Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

31р ЯМР спектроскопия в исследовании энергетического метаболизма мозга в норме и при патологии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "31р ЯМР спектроскопия в исследовании энергетического метаболизма мозга в норме и при патологии"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТЙДОВОГО КРАСНОГО РЧАМЕШ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЛИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. В.ЛОМОНОСОВА

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 677.12:616-831-005.4-73.584-092.9

ЛИХОДИЙ Сергей Станиславович

31Р ЯШ1 СПЕКТРОСКОПИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ ЭНКИ'ЕТИЧВСКОГО МЕТАБОЛИЗМА МОЗГА В НОШ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

03.00.02 - биофизика

Автореферат >, диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ШСКВА 1990

"3 1

О

Работа выполнена в Институте химической физики км. Н.Н.Семенова АН СССР в лаборатории ЯМР гетерогенных химических- и биологических систем.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Л.А.СИБЕПЬДИНА Официальные оппоненты: доктор биологических наук

А.Ф.ВАНИН

кандидат физико-математических наук А.З.ГУРЕВИЧ

Ведущая организация: Институт биофизики, г. Пущино

Защита диссертации состоится п 4 " Н Л 1990 г. в

часов на заседании специализированного совета Ю ОФТТ (К.053.Об.77) в МГУ им. Ы.ВЛомоносова по адресу: П9699, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, физический факультет, аудитория

С "РД

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " " сиЯлЪрЦ 1990 г.

Ученый секретар специализированного совет

(К.053.05.77) в МГУ им. Ы кандидат физико-математич

(Т.М.Козлова)

ОНДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность пррблеш. Метод ЯМР спектроскопии предоставляет исследователям уникальную возможность изучать биохимические процессы непосредственно в живом организме. Больяое значение имеет ЯМ? спектроскопия на ядрах фосфора для изучения биоэнергетики клетки как в норме, так и при различных патологических состояниях.

Высокая чувствительность ткани головного мозга к неблагоприятным воздействиям, в частности к ишемии и гипоксии, предъявляет жесткие требования к методам исследования метаболизма. Больному количеству методов <я vitxo присущи недостатки, связанные с необходимостью нарушать в процессе измерений целостность органа и клеток, что может стать причиной ошибок в измерениях и артефактов.

Изучение интактной ткани мозга нечивазивнымн методами ЕМР спектроскопии с применением поверхностной катупки позволяет избежать указанные недостатки и существенно повысить информативность биологических исследований.

К сокалешш, низкая чувствительность ыэтода ИР серьезно ограничивает его применение в изучении динамики быстропротекающих биохимических процессов. Так, например, приводимое в литературе спектры ЯМР органов и тканей т vwo , как правило, требуют времени накопления 5-20 минут. Дальнейший прогресс в развитии приложений метода, несомненно, связан с повышением чувствительности приборов для регистрации ЯМР спектров, и прежде всего с разработкой специальных датчиков .для регистрации слабых сигналов ЯМР.

Основная масса результатов исследований по метаболизму нервной ткани в условиях ишемии и гипоксии получена традиционными биохимическими и биофизическими методами in vtiia , Проследить динамику изменений уровней фосфорсодержащих метаболитов с использованием этих подходов чрезвычайно сложно.

Несмотря на однозначность данных о характере изменений (снижении) уровней макроэргических фосфатов (АТР и креатинфосфата OtP) в ыозге при ишемии, не существует единого мнения по поводу темпов и обратимости ©тих явлений. Одни исследователи приписывают особую чувствительность мозга к ишемии нарушению биоэнергетических механизмов ресинтеза АТР и OtP , в то время как другие сообщают об их быстром восстановлении в постишемическом периоде, а необратимость повреждений связывается с другими метаболическими структурами кле-

ток: ионными насосами, биомембранами, ферментами, обменом FHK и ДНК и т.д. Имеется ряд данных о необратимости ишемических повреждений клеток мозга при практически неизменных уровнях АТР и СгР

в результате набухания ткани мозга, нарушения Ы&* И* -насоса (оте:

р »

мозга), Этим изменениям способствуют прорыв мембранного Са барь' ера и индукция переписного окисления мембранных липидов, а исполу эование Са-блокаторов и антиоксицантов способствовало снижению треста повреждений в клетке. Однако, как изменялась при этом био энергетика, большинством авторов не исследовалось.

