Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природа нарушений энергетического метаболизма IN VIVO и IN VITRO по данным ЯМР-спектроскопии высокого разрешения

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Природа нарушений энергетического метаболизма IN VIVO и IN VITRO по данным ЯМР-спектроскопии высокого разрешения"

t"~>í «поп

í 5 liLil I-'-"- РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н. М. ЭМАНУЭЛЯ

На правах рукописи

СЕМЕНОВА Наталия Александровна

ПРИРОДА НАРУШЕНИЙ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА IN VIVO И IN VITRO ПО ДАННЫМ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИII ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

(03.00.02 - биофизика)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Ордена Ленина Институте химической физики имени Н. Н. Семенова РАН.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Э. К. Рууге, лектор биологических наук, профессор"Л.Б. Горбачева, доктор химических наук Т.А. Бабушкина.

на заседании диссертационного совета Д. 200 01 в Институте биохимической физики им. И.М. Эмануэля РАН.

С диссертацией можно .ознакомиться в библиотеке объединенного института химической физики РАН.

Ведущая организация: Интитут биофизики клетки РАН.

Зашита состоится

1996 г. в ¡(час.

Адрес. 117977, Москва, В-334, ГСП-1, ул.. Косыгина, 4.

Автореферат разослан

1996 г,

Ученый секретарь •диссертационного совета кандидат химических наук

М. А. Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Разработка современных представлений о функционировании живых систем независимо от уровня их организации невозможна без характеристики особенностей одного из фундаментальных процессов-энергетического метаболизма. Отличительной особенностью энергетики! является ее запрограммированность на поддержание постоянной концентрации АТФ, что, в первую очередь, обеспечивается изменением скоростей метаболизма. Поэтому полное описание процессов производства и потребления энергии в живой системе должно включать в себя сведения о концентрациях метаболитов, участвующих в энергетическом обмене, данные об их динамике и характеристики взаимосвязанаости метаболических превращений. Неискаженные сведения могут быть получены только в неинвазивных исследованиях. Перечисленные требования необходимо учитывать при выборе экспериментального метода исследования. Им удовлетворяет метод ядерно-магнитного резонанса СЯМР) высокого разрешения, позволявший за малый промежуток времени определять качественный и количественный состав метаболитов, их компартментализацию, кислотность внутриклеточной среды в биологических объектах прижизненно.

Несмотря на успехи ЯМР - спектроскопии живых систем Сих свидетельством является то, что за 15 лет своего существования метод развился в самостоятельное направление исследований, результаты которых в настоящее вре^я используются в практической медицине), возможности метода еще далеко не изучены и не исчерпаны. Помимо требующих решения технических проблем С повышение чувствительности, пространственного и временного разрешения), важнейшей задачей остается накопление информации о метаболических процессах и их регуляции в живом организме. Необходима разработка методов адекватной интерпретации данных и способов сопоставления метаболизма и функции. Сложность организации метаболизма в организме ставит задачу поиска экспериментальных моделей, позволяющих исследовать эффекты разных урозней с том, чтобы выявить причины нао'людаемих in vivo процессов. Изучение особенностей функционирования и регуляции энергетического обмена при таких патологиях, как

злокачественные опухоли, нарушение мозгового кровообращения и лучевая болезнь, представляет собой важную биомедицинскув задачу. Требуются данные in vivo о метаболических нарушениях в процессе развития патологий и в результате терапии, которые дают принципиально новую информацию, без чего невозможна разработка современных методов диагностики и лечения.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Настоящее исследование посвяшено поиску новых возможностей метода ЯМР - спектроскопии в научении энергетического метаболизма, выявлению параметров, характеризующих энергетический статус и его изменение при патологических состояниях, разработке соответствующих экспериментальных подходов и способов анализа данных для исследования энергетического метаболизма живых систем. Основное внимание уделено изучению особенностей метаболизма фосфатов - участников энергетического обмена в условиях in vivo. оиенке специфичности и внутрипопуляционной вариабельности энергетического метаболизма при патологических состояниях, выявлению связи между метаболическими и функциональными нарушениями. Такого рода аадачи ставились впервые, возникая параллельно с расширением инструментальных возможностей метода ЯМР для наблюдения метаболических путей in vive. Поэтому необходимым этапом исследования было: I -определить, что "видит" метод; 2 - установить, что в "видимом" характеризует патологию; 3 - выбрать чувствительные метаболические характеристики раавития патологических процессов; 4 - выявить связь между метаболизмом и функцией. В качестве объектов исследования были выбраны патологии двух типов: опухолевые образования и патологии головного мозга различной этиологии. Выбор . моделей определялся как соображениями практической значимости, так и ролью, которая принадлежит энергетическому метаболизму в развитии этих патологий.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые даны оценки энергетического статуса опухолей, позволившие охарактеризовать энергетические процессы собственно опухолевых клеток и эффекты влияния организма. Полученные результаты позволяют проанализировать vcxñHH3->ai отдельных способов противоопухолевой терапич и установить связи между метаболическими сдвигами и

противоопухолевым эффектом. В частности: а) - впервые показано, что особенностью адаптации клеток опухоли к дефициту энергетических субстратов на поздних стадиях опухолевого процесса является увеличение эффективности экскреции лактата во внеклеточную среду и снижение содержания АТФ в клетках; б) - впервые установлено, что противоопухолевые препараты различных молекулярных и клеточных механизмов действия вызывает специфические нарушения фосфатного метаболизма опухолевых клеток, характуризущие особенности прямого действия препаратов на энергетический метаболизм и опосредованные эффекты - через • цитокинетические сдвиги; в) -- в лекарственно устойчивых штаммах опухолевых клеток обнаружен метаболический маркер множественной лекарственной устойчивости, обусловленный модификацией липидного метаболизма; г) - впервые 'обнаружено пролонгированное синергическое действие термотерапии и вазодилатации на энергетический статус опухоли ín vivo; выявлены пороговые эффекты и определены граничные значения интенсивности кровотока в опухоли, модифицирующие ее энергетический статус и вызывающие задержку опухолевого роста.

Впервые с помошью датчиков ЯМР с поверхностными катушками специальной конструкции подробно in vivo изучена динамика нарушений и восстановления фосфатного метаболизма мозга при патологических состояниях разной этиологии. Выявлены индивидуальные особенности ответа системы энергетического метаболизма мозга на патологические воздействия, предложен способ выделения групп риска. В процессе этих исследований впервые: аЗ - охарактеризованы нарушения фосфатного метаболизма клеток изолированного мозга в сравнении с показателями мозга in vivo; б) показано, что снижение уровней макроэргических фосфатов в развитии тотальной ишемии имеет бифазный характер и мокет быть описано суммой двух экспонент с характеристическими временами, различавшимися на порядок. Выявлено достоверной положительное действие блокатора кальциевых каналов верапамила на динамику снижения концентраций макроэргов мозга при тотальной ишемии; в) - впергые обнаружено участие

системы энергетического метаболизма мозга in vivo в процессах компенсации травмы фронтальной коры и механизмах протекторного эффекта экзогенного моносиалоганглиозида GMI, средства коррекции посттравматгческих функциональных нарушений; выявлены индивидуальные характеристики метаболических и функциональных изменений, продемонстрирована их взаимнооднозначная связь.

г). - впервые зарегистрированы нарушения энергетического метаболизма мозга, вызванные компрессией фронтальной коры;

д) - впервые изучена индивидуальная динамика показателей фосфатного метаболизма мозга при общем однократном г -облучении в среднелетальнсй и сверхлетальной дозах; обнаружена функциональная зависимость между кислотностью знутриклеточной среды и концентрацией неорганического фосфата при облучении в среднелетальной дозе; установлено влияние общего т - облучения в сверхлетальной дозе на содерхание АТФ з мезге.

Разработан новый подход к анализу энергетического статуса мозга in vivo, основанный на характеристике связанности и сбалансированности параметров энергетической обмена, измеренных методом ЯМР in vivo. Предложен способ анализа спектральных данных, выявляющий компенсаторные свойства энергетики мозга как целостной системы. Доказана возможность обнаружения патологических изменений в системе энергетического метаболизма, незаметных для стандартных методов статистической обработки спектральных данных. Предложен количественный критерий оценки энергетического статуса, Z-индекс, более чувствительный чем обычно используемые относительные концентрации фосфатных метаболитов.

С помощыэ разработанного подхода для ряда патологических воздействий (фронтальная лсбэктомия, компрессионная ишемия, r-облучение) выявлено снижение адаптационных возможностей и гомеопатической устойчивости системы энергетического метаболизма мозга. Обнаружена взаимнооднозначная связь между характером изменений Z-индекса и функциональными нарушениями, мекду величиной воздействия и динамикой Z.

В целом предложенные подходы и полученные на их основе

результаты открывают новое направление в изучении энергетического метаболизма биологических систем in vivo.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Полученные в работе данные могут служить основой для разработки методов мониторинга роста опухоли в живом организме, создают возможность быстрой оценки клеточных и молекулярных механизмов действия противоопухолевой химиотерапии, перспективы обнаружения метаболических сдвигов, сопутствующих развитию лекарственной устойчивости, расширяют рамки терапии, основанной на модификации опухолевого кровотока.

Результаты исследований динамики метаболизма ишемической ткани мозга необходимы для разработки теории ишемических состояний, поиска критериев оценки степени тяжести нарушений метаболизма. Обнаруженное защитное действие лекарственных препаратов, снижающих темпы изменений состава фосфатных метаболитов при ишемии или способствующих восстановлению метаболических и функциональных повреждений мозга, необходимо учитывать при терапии.

