопросы применения экрана Фарадея для подавления диэлектрических потерь, обусловленных наличием собственной емкости приемо-передащей катушки.

Еа основании результатов исследования воздеГствля аминопро-изводного алкилнитрозомочевины на энергетический мета<о'шзм опу-

(ли меланома В16 мышей и анализа литературных данных был сделан шод о принципиальной возможности применения аналогичных метоне в исследовательских целях и в условиях клиники для скринин-I противоопухолевых препаратов, определения эффективности выб-щного препарата по отношению к опухоли.

Практическая важность исследования влияния карди'оплегии, эедварительного введения витамина Е и гипотермии на протекание юмии в нормальном и гипертрофированном миокарде крысы обусла-швается тем, что холодовая кардиоплегия в сочетании с предвари-шьной фармакологической подготовкой ( в последнее время большие щезды связывают с применением витамина Е ) чаще всего использу-:ся для предохранения сердца в период ишемии ( при операциях на ¡рдце ). Метод ^Р-ЯМР дает полезную информацию о состоянии эне-'етической системы миокарда и в принципе шкет быть использован [я мониторинга состояния сердечной мышцы при развитии ишемичес->го процесса.

Разработанный датчик для перфузированных органов обладает гвствительностью, позволяющей получать спектр -"-Р-ШР сердца ве-м в I грамм в течение I минуты без заметного насыщения сигналов, ■о дает возможность получить достаточно подробную информацию о яальном этапе ишемии ( концентрация креатинфосфата спадает до ювня ниже детектируемого за время порядка 5-10 минут в нор-|термин ). Практическая значимость работы не ограничивается 1Лько выводами о влиянии исследованных факторов на протекание юмии. Методология работы и описанные закономерности протекания юмии могут быть полезными дай изучения влияния других аналогичен факторов на этот процесс.

Настоящая работа выполнена в соответствии с научно-техничес-м планом ИХф АН СССР ( номера государственной регистрации -.011266 от 25 февраля и 81011240 от 25 февраля ).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной рабо-I докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в юлогии и медицине" (Звенигород, 1981 г.), ЛУ, ХУ и ХУ11 Конфе-¡нциях молодых ученых ИХФ АН СССР (1985, 1986, 1988 гг), конкур-IX научных работ ИХФ АН СССР (1982, 1984, 1987 гг), конкурсе-эк-[ертизе перспективных работ ИХФ АН- СССР (1987 г.).

Публикации. По результатам исследований, вошедших в диссер-шионную работу, опубликовано 5 печатных работ, список которых

приводится в конце автореферата

Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 122 етгн-ницы состоит из введения, трех глав, заключения (основные результаты и выводы) и списка цитированной литературы (124 названия). Работа содержит 30 рисунков и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНКЕ РАБОТЫ Во Введении дано обоснование актуальности темы, сформулирована цель диссертационной работы, кратко рассмотрены основные принципы метода ЯМР, необходимые для дальнейшего рассмотрения работы. ШВА I. ДАТЧИКИ ЯДЕРНОГО ШЖТП0Г0 РЕЗОНАНСА ДЛЯ Ж0ЛО1ИЧЕСШ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1.1. Методы выделения чувствительного объема.Рассмотрено применение поверхностной катушки в контексте и в сочетании с другими методами выделения объема, из которого требуется получить спектр ЯМР.

1.2.Факторы, определяющие чувствительность датчика Я1ЛР.Рассмотрена работа простейшего варианта схемы датчика с электрической связью (согласующим конденсатором Сс, рис. I), иримендкщейся наиболее часто для возбуждения и детектирования сигнала свободной индукция ядер образца. Схема настраивается тагам образом, чтобы ее импеданс на частоте резонанса ядер был равен сопротивлению нагрузки (входному сопротивлению предусилителя, Рн=50 Ом активных). Сопротивлениями

1 и.^ учтены потери подстроечного конденсатора и приемо-переда-щей катушки. По теореме об эквивалентном источнике э.д.с. сигнала Ес можно заменить эквивалентной э.д.с. Еэ с , включенной последовательно полному импедансу схемы. Показано, что на частоте резонанса

