Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Процессы метаболизма макроэргических соединений и трансмембранного перенесения неэлектролитов и ионов водорода в условиях криоконсервирования

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Процессы метаболизма макроэргических соединений и трансмембранного перенесения неэлектролитов и ионов водорода в условиях криоконсервирования"

РГ6 од

" " ,'7 Г щи.

..... А- К 'А Д Е М I Я НАУК У К Р А I Н И

!нститут проблем кр!об1ологП 1 крюмедицюти

На правах рукопису

31НЧЕНК0 ВАСИЛЬ ДВДЦОВИЧ

Процеси метабол1зму макроерг1чних сполук 1 трансмембранного перенесения неелектрол1т1в 1 1он1в водню в умовах крIоконсервування

03.Ш.22 - кр1об1олог1я

Автореферат дисертацИ на здобуття вченого ступеня доктора 01олог1чних наук

Харк1в 1994

Робота виконава в 1нст1тут1 проблем проблей кр1оС1олог1I 1 крЮмедицини АН УкраГни

Науковий консультант:

доктор. б№л. наук, професор

лауреат Дер*. премП Укра5ни Мо1севв В.А.

0ф1ц1йн1 опоненти:

доктор ф1зико-математачнш наук, професор Малеев В.Я.

доктор бЮлоПчних наук, ст.н.с. Тугай В.А.

доктор х1м1чких наук, професор Заев е.О.

Ведуча орган1зац1я: 1нствтут <31около1дно! х(мП АН Украйни

Захист в!дбудеться " " и*х. 1994 р. в Згод на зас!данн! спец1ал1зовано! рада Д 016.60.01 при 1нститут1 проблей кр!об1олог1I 1 крЮмадицини АН Укра1ни /310015, Харк1в-15, вул. Переяславська, 23/

3 дасертад1ею можна ознайомитись в б1бл!отец! 1ПК1К АН Укра1ни

Автореферат роз(слано - К - & 1994 р.

Вчений секретер Спец1ал1зовано1 ради доктор медачних наук, проф.

А.Ы. Гольцев

J

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

ООмш б!олог(чно актквних речовин I Гх перенесения в ялиинних системах являють собою групу взаемопов'язаних явищ, що в!д!грають клпчову роль в эабезпеченн! Юнування живо! матер П. Цим визначаеться загальноб(олог¡чний ¡нтерес до вивчення пронес 1 в перенесения 1 обм1ну речовин в кл!тинах. Важливе мгсце в дан (Я проблем! займають процеси з перетворенням матер1альних носПв енергП' в б!олог!чних системах. Утворення метабол 1чного фонду цих речовин 1 Их утил!зац1я залежить в1д функц!онування складних ферментативяих ансамбл!в, регуляцI я яких зд!йснюеться через взаемозв'язок з ¡ншими ферментам, 01 лковими 1шчб1торами 1 активаторами фермент 1в. Порушешя в будь-як!й з ланок цих взаемопов'язаних механ1зм!в викликае патолог1чн1 зм!ни в кивих системах.

3 1ншого Ооку, розробка штучних способ¡в довгострокового збер. ..ння живо! матерП т!сво пов'язана ¡з створенням умов оборотного гальмування процес!в метабол!зму. Таким чином, проблема вивчення процес!в метабол!зму 1 перенесения речовини поряд з П загальноб1олог1чнЕМ значенням дуне вахлива в кр1об!олог!1.

В дан!й робот] досл1даували процеси утил!зацП макроерПчних сполук в эритроцитах людини 1 деяк! супутн) процеси перенесения речовин в кл 1 тинах 1 1х розпод(л м!к внутр!шньо- ! зовн1шньокл1мшним середовищем на р1зних стад!ях кр!оконсервування з викорястанням методу ядерного магн1тного резонансу. Об'ектом досл1дження служили як природа! метабол 1тя - аденозинтрифосфат (АТФ), 2,Э-ДИфосфогл1церат (2,3-ДФГ). неорган1чний фосфат (Фн), так ! екзогенн! речовини, що застосовувться в кр!об!ологп як кр1озахисн1 агента.

Результата досл1ддень використовували для вияснення механ!зм!в порушення енергетичного статусу кл!тин в процес! крюконсервування. Анвл!зували такок деяк! аспекта природно! холодост!йкост1 кивих систем. Одним з оС'ект1в в цех досл!дах служили г!бернуюч1 ховрашки С11е11из ШсШагив в р1зних ф!з1олог!чних станах, в яких вивчали процеси утил!зацИ макроерПчних сполук в печ!нц1. 1нший аспект анал1зу природно! холодост!йкост! був пов'язаний з вивченням стану води при температурах нижче о°с в об'ектах р!зного р!вня

орган 1зацм (рослини, личинки комах), еволмИйно пристосованих ло г. :реэквання суОнульових температур.

В робот! було ви явлено ¡снуьсння кореллцп м1ж особликостями фа-чових перетворень вода в об'чктзх, с.тIйкет. до ли холоду 1 в таких, у яких здатн 1 г?!-, переносите заморожу рання - в!дтавання сткрена за допомогою штучних прийом!». Одержат результата г.'йьатлй сформулювэти !д»г< про юнування деяких подЮьостей у водного кохпгнеята живих систем при температурах нижче .'•"с у «ипядках природного : штучного крюзахисту.

Акту уг::Н! сть проблема.

Рояь'яяанкя пракнгших задач кркчНологП багато в чому залезать ь:д ро?витку фундаментальних д'-.сл1дж8нъ структурного 1 Функц! овального стану бюлоггчно важливих молекул ! надмолекулярная комплекс1в, що регулюють вну трIвньокд!тинний метабол1зм 1 :нтегрьц:ю ф!зюлог1чних функц1й к.п:тани в тлому. Важливим шструмектом для розв'азання цих задач к досупдаёння вяливу температуря на вказан! системи, оск:лькк температура являе собою один з найвакливших фактор;в регулквання б!окатал1зу, мембраннси прон/кностi ! швидкос.т; обм'.ну речовин : енерг1! в будь-якШ жиб!й сйстйм1. В кр Iоб! слог I : , де створююгься умови виключення активно!' життчд^льност! шляхом :три!'н1чування обМ1ну речовин 1 енерг11 ! пер^-дбячэеться, щэб викликзнр низькою температурою !нг1бування миттед'яльност! було шлком оборотним при поверненн! до ф!зюлопчних температур, досл'дження явищ переносу I метабол'.зму явлг.ють собою осоСлквий штерес (Уа1ег1 с.и., 1976, Виноград -Финкель, 1978 ;•.

¡нформаЩя про молекуляр.ч! рухи, про дифуз!ю 1 самодифуз!ю, про транспорт речовин через кл:тинн1 мембрани, сп¡вставления-цих даних а р!внем метабол:т1в ! ¡х ф!з5олог1чнов функЩею являють ссбсю основу для рэзробки б;лвш точних уявлень про те, як шдяаютъоя контролю ! 1нтеграц1! метабол!чн! перетворення I ф'зюлоггчна активн!стъ . в умовах крюконсервування. Ним ьиякачгеться акуальшоть проблема як в науковому, так 1 в практичному план >.

Меток дано)' . робота було досл!дкення метабол1зму 2,3-дифосфогл!иерату, трансмембранного перенесения !он!в Н*, неорган:чногс фосфату 1 кркчзяхисних речовин в ериттюцитах людини

на р t зних стад!ях крЮконсервування, досл1дазння молекулярно! рухливостi в 61олог1чш1Х системах при температурах, нижчих в!д о°С t перенесения речовини в умовах консервування ОЮлоПчних об*ект!в методом заморожування - висушування.

Для досягнення поставлено! мети необх!дно Суло розв'язати так! задач!:

1) доел 1 дити швидк1сть деградацП 2,3-ДФГ в еритроцитах на стадЬчх :якубацП з кр1опротектором, п1сля заморожування в!дтавання, п!сля в!даквання крЮпротектора t перенесения еритроцит!в у суспендуюче середовище;

2) досл!дити зм!ни рН в кл1тинах в присутност! кр1опротектор!в з р{зною irpoHHKHiCTio через мембрани еритроцит!в;

3) доел1дити залежн!сть коеф!ц!ента розпод!лу кр1опротектор1в м1 ж внутр1шньо- 1 зовн1шньокл1тиниим середовицем эритроцит¡в в1д молекулярно! маси 1 вплив температуря на розпод!л крЮзахисних речовин р!гних молекулярних мае м!ж кл!тиною t середовицем;

4) на основI анал!зу п;ютонного обм!ну доел!дити молекулярну рухлив1сть в б!нарних водних розчинах кр1опротектора (гл1церину) i в розчинах глЩерину з додаванням СИлка (сироваткового альбум!ну людини);

5) доел(дити процес вимерзання води при зниженн1 температури 1 оц1нити в1даошення пула зв'язано! води до вс1е! води в об'ектах з природною ст1йк!стю до холоду 1 в таких, у яких кр!ост!йк!сть створена штучно;

6) доел!дити динам1ку видалення вологи з 0!олог!чних об'ект1в в процес1 Их висушування з замороженого стану.