Предложенный метод анализа спектральных характеристик создает основу нового способа диагностики и прогноза in vivo. Выявленная индивидуальная динамика восстановления энергетического статуса мозга и предложенный критерий'оценки нарушений энергетического метаболизма мозга может использоваться для анализа индивидуальной чувствительности мозга к патологическим воздействиям.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы долояены на 5, 6 и 8 Всесоюзных конференциях "Магнитный резонанс в ' биологии и медицине" (Звенигород, 1985; Одесса, 1986; Звенигород, Í990), 2-й Всесоюзной конференции "Физиология, патофизиология, фармакология мозгового кровообращения" С Тбилиси, 1988"), Семинаре фирмы "Вариан" "Прикладная ЯМР-спектроскопия" СМосква, 1990), Европейских конгрессах по ЯМР в медицине и 5иологии (Страсбург, 1990; Цюрих, 1991; Рим, 1993; Вена, 1994;' Прага, 1996), Ежегодных съездах Общества Магнитного эезонанса в медицине СНью-йорк, 1990, Берлин, 1992;' Зан-Франииско, 1994; Ницца, 1995), 26 конгрессе Ампера по магнитному резонансу (Афины, 1992), на Учредительном сонгрессе Международного общества патофизиологии С1391.

Москва), на 12 и 13 Европейских конференциях по экспериментальному ЯМР СОулу, 1994; Париж, 1996), 17 Международном симпозиуме по клинической гипертермии (Павия, Италия, 1994), 2 Международной конференции по биологическим основам индивидуальной чувствительности к психотропным веществам (Москва, 1993), Конкурсах-конференциях учеках ИХФ РАН СМосква, 1992, 1994), Российской научной конференции "Антигипоксапты и актопротекторы: итоги и перспективы" (СгПетербург, 1994), Международном симпозиуме

"Физиологические и биохимические основы активности мозга (С.Петербург, 1991), I научно-практической конференции стран. СНГ "Магнитно-резонансная томография в медицинской практике" (Москва, 1995), 9 Конференции "Магнитный резонанс в химии и биологии (Звенигород, 1996).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 48 печатных работ.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ.

Модельная система клеток асцитных опухолей позволяет свести к минимуму эффекты неоднородности микроциркуляции кровотока в опухоли и обнаруживает специфические сдвиги показатзлей энергетического и липидного обмена, выявляющие: I-механизмы адаптации клеток к развивающемуся в динамике опухолевого роста дефициту кислорода и глюкозы; 2 -цитскинетические эффекты химиотерапии; 3 — особенности метаболизма, связанные с резистентностью опухоли к химиотерапии. Общие закономерности и специфические особенности ответа показателей энергетического метаболизма клеток асцитных опухолей на действие лекарственных препаратов выявляют клеточные и биохимические механизмы, лежащие в их основе.

Снижение опухолевого кровотока создает пороговый эффект "дезенергизации" опухоли in vivo. Противоопухолевый эффект возникает при падении интенсивности опухолевого кровотока до критической величины и является следствием пролонгированной ишемии, вызывающей полную "дезэнергизацию" опухоли in vivo.

oí

Сокращение времени регистрации спектров Р ЯМР in vivo выявляет одновременный бифазный спад фосфокреатина и АТФ в мосте при тотальной ишемии и обнаруживает достоверное

положительное влияние блокирования кальциевых каналов на процессы нарушения энергетики мозга при тотальной ишемии.

Вследствие эффективной регуляции системы энергетического обмена патологические процессы, не связанные с полной ишемией мозга, вызывают слабые специфические сдвиги концентраций фосфатных метаболитов. Нарушения регуляторных механизмов обнаружены с помощью нового критерия, основанного на учете совокупности корреляционных связей между измеренными методом ЯМР in vivo показателями энергетического обмена.

Критерий характеризует гомеостатическую устойчивость и адаптационные возможности энергетики как системы в целом. Разработанный метод анализа устанавливает взаимнооднозначное соответствие между метаболическими и функциональными нарушениями при травме фронтальной коры, зависимость энергетического статуса от величины воздействия > при общем однократном т-облучении, характеризует динамику восстановления энергетического статуса мозга в компенсаторном периоде после фокальной компрессионной ишемии.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из трех разделов. Данные обзора литературы (раздел 1) характеризуют современное состояние исследований метаболизма живых систем методом ЯМР. Раздел II С7 глав) посвящен изучению энергетического метаболизма экспериментальных опухолей in vitro и in viro. Е разделе III (9 глав) изложены результаты исследований фосфатного метаболизма мозга методом ЯМР ^Р in vivo под влиянием патологических воздействий. Каждый раздел содержит краткий литературный обзор по изучаемой проблеме, описание материалов, использованных в работе, методик исследования и способов их разработки, обсуждение полученных результатов. В заключении подведены итоги работы и представлены выводы. Общий объем диссертации 270 страниц. Экспериментальный материал представлен на 48 рисунках и 19 таблицах. Список цитируемой литературы включает 283 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. РАЗДЕЛ I. МЕТОД ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ В ПРИМЕНЕНИИ К АНАЛИЗУ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА

COtiaop литературы) В обзоре приводен анализ современного уровня развития

ЯМР - спектроскопии в применении к изучению метаболизма, преимущества и ограничения метода, перспективы его развития в экспериментальном и клиническом аспектах. Особое внимание уделено результатам исследования энергетического метаболизма. Очерчен круг задач и обсуждены возможности получения адекватной информации в экспериментах in vitro и in vivo.

РАЗДЕЛ II. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ МЕТАБОЛИЗМА ОПУХОЛЕЙ МЕТОДОМ

ЯМР,

Глава I. Обзор литературных данных Обзор посвящен результатам исследований злокачественных опухолей методом ^Р ЯМР, выявляющим особенности энергетики клеток, эффекты различных уровней биологической организации, метаболические характеристики опухолевого роста, действие различных видов противоопухолевой терапии на показатели энергетического обмена опухолей in vivo и in vitro. Рассмотрены механизмы изменений содержания фосфатных метаболитов в клетках и причины модификации энергетического статуса опухолей in vivo. Дано обоснование постановки задач настоящей работы.

Основными задачами исследований раздела являются: I -разработка адекватных моделей для изучения молекулярных, клеточных и системных эффектов в модификации энергетического обмена новообразований; 2 - применение разработанных подходов для обнаружения чувствительных показателей опухолевого роста и эффектов терапии; 3 - изучение влияния различных видов терапии на фосфатный метаболизм опухолей и установление механизмов обнаруженных эффектов.

Глава 2. Материалы и методы исследований опухолей. В работе использовались мыши - самцы линий СЗНА, SHK, DBA- х CgyBig, F^CCBA х С^уБП. Асцитные варианты рака Эрлиха САРЭ) и гепатомы 22а перевивали внутрибрсшинно (инокулум 10®

О С

- 10 ), солидный рак Эрлиха трансплантировали инъекцией 10 клеток в икроножную мышцу.Протиьоопухолевые препараты реумицин íPej или рубошгция СРн) добавляли в переживающую культуру клеток гепатомы 22а в дозе 100 мг/мл. В акспериментах с . асцитными опухолями

l!

Н-нитрозо-Н-метилмочевину, 5-фторураиил и винкристин вводили внутирбршинно, однократно в дозах 120, 200 и 1.9 мг/кг, соответственно, в водных растворах по 0.2 мл на мышь через О суток после перевивки АРЭ. Контрольные животные получали инъекции физиологического раствора NaCl Спо 0.2 мл). Рн и его спин-мечечый.. аналог эмоксил СЭм) вводили мышам - носителям лейкоза • Р388 Счувствительный и лекарственно устойчивые штаммы) через 5 суток после перевивки в дозах LDgg. Гид'ралазин СГДЗ) вводили внутрибрюшинно в дезе 2.5 мг/кг на 7 сутки развития солидного рака Эрлиха. Гипертермии СГТ) проводили локальным обогревом опухоли на водяной бане при 45° С в течение 30 мин. При сочетании ГДЗ и ГТ препарат вводили за 30 мин до ГТ.

Описан метод культивирования клеток и приготовления образцов для измерений in vitro. Проведен анали& влияпид ишемии в периоде регистрации спектров "^Р и ЯМР in vitro на концентрации метаболитов в образцах. Списан способ локализации чувствительного объзма в работе с поверхностной катушкой Сокружность диаметром 5 мм) специализированного датчика для регистрации спектров опухолей in vivo. Спектра ^Р и ЯМР регистрировали на спектрометрах Bruker АМ-400 (in vivo), WH-360 и AC-200 С in vitro, температура 4°C). Обоснован выбор методик измерений, в частности, метода перемежающегося сканирования и параметров спинового эха для одновременного наблюдения сигналов фосфатных метаболитов и дублета CH.j -

о

группы лактата в образцах in vitro.Описаны методы измерения интенсивностей, способы нормировки сигналов, определения значений внутриклеточного рК, методы статистической обработки данных.. •

Глава 3. Исследование особенностей энергетического метаболизма клеток АРЭ в процессе опухолевого роста.

Одной из важнейших характеристик опухолевого роста на

позднйх стадиях является дефицит кислорода и глюкозы.

вызывающий снижение содержания макроэргов в опухолях, что

служит основой многочисленных попыток использовать данные ЯМР 31п

f m vivo лля исследования динамики опухолевого роста. Вместе с тем, показано, что уровни АТФ и фосфокреатияа (ФЮ л

спектрах сильно завислт от вариаций микроциркуляции крови в резных участках популяции клеток. Использование асцитных опухолей позволяет свести к минимуму эффекты, связанные с неоднородностью микроциркуляции, и исследовать особенности гликолиза в процессе развития опухоли.

й клетках АРЭ [модификация ИХФ, Фомина М.М. и Др., 1979] методами ^Р ЯМР и ЯМР in vitro' определяли уровни фосфатов, лактата и величину внутриклеточного рН в динамике опухолевого роста.

Ряс I. А: Динамика уровня АТФ, Ф , значений рН в клетках АРЭ в процесса развития опухоли. По оси абсцисс время (сут); по левой оси огшинат р-АТФ/гР, Ф./ЯР СЯ). Б: Концентрация

' Н

лактата ь клетках АРЭ и в асцитическсй жидкости в процессе роста опухоли. По оси абсцисс время (сут); по оси ординат АСИ/АДСС СУ-е./ши."