Тема диссертации входит в плановую тематику Института химиче xofl физики Ali СССР, утвержденную ГКНТ и Президиумом АН СССР (номе государственной регистрации 81 011266 от 25 февраля).

Цель настоящей работы состояла в следующем:

- повысить чувствительность прибора для регистрации спектров фосфорсодержащих метаболитов мозга крысы иг vivo .

- изучить динамику уровней макроэргич"ских фосфатов мозга при ише мии, а также влияние на метаболизм нервной ткани блокаторов Са^+ каналов (верапаиил), антиоксидантов (витамин Е), антигипоксантов (гаммаоксимасляной кислоты - ГОЖ).

Научная новизна. Предложена оригинальная конструкция поверхностной катушки для датчика ЯМР, предназначенного для регистраци спектров фосфорсодержащих метаболитов мозга крысы m two. Разработан и испытан датчик с повышенной чувствительностью и высокой пространственной избирательностью, что позволило получать спектры Р ЯМР мозга крысы Ы iwo всего за I минуту накопления. Впервые зарегистрирована и описана подробная кинетика изменения уровней макроэргических фосфатов, неорганического фосфата, фосфоятанолами на и степени внутриклеточного закисления в динамике полной ишемии мозга длительностью 30 минут. Показано, что кинетика снижения уро ней макрозргических фосфатов (CtP и АТР) в мозге во время итемии носит бифаяный характер и описывается суммой двух экспонент: быстрой и медленной (периоды полураспадп различаются почт)! в ТО раз) Выявлено достоверное положительное влияние на биоэнергетику нервной ткани блокатора кальциевых каналов верапамила, антиоксипанта витамина Е и антигилоксанта - гаммаоксимасляной кислоты.

Обнаружено существенное (в 10 раз) различие в концентрациях фосфомоноэфиров в ишемической ткани мозга wi vUto и в интвкгном мозге. Впервые выявлено влияние ¡эфирного и барбитуратнсгс наркоза

на уровень фосфокреатина в клетках мозга живой крысы.

Прослежена динамика восстановления исходных показателей энергетического метаболизма мозга в постишемичсском периоде у крыс, перенесших Ю минутнуи клиническую смерть (после оживления).

Практическая ценность работы. Предложенная в данной работе конструкция двухсекционной поверхностной катупки может быть использована при раяработке датчиков ПМР, предназначенных для медико-биологическик исследований. Очевидно, что высокие характеристики описанной катутпки (высокая чувствительность) позволят снизить затраты времени на накопление спектров и изучать быстрее изменения в метаболизме биологической ткани.

Полученные результаты исследований по метаболизму ишемической ткани мозга важны для клинической и экспериментальной медицины, прежде всего, для разработки обобщенней теории ишемических и гипо-ксических состояний, поиска эффективные критериев сценки степени тяжести нарушений метаболизма и прогнозирования восстановления физиологических функций мозга. Продемонстрировано эффективное защитное действие некоторых фармакологических препаратоз, снижаюцих темпы ишемических- изменений в составе фосфорсодергшцкх метаболитов. Разработанная методика оценки влияния лекарственных препаратов на биоэнергетику ткани мозга может быть использована для тестирования и отбора новых лекарственных препаратов, предназначенных для коррекции и лечения патологических состояний мозга.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ. Основные результаты диссертации докладывались на:

- Втором Европейском конгрессе "ЯИР в биологии и медицине" (Берлин, 1968 г.)

- Всесоюзном совещании "Способы коррекции гипоксии а тканях" (Нальчик, 1968 г.)

- на 2-ofl всесоюзной конференции "Физиология, патофизиология, фармакология мозгового кровообращения" (Тбилиси, I0B8 г.)

- на ХУ, ХУ1 конференции молодых ученых- Ш АН СССР (1966,1967 гг.). Апробация диссертации состоялась 7 апреля 1989 г. на заседании семинара по биофизике и физико-химической биологии Отдела кинетики химических и биологических процессов Института химической физики.

Обт.ем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и выводов. Работа изложена на 149 страницах, содержит 34 рисунка, 12 таблиц. Список литературы включает

-А-

199 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обсуждается актуальность теш диссертации, форму лируются цель и задачи исследования.

Первая глава содержит обзор экспериментальных и теоретически работ по теме диссертации. В ней дан подробный анализ литературы по энергетическому метаболизму мозга в условиях гипоксии и ишемии рассмотрены различные методические подходы в изучении биоэнергетики мозга, подчеркиваются преимущества метода ЯМР спектроскопии в исследовании тивой ткани.