наукова ! практична ц1нн!сть.

Можна видишти дек!лька проблем в кр!об1олог1I, в розв'язання яких певний вклад вносить дана робота.

1. В1домо )снування низькотемпературних пошкодженъ, зумовлених осмотичною дег!дратац!ею кл!тин, що призводить до високих (токсичних) концентрац1й речовин в цитоплазм! (levitt J., 1958; Love R.M., 1966; Meryman M.T., 1966, Mazur P., 1970. Пушкарь H.C., Белоус A.M., 1975). ВД ефекти залекать в1д селективно! проникност! кл!тинних мембран (Белоус A.M., Бондаренко В.А., 1978, Фаррант Дж., 1988, Де Лекер Р., Пеннинкс Ф., 1989). Д!я осмотичного стресу в значн!й Mipl пов'язана з розпод!лом екзогенних кр!озахисних речовин

Mist зовн!шньо- t внутр1шньокл!тинним середовищем (Mazur P., 1965, Howe A.w., 1966, Karow A.M., 1969. Белоус A.M., Пушкарь H.C., Шраго М.И., 1975). 1нший аспект дП кр!опротектор!в 1 знижених температур на юПтини пов'язаний 1з зм!нами доннан1всько1' ptBHcmara на мембран! внасл!док перерозпод1лу проникаючих через мембрани toniB п1д д!ею непроникаючих речовин.

В дан!й робот 1 неруйн1вним методом ЯМР-спектроскош > сл1дкувади за розподиом кр!опротектор!в м!к внутр1шньо- 1 зовн(шньокл!тинним середовищем еритроцит1в при pisma температурах 1 за зм!нами доннан1всько! р1вноваги на мембранах еритроцит!в.

Експериментальна методика, що використовувалась, дозволила спостер1гати за динам1кою зм1н доннан!всько1 р!вноваги в процес! ШкубацП кл1тин в р!зних захисних середовищах, п1сля заморожування в!дтанення, п1сля в1дмивання кр!опротектора. Одержан! експериментальн1 дан! про вплив екзогенних речовин на доннан!вську р!вновагу розширюють наш1 у явления про адаптацИз кл1тин до холоду 1 про д!ю крIопротектор1 в.

2. I снування в бЮлоПчних системах води, що не кристал!зуеться, в!даоситься до числа фактор!в забезпечення резистентност1 до низьких температур окремих юнтин, субкл1тинних структур 1 б1опол1мер1в (Meryman Н.Т., 1958, Mazur М. et al., 1966, Luyet В., 1966, SiraatoB D., Раите M. et al., 1975. Boutron P., KauXman A., 1979, Аксенов С.И., 1977, Фаррант Дк., 1988).

Одна з г1потез, висунутих для пояснения крюрезистентност!, базуеться на у явлениях про компартментаЩю кл!тинно! води 1 про 1снування фракц!й води з р1зним ступеней зв'язаност!. В таких системах вода япо сильно переохолодкуеться при температурах нижче 0°С, або частина П не переходить у кристал 1чниЬ стан (Kuntz I.D., 1969, Oyr T.J., Derbyshire W. et al., 1971, Fahy G.M., Levi D.I., All s., 1987). Ф!зичн1 властивост1 кохно! фракцП вода, Ix взаемод1я з кр!опротекторами, вимагають детального експериментального досл1дження. 0бм1н води м1ж р1зними фракц!ями забезпечуеться молекулярними рухами 1 в!дноситься до явиц переносу.

В роботi доел1дхували протонний обм!н в систем! вода -KpicnpoTeKTop - б!лок методом ЯМР. 3 одержаних результат!в випливае, що фракц1я води, зв'язаио'! з б1овол!мером, залучена в швидкий протонний обм1н з кр!опротвктором, причому частота обм!ну зм!иметься при денатуратf б!лка.

Досл!дкення стану води в живих об'ектах з природною ст!йк!стю

до голоду дозволило виявити деяк! под1бносг! в стан) компонента зв'язано! води в них 1 в тих системах, в яких для крюзахисту використовуються екзогенн1 крЮпротектори.

Одержан! результата важлив1 для побудови модел1 модиф1куючо1 д11 кр í опротектор i в на р1зн1 фракц!I води в 01олог t чних системах t захисно! д1! кр1опротектор!в.

3. Поряд з проблемами ф(зшш 1 ф1зично! xtMt i водних систем при температурах, нижчих в1д о°С, важливе м)сце в описанн1 реакцП 61ологiчних систем на холод займае анал)з влливу низьких температур на механ!зми 1 швидкост! реакщй, шо катал 1зуються ферментами (Darbyehie В., 1974, Sheppard Н., Talen W.H., 1974. Луговой В.И., 1974). Так! експерименти краще виконувати на препаратах in vivo, для чого метод ЯМР, що використовувався наш, виявився надзвичайно ц1нним. Методом ЯМР досл1дкували ферментативн! процеси утил!зацП макроерг1чних сполук - АТФ í 2,3-ДФГ в цикл! йибдена - Мейергофа t д1ю шунта Раппопорта -Лубер1нга в еритроцитах лвдини на р1зних стад1ях кр1оконсервування. Одночасно нэруйн!вними методами спектроскоп!Г ЯМР сл!дкували за град!ентом рн на мембранах еритроцит1в, трансмембранним розподЦгом природних метабол!т!в 1 екзогенних речовин. Вся сукупн!сть одерканих даних використана для розробки модельних уявлень про контроль метабол!зму 1 про порушення енергетичного статусу кл1тин в ход! крюконсервац! I.

На захист виносяться

1) розробка концепц!I визначення енергетичного статусу кл!тин на р!зних стад1ях крЮконсервування на баз1 неруйн1ваних метод!в анал1зу;

2) розробка не!нвазивних метод1в досл!даення розпод!лу речовин м!ж зовн!шньо- i внутрtшьокл 1 тинним середовищем з суспенз!ях кл)тин;

3) вияснення природа Юнування кореляцП в стан! води при температурах шиле в1д 0°С в об'ектах з природною холодост1йк1стю 1 в таких, в яких кр)ост1йк1сть створена штучно;

4) розвиток ф!зичних уявлень про протоннкй OÖMlH 1 про молекулярну рушив i сть в водних розчинах крЮзахисних речоаин в присутност1 б!опол!мер!в.

5) розроблен! методичн] Шдхода i придали для вим1рювання осморяност! б iологiчних р!дин I для контролю ооезводкування

бюлоПчних об'ект!в п1д час субл1мац!йно! сушки.

Адробац!я, публ!кацП 1 структура робота ,

OcHOBHi матер!али дисертацП допов!дались на iy, y, yi i yii Всесоюзних конференц!ях з спектроскопi I б1опол!мер1в, Харк1в,1981, 1984, 1988, 1991, на XX конгрес! AMPERE, Талл!н, 1978 на М!жнародному симпоз!ум1 з бЮкалориметрП, Тб!л1с1, 1981 на I Всесоюзному б!оф1зичному зЧзд], Москва, 1982, на ii Всесоюзна конференцП з теоретичних 1 прикладних питань кр1об1олог11,Харк!в, 1988 на iii Всесоюзна конференцП "Научне основы промшленного производства ветеринарнх и биологических препаратов", Москва 1987, на М1жнароднШ конференцП "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины", Харк1в, 1988, на iii ВсесоюзнШ конференцП "Проблемы физиологии и биохимии древеснх растений", Петрозаводск, 1989, на Yin Всесоюзн!й конференцП "Магнитнй резонанс в биологии и медицине", Чорноголовка, 1990, на Всесоюзному симпоз!уы! "Механизмы зимней спячки", Махачкала, 1990, на ii М1жнародн1й конференцП" Успехи современной криобиологии" Харк1в, 1992.