др<0.05 по сравнение с 5 сут.

**сдесь и далее, за исключением специально оговариваемых случаев,приведена средние арифметические значения величин с ожской среднего. Достоверность различий оценивалась по критерия Оьчдепта

от г

Сравнение результатов и Н ЯМР - измерений С рис Та, 63 показывает, что рост ЛРЭ сопровождается снижением интенсивности анаэробного гликолиза и интенсификацией экскреции конечного продукта этого процесса, лактата, из клеток во внеклеточную сроду (рис 163. Величина отношения концентраций лактата в клетках и в асцитической жидкости а й по II сутки опухолевого роста снижается вдвое Сот О.Б до 0.25, соответственно). Таким образом, е процессе опухолевого роста детоксикация лактата происходит за счет его эффектизиой экскреции. В периоде наблюдения урозень внутриклеточного лактата снижается на 7при статистически достоверном снижении АТФ, накоплении Ф и щелочном сдвиге рН. Полученные данные показывают, что способом адаптации опухолевых клеток к аноксии и дефициту глюкозы является снижение интенсивности анаэробного синтеза АТФ и интепсификациия экскреции его конечного продукта, лактата. Перераспределение лактата между клетками и внеклеточной средой является гораздо более выраженной характеристикой опухолевого роста, чем уровень АТФ, что необходимо учитывать при разработке методов ЯМР -мониторинга развития опухоли.

Глава 4. Влияние противоопухолевых препаратов различных механизмов действия на фосфатный метаболизм клеток асцитных опухолей Химиотерапия может использоваться как способ воздействия на опухолевые клетки, позволяюинй исследовать особенности их метаболизма. С другой стороны, можно сжидать, что противоопухолевые препараты разных молекулярных механизмов действия вызывают специфические изменения обмена. В таком случае метаболические сдвиги могли бы служить характеристикой механизма и эффективности препарата. Для проверки этого предположения была разработана простая модель переживающей культуры клеток асцитных опухолей, позволившая наблюдать результат действия препаратов собственно на клетки, мин'/я эффекты органного уровня.

Подобраны условия инкубации, при которых в течение нескольких часов клетки сохраняит постоянный уровень АТФ и активно итрсбляпт содержащуюся в среде глпкоау

Изучалось влияние ингибитора аэробного синтеза АТФ реумицина СРе) и ингибитора синтеза макромолекул рубомицина (Ра) на динамику уровней фосфатов и величины рН в клетках асиитной гепатомы 22а.

РН

Рис 2. Влияние реумицина (в) и рубомицина Сх) на кинетику показателей энергетического обмена клеток гепатомы 22а в переживающей культуре. Контроль - в. Но осям абсцисс время I (мин).

"значения достоверно Ср<0.05) отличаются от контроля.

Для всех показателей, АТФ, фК, Фн и pH, Срис. 2) наблюдалась одна и та же картина: Ре модифицировал их в отличие от Рн. Статистически достоверные изменения обнаружены лишь на фоне сниженной концентрации глюкозы, причем падение АТФ имеет скачкообразный характер, что указывает на ведущую роль анаэробных процессов в энергообеспечении опухолевых клеток и наличие критической концентрации глюкозы, обеспечивавшей этот пороговый эффект снижения АТФ.

Предполагается, что помимо интеркаляции механизмы противоопухолевого эффекта Ру могут включать в себя нарушение целостности клеточных мембран и влияние препарата на дыхательную цепь [Блохин H.H. и др., 19841. Поскольку мы пе наблюдали изменений ни в показателях фосфолипидного обмена Суровни фосфомоноэфиров и фосфодиэфиров), ни в параметрах энергетического обмена под действием Ру, можно считать, что основным повреждающим действием препарата на клетку является интеркаляция. Этот вывод находит подтверждение в литературе I Гаузе Г. Ф. , 1971]. Опосредованное влияние препарата на энергетику клеток через ингибироваяие энергозависимого синтеза макромолекул реализуется за время, существенно большее, чем время опыта, возможно поэтому эффекты Рн з переживающей культуре не наблюдаются.

Аналогичный результат получен при исследовании динамики уровней фосфатных метаболитов клеток АРЭ в переживающей культуре под действием противоопухолевых препаратов N-нитрозометилмочевины (НМЮ, 5-фторурацкла (5-ФУ) и винкристина (V) [Семенова H.A. и др. 1990]. Циклоспецифические. агенты 5-ФУ и V не оказывали заветного' влияния на энергетику клеток. Напротив, НММ вызывал увеличение скорости расходования ФК и АТФ, что свидетельствует о прямом влиянии НММ на энергетический метаболизм исследованных клеток. Отличительной особенностью эффекта НММ было снижение содержания Фн в клетках и рост сигнала фосфомоноэфиров (ФМЭ), что, вероятно, следует связьть с разрушением клеточных мембран и выходом Ф в культур?лм,о сроду

"так, мою.ть перзжи.заг>ших культур позволяет г простом »кек< римеште бистро вамклять прямые эффекты препаратор на

энерготику клеток, получая информацию о биохимических механизмах воздействий.

Глава 5. Влияние пролиферативно активных противоопухолевых препаратов на энергетический метаболизм АРЭ.

Изучение опосредованного действия препаратов на энергетику опухолевых клеток . через ингибирование энергозавксимых процессов синтеза макромолекул требует использования экспериментальных моделей in vivo, однако зависимость энергетического статуса солидных опухолей от цутоккнетических эффектов может маскироваться эффектами кровотока. Поэтому действие пролиферативно активных препаратов N - яитрозо - N - метшгмочевины (НМЮ, 5 -фторурацила С5-ФУ) и винчристпна (V) иа энергетику опухоли изучалось на АРЭ. Препараты вводили животным внутрибрюшинно последовали динамику уровней фосфатчых метаболитов, проводя измерен з изолированных клетках.

При анализе данных С рис 3) обращают на себя внимание два факта: I - все использованные препараты независимо от их молекулярного механизма действия вызывают качественно схожий отклик - немонотонные изменения АТФ относительно контроля и снижение ФК с последующим возвращением к контролю; 2 -амплитуда наблюдаемых сдвигов кардинальным образом зависит oí природы препарата.

Величина эффекта падает в ряду НММ, 5-ФУ, V, что можнс связать с особенностями: влияния препаратов на кинетик} развития опухоли и их противоопухолевой эффективностью. Последняя определялась в параллельных экспериментах пс ИБгибированию накопления асцитической жидкости в соответствш с кинетическим критерием х* [Эмануэль и др., 1975]. Согласзс полученным данным, противоопухолевый эффект также снижается i последовательности: НММ - 5-4У - V. НММ как пролиферативн» независимый препарат вызывает гибель клеток, находящихся в< всех стадиях клеточного цикла, в том числе и покоящихся клеток, доля которых va поздних стадиях роста опухол] достаточно велика. 5-ФУ - анткметаболит, повреждает клетки : S-фазе клеточного цикла, V - митотропный агент, повреждав'

клетки в китезе. Очевидно, с замедлением темпа роста опухоли и сни*ением митотического индекса в поздние сроки развития практически исчезают пролиферирующие клетки - мишени действия 5-ФУ и V. Таким образом, процессы метаболизма ма:фоэргов в клетках АРЭ претерпевают однотипные изменения под действие»; пролиферативно активных препаратов, величина наблюдаемых метаболических сдвигов зависит от цитокинетических эффектов и согласуется с относительной противоопухолевой эффективностью препаратов.

>К С А) и АТФ СБ) в клетках АРЭ. По оси абсцисс - время часы), по оси ординат - ФК/С р-АДФ+у-АТФ) 1А); -АТФ/СЭ-АДФ+г-АТФ) СБ), аштрихованная полоса - контроль. р<0.05

лава 6. Антраииклин устойчивые штаммы лейкоза Р308, осфатный метаболизм.

оскольку развитие мнокествэяной лекарственной устойчивости МЛУ) опухолей значительно ограничивает возможности терапии", собеннсе значение приобретают характеристики, позволившие тличить МЛУ-опухоли от чувствительных.

редложено несколько механизмов возникновения МЛУ, в

частности, затрагивавших фосфатный метаболизм. С цел ью обнаружения характеристических особенностей фосфатного обмена ИЛУ - опухолей мы определили методом ЯМР содержание

фосфатных метаболитов и величин внутриклеточного рН в клетках лекарственно чувствительного и резистентных к Рн и эмоксилу (Эм) штаммов лейкоза Р388 (Р388/рн, Р388/эм), имеющих фенотип МЛУ, на экспоненциальной, стационарной и терминальной стадиях развития опухолей. Изучалось также влияние Рн и Эм на фосфатный метаболизм клеток этих штаммов в динамике роста опухолей.

Б клетках Р388 содержание ФМЭ было постоянным во все сроки наблюдения, в клетках резистентных штаммов - вдвое ниже, чем в тетках исходного в периоде развития лейкоза, за исключением терминальной стадии для клеток Р388/эм. Введение Рн и Эм не изменяло вида спектров клеток Р388/эм и P39<VpH в течение 7 сут наблюдения, но в клетках Р388 к концу опыта вызывало, соответственно, трех- и четырехкратное повышение концентрации ФМЭ. Таким образом, развитию МЛУ сопутствует изменение уровня мнтермедиатов фосфолипидного обмена, ФМЭ, что может . быть неинвазивной характеристкой развития МЛУ и свидетельствует о нарушениях фосфолипидного метаболизма клеток при , возникновении - лекарственной устойчивости.