Вторая глава содержит описание экспериментальных методик и характеристику объектов исследования.

Объектом исследования были беспородные крысы-самцы весом 150-200 г. Вся партия экспериментальных животных была разбита на группы и серии, согласно Таблице I.

1. Спектры ЯМР ^Р т иМю регистрировали на ЯМР-Фурье спектрометре №7/-360 фирмы Брукер с рабочей частотой 145,78 Мгц на ядрах фосфора. Регистрация спектров ЯМР мозга крыс иг шгю проводилась на ЯМР-Фурье спектрометре АМ-400 фирмы Брукер на резонансной частоте 162 Мгц. Для регистрации сигналов ЯМР мозга живой кр! сы был разработан и изготовлен специальный датчик. Необходимость

в разработке такого датчика была вызвана отсутствием серийных конструкций, удовлетворяющих повышенным требованиям к их чувствительности и избирательности. Съемка спектров для изучения динамики изменения уровней фосфорсодержащих метаболитов в мозге крысы была автоматизирована и управлялась мини-ЭВМ спектрометра по специальной программе.

2. Кгемия мозга моделировалась у закрепленных в специализированном датчике К.ЧР животных одним из трех способов. Вн^ор модели определялся задачами эксперимента. 1-я модель - остановка сердца, вызванная действием электрического тока (фибрилляция желуцочков); может быть проведена дистанционно в нужный для экспериментатора момент. 2-я модель - остановка сердца, вызванная введением в кровяное русло (бедренная вена) раствора ацетилхолиня. Спустя 10 минут после остановки сердца, хивотные пегко оживлялись. 3-я модель - прекращение кровообращения достигалось пережатием еепаечио-оо-

Таблица I.

Группы животных1 Количество животных Примечания

I серия - модельные опыты по отработке конструкции датчика ЯМР

1. Контроль 15 Эфирный или барбиту-

ратный наркоз, интак-тшо животные

II серия - ишемия мозга, эксперименты т vitu>+^

2. Контроль 20

3. Гипотермия 30 Охлажденкз выделен-

ного мозга до О С

4. Гипобиоз (+15 С) При гипобиозе пред-

варительное введение аминазина

III серия - влияние наркоза на уровни фосфорсодержащих метаболитов, эксперименты in vwa Сдатчик с пов, кат.)

5. Контроль 15 Животные без наркоза,

вышедшие из наркоза

6. Наркоз эфирный 15

7. Наркоз барбитуратный 15 Тиопентал натрия в/б

IV серия - пиемия мозга, эксперименты иг wW"1^

8. Контроль 30 Ишемия, 3 модели

9. Введение верапаыила 15 2 модели ишемии

в/б Верапамил 5 мг/кг

10.Введение верапамила 10 2 модели ишемии в/ж Верапамил 5 мг/кг

11.Введение витамина Е 10 Ишемия I модель в/б Вит. Е 50 мг/кг

12.Введение ГОМК в/б 10 Иаемил I модель

ГОМК 200-300 мг/кг

V серия - регистрация изменений уровней фосфорсодержащих

метаболитов в постишемичееком периоде

13.Контроль 10 Оживление поел« 10

минут ишемии

14.Эксперимент 20 То же, что 13.), но с

введением препаратов

Примечание: + - эфирный наркоз

++• - наркоз: тиопентал натрия в/б - внутрибрюшинное введение в/ж - введение в желудочки мозга.

t

судистого пучка.

У животных 13 и 14 групп, У серия экспериментов, после 10 минут ишемии осуществлялось восстеновление кровообращения путем проведения реанимационна мероприятий. Контроль па прекращением и восстановлением сердечной деятельности проводился с помощью электрокардиоскопа .

3. Математическое описание кинетических кривых. Кинетические «швне изменений уровней ОьР и АТР при ишемии анализировались численными метопами путем аппроксимации экспериментальных точек теоретическими кривыми вида: _ „ f ч

где ¿.-время, а Л и «; -параметры, которые варьировались с тем, чтобы минимизировать сумму квадратов отклонений теоретических точек от экспериментальных. Л/ выбиралось равным 1,2,3,4 и 5. Использовалась программа, написанная на алгоритмическом языке Паскаль.