Матер1али дисертац!I опубл!кованt в 51 науков!й роботt, з них 8 авторських св!доцтв.

Робота викладена на 203 стор1нках маишношсого тексту, мЮтить 46 рисуня1в, 14 таблиць t список л!тератури, який включав 325 poölT, з них 122 - в1тчизняних 1 203 зарубИгаих автор1в.

Об'екти i метода досл!дження.

В робот! використовували еритроцити з донорсько! кров1 лвдини. Венозну кров, з1брану в проб(рки з гепарином або з цитратом натр1ю центрифугували при soog протягом ю хв í в1дд(ляли плазму. Еритроцитарну масу в¡даивали ф1з!олог1чним розчином або 0.15 М фосфатним буфером (Na2HP04/ NaH2PO¿, pH 7.4) два або три рази. Титрування еритроцитарноК .маси проводили безпосередньо в ампул! ЯМР, додаючи до суспензП еритроциПв малими порц!ями розчин кр1опротектора концентрацП эо - 509 при пост!йному перем1шуванн1 i доводили таким чином концентрац1ю кр1озахисно! речовини в суспензП до ю-1&£. БактерП у. Pestis EV76 вирощували на твердому середовиш.i ашвлення Хотт1нгера при 28° С протягом 48 годин, змивали ф131олог!чним розчином 1 суспендували в кр!озахисних середовищах, як описано вице.

Спектри 31Р-ЯМР реестрували на !мпульсних Фур'е спектрометрах ВгиКег СХР200, ВгиКег СХР300, Broker WH360 i Varlan VXR300. Типов1 умови запису спектр1 в 31Р-ЯМР в режим1 Фур'е: 60-градусний 1мпульс, час затримки о.эс, накопления на участку пам'ят! розм!ром 8К. При вим!рювэнн! > х!м!чних зрушень 31Р-ЯМР використовували як еталон розчин натр1ево! сол) етилендиам1нтетрафосфоново! кислоти в IX, о. Спектри 'н-ЯМР реестрували на прилад1 Tesla BS 567А з робочою частотою юо МГц для протон1в в режим! CW. Похибки визначення х!м!чних зрушень ±0.01 м.д., 1нтенсивност! сигналу ЯМР +1056, температура зразка в датчику спектрометра ЯМР п!дтримувалась з точн!стю ±1°с.

Для приготування розчин! в крЮзахистних речовин використовували пол!етиленгл!кол! молекулярних мае 300-4000 ф1рми "Merck" квал1ф!кац! i purum, глЩерин, 1,2-пропанд1ол, метанол, етанол, ДМСО - в1тчизняного виробництва квал!ф!кецП ХЧ. Використовували такон 1ндив!дуалън1 пол!етиленгл'кол! 1 ол1гомери ПЕГ з вузышм молекулярно - масовим розподигом з середа 1 ми молекулярними масами 150, 200, эоо, 1500, одеряан1 в в!дд1л1 кр!опротектор!в 1ПК1К АН Укра!ни.

Розпод1л кр!опротектор!в м!к кл!тиною 1 середовищем.

ПроникнЮть кл1тин для крЮзахистних речовин 1 розпод!л кр!опротектор1в м1ж зош!шньо- 1 внутр1шньокл!тшшим середовищем являють собою частину надзвичайно важливо! в кр!об!ологП проблеми - вивчення механ1зм1в захисно! д11 кр1опротектор1в. 3 найб1льш загальнюс м!ркувань ясно, що розпод!л кр!опротектор!в м1ж кл!тиною 1 середовищем пов'язаний з властивостями нап1впроникно! кл!тинно! мембрани 1 з г1дратац!ею коло!д1в протоплазми, яка зм!шоеться внасл1док проникнення речовин всередину кл1тини.

В дан!й робот! розпод!л кр!озах!стних речовин м1ж кл!тиною 1 середовищем визначали за допомогою методичних п1дход!в на основ1 спектроскоп!! ЯМР [13, 17, 19. 20, 22, 50].

В основу першого методичного Шдходу покладбний спос1б розд!лення суспензП кл1тин на щ!льний осад I м1жкл!тинну р!дину з наступлю» визначенням конценграц!I досл!даувано! речовини в кокн!й з фракцШ методом ЯМР. Для досл!д1в використовували розчини крюзахисних речовин з концентрацию неелектрол1ту 30 мас.#, як1 готували на ф!з!олог!чному розчин!. Розчин неелектрол!ту зм!шували

у об'емному в1даошенн1 1:1 з эритроцитами, в!дмитйыи в!д плазми, екв1л!брували деякий час для досягнення дифуз1йно! р1вноваги (не менше 10 хв), центрифугували 10 хв при 800^ 1 реестрували спектра ЯМР кл!тин, що ос!ли 1 надосадково! р!дини. Як к!льк!сну м1ру розпод!лу речовин м1к кл1тиною 1 середовищем використовували коефЩ1ент розпод1лу <з, що дор1внюе в!дношенню концентрат I речовини в кл1тин1 до концентрацП II в м!ккл1тинному середовищ!. Коеф1ц1внт о знаходили з в!даошення 1нтенсивност! сигналу ЯМР в щ1льному осад! кл!тин до 1нтенсивност! сигналу в надосадков1й р!дин! з урахувакням залишкового м1*кл1тинного об'ему.

ОЩнку залишкового м1жкл1тинного об'ему проводили на основ! вим1рювання гематокритного в!даошення досл1дкуваного осаду кл1тин за допомогою стандартно! методики центрифугування в тонкому кап!ляр!. Величина гематокритного в!даошення складала б!ля 0.9 для еритроцит!в у середонищах з нпзысомолекулярниыи неелектрол!тнши добавками (етанол, метанол, глщерин) I зб!льшувалась при зб!льшенн1 молекулярно! маси останн)х. В присутност1 ПЕГ-1500 вона досягала значения, близького до 1.

При визначенн! а для ПЕГ з молекулярное масою 400 1 б!льше т враховували той факт, що препарата ПЕГ масть в своему склад! досить широкий ваб1р ол!гомер)в з р!зниыи молекулярними масами. До розрахунку приймали молекулярно - масовий розпод1л досл1джуваного невлекгрол(та, знайдений хроматограф!чним методам. Сумарне значения а знаходили, враховуючи внесок кожного з низькомолекулярних компонент! в з ваговим мнохникон, прошрцЮнальнвм вм!стов! компонента.

Показано, що встановлення дифуз!йно! р1вноваги м!х внутр1шньо-1 зовн1шньокл!тинним середовищем в еритроцитах для доел 1дкуваша кр!озахисних речовин в!дбуваеться досить швидко. Коеф!ц!ент а досягае величини, що складае 0.9 в1д р1вновахного значения вже через 5 хв екв!л!брац!1 еритроцит!в при температурах +4 - +37°С не лише для низькомолекулярних кр1опротектор!в, але 1 для таких речовин, як ПЕГ-1500 1 ПЕГ-2000.

На рис.1 показана залехн1сть коефЩ1ента а в умовах дифуз!йно1 р1вноваги для еритроцит1в в1д молекулярно! маси досл!джуваних неелектрол1т1в при 37°С.

Видно, що в досл1дкуваному наш ряду кр1озахисних речовин в!дсутня р!зка меха м1ж речовинами проникними 1 непроникними через мембрани еритроцит!в. Знайден! значевя о буди використан! в

розрохунках за теор!ею Кедем-Качальського коеф)ц1ента в!дбиття о мембран еритроцит)в для крЮзахисних речовин. Для ПЕГ-1500 I ПЕГ-2000 о = 0.18 ± 20$. Для 1нших кр!озахисних речовин величина а не розраховувалась, оск!льки 1з зростанням а з<31льшуеться похибки роэрахунку.

Молекулярна маса

Рис.1 ЗалежнЮть коеф!ц1ента розпод1лу крюзахисних речовин м!ж внутр!шньо- 1 зовн!шньокл1тинним середовшцем ыд молекулярно1 маси при 37°С.