от

Глава 7. ЯМР in vivo - спектроскопическое

исследование изменений фосфатного метаболизма солидной карциномы Эрлиха пол действием гидралазина и гипертермии, сеязь с противоопухолевым эффектом и ингибированием

кровотока

Целью исследований было выявление зависимости энергетического статуса опухоли in vivo от модификации опухолевого кровотока и обнаружение связи этих характеристик с величиной противоопухолевого эффекта. Снижение кровотока достигалось применением локальной гипертеркия СГТ), вазоактивногс препарата гидралазина СГЯЗЗ и их комбинированного действия (ГдЗ-йТ). Исследоьался пролонгированный эффект терапии Счерес сутки после зоатойстЕИй;. Статистическая обработка яанны> ípvc 4) выячнла следующие закономерности: I - изменение

кровотока хорошо согласуется а залержкой роста опухоли; 2 -эти показатели совпадают с уменьшением показателей энергетического статуса ФК/ФИ и АТФ/Ф,. только для ГДЗ+ГТ; 3 -

п И

при более чем в 3 раза сниженной интенсивности кровотока после ГТ изменения ФК/ФН и АТФ/ФН отсутствуют;' 4 •• при полной "дезенэргизации" опухолей после ГДЗ+ГТ наблюдается относительно небольшой, хотя и статистически достоверный противоопухолевый аффект. Выявленные факты указывают на существование критической величины кровотока, ниже которой происходят резкие изменения энергетики, когда содержание макроэргов определяется скоростью подачи кислорода и субстратов. Пороговое значение интенсивности кровотока достигается при ГДЗ+ГТ, следствием чего является снижение макроэргов до недетектируемых методом ЯМР величин. Зарегистрированная задержка опухолевого роста и полная "дезенергизация" опухолей, наблюдаемая в спектрах ЯМР после ГДЗ+ГТ, указывают на то, что это воздействие вызывает пролонгированную ишемию и, как следствие,. гибель части опухолевых клеток.

31

Р ЯМР ín vivo спектры карциномы Эрлиха через 24 ч после воздействий: ГДЗ. . Св),

ГТ (б), ГДЗ+ГТ (а) в

сравнении со спектром в контроле С г.). Отнесение сигналов: I - ФМЗ, преимущественно фосфохслив к фосфоэтаноламин; 2 - Фр;3 -ФК; 4 - 7-АТФ + 0-АДФ; 5 -«-АТФ + а-АДФ + НАДСНАДН); 6 ■•

в

C3i Шг ^з BB< 20

0.0

сигналов ФК и АТФ не' хх

интервал достоверно*

4 - п/о эффект (дни)

1 - ФК/Фн(%)

2 - атф/Фн (%)

3 - Т1/2 (мин)

95%

контр. ГДЗ ГТ ГДЗ+ГТ

Рис 4. Относительные концентрации макроэргических фосфатов в оолидыой карциноме Эрлиха чераз 24 ч после воздействий. Противоопухолевый эффект ГДЗ, ГТ, ГДЗ+ГТ (задержка роста опухоли относительно контроля) и скорость опухолевого кровотока ччрез 24 ч после воздействий (период полувыведения Хе, Т1/2, средние геометрические).

Обнаружен синергический эффект ГДЗ+ГТ, проявляющийся в изменении всех измеренных показателей. Использованный способ усиления действия гипертермии путем целенаправленного подавления кровоснабжения опухолей, несомненно, может найти свое место в практической онкологии.

Раздел III. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ЯМР 31Р ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА ГОЛОВНОГО МОЗГА.

особенности исследований мозга методом ЯМР in vivo, приведены краткие сведения о метоле поверхностных катушек. Изложены основные результаты иаучэник энергетического метаболизма мозга методом ЯМР при нарушениях мозгового кровообращения л другла патологических состояниях. Обоснованы задачи настоящего исследования, идея которых состояла в повышении

от

информативности метода ЯМР Р при изучении энергетического м'гтаболызм-! мозга. Необходимость решения такой задачи следовала как из анализа литературных данных, так и из

Глава I. В обзоре литературы рассмотрены методические

собственных экспериментов на мозге in vitro и in vivo. Поставленная цель достигалась двумя путями: Т - сокращением времени регистрации спектров за счет использования поверхностной катушки специальноJ геометрии, позволяющей получить удовлетворительное отношение сигнал/шум в спектре мозга крысы за I мин; 2 - разработкой нового метока анализа данных, выявлявшего свойства системы энергетического метаболизма, незаметные для стандартных способов статистической обработки. ■ Сформулированная выше задача решалась в исследованиях динамики фосфатных метаболитов мозга при тотальной ишемии, после травмы фронтальной коры, в периоде восстановления при компрессионной ишемии, после общего острого г-оолучеиия.

Глава. 2. Экспериментальные модели. Методики экспериментов к

анализа

В работе использовались беспородные крысы-самцы. Образцы изолированного мозга получали после вскрытия черепа, извлечения и перенесения мозга в ампулу ЯМР с физиологическим раствором при 0 - 4°С. Снижение ректальной температуры крыс до 15 проводили в камере с температурой О® С. Тотальная ишемия достигалась I - 3-мияутной электрофибрилляцией мышцы сердца переменным током' 27 Б, который подавали на паоу игольчатых электродов, закрепленных иод кожей грудной клетки. Контролировали электическую активность сердца (ЭКГ). Ацетилхолиновая модель тотальной ишемии создавалась введением раствора ацетилхолина (100 мг/кг) в бедренную вену [Лихо-дийС. С. и др., 1982].

ЯМР Л1Р измерения проводили непосредественно перед остановкой сердца и в течение получаса с интервалом 1-2 мин сразу после нее. Верапамил вводили за 30 - 40 мин до ишемии внутибрюшинно (5 мг/кг) или в желудочки мозга (0.5 мг/кг, объем 0.05 мл).

При фронтальной лобэктомад крысам удаляли 50% фронтальной коры [Романова Г. А. и др., 1989]. Контролем служили лотаоопсркровачкые животные. Гаяглисзид GMI применяли I* ъглс аппликации губки, прочитанной препаратом (40 цг), которую накладывали на поврежденную сбласть (опыт) кли па

соответствующую ей поверхность не-гравмированного мозга

С контроль). У каждого животного перед операцией, на 4 и 9

сутки компенсаторного периода определяли двигательную

активность ь открытом поле, послэ чего измеряли уровни

фосфатных метаболитов и значения внутриклеточного рН в мозге.

Симметричные двусторонние очаги 15 - минутной компрессионной

ишемии лобной коры создавали погружением тефлонового стержня

на 2 мм [Barslcov I.V. et al., 1991]. Контролем служили

локкооперировапные крысы. Измерения фосфатных метаболитов и

внутриклеточного рН проводили до ишемии и далее с интервалом

з 12 мин в течение часа после нее.

fiO ТЯ1"*

Тотальное г-облучение оиСо я 1 'Cs чроводили при мощности дозы 1.3 и 0.03 Гр'е С время экспозиции з обоих случаях 4 шн). Поглощенные дозы составляли 300 и 6.5 Гр, соответственно. Фосфаты в мозге измеряли перед облучением, черйз 2 - i ч, I, Сдля обеих доз ) 2, 4 и 6 сут Сдля дезы 6.5 Гр) после облучения.

Спектры ЯМР изолированного мозга регистрировали на спектрометрах Bruker AM - 400 и V® - 360 при 4°С. Спектры ЯМР мозга in vivo регистрировали на спектрометре Bruker AM -400, применяя специализированные датчики с поверхностной катушкой. Для изучения тотальной ишемии применялась двухсекционная объемно - поверхностная катушка, геометрия, которой позволяет повысить отношение сигнал/шум за счет увгличе.чия объемг образца и в то же время обеспечивает удоелетворительнуо пространственную избирательность (Лиходий С. С. , 19903. В остальных опытах использовали плоскую олновитковую ка-ушку диаметром 14 мм и импульсную последовательность Depth sequence для локализации чувствительного объема. Для обеих катушек описаны опыты на фантомах по подбору параметров, обеспечивающих пространственную избирательность. Обоснованы способы обработки сигнала спада свободной индукции (например, метод convolution difference в случае двухсекционной катушки), метоцы нормировки интенсивностей сигналов спектров, определение внутриклеточного рН (по химическому сдвигу сигнала неорганического фосфора), методы статистической обработки данных.

Способ получения Z-индека состоит из создания корреляционной матрицы, элементами которой являются нормализованные (Z -преобразование Фишера) линейные коэффициенты корреляций между -парами переменных (относительные интегральные интенсивности сигналов, значения рН для выбранной группы спектров мозга "^Р ЯМР in vivo) и редукции размерности матрицы путем усреднения. Дана оценка теоретических и выборочных значений дисперсии Z. Приведены вычислительные эксперименты для получения формулы вычисления дисперсии. Описан метод классификации состояний энергетики мозга по критерию максимального значения Z.

Глава 3. Методические подходы к изучению .фосфатного метаболизма мозга. Сравнительный анализ ЯМР спектров

мозга крыс in vit.ro и in vivo.

Высокая чувствительность ткани головного мозга к ишемии и гипоксии предъявляет особые требования к методам исследования метаболизма. При выборе экспериментальной модели для изучения фосфатного обмена мы исследовали модель охлажденного изолированного, мозга. Обнаружено, что время, затраченное на выделение ткани, кардинальным образом влияет на вид спектров (рис 5а - в). Значения [АТФЗ и [ФК1, полученные при анализе спектров in vitro (рис 56; образцы приготовлены за 10 с), согласуются с биохимическим оценками. Сравнение данных ЯМР in vivo (рис 5в) и in vitro показывает, что при выделении мозга в клетках заметно снижается [ФК1, увеличивается [Фн5 и [ФМЭ]. Аномально высокий уровень ФМЭ обусловлен возрастанием фосфоэтаноламина, что свидетельствует о быстром разрушении мембранных фосфблипидов. Общая гипотермия (15° С) не изменяет содержание фосфатов в мозге. Сравнительный анализ спектров изолированного мозга и мозга in vivo показал, что во время выделения в нервной ткани в течение нескольких секунд происходит существенное Изменение уровней фосфатных метаболитов. Зарегистрированные метаболические сдвиги не зависят от температуры тела животного. Для получения адекватной информации о фосфатном метаболизме мозга метод ЯМР - измерений в изолировщиком охлажденном мозге неприменим и необходимо использование методики ЯМР in vivo.