4. Определение внутриклеточного рН основано на известной зависимости мекду концентрацией протонов и химическим сдвигом сигнала неорганического фосфата в спектрах Р ЯМР:

где £ Pi - разница химических сдвигов сигнала Pi и фосфокреатина.

5. Ео второй серии экспериментов регистрировались спектры изс лированного мозга. У наркотизированного животного очень быстро (э£ 1С с) вскрывалась черепная коробка, мозг вынимался пластмассовой ложечкой и переносился в охлажденный до -1+0° С физиологический раствор (гипотермия). Далее охлажденный изолированный мозг немедленно посещался в 10 мм ампулу и регистрировался ^Р ЯМР спектр. Состояние гипобиоза у крыс вызывали введением аминазина внутрибрю-тиино с последующим охлаждением. Все эксперименты с животными проводили под масочным эфирным или тиопенталовым наркозом.

В третьей главе содержатся экспериментальные результаты и их обсуждение.

Специализированный датчик ЯМР для получения ^ Р спектров мозга . В i960 г. Аккермяном Д.Д. и соапт. была предложена поверхностная катушка в виде плоской спирали, которая помещалась над нсследз емш органом и позволяла получать спектры ЯМР при зптр'лмх вр< мени на накопление сигнала около^ 30 минут. Приводимые до н'.гтопще-го времени в литературе спектры органов и тканей t-n тм та км

трэбовали довольно длительного накопления - от 5 до 20 минут, что серьезно ограничивает возможности метода а изучении таких быстро-протекаюших процессов, каким является ишемия головного мозга.

Одним из основных элементов, определяющих чувствительность спектрометра ЯМР„ является конструкция датчика сигналов и прежде всего конфигурация и геометрия пркемно-передаюгцей катушки. Кроме высокой чувствительности, конструкция поверхностной катутаки должна также обеспечить вксокуи пространственную избирательность, т.е. регистрации сигнала ЯМР от изучаемого органа с минимальным вкладом в спектры о кружа или* тканей (коч;а, отлады и т.д.). Однако, требования высокой чувствительности и избирательности во многом противоречивы и в какдом конкретном случае требуется оптимальный выбор основных га[лиетров катуши.

Известно, что повысить чувствительность датчика ЯМР можно путем уввличения размеров катушки. Однако, анатомическое строение головы крь,сы таково, что по бокам черепа имеется довольно толстый слой мышц, и при диаметре катушки более одного сантиметра в спектрах начинает проявляться их вклад. Мы нашли такую конструкции поверхностной катушки {рис.1), которая позволяет при большем объеме

-Ж0

Рис.1. Конфигурация двухсекционной двухвитковой поверхностной катушки . Применена в конструкции датчика ЯМР, предназначенного для регистрации спектров фосфорсодержащих метаболитов морга »ивой крысы.

ткани мозга, захватываемом её радиочастотным полем, уменьшить що пренебрежимо малой величины вклад в спектры ЯМР поверхностных тнп-неР.

Численными методами было проанализировано распределение в образце индукции магнитного поля В< , генерируемой плоской круглой и двухсекционной поверхностными катушками. Индукция магнитного поля в точке наблюдения, как известно, определяется следующим об;изом:

-е-

ь, =

ЬлЗ гз

гдед,- магнитная постоянная, -7 - тор, злемент длины провода, направление которого совпадает с направлением токя, 1 - радиус-вектор от точки наблюдения до ялементя тока. Для упорства сопоставления результатов расчета, диаметр круглой катушки выбран равным С а размеры секшй двухсекционной катушки количество витков -

два. Результаты представлены на рис.2 в виде таблицы (матрицы) графиков.

Некоторые пояснения. Вектор поля Во направлен вдоль оси 02 декартовой системы координат. Ось ОХ является осыо симметрии для обеих катутаек. На графики нанесены зависимости проекций вектора тгнитнсй нндугсции В< на плоскость ХУ : Ьж*(х) - для двухсекционной и Й6ку(х) - для круглой катушек, ибо именно зти компоненты необходимы для возникновения явления ЯМР. Расположение графиков в строке и столбце отражает следующий порядок присвоения значений параметрам у и Н :

0,3£/4 <./4,3 1/4 ¿72,31/4 3174,3174 о,иг 1_/4Л/2 иг,иг 3174,¿72 о,ь/4 lM.UA иг,Ш 31У4Л/4 0,0 ¿./4,0 /./2,0 3)74,0 На каждом графике, помимо зависимостей и ЯВ*уСж) , показаны

относительные размеры двухсекционной катушки, а на первом графике -область головного мозга (В) и область расположения мытечнсй ткани (заштрковано).