Э.д.с. шумов контура Ещ к . физически не отличащаяся от сигнала,

Рис.1

-б-

л

свадратично складывается с шумами нагрузки на входном сопротивлении »редусилителя. По теореме Найквиста получаем:

V \/4KS^(TK+THW4riFH 0,88/Т^, *де TR и Тн - шумовые температуры контура и нагрузки. Отсвда чувст-(ительность спектрометра, определяемая как отношение Еэ>с /Ещ, авна

i.e., в основном, определяется свойствами приемо-передавдей катушки. 1еличина Ес пропорциональна коэффициенту заполнения и зависит от •еометрических параметров катушки (числа витков, их размера, форси и т.п.). Величина^ в том случае, если в объеме катушки находится проводящий образец, зависит от следующих факторов: )потерь на омическом сопротивлении проволоки; )диэлектрических потерь, возникающих вследствие того, что силовые инии электрического поля межвитковой емкости катушки.пронизывают роводящий образец, и учитывающихся в эквивалентной схеме парал-ельным включением низкодобротной емкости С0 (рис.1); )магнитных потерь, обусловленных вихревыми токами в образце. .

Магнитные потери физически .'ив отличаются от сигнала, с диэ-ектрическими же потерями можно эффективно бороться, применяя так азываемый экран фарадея, суть которого заключается в том, что межу катушкой и образцом вносится металлическая заземленная конструк-ия, не создапдая короткозамкпутых витков для электромагнитного поя катушки; тогда силовые линии электрического поля межвитковой ем-ости не проникают в образец. Однако экран, сам обладая емкостью индуктивностью, вносит потери в контур. Эффективность экрана оп-еделяется удачностью его конструкции, диктуемой конкретной геомст-вей катушки. Применение экрана особенно актуально дня катушек эльших размеров (свыше сантиметра), когда сопротивление потерь ежвитювой емкости превышает омическое сопротивление проволоки. .3.Датчики с поверхностной катуппгой.Наия были разработаны датчи-i с поверхностными катушками для магнитов с теплш зазором 50 и } ш к напряженяостями магнитного поля 8,5 и 9,4 Т•соотвотствсл-

Выбирая диаметр поверхностной катушки, необходимо учитывать, го, чем меньше этот диаметр, тем лучше пространственная избира-элыюсть катушки, но тем меньше ее чувствительность. Наш исполь-

зовапась катушка диаметром, 5 мм, что позволяет получать спектры крупных органов мши (почень, мышца, мозг). Наша задача состояла в том, чтобы, используя такую катушку, получить спектр за время, в течение которого состояние мыши в магните оставалось бы более или менее неизменным (»^30 минут).

Специфика поверхностной катушки состоит в том г что образец располагается вне ее объема. Наиболее универсальной формой для такой катушки является плоская сл.:раль, в которой достигается коэффициент заполнения около 1/2. Для того, чтобы оценить чувствительность катушки,, нужно найти величину Ес при заданных параметрах витков. Для этого требуется рассчитать поток магнитной индукции ядер образца сквозь плоскость витков после окончания возбувдащеп импульса. Методика рассчета состояла в следующем. Сначала искалос; поле катушки с током такой величины, чтобы за время импульса повернуть намагниченность в центре катушки на требуемый угол. В остальных точках полупространства, в котором располагается образец, величина угла, прецессии вектора намагниченности после окончания импульса пропорциональна амплитуде поля в этих точках' и времени действия импульса. Поток сквозь плоскость витка создает лишь прое: цкя намагниченности на направление поля витка. Далее находился этот поток от намагниченности единицы объема полупространства. Окончательно, ноток индукции ядер через площадь каждого из витков катушки получали интегрированием предыдущего потока по всему полупространству. Величина Ес пропорциональна' сумме потоков через вое витки катушки. Приведем окончательную пормулу, использованную нами для численного расочета потока сквозь один виток, радиуса К:

II, (С32 Х3-АС12х+22-Ь2}+

где (е-*)(12-?л2)1/Ь ];

Сь- ГБЦс«

х= [б-р)

х=Н (в-?)'

з ге к^;

,llf - проекции поля катумки на ось катушки и со радиус.