Спостереження за динам 1кою 01льш швидких процес!в перерозпод1лу кр!опротектор!в в кл!тинних суспенз!ях ми проводили за доломогою спектроскоп!5 ЯМР на ядрах 31Р [7. 19, ?о]. В основ1 експериментально! методики лежить той факт, що х1м!чне зрушення сигналу 31Р-ЯМР неорган1чного фосфату в кл1тинах е функц1ею рн середовища, а б!льш1сть з використовуваних в нинтшй час крЮпротекторних добавок впливають на кислотн!сть водних середовищ. Додання крюпротектор1в, як! легко проникають через мембрани

(значения Q близьке до 1) спричинюють им! ни рн як внутр!шьно- , так 1 зовн1ншьокд i тинного середсчвда. У випадку кр1опротектор1в, ш.о локал!зуються головним чином у м ¡жши тинному середовюц1 (Q<1) виникае значна неекв!вялентн!стъ рн внутршнього 1 зовШшнього середовика кл i тин.

На рис.2 показан! спектру. °' Р-ЯМР контрольного зразка еритроцит!н без кр!опротекторз i Шсля додавання крюпротектора з явно малим коеф1ц1ентом рогпод1лу (ПЕГ-4000). Видно, то в присутностi ПЕГ-4000 сигнал Фн розщ1плюеться на два. Додаючи в суспензию розчин цитрату марганцю.ми досягали уширення сигналу йовшшныжл! тинного Фн i зникнення Я ого в спектр! ЯМР високоК розД1ЛЬно!' здатност! .В такий спосЮ здШснювали в!днесення

Рис.? Спектри 3'Р-ЯМР (при 145-78 МГц) еритроцитарно! маси: почятково1 (а), п!сля додання ПЕГ-4000 до к!нцево! концентрат I ю об% (б), при охолодженн! зразка до 5°С (в), при нагр1ванн! зразка до 40°С (г), п1сля додання ои мл насиченого розчину цитрату маргашда (в). В1днесення сигнал!в на приклад! спектра (б): сигналу при -3.72 1 -2.97 м.д. належать фосфатним трупам 2,3-ДФГ в третьому 1 другому положениях в!дпов1дно, -2.46 1-1.99 м.д. - Фн всередин! I зовнг еритроцит1в. Х1м1чн1 зрушення наведен! в!дносно 8556

сигнал!в зовШшньо- I внутр1шньокл1тинного Фн. Величина рН зовн1шнього середовицэ в присутностч слабо проникаючого крюпротектора виявилась нижчою, Н1ж всередин1 кл1тин. Нагр1вання до 40°С I охолодкення до 5°С не зм1нюе вигляду спектре.

При додаванш низькомолекулярних неелектрол!т|в (М<2СЮ) ь спектр]3!Р -ЯМР еритроцит1 в рееструеться один сигнал Фн.

на рис.з показанI результаты аналог1чного експерименту з ПЕГ-зоо. При П1 двиценн! температури в!дбуваеться зличтя сигналш внутр!шньо- 1 зовн1шньоклIтинного Фи, причому температуря; зм!ки виявляються необоротними. Таким чином, в гомолог¡чному ряду пол1етиленгл1кол Iв ПСГ-зоо займае пограничне положения по характеру розлод!лу м(ж зовн1шньо- I внутр!шньокл1тинним середовищем еритрсцит1в. При температур1 близько го°С в(н проникае в кл!тину в значно менших концентратях, н1ж при температур! 40°С.

-2.es \

-г,1&

-^"-г.во]'

-4,07-3,33

|Г А .1 """

1\ 1 . """"

! • ! и -1,1Т

^ I

\ \ ' V ^

-г,г*--Ш \

-3,70 -¿,05 А Л'

и

Рис.з Спектри 31Р-ЯМР (при 146.78 МГц) початково! еритромаси

(а); п1сля додання ПЕГ-ЗОО до к!нцево! концентрац! 1 ю o6.SK

(б); шсля охолодкення до зразка до (в); шсля нагр!вання зразка до 40°С (г); Шсля поверненяя до к1мнатно1 температури (д). В1днесення сигнала таке ж, як на рис.2.

В!домо, що диметилсульфоксид (ДМСО) здатний впливати на проникнють кл1тинних мембран для багатьох речоиин. В дан1й робот 1 досшдкувався вплив ДМСО на розпод1л ПЕГ-500 м!х еритроцитами 1 середовищем. На рис.4 подан 1 результата титрування еритроцитарно! маси крЮпротектором ПЕГ-500, який, як видно з рис.1, мае невеликий коеф!ц1ент розпод!лу (Олиэько 0,3 при Э7°С). Додання до виз!дноI еритроцитарно! маси ПЕГ-500 при к!мнатн1й температур1 призводить до розщеплення сигналу Фн в спектр! 31Р-ЯМР (рис.46). Шсля додання до зразка ДМСО при к1мнатн!й температур 1 розщеплення сигналу Фн в спектр! 31Р-ЯМР збер!гаеться (рис.4в), однак наступив Шдвищення температури до 40°С приводить до реестрацП т1льки одного сигналу Фн (рис.4г), тобто в1дбуваеться р!зке зб1льшення концентрацП ПЕГ-500 в кл!тинах, мокяиво, внасл!док зб1льшеиня розм!р!в мембранних пор. Повернення до к1мнатно! температури не призводить до зм1н вигляду спектра (рис.4Д). Спектри, одеркан1 Шсля додавання до розчину цитрату марганцю (рис.4е), св!дчать про розпод1л Фн м!ж зовнИлньо- 1 внутр1шньокл!тиним середовищем 1 про збереження ц1л1сност1 кп1тин. Запропонований метод реестрац! ! вшшву ДМСО на розм1ри пор еритроцитарно! мембрани е посередн1м, необх!да1 додатков! докази правильное? 1 1нтерпретаци даних, одержаних при анал!з1 багатокомпонентних систем.

Еикче наввден1 результата експерименту по одаочасному додаванню до вих1дно! еритроцитарно! маси сум)ш1 кр!опротектор1в з сильно в1дм!нними коефЩ1ентами розпод1лу - ПЕГ-4000 1 гл!церину (рис.5). Як можна бачити з рис. 5а, в ирисутност1 обох сполук в!дбуваеться розщеплення сигналу Фн в спектр! 31Р-ЯМР еритроцитарно! маси. При Шдввденн! температури зразка до 40°С в!дбуваеться р1зке уширення сигналу Фн в зовн 1 шньокл1 тинному середовищ! (рис. 5в), так, що в спектр! 31Р-ЯМР рееструеться практично один сигнал Фн. Однак при поверненн! до к!мнатноГ температури ширина сигналу зовн! шньокл 1ишого Фн набувае почэткового значения (рис. 5г) ! знову рееструеться розщеплення сигнал!в. В!днесення сигнал!в внутр!шньо- 1 зовн!шньокл!тинного Фн було виконано за допомогою цитрату марганцю (рис. 5Д).

Таким чином використаяня спектроскоп!I 31Р-ЯМР високо! розд!льно! здатност! дозволило одержати нов! експериментальн1 докази зб 1 льшэння розм!р!в пор в мембранах еритроцит1в людини Шд д1ею ДМСО ! показати збереження вшшву температури на розм!ри пор, зб!льшених даметилсульфоксидом.

з. "ч."-

•f 7 е?

to" to c\T»v ft

_

JSL.

s s

Jl,

S S S?

ы" csT i i i

Рис.4 Спектри 31Р-ЯМР (при 145.78 НГц) еритроцитарно! маси: а -початково!, б - П1сля додавання ПЕГ-500 до к1нцево1 концентрат I 10 00% , в - п1сля додаванпя до зразка ДМСО до к1нцево1 концвнтрацИ 5 об% , г - п1сля шдвищення температуря до 40°с, д - П1сля повернення до к!мнатно! температуря, е -Шсля додавання до зразка 0.1 ыл насичевогсгрозчину цитрату ыарганцю. В1даесення сигнал!в таке а як на рис.2. Рис.5 Спектра 31Р-ЯМР (щи 145.78МГц) еритроцатарноГ маси: а -лочатково!, б - п1сля додавання ПЕГ-400 t гл!церину до к!нцевнх концентрацШ б t ю об% в1дгюв1дно, в - п!сля Шдвищення температура до 40°С, г - Шсля повернення до кигнатно! текпвратури, д - п!сля додавання до зразка 0.1 мл насичвного розчнну цитрату марганцю. В1днесэння сигнад1в теке а, як на рис.2. Сигнал при 4.20 1 4.12 м.д., що повториться в спектрах г I д. налезать, мабуть, фосфатнга групам caiaptB. В!днесення сигнал!в не проводилось.