Пусть область 90° импульса (обозначено - о) находится в центре мозга. Бли*е к поверхности плоского витка и вершине двухсекционной катуши магнитная индукция быстро возрастает, что позволяет эффективно насыщать поверхностные слои ткани (кожа головы) и свести к минимуму их вклад в спектры ЯМР при правильном выборе временной задержки на релаксацию и длительности радиочастотного импульса.

При увеличении координаты у (¿=0) область 90° импульса пля плоской катушки постепенно перемещается бли*е к поверхности головы крысы и при значении */-ЗЛ./4 (2=0) наблюдается неблагоприятная ситуация: область 90° импульса совмещена с местом расположения мышц головы. В случае двухсекционной катушки область 90° импульса смещается в меньшей степени и в противоположную сторону - вглубь

€ - Ь^г^Ггуаеес«иг \ ь

\ \'

К - ¡Л

к \ \ к

-

к \ \ к

IX- А

к к к

Рис.2. Проекция вектора индукции магнитного поля на плоскостьХУ : I - для двухсекционной вку(*,у,2) и 2 - КВху (х-У,2) для плоской круглой поверхностных катушек. Представлены зависимости вхуМ и Я&*у(х) при фиксированных значениях у и н . Поцробиости в тексте.

ткани мозга. В самом худпем случае поверхностные слои находятся г области 1304-140° зоицирувдего импульса (рис.2 при 2 -0, у . Не при , т.е. в области расположения мышц головы происхо-

дит быстрое увеличение магнитной индукции (у-ЗС/4, £ -0,1/4,31/4), что приводит к етде большему уменьшению вклада поверхностных слове за счет наенщения сигнала ЯМР.

Эти рассуждения в основном справедливы также и при других значениях координат ¡/иг. Например, при у-0, г -¿./2 вклад поверхностных слоев р спектры мозга в случае применения плоской катушки более значителен, нежели в случае применения двухсекционной катушки и т.д. Однако, на некоторых участках ситуация не столь однозначная: так приу=^/2,г ^¿/2 пространственная избирательном двухсекционной катушки падает. Тем не менее, в реальном эксперименте оказалось возможным уменьшить вклад зтих участков подбором условий регистрации спектра: выбором длительности зондирующего ра диочастотного импульса и временной задеркки на релаксацию (рис.3)

Рис.3. Тестовый образец для эксперимента по оценке избирательности поверхностной катушки и спектры ^Р ЯМР, полученные с его помощью. 1 - раствор МО , 2 - фильтровальная бумага, пропитанная раствором неорганического фосфата, 3 - катушка Спектр а) длительность зондирующего импульса 10 т:с, спект б) - 20 мке, в) - 30 мкс. Задержка на релаксацию составила 0,3 с.

« S О -5" -16 - <5 -го

FTM

от

Рис.4. Спектр Р ЯМР фосфорсодержащих метаболитов мозга крмсы in vwo . Общее время накопления спектра - 60 секунд.

Дпухсекци иная поверхностная кагутикя была применена в разработанном нами специализированном датчике ^Р ЯМР для регистрации пула фосфорсодержащих метаболитов в мозге крысы in тлю . Датчик облапает высокой чувствительностью; спектры ЯМР мозга крысы с достаточно хорошим отношением сигнал/шум могут быть получены за ."Ю»С0 секунд накопления (рис.4).

Сравнительный анализ ^Р ЯМР спектров мозга «рисы in ix¿w и m vivo был проведан с целью изучения влияния ишемии и условий выделения на биоэнергетический статус изолированной ткани мозга.

Основная трудность работы с изолированным мозгом состояла в том, что все процедуры, связанные с выделением, охлаждением ткани и т.д. необходимо делать максимально быстро. В том случае, когда на выделение мозга было потрачено более 30+10 секунд, в спектрах мы не обнаруживали сигналов фосфокреатина и АТР, в них присутствовали только сигналы неорганического фосфата (Pi) и фосФемонозЯи-ров (PME) (рис.ПА). Наблюдаемое значение химического сдвига сигнала PL свидетельствовало о развитии ацидоза (рН-6,4) в изолированной ткани мозга.