Поток от ишгов'.лчсошх катушек колучали по этой ни f ориулс июксписм HOTOKOii через кандыи из bftkob нужного радиуса К

Результаты рассчето для олиовпткоv.oil катуикп ¡¡.х 90°, 180° i 360° импульсах (здесь и далее градуснос7ь шг.ульса отнесена i" i'o— »метрическому центру катушки) предстаилспш на ркс.2. По оси орди-тт отложена' величина Ес в условных единицах, которая достигаете.';, ;сли образец заполняет часть полупространства I) от плоскости впт-са до плоскости параллельной ov и находящейся от нес на раоетояш.:., >тло;кенном по оси абсцисс и сраженном в радиусах иитка; '¿) от о он витка до поверхности цилиндра с той же осью и радиуса, оию-шию-х> по оси абсцисе и внракенкого в радиусах нитка. Первые кривые гроведены сплошной лктшеп, пторне - пунктиром.

Ряс. 2

жг т'

за?

1 о ' 1 1 5 Ц"

)

Из рисунка видно, что максимальный сигнал принимается катушкой при 90° импульсе иа области, ограниченной по оси катушки зе радиусом, а в плоскости катушки ес диаметром. При увеличении ¡уштеяьности импульса эта область увеличивается до двух радиусов то оси и двух диаметров в плоскости витка при 360° кмпульсе. При этом возле плоскости катушки появляется область, откуда не прини-лается сигнал, что монет быть использовано для. исключения из спектра приповерхностных сигналов, например сигналов от коки животно-то. Однако, при этом общая интенсивность сигнала, т.е. чувствительность, уменьшается.

í

Рассчеты сигнала дая катушек с большим числом витков приводят к достаточно неожиданным результатам. Рассчеты показывают,что:

1) не удается достичь в многовитковых катушках той интенсивности сигнала, которая получается при 90° импульсе в одновитковой;

2)г.олная интенсивность сложным образом зависит от длительности (градусности) импульса, однако для кавдой из катушек максимальный сигнал принимается при большей длительности импульса при большем количестве витков в катушке;

3) в 8-витковой катушке при градусности импульса больше 360° возникают сигналы болыюй интенсивности от приповерхностного слоя; они противоположны по фазе сигналу после 90 иимпульса и принимаются с радиусов, больших радиуса катушки (внешнего витка).Это может привести к артефактам во время накопления сигнала при помощи катушки

с числом витков больше 4-х.

Таким образом, наиболее эффективной оказывается одновитковая катушка, причем ее чувствительность вопреки распространенному мнению не определяется ее добротностью, но более сложным образом зависит от ее параметров. Причина заключается в неоднородности поля катушки и в нелинейности ответа спиновой системы на возбуждение. В каждой точке пространства, занятого образцом, проекция намагниченности на направление ноля пропорциональна не напряженности поля, а синусу этой величины, причем картина осложняется тем, что ответ спиновой системы не симметричен относительно оси катушки, поскольку проекция поля катушки на направление Н0 не вызывает изменения угла прецессии намагниченности.

Итак, мы использовали одаовитковую катушку диаметром 5 мм, подбирая длительность импульса при помощи специальной кюветы, разделенной параллельными плоскостями на изолированные друг от друга ячейки, которые по очереди заполнялись раствором фосфата.

Лабороторные животиые помещались в датчик в специальной кассете, 'позволяющей точно фиксировать место, из которого требуется получить спектр.

1.4.Датчик для исследования пеаВУзитаованного сердца. В этом датчике нами-была применена двухпитковая катушка, в объеме которой сердце подвешивается вертикально.(рис.За). Ее размеры (г1см) должны обуславливать значительные диэлектрические потери. Для того, чтобы их избежать, наш: предложена оригинальная конструкция экрана

арадея.Идея заключается в том, что проволока, из которой изготов-

ена катушка, снабжена коаксиальной заземленной оплеткой, разомк-утой посередине, чтобы она не стала короткозамкнутым витком поот-ошению к полю катушки. Такой экран работает при условии, что ди-иетр оплетки много меньше диаметра витков катушки; в этом случае агнитное поле катушки не пересекает поверхности оплетки. Проана-, взировать работу экрана можно,исходя из эквивалентной электричес-эй схемы контура с заэкранированной катушкой (рис.36). Малая ве-ачина индуктивности экрана 1_э позволяет избежать вредного влияния взходобротной емкости С0. Это влияние может быть еще уменьшено, зли уменьшать емкость Сд, определяемую толщиной диэлектрика меж-¡г проволокой катушки и оплеткой.