Результатом виконаного в даи!й робот! досл1дження розпод!лу кр!опротектор1в М1Ж кл1тиною 1 середовшцем стало встановления того факту, що досить поширений к кр!обюлог!) под ¡л крюпротектор!в на проникн! 1 аепроникн! (так зван: еидо-- ! екзоцелюяярно) д!1) потребуе уточнения. Б ряду речовин з близькими ф1зико - х 1 м ■чними властивостями р!зка межа м1к даними двома клаоами кр!опротектор1В в)дсутня. "Пограничн!" кргопротектори в одних умовах можут.ь д!яти, як "екзоцелюлярн!", тобто Их концентрац!я в зови Ниньоклитинному с ере довищ ( мояе бути б1лыюю, н!ж веере дин) кл I тини, а в шших вшадках - як "ендоцелюдярн!". Характер 1х дП залежить ви температури, В1Д терм1чно! перед!сторП зразка \ вц приеутног.т! в середовищ 1 речовин, що впливають на проникн ють мембран 1 на розпод1л екзогенних крЮпротекторних добавок м!ж внутрШнъо- ! зовн1шньокл1тинним середовищем. Значения коеф!ц!ента розпод!лу для "пограничних" кр!опротектор!в лежить в д!апазои! 0.3-0.5. Отке, для вияенення характеру локал!зацП кр!опротектора в кл 1 тинних системах 1 його осмотично) дП сл!д в кохному конкретному випадку експериментально визначати I оиал!зувати числов! значения коеф!ц1ента розпод1лу його м!ж клIтиною 1 середовищем.

Дослдкення метабол 1зму макроерг!чних сполук на р!зних стад!ях кр1оконсервування еритроцит1в 1 природной адаптацп 01олог1чних об'ектш до холоду.

Екергетичний статус кл1тин е важливим показником здатност! )х до репарацП л!сля крюгенних вплив1в. Виживання кл!тин шеля крюконсервування багето в чому залежить в!д темп1в в1даовлення кл!тинного метабол Юму 1 зокрема, енергетично! системи кл!тин. Внутргтнлй пул макроерг!чних сполук, проникнють мембран ! величина .четок!в субстратIв суид ропглядати, як важлив1 параметра кл1тини, хс "я.'ег>-:очують ! 1 життездатн!сть на рюних стад!ях хрЮконсор^укання. Разом э тим розглянутий вице складний характер I залежнсст! трансмембранного розподиу кр!озахисних речовин В1 д I молекулярио! маси, температури, терм!чно! перед!стор 11' та !нших фактор!в дае п!дстави думати, що на процеси кл1тинного метабол1зму по-р Юному будуть впливати екзогенн! речовини нзв)ть з досить близькими ф!зико - х1м1чними властивостями. Тому яосл;дхекня кл! тинного метабол Юму являв зн^чний !нтерес точкг зору

кр!об1ологП.

В робот! використовували метол 31Р-ЯМР для реестрацП макроерПчних сполук - АТФ 1 2,3-ДФГ в еритроцитах 1 для спостереження за динам1кою ¡х розпаду та накопления неорган1чного фосфату на р1зних стад!ях крЮконсервування [16, 18, 21, ¿9. 38. 48 46]. Досл!даували також макроерпчн! сполуки в печ!нц! Пберенуючих ховрашк!в СЗДеНив ип<1и1а1;из в р!зних ф!зюлог!чних станах [39, 40, 41, 42]. Було показано, що для стану зимово! сплячки, в якому ховрэшки здатн1 переносити охолодження до температури близько 0°С, характерн1 глибок! перебудови енергетичного апарату. Зокрема, при цьому значно знижуеться швидкють утил!зац11 макроерПчних сполук в печ1нц1 пор!вняно з активним станом тварин. -Iслування таких механ1зм!в природно! перебудови енергетичного апарату в кл) тинах тварини вказуе на важливу роль енергетичного статусу кл!тин в адаптаци до холоду 1 е щв одним аргументом, що доводить необх!дн!сть досл!дження стану макроерг!чних сполук в умовах штучного кр!оконсервування.

Так! досл!дження в дан!й робот! виконували на еритроцитах з донорсько! кров1 людини. Еритроцити досл!джували на стад)ях ¡нкубац;! в кр!озахисному середовшц I, п!сля заморожування -в1дтавання, шсля в1дмивання крюпротектора 1 перенесения кл 1 тин в нове середовище (нкубац! Г. Розпад макроерг1чних сполук в кл (тинах суцроводжуеться ростом концентрат! неорган!чного фосфату. Вим1рювання 1нтенсивнсст! сигналу Фн на протяз1 часу !нкубацI! еритроцит!в можна використовувата для визначення швидкост1 розпаду макроерг!чних сполук.

на рис.6 показана залежн!сть в!д часу Iнтенсивност1 сигналу Фи, нормованого до сумарно! штенсивност1 сигнал;в Фн + 2,3-ДФГ для еритроцит1в в середовищах з р1зними крЮзахисними добавками [46]. Видно, що п1сля початково1 фазк пост!йних значень (лаг-фаза) настае фаза зростання ¡нтенсивност! сигналу Фн. Числов! значения тривалостI лаг-фази ! швидаост! зростання сигналу Фн подан; в табл.1. В присутност! р!зних кр!опротектор!в тривал1сть лаг-фази або зростае, як наприклад у випадку

крЮзахисно! сум1ш1 пропанд1осахароль (ПДС), або скорочуеться (глЩерин, ПЕГ), однак швидк1сть зростання сигналу Фн у вс!х випадках зб!льшуеться.

на рис.7 показан1 спектри 31Р-ЯМР еритроцит!в п1сля р!зних стад!й кр!оконсервування. Видно, що зм)ни енергетичного стану

Рис.б Залежн1сть !нтенсивност1 сигналу 31Р-ЯМР Фн в!д часу в эритроцитах здорового донора в середовищах без кр1опротектора 1 з 1556 добавками0 крюпротектора. Спектри рееструвались при температур! 20°С.

Таблиця 1. Тривал1сть лаг-фази 1 швидкост! зростання 1нтенсивност! сигналу ЯМР Фн в еритроцнтах в процес! !нкубац!1 при 20°С в р!зних середовищах.

Склад середовища 1нкубац!I Лаг-фаза (годани) ШвидкЮть зростання сигналу Фн, %/годину.

контроль 4.5 5

15« ПЕГ-ЭОО 1.5 10

15« ПЕГ-400 1.7 8

15% глШерину 2.6 7

15% ПЕГ-150О 5.5 7

15« 1.2-1Ш в

склад! ОДС 6.5 8

ш :

Рис.7 Сшктри 31Р-ЯМР. (1фи 145-78 МГц) в процес! 1нкубацП Оез глюкози при Э7°С еритромаси: А - початково!, Б - п!сля крюконсервування 1 в!дтавання, В - п!сля наступного двохстад!йного в!даивання в1д крЮконсервуючого розчину, Г-п1сля перенесения в середовище ЦНИИГПК 8в. В1днесення сигнал1в тане ж, як на рис.2. Сигнал при -11.96 м.д. налекитъ еталону -розчину натр1ево! сол! етилендиам1нтетрафосфоново1 кислоти в 0г0. Х1м1чн1 зрушення в м.д. наведен! в1дносно 85Я Н3Р0д. Час, *о провшов в1д початку !нкубацП при 37°С до одеркання спектра, вказаний на рисунку.

еритроциив зумовлен! не ст1льки власне процесом заморожування -в1дтавання, ст1лькй впливом крюзахисних добавок, в!дмивних розчин1в 1 суспендуючих середовищ.

ДеградаЩя 2,3-ДФГ прискорюеться шсля кожно! стадП технолог1чного процесу крЮконсервування: п1сля заморожування -в!дтавання, в!дмивання крЮпротектора, перенесення в суспендуше середовще.

Механ1зм явиц, що спостер!гаються може включати в себе дек!лька фактор!в р!зноспрямовано! дП.

По-перше, як показано нами, в лрисутност1 кр1опротектор1в порушуеться доннан1вська р1вновага в систем1 1 зм1нюеться розпод!л 1он1в м!ж внутр!шньо- ! зовн1шньокл!тинним середовищем [19]. Внасл!док цього моклив! порушення робота цитоплазматичних фермент1в гл!кол1 тайного шшху.

По-друге, крЮпротектори, що проникають в кл!тину, здатн!, мабуть, утворювати комплекси з б!олог!чно активними молекулами, в тому числ! ! з 2,3-ДФГ I впливати на швидк!сть ферментативних реакшй.