31

На рис.б представлен Р ЯМР спектр мозга живой крысы, полученный с помощью датчика с поверхностной катутской. Сравг.-нке спектров ЯМР мозга i-n wvo и '-n i*.iw свидетельствует о существенном ¡наличии в содержании Pi И PMí в интактной и изолированной ткани мозга. В целом, характер изменений в содержании макреэргеи и зла-

Рис .5. ЯМР спектры изолированного мозга крысы иг vitio .

Спектр А - с момента вскрытия черепной коробки до охлаждения ткани прошло более 30 секунд. Спектр Б - на более 10 секунд.

чения внутриклеточного рН ыоэга крысы, регистрируемый в экспериментах ¿я viiw ,• соответствует таковым изменениям, обнаруженных в оксперииеш-ах 'иг vivo, Однако, имеются и определенные различия.

Во-первых, темпы развития ншеыических явлений, судя по скорости падения макроэргических фосфатов, в изолированном мозге иамно-го выше, чем аналогичные в экспериментах с поверхностной катушкой Во-вторых, в изолированном мозге мы опрецилили концентрации , которая примерно в 1(У раз превышала содержание соответству-ющик соединений, определяемых биохимическими методами в норме.

В-третьих, мы не обнаружили сколько-нибудь заметного эакис-ления внутриклеточной среды в изолированном ишемическом мозге к тон случав, если с момента вскрытия черепной коробки до момента охлаждения проходило менее 40-50 секунц, даже если в спектрах не регнст[мрпьалксъ сигналы креатинфосЗата, АТР, а уровни неоргани-

Oip

Рис .6.

31

Р ЯМР спектры мозга крысы т хнлю , зарегистрированные с помощью датчика с поверхностной катушкой. Спектр А - в контроле у интпктного животного, спектр В регистрировался у того же животного в течении I минуты с момента наступления клеши, вызванной остановкой сердца электрическим током.

ческого фосфата и РМ£ достигали максимальных значений.

В-четвертых, уровни крмтинфосфата и АТР в изолированной ткани мозга при 0° С постепенно снижались с одновременным ростом содержания неорганического фосфата, причем спустя 4-5 часов выдер-живпния на льпу в изолированной тка1ги молга регистригуются следовые количество макроэргоя. Однако, и в этом состоит отличие от ииемии гилоеного мозга при нормотермии, зякисленил внутриклеточной среды в гипотермичвском мозге мы не обнаружили.

Аномально высокий уровень фосфомоноэфиров, зарегистрированный нами в гипотермическсм мозге ¿п гнЛге , по-видимому, связпн с процедурой изоляции ткани мозга (механическим возаействием). Аналогичные высокие концентрации РМ£ регистрировались в экспериментах с перфузией срезов мозга в работе, описанной в литературе, в которой ткань подвергается сильному механическому воздействию в процессе подготовки срезов. Высокий уровень PME при ишемии и особенно механическом повреждении ткани мозга обусловлен возрастани-

еы содержания фосфоэтаноламина, « свидетельствует о быстром разрушении мембранных фосфолшшдов, Это дает основание полагать, что деструкция мембран является нервны звеном развития патологических процессов в ишеыическом и травмированном мадге.

Спектры ЯМР иг тлю . Прове цен сравнительный анализ данных по.относительным концентрациям фосфорсодеркащих метаболитов мозга, определяемых с помощью датчика с поверхностной катушкой, с аналогичными результатами биохимических исследований, описанных в литературе. Б целом наблюдается хорошее совпадение. Ноболшов различие в данных может быть обусловлено наличием методических погрешностей и артефактов и, как показано нами, зависит от вида при™ меняемого наркоза. Нами обнаружено статистически достоверное различие в содержании в мозге крыс при эфирном и тиопенталовои наркозе, а также без наркоза (в состоянии стресса). При офирноы наркозе наблюдалась тенденция к снижении содержания креатинфосфа-та в мозге крыс на 6,1+7,7 % в сравнении с контролем. Напротив, при тиопенталовом наркозе обнаружено статистически достоверное повышение содержания креатинфосфота в сравнении с контролем на

Нарушения в энергетике мозга при ишемии. В первые не минуты ишемии мы наблюдали быстрое снижение уровней иакровргических фосфатов мозга, рост уровня неорганического фосфата (рис.7) с одновременным развитием внутриклеточного ацидоза.