Заэкранированная катушка позволяет получить спектр от серд-а весом менее грамма в результате 40 накоплений при 70° импульсе, энструкция датчика предусматривает термостатирование сердца и по-аваемого перфузата.

»с.За Рис.Зб

IABA 2. ПРИМЕНЕНИЕ ДАТЧИКА С ПОВЕРХНОСТНОЙ КАТУШКОЙ К ИССЛЕДОВАНИЮ шт. ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ ПА ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ ШШОШ BI6 МЫШЕЙ.

Применение датчика с поверхностной катушкой позволяет просле-1ть динамику изменения пула макроэргов при разлитии опухоли на (ном животном. Диаметр поверхностной катушки позволял получать шктры от небольших (не более 0,3 г) опухолей, что давало возмож-

Г11 * . МГ

I X* |С> Сэ, /.

\К ' rift •

\\

ность начинать серию измерений на ранней стадии экспоненциального роста опухоли. На 9-е - 12-е сутки развития опухоли в спектре наблюдаются сигналы АТФ, креатинфос<;>ата, неорганического фосфата. В те чение нескольких последующих суток сигналы макроэргов уменьшаются (креатинфосфат исчезает из спектров), а сигнал неорганического фосфата увеличивается.

Нами было проведено исследование действия аминопроизводного алкилнитроэомочевины на развитие опухоли по спектрам мела-

номы BI6 мышей. Опухоль прививалась мышам-гибридам C57Bi/6*CBA/2 подкожно. Препарат вводили мышам в сроки, когда опухоль достигала веса 0,6 и 1,2 г. Исходный спектр получали до введения препарата. Введение препарата приводило к задержке роста опухоли на 12 - 15 суток. При этом относительное содержание АТФ и креатинфосфата поддерживалось на более высоком, а нееорганического фосфата на более низком уровне при введении препарата на более ранние сроки развития опухоли (рис.4 А-В), что, вероятно, связано с большей эффекти-вноатью раннего курса терапии. Введение препарата, не эффективного для данной модели, не приводит к существенному отличию кинетик спектральных изменений от контрольных (рис.4 А-В). Рис.4

f х

1 - аминопроизвоцное алкилнитрозомочевины

начальный вес опухоли 1,2г

2 - аыинопроизводное алкилнитрозомочевины

начальный вес опухоли 0,6г

3 - контроль

4 - метилнитрозомочевина

- L+ \

1

раябцтие с пуз, «м t41 с уг.

Лолученные результаты находятся в согласии с данными ряда явторон о воздействии эффективных химиотераневтических препаратов на другие модели опухолей.

Таким образом, можно заключить, что в основе наблюдаемых спектральных изменений лежат общие закономерности реакции опухолевых клеток на химиотерапевтическое воздействие, и сохранение или

от

повышение уровня макрозргов, фиксируемое методом °-'-Р-ЯмР, может служить тестом на эффективность терапии, не специфичном ни в отношений вида опухоли, ни в отношении применяемого препарата. При этом эффективность можно оценивать в достаточно ранние сроки после введения препарата. Привлекательной чертой метода является его неин-вазивность (принципиальная), что особенно ценно для клинических приложений.

Если говорить о механизме описанного ответа опухолевых клеток то изученные пами литературные данные, в частности гистологические (которые, по-видимому, также не специфичны в отношении вида опухоли), не позволяют однозначно выбрать какой-либо один вариант. Как I правило, высокий уровень макрозргов связывается с лучшей оксигеиа-цией клеток опухоли после воздействия препарата. Такое состояние связывают с большей метаболической активностью клеток опухоли. Однако, показанное наш и другими авторами резкое торможение роста опухоли позволяет предположить, что ее клетки, напротив, переходят в состояние с пониженной метаболической активностью, когда макро-эргические соединения, накапливаясь, остаются "невостребованными". ГЛАВА 3.' ПРИМЕНЕНИЕ ДАТЧИКА ДЛЯ ПЕРФУЗИР0БА1ШЫХ ОРГАНОВ К ИССЛЕДОВАНИЮ ИШЕМИИ МИОКАРДА КРЫС.