от

Рис 5. Р ЯМР спектры мозга.крысы. А - изолированный мозг, с момента вскрытия черепной коротки до охлаждения ткани прошло более 30 секунд; Б - не более 10 секунд. В - мозг in vivo.

Глава 4. Нарушения энергетического метаболизма мозга при тотальной ишемии.

Развитие патологических механизмов клеточного повреждения при ишемии мозга определяется нарушениями энергетического метаболизма CSiesjo В.К., 19781. Последние развиваются в мозге чрезвычайно быстро. Поэтому сокращение времени анализа необходимо для получения детальной информации о динамике повреждений энергетического обмена при ишемии. Используя датчик с двухсекционной поверхностной катушкой, мы смогли получить спектр мозга крысы за I мин. Тотальная ишемия - предельный случай нарушения моагового кровотока -использовалась как модель для изучения изменений энергетического обмена вследствие ишемии. Уже в первые минуты после остановки сердца креатинкиназная система оказывается неспособной поддерживать стационарный уровень АТФ, е результате чего наблюдается одновоемэнчое падение ФК и АТФ при росте Фн, ФМЭ и снижении рН. Временные зависимости уровней ФК и АГФ хорошо аппроксимируются суммой двух экспонент Срис 6, 7). Для ФК периоды полураспада бьстрой и

медленной компонент составляют 1.3 и 14.3 мин; для АТФ -соответственно, 2 и 10.6 мин. Полученный результат может быть следствием разной чувствительности клеток глии и нейронов к ишемии.

Рис 6. Изменение уровней ФК С А) и АТФ (Б) в динамике 30 мин ишемии С°). По осям абсцисс время (мин).

По осям ординат интенсивность С Л сигналов ФК СА) и р-АТФ СБ) в спектрах С У. от контроля время 0).

Аппроксимация суммой 2-х экспонент Ссплошные кривые).

ГЛАВА 5. ' Влияние верапамила на динамику снижения уровней фосфатов моага крыс при тотальной ишемии.

Блокирование каналов может замедлять темпы деградации макроэргов в мозге при ишемии и тем самым быть средством терапии. Нами обнаружено достоверное положительное влияние Са -антагониста верапамила на динамику уровней фосфатных метаболитов мозга в течение 30 - минутной тотальной ишемии, вызванной остановкой сердца. Под действием препарата замедлялись темпы снижения АТФ, ФК и накопление Ф3. Вместе с тем. общий характер метаболических сдвигов оставался неизменным.

Исследована эффективность действия верапашла в зависимости от способа его введения. При сохранении основных закономерностей, влияние препарата, введенного в желудочки мозга, было более кратковременным, чем при внутрибрюшинном введении, что указывает на роль системных эффектов в механизме обнаруженного протекторного действия препарата на динамику измеренных показателей энергетического обмена мозга при тотальной ишемии.

Глава 6. Оценка энергетического статуса мозга с помощью метода свертки корреляционных матриц спектральных данных.

Полная ишемия - одно из немногих патологических состояний, при которых наблюдается заметное уменьшение концентраций макроэргов в мозге. Вследствие эффективной регуляции в системе энергетического метаболизма фосфаты -участники энергетического обмена мозга стабильны даже в результате сильных воздействий [Siesjo В. К., 19781. Принципиально новую информацию о системе можно получить, если при анализе учитывать не только концентрации фосфатных метаболитов и значения внутриклеточного рН, но и связи между ними как компонентами целостной системы.

Идея разработанного анализа состоит в том, что совокупность корреляционных связей между переменными, полученными из группы &1Р ЯМР спектров in vivo (интенсивности сигналов, значения внутриклеточного рЮ, характеризует определенное состояние системы энергетического метаболизма. Для оценки этой совокупности необходима свертка информации. Мы использовали усреднение, предварительно нормализовав •элементы корреляционной матрицы, и получили интегральную характеристику связанности и сбалансированности параметров системы, Z-индекс. Полученный показатель позволяет поставить в соответствие каждому состоянию системы число и затем сравнивать эти числа. Поскольку Z-индекс является средним значением z-преобразованных коэффициентов корреляций ^j), его изменения могут быть вызваны как изменением значений z^j, так и изменением баланса положительных и отрицательных корреляционных связей. Эти два фактора можно разделить, если нарлду с Z использовать усреднение модулей 1^.1 - |Z|.

Таким образом, 2 характеризует сбалансированность корреляционных связей, а \2\ - их величину. Эксперименты с различными патологическими воздействиями показали, что ¡21 менее чувствителен, чем 2.

Доказано, что 2 - индекс, ориентированный, в отличие от других критериев, на изменение структуры корреляционных связей между переменными, способен выявлять изменения в системе, не заметные для других критериев. 2 не выявляет биохимических механизмов изменений, происходящих в энергетике, но в биохимическом смысле он характеризует гомеостатическую устойчивость, компенсаторные возможности, а значит, жизнеспособность энергетики мозга. Обоснованы смысловые границы применения 2 - анализа Сслабо связанная система, в которой отсутствуют устойчивые функциональные зависимости). Получены теоретические и экспериментальные границы величины 2. Разработан метод вычисления дисперсии 2, <г ; описаны вычислительные эксперименты по проверке теоретических значений оценена выборочная дисперсия 2 по экспериментальным данным для интактного мозга. Увеличение 2 С до значений, характерных для абсолютно несвязанной системы - набора случайных чисел) было неспецифическим следствием патологического воздействия, независимо от этиологии последнего. Это позволяет использовать возрастание 2 как критерий патологического состояния и полагать, что патологическое водействие разрушает структуру связей в системе энергетического метаболизма мозга, а следовательно, устойчивость системы. 2 - критерий оказался более чувствительной характеристикой гомеостаза, чем А1Ф и другие фосфаты - участники энергетического обмена, что иллюстрируют данные экспериментов, изложенные в следующих главах.

Глава 7. Исследование энергетического метаболизма мозга крыс в компенсаторном периоде поело травмы фронтальной керы.

В главе изложены результаты исследования компенсаторных возможностей энергетики мозга крыс в периоде восстановления после фронтальной лобэктсмии СФЛ) и результаты 2-анализа, выявившие взаимнооднозначную связь между метаболическими и

функциональными нарушениями. Проведена оценка действия экзогенного моносиалоганглиазида 6М1, средства, способствующего структурному и функциональному восстановлению мозга после травмы, на энергетику мезга в компенсаторном периоде после ФЛ.

По результатам анализа средних ФЛ вызывает обратимое снижение уровня АТФ и рост АДФ в мозге, при аппликации ганглиозида этот эффект ФЛ исчезает Стабл.I). Оценка интегративной деятельности ЦНС по динамике двигательной активности в компенсаторном периоде позволила достоверно классифицировать животных на 2 подгруппы с соответственно увеличивающейся и уменьшающейся двигательной активностью. При применении 0>М^ индивидуальные различия в изменении двигательной активности не обнаружены.

В подгруппах с разной динамикой двигательной активности наблюдались слабые, разновременные и разнонаправленные сдвиги уровней фосфатов в комеасаторном периоде (табл.1). Использование 2 - индекса позволило сравнить подгруппы и показало, что ФЛ вызывает увеличение этого параметра, наиболее выраженное у животных с гиперактивностью Стабл.2). При использовании 6М1 величина 2 не изменялась (табл.2). Дополнительно к классификации по локомоторной активности проведена классификация по г-индексу с тем, чтобы установить соответствие между метаболическими и ' функциональными нарушениями. Критерием отбора, который осуществлялся полным компьютерным перебором С®^, было максимальное значение 2 для одной из подгрупп в конце опыта (9 сут). Индивидуальный состав подгрупп при двух способах классификации (по поведению и по 2) оказался идентичным, за исключением I животного. Совпали и значения 2 в полученных этими независимыми методами подгруппах С табл. 2).- Таким образом, слабые сдвиги средних значений фосфатов мозга маскируются неоднородностью индивидуальной динамики восстановительного периода. Однако анализ корреляционных связей между параметрами системы энергетического метаболизма выявляет патологические изменения в энергетике.

Табл. I. Относительные интегральные интенсивности сигналов

фосфатных метаболитов (Я) в. спектрах мозга крыс перед ФЛ (время 0) и в компенсаторном периоде после ФЛ.

-Группа животных

Время (сут)

у-АТФ+0-АДФ <х-АТФ+а-А1Ф „ 0-АТФ ШЖН) +ДФЛЭ

1 (ФЛ) 0 13.9+0. 6, 37.6+0.6 9.9+0.6а

4 14.3+0. 5 35.9+0.6 8.9+0.6а

9 12.7+0.6 38:1+1.0 11.4+0.6

1Ь (ФЛ, 0 14.1+0.6 38.3+0.7 ь 9.9+0.9,

уменьшение дви- 4 13.7±0.8 " 35.0+0.6° 8.1±0.9

гательн. активн.) 9 13.9+0. 7 39.1+1.2 10.1+0.8

2 (ФЛ + ОЯ) 0 13.5+0. 4 35.7±0.7 9.6+0.7

4 14.1+0.7 33.6+1.1 10.1+0.8

9 13. 0+1.1 35.4±1.1 • 11.6+1.2

3 (Ложно- 0 14.4+0.5 35.1+0.6 10.6+0.6

оперир. 4 13.7+0.7 35.5+1.0 10.2+0.5

+ вкп 9 13. 2+0.6 37.9±2.3 11.5+1.0

4 (Лсжно- 0 13.5+0.7 35.7+1.3 10.6+0.8

оперир. 4 12.0+0. 4 35.6±1.3 11.2+1.0

-Пределы интегрирования сигнала от -6.5 до 11.5 м. д. и р <0.05 по сравнению с соответствующими величинами в группе 4. р <0.05 по сравнению с предоперационным уровнем.