По-трете, енергетичн1 витрати 1зольованих еритроцит1в, як) при в!дсутност1 глюкози покриваються за рахунок витрачання 2,3-ДФГ, мабуть, неоднаков1 при 1нкубацП кл1тмн в р!зних середовищах. Разом з там, приклад з 1нкубац1ею еритроцит1в в складному кр!озахисному середовищ! ПДС (табл.1) вказуе на моклив!сть керування процесом деградацИ макроерг!чних сполук шляхом шдбору оагатокомпонентних крюзахисних середовищ.

Досл!дкення стану води в б!олог1чних системах з природное 1 штучно створеною холодост!йк!стю.

Лвица переносу в кивих системах т!сно пов'язан1 з ф1зичними властивостями водного компонента б1олог!чного об'екта. Холодов1 пошкодаення Оагато в чому визначаються зм1нами властивостей розчинника, що виникають при замерзанн! системи. Кр!озахисн! речовини справлять широкий спектр д!й на компоненти кивих систем, в тому числ! 1 на ф!зико - х!м1чн1 властивост! водного компонента Зокрема вони сприяють ослаблению осмотичних стрес1в при крюгенних д!ях на кл!тини. Разом з тим в!дом! бЮлоПчк! об'екта р!зного

р!вня орган 139ЦП (рослини, комахи та ;н. ■, одатн: пберп'ати життсздатн!сть п!сля досить глибскогс охолодоння. Являв ¡нтерес егпвстзвити влзстивост; водного компонента I його реакций на охолодкенкя в об'ектах з природное холодеет:йк!стю ! в таких, у яких ця вдасткв!сть створена штучно, ¡нтерес до такого эн'-..г.!?у ррозум!лиЯ як з нэукогго!" точки зору, 'ГЬК 1 в зв'язку з практичными задачами кр1об1олоп!. 3 проблемою дп крюпротектор!в ть-ко пов'язанШ 1 анал!з ф;зико - хш1чшге властигостей ро?чин;р. м;«мслекулярних взаемод!й в них, медекуляно: рухлу; <"•:;, м!«молекулярного обк'ну.Так! дослздження "ули з;иР.снрн; ь ;:-!н;Я робот) [12, 30, эг, 33, 37, 43, 44, 4". 4Я. Дсол;ди проводили на об'ектах, що гначно в1др!зняються генетично. Доел;джували дгревк• рослини з р!зною холодост1йк1ст!о (береза Ве1и!а 1 , яблуня На1иа СотеаггИса сорту Кальвиль). Метолом 'н-ЯМР вивчали, фазов; переход: води в цих об'ектах при температурах, нижчих в!д о°с. Експериментальна методика базуеться на тему факт!, що яри переход! води в тверду фазу !1 сигнал ЯМР уиирюеться на деюлька порядки; ! не рвеструеться в спектрах ЯМР еисоко; розд)льно: здатност1.. Фракц! я води, зв'язаног з г.'дрофгльними центрами Сюлопчни?-молекул, або яка входить до складу пдратких оболонок !он1В, переходить в критэлНчу фазу 1 рееструоться в спектр! ЯМР кикч-температури кристал]зацП основно! маси розчинника. Ця властность дозволяе в!др1зняти в!льну I зв'язану воду (метод Кюнтца).

ЛаПнц) берези ! яблун! брали в лрупй половим зими, ксли, температура утримувэлась довгий час нижче -¿0°С. При цьому рослини знаходяться • в стан1 вимуиеного спс.кою ! мявть висску ст!йк!сть до холоду. В к 1мнэтних умовах преходили репдсатэщ», занурвючи папнц! в воду. На рис.а показан; залетает! ¡нтенсивнсст! сигнал ¡в ЯМР в1д температуря в паПнцях з р;зким обводнениям. Видно, шо в папнцях берези, взятих безпосередньо з дерева, !нтенсккн!стк сигналу води не змшюеться до -ы°С, а в папкцях яблун; до -'••"с. нижче цих значень температури в!дбуваеться поступове змчтення ¡нтенсивност) сигналу води внаиидон кристал!зэцл слабо зв'язано! фракцП. В обводнених (тобто не адаптованих до дН холоду) рослинах кристал!ззц!я води починаеться при б ¡.тыл високих температурах. Мабуть в обводнених рослинах зм!нюеться сп!вв1дношення пул г в м)цно-1 слабо зв'язано1 води, причому в останньому розвиваеться кристал¡зац!я. В1ДПов!ДНо шдвищуеться ! температура холодового пошкедаення. Можня думатк, що холодосийкють зь'язг.нч ш- ~

абсолютам вм!стом зв'язано! води, а з в1дносним розм1ром компартмент!в слабо 1 м1цно зв'язано! води. Зменшення в!дносного вмЮту слабо зв'язано! води сприяе б!льш глибокому переохолодженню

-10 -20 -30 -40 Температура., "С

-50

Рис.8 Зале*нIсть ЮТенсивност! сигналу води в!д температура в паг!нцях берези I яблун!. 1,2 - паг1нц1 береза бзят1 безпосередаьо з дерева, 3,4 - паг1нц1 яблун!, взят1 безпосередньо з дерева, 5.6 - паг1нц1 берези п!сля в1дрощування в Юмнатних умовах (1,3,5 - охолодаення, 2,4,6 -нагр1вання).

1 ослаблении пошкоджень внасл1док кристал1зац1I льоду.

В1домо, то деяке насшня, спори 1 пилок рослин мавть дута малу залишкову волоПсть 1 здагн1 переносити охолодаення впритул до температури р1дкого гел1ю без втрати- гиттездатност1. Ыабуть в таких об'вктах вся вода знаходиться в зв'язаному стан! 1 не зазвав фазових переход1в першого роду при охолодаенн!.

Цей же методичний прийом ми використали при досл!дженн1

куколок Hyphantria cunea Dr. Було встановлено, що вода в зимуючих куколках при температурах ■ до -п°С знаходиться в метастаб!льному переохолодженому стан1. При температур) -17°С настае кристал!зац1я 1 куколки гинуть. При шдвищенш температури повне танення води настае в• температурит облает! близько о°С. Цей факт вказуе на незначний вм1ст в гемол!мф! куколок осмотично активних рзчовин, що виконують роль "природних кр!опротектор1в". Зв!дси видно, що холодост!йк!сть досл!дауваного виду Hyphantria Cunea Dr зв'язана з ст1йким переохолодкенням води в температуря i й облает 1 нижче о°С. Високий bmIct слабо зв'язано! води сприяе утворенню кристал!в льоду 1 веде до крЮпошкодження. Системи з штучно створеною ст!йк1стю до холоду характеризуеться там, що стан води в них модиф!кований введениям неводаих. крЮзахисних добавок. В дан1й робот! досл1джували стан води в б!нарних системах вода - кр1опротектор [1, г, 261, в розчинах кр1опротектор!в з добавками б1ошл!мер!в [2, 3, ю, 14, 15, 30, 45] ! в суспенз1ях кл)тин з кр!озахисними речовинами [30,47]. на приклад! еритроцит1в 1 бактер!й Y. Pestis EV76 було показано, що в присутност1 крЮзахисних речовин в систем! зб!льшуеться в!даосна к1льк!сть зв'язано)! води. Внесок кожного з компонент!в в сумарну г1дратац!ю системи лише в деяких випадках п!дкоряеться правилу просто! адчитивност!, але част!ше всього така аддитивнЮть в1дсутня. Особливо сильний вшшв кр!опротектор!в з ряду ПЕГ на стан води виявляеться при досл!дженн! ц1лого органа, де може спостер!гатись в1дт!кання в1льно! води з окремих компартментi в 14, 27].

Досл!джуючи осмолярн1сть розчин!в за допомогою спецюльно розробленого приладу [34], ми виявили, що осмолярнють багатокошонентних розчин1в, як 1 Пдратац!я, не Шдкоряються правилу просто! аддитивност!Однак у bcíx випадках для бIслог!чнкх систем з рЮним р1внем органЮацП спостер!гаеться зб!льшення в!дносног KíJTbKocTt зв'язано1 води при додаванн! крюпротекторю.

Таким чином, подан! експериментальн! результати вказують на те, що в б1олог!чних об'ектах з природное ст!йк!стю до холоду • в таких, у яких холодост!йк!сть створена шляхом введения штучних крЮзахисних речовин, 1снуе загальна властивЮть - високий вмЮт компонента зв'язано! годи в об'ект1.

Досл!дження молекулярно! рухливост! в водних розчинах крЮпротектора а добавками б!лк!ц.