II,4+4,1 %.

ЬОО

« Ь ч го г к

Ни1. .7. Изменение шиенсивиосш сигналов Я* ирАТР в ЯМ! спектрах мозга нрыг 'п в динамике 30 минутной

ишемии (ь процентах от контроля -к >.

Лнялиа данных выявил бифазннй характер снижения содержания GiP и АТР в клетках мозга крысы при ишемии, причем быстрая компонента для имеет период полураспада около 1,3 минуты, медленная - 14,3 минуты. Для АТР - 2,0 минуты и 10,6 минуты, соответственно .

Наличие бифазного характера процесса снижения содертания макроэргов в ткани мозга при ишемии связано, видимо, с тем, что разные клетки головного мозга по разному переживают состояние и:пемии и можно выделить два типа клеток, предположительно, глияяшые и нейроны, .идя которых скорости расходования макроэргов при ишемии сильно различаются.

В целом, полученные наш результаты укладываются в рэмки существующих представлений о метаболизме фосфорсоцергкавдат соединений мозга при ишемии. Однако, следует отметить, что у части животных (приблизительно у 30 %) в первые минуты ипемни мы наблюдали заметное повышение уровня АТР (в среднем на If:-20 %), показанное на рис,7 пунктирной линией.

Влияние физиологически активных веществ на процессы итаснии мозга.

Верапамил. Нами было обнаружено эффективное влияние блоквто-ра кальциевых каналов верапамила на динамику уровней фосфорсодержащих метаболитов в мозге крыс в течении полной ишемии. Рис.13 демонстрирует явное различие в темпе расходования СТР во время кше-

* А" 12 го 2 8 .чин

Рис.8. Влияние предварительного ввепения верап&мила на скорость падения уровня АТР (в процентах от контроля -к ) в динамике полной ишемии;* - рСО.Сб в сравнении с контролем.

мии у леченных и нелеченных животных. Замедлялись также темпы снижении уровня иреатинфосфата и нарастания уровня неорганического фосфата.

Исследована эффективность действия препарата в зависимости от способа введения его подопытным животным. При сохранении общих закономерностей, влияние верапамила, введенного в желудочки мозга, было более кратковременным, чем при внутрибрюшинном введении.

Витамин Ег гамма-оксимасляная кислота. При предварительном введении животным витамина Е и ГОМК также наблюдалось замедление развития ишемических нарушений биоэнергетики, однако'эффект был менее выражен, чем в случае верапамила. Обнаружено также, что в том случае, когда животные получали ГОМК, степень внутриклеточного закислеиия била заметно выше, чем в контрольной группе.

Восстановление биоэнергетики мозга в постишемическом периоде.

На рис.9 представлена серия ЯМР спектров мозга, которые регистрировались у животных, перенесших клиническую смерть длитель ностью Ю минут. Возобновление работы сердца достигалось путем массажа и проведением искусственного дыхания.

Возвращение содержания регистрируемых метаболитов и внутриклеточного рН к норме происходило в разные сроки постишемическо-го периода. Так, уровень неорганического фосфата не возвратился к норме даже спустя 3 часа наблюдения, в то время как OiP возвращался к исходному уровню через приблизительно 2 чиса, уровень АТР - через 1,5 часа, рН - более чем через 2 часа.

У животных, предварительно леченных верапамилом и витамином li нормализация содержания неорганического фосфата происходила в перше 2 часа более быстрыми темпами, чем в контрольной серии. Однако, спустя и сутки после оживления уровень Pi во всех исследованных группа к животных не вернулся к исходным значениям.

Что касается уровней и АТР, их восстановление происходило у леченных животных значительно быстрее: у животных с вера па-мидом, ьведвнмым внутрибрюшинно, исходный уровень 0>Р наблюдался че(«з 2£>-30 минут, при введении в желудочки мозга - через 40-60 минут, с ьитамином Е - через 40-60 минут. Восстановление уровня. АТР чроисхоиило в течении первых 10-30 минут, т.е. несколько рань-ыь, чем уровня Р. Четких различий в темпах нормализации внутри-н>иvMinuno ¡И к группах леченних и нелеченных животных не обнару-Опмечп , ь группе ири% получавших зеряпамил внутрибршинно, н •! vrt.';i.fu: ■!• Mi-HH« fJi «.цр^делено спустя V. часа после оживлен«»-.