Табл. 2. Значения 2-индекса (¿дисперсия 5 в мозге крыс

различных групп животных перед операцией (время 0) и в периоде восстановления.

Время (сут)

Группа животных

1 (ФЛ)

2 сфл+сзмп

3 СЛожно-оперир.+6Щ)

4 (Ложно-оперир.) 1а (ФЛ, увеличение двигат. активн.) 16 (ФЛ, снижение двигат. активн.)

1Ь' (ФЛ, остальные)

Применение ганглиозида вМ1 нормализует нарушения энергетического метаболизма мсага в компенсатсрном периоде после фронтальной лобэктомии, о чем свидетельствует отсутствие изменений уровней фосфатных метаболитов и

0 4 9

-0.18 -0.15 -0.14 -0.16 -0.10 -0.19 0. 0016 0.0026

-0.16 -0.14 -0.14 0.0032

-0.17 -0.19 -0.20 0.0032

-0.18 -0.20 0.01 0. 0053

-0.20 -0.17 -0.11 -0.20 -0.16 0.03 0.'0040 0. 0053

-0.22 -0.11 -0.17 0.0040

г-индекса.

Использование 2-индекса дает возможность выделить животных с наиболее выраженными нарушениями энергетики и выявить связь между метаболическими и функциональными нарушениями.

ГЛАВА 8. Исследование Нарушений фосфатного метаболизма мозга крыс при двусторонней фокальной компрессионной ишемии.

Влияние локальных нарушений кровотока на энергетический метаболизм мозга изучено мало не только с точки зрения механизмов, но и в смысле выявления эффектов и их динамики. Чувствительность 2 индекса мозга к травме фронтальной коры позволяла надеяться, что влияние слабых изменений кровотока на энергетический метаболизм при компрессионной ишемии может быть обнаружено' с помощью этого параметра. Решение такой аадачи позволило бы, с одной стороны, получить данньО об участии системы энергетического метаболизма в механизмах этого вида травмы и, с другой стороны, оценить возможности предложенного способа корреляционного анализа и 2 - параметра для обнаружения патологических сдвигов в энергетике мозга. Анализ средних значений фосфатных метаболитов мозга в течение

1 часа после 'компрессионной ишемии обнаружил небольшие по величине статистически достоверные сдвиги измеренных показателей, динамика которых была различной по отношению к контролю Сложнооперированные животные) и к предоперационному уровню С табл. 3). Последнее обстоятельство, вероятно, обусловленное суперпозицией эффектов компрессии и изменения внутричерепного давления при вскрытии черепа, чрезвычайно затрудняло не только интерпретацию данных, но и их сравнение. Использование 2 - анализа позволило решить эту задачу. Показано, что сразу после прекращения компрессии в мозге изменены уровень АТФ и 2 (табл. 3). Одновременно возрастал и |2| - параметр, ■ характеристика связанности компонентов системы. И уровень АТФ, и Ъ являются показателями гомеостатической устойчивости и обнаруживают патологические сдвиги в энергетике мозга, обусловленные компрсссисй коры.

2 оказался более чувствительной и более удобной характеристикой энергетического статуса мозга, чем 1АТФ). Мы наблюдали лишь нобольлое снижение АТФ, т;:"/' п:; П

Габлица 3. Динамика интегральных интенсивностей сигналов Фн,

«-АТФ+а-АДФ+НАД/МАДН++УДФ*, р-АТФ (у. относительно суммарного (юсфора) , значений 2-индекса и 121 С¿стандартное отклонение) в лозге крыс экспериментальной (I) и контрольной СП) групп.

зремя Ф

а-АТФ+о-А1Ф+

!мин) NAJI/NAM +УДФ

I II ' I li

0 6.2 + 5.8 + 35.2 + 37.4 +

0Г5 0.6 оГЭ 2Г0

.6 8. 9а + 7.2 + 34.8 + 37.1 +

Í8 оГэ 1Г7 1.3 гТ8

й 7.1 + 6.5 34.06 + 38.7 +

10 оГз 0.7 0.8 г. Г -

Ю 8.2a,d 6.3 + + 32. la'd 37.0 +■ +

32 0.3 1.0 0.8 2.5

52 8.3a,á 5.4 + + 33.2 + • 36.9 +

34 0.6 0.7 ra- 2.5

I

/з-АТФ II

2

121

,а

13.3 +

0.3

11.3 +

0.9

11.9 +

1.0

12.3 +

0.5

11.7

0.7

12.6 +

0.9

■ I II i II

-0.18 + -0.17 + 0.52 + 0.53 +

0.03 оГоз 0.03 оГоз

-0.04 + -0.20 + 0.28 + 0.52 + •

о.бз .0.03 0.03 оГоз

-0.18 + -0.20 - + 0.53 + 0.52 +

оГоз оГоз 0.03 0.03

12.5 11.1 -0.15 -0.20 0.52 0.54 £ + + ± ± +

0.3 оГэ 0.03 0.03 0.03 0.03

12.1 12.9 -0.15 -0.18 0.53 0.52 + + + + + +

0.6 0.7 оГоз о.оз оГоз оГоз

}- р<0.05 по сравнению с дооперационным уровнем. - р<0.05 по сравнении с соответствующим значением в контроле.

'величивался более чем на 200"/.. Кроме того, АТФ уменьшался ■олько относительно исходного уровня и не изменялся )тносительно контроля. 2-индекс возрастал как по сравнению с штактным состояним, так и по сравнению с контролем, [олученные данные ■ выявили . нарушения энергетического (етаболизма мозга при компрессионной ишемии и обнаружили [реимущества 2-анализа по сравнению с анализом средних.

Глава 9. Влияние общего 7-облучения на фЬсфатный ютаболизм головного мозга крыс • по данным Р спектроскопии in vivo.

Механизмы нарушения . функций - головного мозга под [ействием ионизирующей радиации изучены недостаточно. На юновании ряда экспериментальных . данных высказываются •редположения о влиянии радиации, на системы синтеза АТФ, з

первую очередь на окислительное фосфорилирование [Давыдов Б. И., 1987], что вызывает дисфункцию энергозависимых процессов ионного транспорта, создающую основу для изменения реактивности нервной ткани и развития неврологических повреждений.

в.о

4.0|-

ц г ' ■ " " ■ I 1 | ' ■1 Н I I I I | ' ■ Ч Н I П р I 1 " ■ | ■ " " ■ ■ ' Ч " " " ■ ■ ^ 0

о г < о " о

РН

7.50

7.40

7.20

3^0 I ' М I ] II [ I 11 I г. I I и I |...... I I ? 11 I I I 11 ■ I I |. I I I . I I 1 ^ ;

О 2 И

г ' 6

Рис 7. Влияние общего

однократного г

облучение в дозах 6.5

Гр. СО) и 300 Гр. Св)

на уровни АТФ Са), Фн

(б) и величину

внутриклеточного рН

С в) в мозге крыс. По

осям абсцисс-

времяСсут); по оси

ординат-интенсивность

сигналов 0-АТФ С а) и

Ф„(б), приведенная к н

ЕР Значения для

иитактного мозга время О

'pZO.CS по сравнению с исхолним -начсииом О!

Для характеристики состояния энергетического метаболизма мы провели исследование динамики уровней фосфатных метаболитов и значений внутриклеточного рН в мозге крыс после общего однократного у-облучения в дозах 6.5 и 300 Гр, вызывающих, соответственно, костно - мозговой синдром и ЦНС синдром. Анализ средних значений измеренных величин показал, что дозы 6.5 и 300 Гр. вызывают лишь небольшие сдвиги уровней фосфатных метаболитов и значений внутриклеточного рН в мозге С рис 7 а-в). Обратимое снижение Ф и рост рН через сутки после облучения в среднелетальной дозе наблюдается при неизменном уровне АТФ. Однако через 2 сут регистрируется существенное увеличение 2 параметра, значения которого не возвращаются к норме в течение исследованного периода (табл. 4).

Таблица 4. Значения 2-индекса С±дисперсия) в интактном мозге крыс (время 0} и в динамике после г~облучения в различных дозах.

Доза облу- Время (сут)

чения (Гр)

О 0.1 1 2 4 6

6.5 -0.18 -0.21 -0.17 -0.08 -0.08 -0.02

+ + + + + +

0.0032 0.0032 0.0032 0.0032 0.0032 0.0032

300 -0.19 -0.14 -0.07

+ + +

0.0032 0.0032 0.0032

Облучение в сверхлетальной дозе через сутки приводит к одновременному возрастанию уровня АТФ и значения 2, что можно считать свидетельством патологического состояния энергетики мозга и показателей снижения гомеостатической устойчивости системы энергетического метаболизма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. В работе с помощью метода ЯМР-спектросшпии получена принципиально новая информация и обнаружен ряд неизвестных ранее закономерностей энергетического метаболизма in vitro и in vivo. Впервые обнаружены способы адаптации злокачественных опухолей к дефициту энергетических субстратов и кислорода. Выявлены закономерности энергетического метаболизма опухолевых клеток на разных уровнях биологической

организации. Подтверждена ведущая роль анаэробных процессов в энергообеспечении опухолей как в периоде опухолевого роста, так и при экстремальном воздействии - ингибировании аэробного синтеза АТФ под влиянием противоопухолевой химиотерапии. Активация креатинкиназной системы, проявляющаяся в увеличении скорости расходования креатинфосфата при ингибировании аэробного синтеза АТФ, обнаруживает путь поддержания стабильности АТФ в опухолевых клетках в условиях нарушения процессов электронного транспорта.