Д1я кр1опротектор!в. .як було показано вище, багаго в чому визначаеться !х здатнЮтю зв'язувати воду, внасл)док чого зм1нюеться склад незамерзаючих м1крофаз в систем! I частина р!дини склуетъся при температурах, нижчих В1Д о°С.

Вежливою властивЮтю, яка дозволяе характеризувати м!ру зв'язаност! вода, е швидають переор!снтац!1 1 трансляц! 1 молекул в процес! м 1 жмолекулярного 1 протонного обм!ну. Метод ЯМР дозволяе виявити р1зниц» м!ж центрами, що обм!нюютъся.

Розд1льне спостерехення сигнал ¡в вдаеться в тих випадках, коли р1зниця х!м!чних зрушень в 'сомпонент1в, що обм1нюються .1 час обм!ну ч зв'язан1 сп1вв1дноиенням:

аО » 1

В дан1й робот) доел|джували процеси м1жмолекулярного ! протонного обм1ну в систем! вода - сироватковий альбум!н лвдини -глЩерин [31, 35]. Використовували важку воду 1>г0. Спостер!гали за протонними сигналами залишково! н20 в склад! о20.

На рис.9 (вставка) показан1 спектри ЯМР протон!в Н^О 1 он в розчин! глЩерину в важк!й вод! з доданням сироваткового альбум!ну лвдини (САЛ). Як можна бачити з рис.9, в б!нарн!й сум!ш1 ьг0 -глЩерин з масовим в1дношенням компонент!в 1:9 при рн=6.6 сигнали Нг0 ! ОН ревструыться розд!льно у всьому досл!джуваному д!апазон! температур, причому залежн1сть х!м1чного зрушення В1д температури С = I (Т) л1н!йна. Це характерно для систем з водневими зв'язками.

При додаванн! САЛ сигнали Н20 I ОН зливаються в один в д!апазон! температур, вищих в1д ю°С, а нижче в!д ц!е! температури стае можливим !х розд!льне спостереження. Час обм!ну при Ю°С складае б1ля ю~3с. Зв1дси видно, що протонний обм!н в присутност1 САЛ прискорюеться. Якщо САЛ п!ддати теплов!й денатурат I шляхом нагр!ввння розчину до юо°С, то сигнали Н20 1 ОН вдаеться спостер!гати ' розд1льно при температур!, нижч1й в1д 20°С. Отже, в присутност: денатурованого б1лка обм1н прискорюеться в менш1й м!р1, н1ж з нативним б!лком. ЗНдно з ¡снуючими у явлениями, елементарний акт протонного обм!ну зд!йснюеться в воднево-зв•язаних комплексах

',6 1,2'

ь, №.д.

а\

П Ч ✓ Чл °Ч

__°лЧ -- .-Ч

ЗНи I1 '' '' ^

№ \°< у

О'С Хл'

А

40"С

-го

\

о

"го'-1

Рис.9 Залежност! х!м!чних зрушень сигнал!в 1Н-ЯМР н?с I груггл ОН глЩерину в!д температури в систем! гл!церин - 3,0, мае. в!дношення компонент!в 9:1. о - сум1ш гл!церин - в20;

х - система глЩерин - Т>г0 з добавками САЛ, 1 мг/мл; а - п!сля денатурацП САЛ нагр1ванняы.

компонент1в, що обм!нюються. У в1дпов!даост1 з цим, катал!тична д!я биша на обм!н повинна виявлятись через його вплив на воднево-зв'язан! комплекси вода - глЩерин. Одним з показник!в М1ри залученост! функцюналышх труп молекул у воднев! зв'язки моне бути величина пох!дно! х!м1чного зрушення сигнал!в 1н-ЯМР Н„о I ОН по тэмператур1 сЮ/йТ в досл1дхуваних системах, як! знаходили з нахилу прямих 5 = Г(Т) на рис.9. Числов! значения пох)дних <16 ли1 подан! в табл.?..

В присутност! нагивного САЛ величина <16/ аТ мае найменше значения, а протонний обм1н у цьому рипадку найшвидиий. Мабуть, в даному вшгадку тлекут г.Шцеркну втягвютъся в у творения нрулних УЛжмолекулярних агрегат¡в ! зростае частота утворення воднево-зв'язаних комплекса з молекулами н?0, в яких взаемне розташування функцюналышх груп спркятливе для зд1йснення акту протонного обмшу.

Таблица ?. Значения пох1дно) х!м!чного зрушення сигнал 1в 1 н-ЯМР н?С 1 он по температур! <Ю Л1Т в систем 1 глЩерин Р?0 з масовим в)дкошенням 9:1 при рн=6.6.

склад розчину )'лщерин+ В20 (9:1 ) 1л щерил+ Бг0 + САЛ !'лщерин+ ПО + САЛ, теплова де-натурац!я

аб/лт. Н,0 0.85 Ю"2 0.89 10"г 0.69 Ю"?

т.д./К ОН 0.89 10~2 0.67 10"2 0.79 10~г

Одержан! експериментальн! результати дають п1дстави думати, що ця взаемод^я в!дбуваеться в шар! води, який находиться в оезпосередньому контакт! з г1дроф!льними центрами б1опол!мера.

Дослдаення мпщост) зв'язування води I процес!в переносу при субл1мац!йному висушуванн! б!олог!чних матер!ал!в.

Фракция зв'язано! води, як було показано вище, В1д!грае ¡стотну роль в холодост!йкост! хивих систем. Тому значний ¡нтерес для кр1об1олог!1 являе собою вивчення саме т1е! частини водного компонента в б!олог!чних об'ектах, що безпосередньо взаемод!е з тЧдроф!льними центрами. Для таких досл1джень в дан!й робот! був виготовлений спец!альний калориметр [7] ! вим1ряна теплота десорбцП води з деяких б!олог!чних об'ект!в при р!зних значениях !х вологост 1. В таблиц! 3 подан! значения теплот десорбцП води з деяких в!русних вакцин 1 з захисних середовищ, як1 використовуються ь технолог!) субл!мац1йно1 сушки б)олог!чних об'ект!в. Зразки висушували з водних розчин!в в захисних середовищах, склад яких вкгзяний в таблиц! 3. Висушен1 зразки доводили до необх1дного значения залишково! вологост!, витримуючи )х в середовшщ з необхШим значениям тиску насиченно! пари води до досягнення ршноваги.

Аналог!чн! досл)дкення були виконан! на зразках л1зину в диапазон! вологост! зразюв 20% - 1.8%.

Було встановлено, що при вологост 1 менше 18% , коли вибуваеться десоротя м!цно зв'язано! з бтлоПчним матер!алом

води, теплота дэсорбцП перевищуе теплоту випаровування тесто! води при в1дпов!дн1й температурь Р1зниця тегают зб1лыпуеться при змешенн1 вологост1 1 досягае 80 - 120 кал/г н20 (3.34 Ю - 5.02 ю кДж/кг нг0) при вологост1 зразка менше 4%. Ця загальна законом!рн1сть спостер!галась для вс!х зразк!в, що досл!дкувались. Приймаючи до уваги, що теплота кристал!зац1I води при 0°С складае 80 кал/г н20 (3-34 Ю кДж/кг 1^0 ), на'основ 1 одержаних результат!в мокна зробити виснбвок, що в розчинах 01оматер!ал1в перех!д зв'язано! води в кристал!чну гратку льоду енергетично невипдний. Ця фракд!я води рееструеться, як незамерзаюча при температурах иначе температури кристал!зац!I основно! маси розчинника, що Оуло показано вище.

Таблиця 3. Теплота десорбцИ води з 01опрепарат1в при вологост! 3.5%.

препарат

склад

захисного

середовшца

к1льк1сть десорбова-но! води.*

Теплота десорбц!I кал/г 1^0

"Температура, с

сахароза (5$)

Желатин (1.2*) 1.6 664 40

Декстран (г%)

Сахароза (5%)

Желатин (7*) 0.9 604 50

Декстран (5*)

чисте середови-ще для проти-бруцельозно! вакцини

цротиоруцельоз-на вакцина в р1зних середо-вищах

сахароза (5*)

Декстран (5*) 1.1 640 50

Сахароза (5*)

Желатин (0.7*) 0.7 670 50

Декстран (5*)

Сахароза (5%)

зелатш (5*) о.8 690 50

Декстран (5*)

иуха в1русвак-цина проти хво-роби ныъ-Касла, штамм Ла-Сота"

обезжирено молоко (15*)

Пептон (5*)

1.2 0.8

674 616

50 50

Розглянутий вище калориметричний метод досл!дкення зв'язано! з б1олог!чним об'ектом води був використаний нами для побудови прилад!в для контролю процес!в тепло- 1 масопереносу п!д час

cyd.ruмац!Иного висушування С!олаг!чних матер!ал!в.