C^p ¿АТР+Л.АОР

31

Рис.9. Серия Р ЯМР спектров мозга крысы при развитии ишемии: А) - контрольный спектр, Б) - на 2 минуте и В) на б минуте ишемии; и в постяпемическом периоде (после оживления): П, Д), К) - на 20, 60, 120 минутах после восстановления кровообращения.

ВЫВОДЫ

1. Разработан и создан датчик ЯМР, предназначенный для регистрации спектров ^Р ЯМР v. оценки состояния энергетического метаболизма ткани головного мозга живой крысы. Датчик отличается высокой чувствительностью, что позволяет в реясиме накопления получать спектры ЯМР мозга крысы всего за 1-2 минуты.

2. Впервые неинваэивным методом ЯМР спектроскопии in w научена кинетика изменений уровней фосфорсцдеркапдох метаболитов головного мозга и значений внутриклеточного рН в динамике полной иле-

ыии длительностью 30 шкут. Выявлено достоверное положительное влияние на биоэнергетику нервной ткани блокаторов каналов (верапашл), ангиокснданта (витамин Е) и ингигипоксанта (Г0ШО. lia практике продемонстрирована возможность использования ЯМР спек троскопии для изучения быстропротекающих биоэнергетических процес сов.

3. Кинетика снижения уровней макроэргических фосфатов (СчР, АТР) в мозге во время ишемии носит бифазшй характер и описывается суммой двух: экспонент: быстрой - период полураспада для 1,У+0,2 и для АТР 2,9+0,3 минут, медленной - для С.Р 20,6+1,0 и для АТР 15,3*1,0 шнуты. За 2-4 минуты полной ишемии уровень в ткани мозга снижался на 50-40 % от исходного, АТР - на 35-40 %, а уровни неорганического фосфата и фосфомонозфиров вырастали на 100-120%. Значение внутриклеточного рН падало до 6,77+0,05 на 4 минуте.

4. Предварительное введение внутрибрюшинно и внутрь желудочков мозга Са^" блокатора верапамила достоверно снижало скорости падения уровней макроэргических фосфатов (особенно АТР) и нарастания содержания неорганического фосфата во время ишемии. Полученные данные подтверждают ведущую роль Са-зависимых процессов в ишемической дезорганизации биоэнергетики мозга.

5. Предварительное введение животным внутрибрюшинно антиока данта витамина Е и антигипоксанга Г0MК также оказывало заметное, хотя несколько менее выраженное, чем верапамил, положительное вл] яние на темпы изменений фосфорных метаболитов мозга как во время ишемии, так и в постишемическом периоде после 10 минутной клинической смерти.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работа;

1. Лиходий С.Сг. .Семенова. Н.А.,Дубинский В.З..Лиходий Ст.С, Сибельдина Л.А. Об уровнях фосфорсодержащих метаболитов в ыоэгу крыс по данным 31Р ЯЫР//Нейрохимия.-1967.-Т.б.-С.439-441.

2. Лиходий С.Ст..Лиходий Ст.С.,Сибельдина Л.А..Семенова Н.А Динамика уровней макроэргических фосфатов мозга во время ишемии по данным 31Р ЯМР спвктроскопии//Нейрохимия.-19В8 .-Т.7.-С.415-42'

3. Лиходий С.Ст..ЛиходиЙ Ст.С..Сибельдина Л.А..Семенова Н.А Влияние верапамила на динамику снижения уровней макроэргических фосфатов мозга при ишемии по данным ^Р ЯМР спектроскопии//Воп-

росы медицинской химии.-1988.-Т.6.-С.109-113.

4. ЛиходиП С.С. Изучение фосфорсодержащих метаболитов мозга крысы методом ЗГРЛМР., деп. ВИНИТИ,»1226-ГО8 от 15.02.88 г.

5. Гаинуткииа И.В.,Бяранчмкова М.В..Сибельдина Л.А..Семенова Н.А.,ЛиходиЯ С.С..Конрадов А.Л .//Тезисы 2-ой Всесоюзной конференции "Физиология,патофизиология,фармакология мозгового провооб-гащешя". -Тбилиси., 1988. -С .47.

rat brain in vivo// Second European Congrcs9 of NMR in Medicine And Biology, - Berlin, 1988, Juno 23-26. - P. 134.

6. Llkhodij S.S., Sibpldina Г..Л., Elchoff U. P NMR study of

31