И в опухолевых клетках, и в опухоли in vivo обнаружен резкий срыв АТФ - гомеостаза, обусловленный суммарным воздействием на аэробный и анаэробный пути синтеза АТФ. Только чрезвычайно сильные изменения в энергетическом метаболизме - полная "дезенергизация" клеток - создают достоверный противоопухолевый эффект, механизм которого основан на пролонгированной' глубокой ишемии. В этой связи очень существенен обнаружений.* пороговый эффект подения уровня АТФ при достижении критической величины интенсивности кровотока в опухоли in vivo.

Итак, эффективная регуляция энергетики поддерживает постоянные уровни фосфатных метаболитов вплоть до глубоких изменений концентраций энергетических субстратов, поступавших в клетки. Впервые создан метод, позволяющий выявить и оценить нарушения этой регуляции. Оказалось, что именно такая оценка дает возможность обнаружить изменения в энергетике, коррелирующие с нарушением физиологической функции. Эти данные были получены при исследовании энергетического метаболизма- мозга, но разработанный подход может быть использован для изучения энергетики других биологических структур и для исследования других метаболических систем. Результаты работы могли быть получены только при испол'ьзовани такого экспериментального метода,как метод ЯМР спектроскопии, поскольку это единственный метод, позволяющий изучать пути метаболизма неинвазивно, получать многопараметрическую информацию в динамике процессов за малый промежуток "времени Реализация этих возможностей потребовала создания новых подходов, которые существенно расширили экспериментальные возможности метода для изучения биологических скстсм.

В работе впервые даны эффективные оценки изменений показателей фосфатного метаболизма в опухолях и мозге in vivo in vitro, которые позволяют обнаружить, и охарактеризовать .динамику опухолевого роста, возникновение множественной лекарственной устойчивости, молекулярные и клеточные механизмы противоопухолевой терапии, метаболические последствия нарушений мозгового кровообращения, эффекты противоишемической и посттравматической терапии, участие энергетического обмена в механизме развития патологий головного мозга различной этиологии. Предложены способы выявления индивидуальных особенностей нарушения метаболизма и выделения групп.повышенного риска.

ВЫВОДЫ

¡.Впервые установлено, что опухоль на поздних стадиях развития адаптируется к ' дефициту кислорода и глюкозы посредством снижения интенсивности анаэробного гликолиза и интенсификации экскреции лактата. Распределение лактата между клетками и внеклеточной средой является более чувствительной характеристикой опухолевого роста, чем концентрации фосфатов - участников энергетического обмена.

2. . Впервые показано, что молекулярные механизмы химиотерапии проявляются в характеристических нарушениях фосфатного метаболизма опухолевых клеток, на основании чего предложен удобный способ отбора препаратов прямого действия на энергетический обмен. Влияние химиотерапии на клеточную кинетику опухолей обнаруживается. в неспецифических сдвигах уровней макроэргов в клетках при элиминировании влияния опухолевого кровотока. Величина эффекта согласуется с циклоспецифичностыэ и противоопухолевой эффективностью препаратов.

Возникновение множественной лекарственной устойчивости сопровождается модификацией фосфолипидного обмена и характеризуется изменением содержания ФМЭ в опухолевых клетках.

3. Обнаружен пороговый эффект влияния кровотока в опухоли на энергетический статус опухолевых клеток in vivo, впервые дана оценка критического значения интенсивности кровотока, вызывающая "дсгенэргизацию" опухоли и, как

J6

следствие, достоверную задержку опухолевого роста. Выявлено синергическое пролонгированное действие терапии гидралазин +■ гипертермия на величину противоопухолевого эффекта, интенсивность опухолевого кровотока и энергетический статус опухоли.

4. Сокращение времени регистрации ЯМР спектров in vivo выявляет закономерности влияния нарушений мозгового кровообращения на показатели энергетического и. фосфолипидного обмена мозга и достоверное замедление патологических изменений метаболизма под действием блокатора кальциевых каналов верапамила при тотальной ишемии.

5. Впервые найден способ, позволяющий оценить одно из основных свойств системы энергетического метаболизма мозга -регуляцию метаболических процессов, обеспечивающую стабильность системы. Разработан новый метод анализа спектральных данных, основанный на характеристике совокупности силы и сбалансированности связей между показателями системы энергетического метаболизма мозга, измеренными методом 3*Р in vivo. Предложен новый количественный критерий энергетического статуса мозга, выявляющий патологические изменения в энергетике, незаметные для стандартных способов анализа.

6. Впервые in vivo, на индивидуальных животных изучена динамика нарушений энергетического метаболизма- мозга при травме фронтальной коры, локальной компрессионной 'ишемии,', общем i - облучении. Показано, что при специфических изменениях, характеризующих разновременные • и разнонаправленные сдвиги метаболизма в каждом конкретном случае, универсальным ответом на воздействие является снижение силы и сбалансированности корреляционных связей в системе энергетического метаболизма мозга, оценка которой позволяет установить связь между метаболическими и функциональными нарушения.«, величиной воздействия и устойчивостью системы.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

I. Дубинский В.З. , Семенова Н. А , Сибельдина Л. А.

от

Изучение методом Р-ЯМР динамики энергетического ой'мена в

клетках гепатомы 22-а при действии противоопухолевых препаратов.// Докл. АН СССР. - 1985. Т. 281. N I. С. I8Q-I83.

2. Семенова Н. А. , Дубииский В. 3. , Сибельдина Л. А. •Кинетика фосфорилироваяия D-глюкозы в опухолевых клетках на начальной стадии "zero-trans" - транспорта. Изучение методом 3*Р-ЯМР.// 9 Всесоюзн. школа по магнитному резонансу, Кобу лети. - 1985. - С. 656-658.

3 Sibeldina L.A. , Yushnanov V. Е., Knubovets T.L. , Christianovich D.S. , Shkarin P. Yu.Semenova N. A., Eichhoff U. High resolution 31-P and 1H-NMR spectroscopy in experimental oncology.// Bruker Med. Report - 1988. - N 1. -P. 15-21.

4.Лиходий С. Ст., Семенова Н.А., Лубинский В.3., Лиходий Ст.С., Сибельдина Л. А. Об уровнях фосфорсодержащих метаболитов в мозге крыс по данным ЯМР.// Нейрохимия. -1987. - Т. 6. С. 439-441.

5. Лиходий С. Ст., Лиходий С.С. , Сибельдина Л.А. Семенова Н. А. Динамика уровней макроэргических фосфатов мозга во время ишемии по данным Р ЯМР спектроскопии.// Нейрохимия. - 1988. - Т. 7. С. 415-424.

6. Лиходий С. Ст., Лиходий С. С. , Сибельдина Л. А. Семенова Н. А. Влияние верапамила на динамику снижения уоовней макроэргических фосфатов мозга при ишемии по данным Р-ЯМР спектроскопии in vivo.// Вопросы медицинской химии. - 1988. -Т. 6. - С. 109—113.

7. Ганнушкина И.В., Баранчикова М.В., Сибельдина Л. А. Семенова Н. А. , Лиходий С. С. , Конрадов А. А. // 2 Всесоюзная конференция ' "Физиология, патофизиология, фармакология мозгоеого кровообращения". - Тбилиси, 1988. - С. 47.

8. Ганнушкина И. В., Баранчикова М.В., Сибельдина Л. А. Семенова Н. А. , Лиходий С. С. , Конрадов А. А. Некоторые прогностически значимые показатели биоэнергетического метаболизма - мозга при его ишемии в эксперименте (ЯМР-спектроскопическое исследование).// Журн. невропатологии и психиатрии. - 1989. - T.LXXXVIII. - Вып. I. - С. 27-31.

9. йелок Е. П. , Семенова Н. А. , Островская Л. А. ,

От

Сибельдина Л. А. Исследование методом Р-ЯМР метаболизма клеток асцитного рака Эрлиха при действии противоопухолевых

препаратов разных классов.// VII Бсес. , конф. "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Звенигород - Черноголовка. -

1989. - С. 52.

10. Sibeldina L. А., Eichhoff U, , Knubovets T..L. , Semenova N. А., Khristianovich D.S., Yushmanov V.E., Likhoduj S.S. P NMR study of biological structures in normal and pathological state. // 11 Internat. Conf. on phosphorus chemistry. - Tallin, 1989. - P. 4-5.

11. Семенова H.A., Щелок Е.П. , Сибельдина Л.А.

от

Исследование методом Р ЯМР влияния противоопухолевых препаратов на метаболизм клеток асшггного рака Эрлиха в переживавшей культуре. //. Эксперим. Онкология деп. ВИНИТИ N7571-BQ9 от 20.12. G9.

12. Ширяева O.A., Семенова H.A., Сибельдина Л. А. , Гончарова С.А., Коновалова Н.П. Исследование фосфорсодержащих метаболитов в клетках антрациклинустойчивых штаммов лейкоза Р388. // Эксперим. Онкология. -4989. - Т. ii. - N 4. - С. 70-73.

13. Романова Г.А., Семенова H.A. Исследование методом

от

ЯМР Р in vivo динамики уровней фосфорсодержащих метаболитов в мозге крыс при фронтальной лобэктомии. // Докл. АН СССР. -

1990. Т. 313. - N 5. - С. 1254-1258.

14. Semenova N. А., Tshelok Е. Р. 31Р - and - NMR study of Ehrlich ascites carcinoma cells (EAC) metabolism under l-nitrcso-l-methylurea. // Seminar "Applied NMR spectroscopy". - Moscow, 19S0. - P.29.

15. Semenova N. A., Tshelok E.P., Eichhoff U., Sibeldina

Ol

L.A. P-NMR ■ study of Ehrlich ascites carcinoma cells metabolism under the effect of. antitumour drugs of various classes. // Eur. Congr, of NMR in Medicine and Biology. -Strasburg, 1990. - P. 317.