В этой главе рассмотрено поведение миокарда крысы по изменению спектра ^Р-ЯМР при развитии экспериментальной ишемии.в контроле и при различных воздействиях на миокард, находящих примененне в практической кардиохирургии для противоишемической защиты миокарда во время операций на сердце. Эти воздействия: понижение температуры с 35°С (нормотермия) до 16°С (гипотермия), остановка сердца кардиоплегическим раствором, предварительное (за сутки) введение крысам витамина Е внутрибршинно. Нами были изучены также гипертро-£жрованные (экспериментальная гипертрофия) миокарды, поскольку, с эдной стороны, гипертрофия является частой спутницей оперируемых зердец, а, с другой стороны, энергетический статус таких сердец от-

личается от нормы, что может сказаться на протекании ишемии. Различные комбинации перечисленных воздействий на нормальный и гипертрофированный миокард составляют 16 серий экспериментов. Каадая серия проводилась на 5 - 10 крысах.

Первые 10 минут ишемии, характеризующиеся наиболее быстрыми спектральными изменениями, изучались с максимальной подробностью (накопление одного спектра занимало 1,5 минуты). Дм одного миокар да все спектры в кинетике обрабатывались и интегрировались с одной и той же нормировкой.

Констатировано, что во всех нинетиках суммарная интенсивности сигналов б спектре не изменяется в течение ишемии за время найлвде-ния (небольшие завалы наблюдаются в начале ишемии и связаны с частичным насыщением сигнала креатинфосфата и в конце ишемии и связаны с возможным переходом неорганического фосфата в пул, невидимый для ЯМР высокого разрешения). Эта суммарная интенсивность соответствует концентрации, измеренной нами в отдельных экспериментах и оказавшейся равной ~30 мкМ/г. Отсдда легко рассчитать концентрацию любой фосфатной группы, давдей сигнал в спектре.

Спектры перфорированного сердца получали через 4 и 6 минут перфузии. Качество перфузии проверяли по отсутствию сигналов в области слабопольнее 0 м.д. и высокой относительной интенсивности сигнала креатинфосфата. Тотальную ишемию моделировали прекращением подачи перфузата к сердцу.

Спектральные изменения во время ишемии сводятся к следующему. В нормотермии сигнал креатинфосфата уменьшается до уровня ниже детектируемого за время 5 -15 минут, уровень АТФ уменьшается вдвое (до 3 - 3,5 мкМ/г) за 15 - 25 минут ишемии. Концентрация НАД-содер-жащих соединении остается практически неизменной (3-5 мкМ/г) в те течение всего времени наблюдения ишемии. Сигналы неорганического, фосфата и йосбошшэфироп не разрешаются в той степени, которая бы позволяла их раздельно интегрировать. Однако, для некоторых серий экспериментов было проведено их разделение при помощи компьютерной симуляции сигналов, мшшмизирупцеп среднее квадратичное отклонение рассчитанного спектра от реального. Оказалось, что сигнал йосфомоноэйиров составляет от 30£ до 70$ от общей интенсивности двух сигналов. Большая ширина сигнала фосфомоноэфиров (до 600 Гц), а также большой разброс в кривой титрования этого сигнала, получен-

ной на основании химических сдвигов сигнала неорганического (-о&гат.и позволяет предполагать наличке нескольких фосфомоиоаТироп, дащих вклад в перекрывающиеся сигналы.

Важным моментом оказывается то, что концентрация АДф, '¡несчитанная из спектров, остается около 0 и не увеличивается.даже при почти полном гидролизе АТФ. Рассмотрены возможности перехода молекул АД5 в невидимый для ШР высокого разрешения пул, связанный с ми-офибриллярными структурами. Рассмотрена также общая картина возможных движений фосфатных групп из одних пулов в другие. На основании этого рассмотрения с. учетом постоянства суммарной концентрации фосфатных групп, наблюдаемых в спектре, сделан вывод о том, что в ми-'

0 карде с развитием ишемии накапливается не АДФ, a Altó, который наряду с фосфатами Сахаров, образующихся на кути гликолиза, определяет интенсивность сигнала фосфомоноэфиров. Конкретные биохимические . механизмы, приводящие к накапливанию Ai.® в условиях ишемии, остаются неясными.

Для нескольких серий экспериментов нами било проведено сравнение кинетик уменьшения уровней макроэргов по время ишемии в тех злунаях, когда эти кинетики получали r ампуле серийного датчика КМР госле иссечения миокарда, и в тех случаях, когда кинетики получали

1 разработанном наш датчике после предварительной перфузии, йте-'ики, полученные в ампуле, характеризуются более быстрым (но край-!ей мере, на начальном этапе ишемии) спаданием уровня АТФ. В гипо-■ермии кинетики различаются в гораздо меньшей степени. Креатинфос-ат практически не детектируется в "ампульных" экспериментах, тога как в модели "ишемия после перфузии" детектируется до 15 минут в ормотермии и более часа в гипотермии. Приведенное сравнение, быть эжет, чисто методического плана, говорит о том, что "ампульные" и иерфузионные" эксперименты следует с осторожностью сравнивать ме-цу собой.

Особый интерес представляет вопрос о наличии в сердце критикуете концентраций АТФ. Дело в том, что с некоторого момента вре-!ни после начала ишемии, сердце ухе невозможно после реперфузии юзобновления кровотока) вернуть к исходным параметрам функциони-»вания. В этот момент начинает развиваться ишемическая контракту-i сердечной мышцы. Вопрос о существовании критической концектра-ш важен не только как принципиальная возможность оценки состоя-

ния иаемизированного миокарда, но и для понимания механизмов перехода обратимых ишемических изменений в необратимые. Для некоторых серий экспериментов нами было проведено сопоставление полученных нами кинетик уровней АТФ с данными других экспериментов о ходе развития ишемическо!: контрактуры. Начало этой контрактуры, равно как и скорость падения уровня АТФ, в значительной степени зависят о ус- " ловий эксперимента (температуры, условий перфузии и т.п.), которые трудно в точности воспроизвести в разных экспериментах. Тем более впечатляющим кажется факт, что почти во всех рассмотренных случаях (исключая нормотермическую кардиоплегию) начало контрактуры происходит при достижении АТФ уровнямкГу!/г, т.е. половины исходной концентрации. Интересно отметить, что по Ф.З.Меерсону при такой концентрации, также пазванпой им критической, происходит ингибиро-вание гликолиза - единственного источника энергии в ишемизированном миокарде.

Б этой главе мы провели сравнение хода убыли АТФ и креатин-фосфата при развитии ишемии отдельно для 4 блоков экспериментов: для нормального и гипертрофированного миокарда в .нормотермии и в гипотермии. При таком подходе выявляется'эффективность воздействия предварительного введения витамина Е и остановки сердца кардиопле-гическим раствором, а также их сочетания, на протекание ишемии в двух моделях миокарда, интересных для глрдиохирурги;;, при двух температурах, также представляют« практически'! интерес.

В блоке нормотершщ-пормальный миокард наиболее длительное спадание уровня АТФ наблюдается прп кардиоплогии. Витамин Е тайке приводит к увеличению продолжительности спадания уровня АТФ по сравнению' с контролем. Сочетанное же их действие не дает подобного результата: кривая спадания уровня АТФ возвращается к контрольной.

Для гипертрофированного миокарда в нормогершпг характерна иная картина. Здесь убыль АТФ во время ишо.мик после предварительного введения витамина Е по отличается от контроля, равно как и сочетанное действие витамина Е и кардиош^гии от простой кардиоплегил. Витамин 2 не оказывает влияния на ход ишемии гипертротировгишого миокарда при 35°С, однако, кардиоплегия, как и в случае контрольного миокарда, оказывается эффективной.

При понивенной температуре для нормального миокарда предварительное введение витаыикг Е дает лучшие результаты, чем кардио-

плегия, однако наибольшее отличие от нормотормического эксперюлеп-та заключается в том, что наилучшие результаты дает сочетание витамина Е и кардиоштегии. Такая ле картина характерна для гипертрофированного г.даотсарда в гипотермии. Наилучший результат дает здссь сочетание кардиоплегии и витамина Е. Таким образом, при пониженной температуре предварительное введение питашна Е дает хорошие результаты для обеих моделей миокарда.