IB. Ширяева O.A., Семенова H.A., Сибельдина Л. А. ,

от

Гончарова С. А., Коновалова Н. П. Р ЯМР - исследование фосфорсодержащих метаболитов в клетках антрациклин-устойчивых штаммов лейкоза Р388 m vivo.//' VIII Бсес. конф. "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Звенигород - Черноголовка. -1990. - С. 242.

17. Semenova N. А. , Romanova G. А. . Sibeldina L.A. In vivo

Я1 Jy

Р NMR study of dynamics of phosphate metabolite levels in

rat brain after frontal lobectomy. // Eur. Congr. of NMR in

Medicine and Biology. - Strasburg, 1990. - P. 246.

18. Semenova N. A.. Tshelok E.P., Eichhoff U. , Sibeldina

ot

L. A. P-NHj? study of Ehrlich carcinoma cells metabolism under the effect of antitumour drugs of various classes. // 9th Arrnu. Sci. Meeting of the Soc. of Magnetic Resonance in Medicine. - New York, 1990. - P. 828.

19. Semenova N. A., Romanova G. A., Sibeldina L. A. In vivo

qi

P NMR study of dynamics of phosphate metabolite levels in rat brain after frontal lobectomy. // 9th Annu. Sci. Meeting 1 of the Soc. of Magnetic Resonance in Medicine. - New York,

1990. - P. 1022.

20. Семенова H. A. , Шелок E. П., Островская Л. A., Сибельдина Л. А. Исследование методом ^*Р-ЯМР высокого разрешения нарушений в системе энергетического метаболизма клеток асцитного рака Эрлиха при воздействии противоопухолевых препаратов.// Изв. АН СССР, сер. биол. -

1991. - N 5. - С. 794-798.

21. Semenova N.A. , Tshelok E.P, Eichhoff U. 31P - and

- NMR study, of Ehrlich ascites carcinoma cells (EAC) metabolism under 1-nitroso-l-methylurea. // Sth Annu. Congr. the European Soc. Magnetic Resonance in Medicine and Biology, Zurich. - 1991. - P. 223.

22. Romanova G. A. , Grechova Т. V. , Semenova N. A. Behavioral changes and level of.metabolism in rat brain after frontal lobectomy, their correlation and correction. // Const. Cong, of Int.. Soc. Pharmacol, Moscow. - 1991. - P. 36.

23. , .. Семенова H. A., ' Дубинский В. 3. ЯМР-спектроскопияопухолей. Эффекты смены субпопуляпий в растущей опухоли.// Докл. РАН. - 1992. - Т. 323. - N I. - С. 169-172.

24. Semenova N. А. , Yushmanov V.E. The assessment of enerqy status of a rat brain after acute radiation exposure. // 11th Annu. Sci. Meeting of the Soc. of Magnetic Resonance in Medicine. - Berlin,. 1992. - P. 2157.

23. Semenova N. A. , Yushmanov V.E. 31P Kffiin vivo study :>f rat brain phosphate metabolite levels under acute

radiation exposure. // 26th Congr. Ampere on Magnetic resonance. - Athens 1992. P. 438.

26. Семенова H. A., Ювманов В. E. ЯМР 3IP in viva-. исследование уровней фосфатных метаболитов мозга крыс, в динамике после острого ц-облучения.// Радиобиология. - 1993. -

т. зз. - с. заа-з91.

27. Семенова Н. А., Юшманов В. Е., Конрадов А. А. Оценка энергетического статуса головного мозга крыс при остром

от

т-облучении в разных дозах по данным Р ЯМР спектроскопического исследования in vivo. // Радиан. Биология. Радиоэкология. - 1993. - Т. 33. - С. 627-632.

28. Romanova 6. A. Seraenova N. A. So veto v А. N. Individual features of brain, bioenergetic metabolism associated with changes of rats moving activity after frontal lobectomy. // 2th Int. Conference "Biological basis of individual sensitivity to psychtropic drugs". Moscow, 1993. - P. 130.

29. Semenova N. A., Romanova (••'. A. Correction effects of G^ ganglioside on the energetic metabolism of rat brain under frontal cortex injury. In vivo 31-P NMR studies. // 10th Annu. Sci. Meeting the .European Soc. Magnetic Resonance in Medicine and Biology, Rome. - 1993. - P. 481.

30. Semenova N. A. , Yushmanov V.E. , Konradov A. A. 31P NMR in vivo study of the acute effects of different doses of y-radiation on rat brain phosphate metabolism. // MMR in Biomed. - 1994. - V. 7. - P. 203-208. .

31. Романова Г. А., Семенова H. A., Советов A.H. Протекторное действие моносиалоганглиозида ГМ-I на биоэнергетику и интегративную деятельность, головного мозга крыс после травматического повреждения фронтальной коры.// Российская научн. конф. "Антигипоксанты и актопротекторы; итоги и перспективы", Санкт-Петербург, 1994. - С. 278.

32. Семенова. Н.'А. , Романова Г.А., Конрадов А.А. Оценка энергетического статуса мозга крыс при фронтальной лобэктомии, протекторное действие ганглиозияа GM1 (ЯМР in vivo).// Докл. РАН. - 1994, - Т. 335. - N 5. - С. 650-652 .

33. Romanova G. А. , Semenova N.A. , Barskov I V., Sovetov A.N. Changes of integrative activity and energy metabolism of

rat brain after focal cortex ischemia. // Int. Symposium physiol. blochem. basis of brain activity. S.-Peterburg, 1994. - P. 1945.

34. Semenova N. A. , Romanova G. A. , Konradov A. A. Assessment of energy status of rat brain after frontal lobectomy, effects of ganglioside GM1. 31P NMR in vivo study. // 12th European experimental NMR conference. Oulu, 1994. .- P. 44.

35. Semenova N. A., Yushmanov V. E. 31P in viva study of the acute effects of irradiation on rat brain phosphate metabolism. Abstr. // 11th Annu. Cong, of the European Soc. Magnetic Resonance in Medicine and Biology, Vienna, 1994, - P 303.

36; Semenova N. A. , Rosantseva Т. V. , Kozina L.V., Zaitsev A. V., Kozin S.V. The effects of hydralazine and hyperthermia on phosphate metabolism of Ehrlich carcinoma (31P in vivo study). // 11th Annu. Cong, of the■European Soc. Magnetic Resonance in Medicine and Biology, Vienna, 1994. - P. 478

37. Semenova N. A., Ronanova. G. A. Konradov A. A. 31P NMP. study of ganglioside GM1 influence on rat brain phosphate metabolism after frontal cortex injury. // 13th Ann. Sci. Meeting of Soc. Magnetic Resonance in Medicine, SanFrancisco, 1894. - P. 157.

38. Kozin S.V., Zaitsev A.V., Kozina L.V. , Semenova N.., Rozantseva Т. V. Tanaka Y. Hydralazine and thermotherapy: II. Canges in tumor blood flow and energy status. // 17th Intern. Symposium on Clinical Hyperthermia, Favia, 1994. - P.30.

39. Semenova N. A. Dubinsky V. Z., Konradov A. A. 31P NMR in vivo study of rat brain energy metabolism after frontal cortex injury. A method based on convoluted correlation matrices of the spectral data. // NMR in Biorned. - 1995. - V. 8. •■ 164-170.

40. Semenova N. A. , Dubinsky V. Z. , Konradov A. A. Disturbances in rat brain energy metabolism and changes in oehavior after frontal lobectomy. // 3rd Annu. Sci. "Meeting of society of Magnetic Resonance and the European Society for ■lagnetic Resonance in Medicine and Biology. Nice, 1995. - 4.3.-э. 1764.

41. Семенова H. A. , Дубинский B.3. , Романова Т.к. , Конрадов V А. "^Р ЯМР-спектроскопическое исследование компенеэторнкх

возможностей энергетического метаболизма мозга крыс после травмы фронтальной коры. // Научно - практич. конф. "Магнитно -резонансная томография в медицинской практике". Москва, 1995. -С. 26.

42. Semenova N.A. , Dubinsky V/Z., Konradov A.A. 31P NMR in vivo study of rat brain energy metabolism after frontal cortex injury. Method of convoluted correlation matrices of the spectral data.// 13th European experimental NMR conference, Paris. -1996. - P. 335.

43. Semenova N.A., Kozina L.V., Zaitsev A.V., Kozin S.V.

■31

0iP NMR in vivo study of changes in Ehrlich carcinoma phosphate metabolism after hydralazine and hyperthermia treatment. // 13th European experimental NMR conference, Paris. - 1996. - P. 345. •

от

44. Семенова H.A., Конрадов A.A. , Романова Г. А. Р ЯЦ? in vivo. Исследование нарушений фосфатного метаболизма мозга крыс при двусторонней фокальной компрессионной ишемии. // Биофизика. - 1996. - Т. 4L - N 5. - С. И06-ПГ1.

45. Семенова H.A. , Козин С.В. , Козина Л.В., Зайцев

от

А.Б..Розанцева Т. В. Р ЯМР in viva - спектроскопическое исследование нарушений фосфатного метаболизма карциномы Эрлиха. Противоопухолевый эффект гидралазина и гипертермии. // Докл. РАН. - 1996. Т. 351. - N 3.

46. Семенова H.A., Дубинский В.З., Конрадов A.A. 31Р ЯМР in vivo в исследовании нарушений энергетического метаболизма мозга крыс при экстремальных воздействиях Новый метод оценки энергетического статуса мозга. // Изв. РАН, сер. биол. В печати.

47. Semenova N. A. Dubinsky V. Z. , Konradov A. A. An assesment of brain energetic status by a method based on convplted correlation matrices of P NMR in viva data. // 13th Annu. Cong, of the European Soc. Magnetic Resonance in Medicine and Biology, Prague, 1995. - P .

48. Semenova N.A. Current state of metabolic pathways studies by in vivo NMR spectroscopy. // Phys. Chem. Biol, it Med. В печати.