Из. приведенных сравнений следует, что эффект различных воздействий на протекание миокарда зависит от конкретных условий эксперимента и может проявляться в одних случаях и пе проявляться в других. Для систематического понимания подобных эф?ектоа необходимо раскрытие механизмов действия протшошешческих средств. Эти задачи выходят за рамки настоящей работы, определяющей лишь негодные точки их решения.

В Заключении кратко сформулированы основные результаты и выводы диссертационной работы.

ОСНОВНЫЕ РгЬУЛЬТАТН И ВШЩЫ

от

1. Разработан датчик ^АР-Я;яР с одновитковой поверхностной ка-•ушкой, которая, как показывают произведенные рассчеты, оказывается ;аиболее чувствительной. Ее диаметр позволяет получать спектры от рганов и т:аней размером от 5 мм, находящихся в живущем организ-:е, а чувствительность - ¿скапливать сигналы фосфорсодержащих сое-инепий с концентрацией не более I мк1Д/г за время не более 20 минут.

2. При помощи разработанного, датчика исследован ^нергетичес-

ий метаболизм опухоли меланома В16 маюй .-о время роста опухоли и

эд влиянием химиотерапии. С развитием опухоли уровень макроэргов

аеньшается до значений ниже детектируемых. Однократное введение

репарата в терапевтической дозе стабилизирует уровень макроэргов

ни увеличивает его при условии эффективности примененной терапии.,

1 основании сравнения этих данных с данными, полученными другими

зтораш на других моделях опухолей сделан вывод о возможности мечт

эдом ОАР-ШР диагностировать эффективность препарата независимо р вида опухоли и применяемого препарата. - ■

3. Разработан датчик ^Р-ЯУР для исследования пер^узирован-а органов. Для повышения чувствительности в его конструкции прк-шен оригинальный экран фарадея, позволяющий эффективно избавлять-

ся от диэлектрических потерь. Чувствительность датчика позволяет выкашшвать сигналы фосфорсодержащих соединений с концентрацией не выше I мкМ/г за время не более I минуты.при весе образца не более I г.

4. При помощи разработанного датчика для перфузированных органов исследована ишемия нормального и гипертрофированного миокарда крыс при воздействии важных для кардиохирургии средств проти-воишемической защиты - гипотермия, кардиоплегия, предварительное введение витамина Е. Показано, что в нормотершш кардиоплегия обеспечивает наиболее длительное спадание уровня АТФ. Введение витамина Е не оказывает влияния в случае гипертрофированного миокарда, а в случае нормального миокарда замедляет скорость убшш АТФ по сравнению с контролем, в сочетании же с кардиоплегией дает результаты совпадающие с контрольными. В гипотермии введение витамина Е оказывается эффективным для обеих моделей миокарда, причем, наилучшие результаты дает в сочетании с кардиоплегией. Показано, что почти ьо всех случаях, изученных нами, развитие ишемической контрактуры начинается при уровне АТФ ~3 мкМ/г, который, возможно, является критическим. Показано, что исследование ишемии в ампуле без предварительной перфузии дает результаты, отличные от тех, которые получены при изучении ишемии после предварительной перфузии. Показано, что гидролиз АТФ в ишемизированном миокарде приводит к накоплению не АДФ, а АЫФ.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В РАБОТАХ:

1. Шкарин П.Ю., Самойленко A.A., Сибельдина Л.А.; "Регистрация спектров ЯМР 3*Р высокого разрешения с поверхности живого объекта";- Биофизика, IS83, т.28, Н, с.122-127. -

2. Соколова И.С., Шкарин П.Ю., Дубинскии В.З., Самойленко А.А Сибельдина Л.А., Горбачева 1.Б.; "Изменение в синтезе ДНК и пуле фосфорсодержащих метаболитов в опухолевых.и нормальных клетках в процессе роста меланомы BI6. Использование метода ^Р-ЯМР высокого разрешения в опытах in vivö"; - Доклады АН СССР, 1983, т.271, Ж,

с.223-226.

3. Шкарин П.Ю. "Датчик 31Р-ШР для исследования перфузированного сердца"; - деп. в ВИНИТИ, Я1226-В88 от 15.02.88, 5 стр..