Висушування 01оматер1ал!в з замороженого стану е одн!ею з кр!огенних б!отехнолог!й, що мае в нишшн!й час досить широке застосування не лише в лаборатории., але 1 в промислових масштабах. Тому розробка неперервних метод1в контролю тих процес1в, що Б1Дбуваються на протяз! технолог1чного циклу висушування являе собою пеЕний практичний ¡нтерес.

В данШ робот 1 були запропонован! експериментальн! метода 1 виготовлене вIдпов!дно обладнання для неперервного контролю теплопереносу безпосередньо в сушильних апаратах в ход1 технолог!чного ироцесу сушки [5, 8, 9, 11 , 23, 24, 25, 28]. В основ! запропонованих метод ¡в ле жить вим1рювання теплового штоку в!д оточуючих т!л до висушуваного матер!алу.

На рис.ю показана залежн!сть теплового потоку в1д часу, одержана за допомогою розробленого датчика теплового потоку в процес! субл!мац!йно! сушки зразка захисного середовища на основ! пептону. На рисунку також показана залежн!сть вологост!

Рис.ю Залежн 1 сть вологост 1, швидкост1 сушки 1 .теплового потоку сушки в1д часу висушування для захисного середовища на основ! пептону.

V? 1500

О

О 10 20 30 МО 50 60 70 Час, гадики

в1д часу сушки, одержана пер 1одичним зважуванням зразка в ход; висушування. Диференц1юючи цю криву по часов!, знаходили швидкють сушки. Одержана залежнЮть швидкост! сушки в!д часу дозволяе зарееструвати перЮд пост1йно! швидкосИ сушки (фазу сублШацШ 1 фазу досушування. Як видно з рис.1 о, ц1 ж фази рееструються I за допомогою датчика теплового потоку, причому в технолог 1чному в1дношенн1 вим1рювання теплового потоку реэлЮуються досить простими засобами. За допомогою вим1рювання теплового потоку сушки можна вирахувати швидк1сть сушки зразка. Таким чином, сигнал датчика теплового потоку може бути використаний для керування процесом сушки [24], наприклад для переходу на форсований режим сушки.

ВИСНОВКИ

1. Розроблена концепЩя визначення енергетичного стану еритроцит1в на р1зних стад1ях кр1оконсервування на основ! анал1зу динам1ки розпаду макроерПчних сполук в кл1тинах в умовах виснаження по глшоз!.

2. на основ! досл!дження швидкост! деградацИ 2,3-ДФГ в еритроцитах в присутност! кр!опротектор!в з рюною проникною здатнЮтю кр!зь мембрану виявлено, що крЮпротектори, як1 слабо проникають через цитоплазматичну мембрану, здатн1 викликати сильн!ш! порушення в метабол!зм1 кл!тин, н!ж крЮпротектори, що легко проникають в юл!тину. Це суперечить традиц1йним уявленням

1 вимагае !х уточнения. Запропонований механЮм явшц, що спостер1гаються в присутност! слабо проникних кртопротекторт.

3. Проведено досл!дження енергетичного стану еритроцит!в на стад!ях п!дготовки !х до кр!оконсервування, п!сля заморожування -в1дтанення, п1сля в1дмивання в!д крЮпротектсра I перенесения кл1тин в нове середовище суспендування. Показано, що д1я кокчо! стад!1 крЮконсервування на енергетичний апарат кл!тин виявляеться в зм!н1 тривалост1 лаг-перЮду ! швидкост) деградаш! макроерпчних сполук в 1зольованих еритроцитах.

4. Проведено досл!дження енергетичного стану еритроцит!в пк-ля !х консервування в захисному середовиии ПДС ! показано, ао процедура заморожування - в!дтанення мало впливае на р!вень г\з-ДФГ в кл1тинах, але швидкЮть його деградащ! шсля кр!оконсервуватя

зб!лыпуеться.

5. Виявлено виникнення трансмембранного град!ента рн в эритроцитах в присутност! крЮзахисних речовин, що локал1зуються в м1кл1тинному середовиц!. Вфект пояснюеться порушенням доннан1всько! р!вноваги на мембранах кл1тин.

6. , Серед досл1джених кр1озахисних речовин з класу неелектрол1т1в молекулярних мае 32-2000, як1 найб1льш широко використовуються в кр!о01олог1I, не виявлено р1зко! границ! м!ж речовинами проникними 1 непроникними через мембрану еритроцит1в. Коеф1ц1ент розпод1лу м1ж кл1тиною 1 середовищем для цих речовин монотонно знижуеться з ростом 1х молекулярно1 маси. Коеф1ц1ент в!дбиття мембран еритроцит1в для неелектрол1т1в зменшуеться з ростом молекулярно! маси останн1х.

7. Ексгориментально показано, що проникнення кр1опротектор1в в еритроцити в1дбуваеться по механ!зму пасивно1 дифузП 1 в значн!й м1р1 визначаеться сп1вв1дношенням розм!р!в молекул крЮпротектора 1 мембранних пор.

8. В гомолог1чному ряду ПЕГ для ол!гомер1в молекулярних мае 200-зсю характерна "погранична" положения по характеру 1х розпод1лу м!х зовн)шньо- 1 внутр1шньокл1тинним середовищем еритроцит!в. В цьому д!апазон1 молекулярних мае розпод!л кр1опротектора м!ж кл1тиною 1 середовищем сильн!ше заложить в1д температури при 20-40°С, н1ж для 1нших молекулярних мае.

9. 0держан1 нов! експериментальн! докази зб1льшення розм!р1в мембранних пор еритроцит1в п!д впливом ДМСО 1 збереження при цьому здатност! пор до подальшого зб!льшення при Шдвищенн! температури до 40°С.

ю. Б1олог!чн1 системи, що мають природну ст!йк1сть до температур, нижчих в!д 0°С, I так1, у яких холодост!йк1сть створена штучно, характеризуються загально властив1стю - б!лып високим вм1стом зв'язано! води по в1дношенгао до вс!ею вода в об'еки пор!вняно з об'ектами, не здатними переносити -температури нижче 0°С.

11. Шжмолекулярний протонний обм1н води з кр!опротектором в1дбуваеться не лише в об'ем! водного розчину, але 1 поблизу б1лкових макромолекул, причому макромолекулв виявляють катал(тичну д1ю на обм!н.

12. Показано, що для фракцП м!цно зв.'язано! води в

б1олог1чному об'ектм перех!д в кристал1чну гратку льоду енергетично невиПдний.

13. Розроблений ! виготовлений придал для вкм1рювання ОСМОЛЯрНОСТ! 610Л0Г1ЧНИХ р1дин 3 С1ЛЫИ ВИСОКОЮ точн!стю, К! ж за допомогою сер1йних прилад1в, ¡до випускаються промисловЮтю.

14. РозроСлена методика I виготовлений прилад для неперерьного контролю видалення води з бюлоПчних оС'ект;в е ход! технолог(чного процесу !х субл1мац1йно1 сушки.

ПЕРЕЛ1К P06IT, ОПУБЛIКОВАНИХ ПО TEMI ДКСЕРТДЦ! I

1. Зинченко В.Д. О протонной подвижное те в системе вода -полиэтиленгликоль// Современные вопросы криобиологии: Сб.н.тр.-Киев: Наук, думка, 1976. - С. ¡3-15.

2. Мойсеев В.О., Манк В.В., 31нченко В.Д., 31нченко О.В. Про стан води в розчинах гемоглобшу з добавками пол t етиленоксиду // ДоповШ АН УРСР, сер. Б.- 1977.- II. - С. 1033-11X5.

3. Моисеев В.А., Зикченко В.Д., Зинченко A.B., Стародуб Н.Ф., Рекун Г.М., Манк В.В. О влиянии полиэтиленоксида на состояние веды в растворах гемоглобина при замораживании-отогреве // Механизмы юриоповрездения и криопротекции биологических структур.-Киев:Наук.думка, 1977.- С. 38-39.

4. A.c. 894507 СССР GOIH 24/08 Способ определения степени дегидратации стекловидного тела / Чередниченко В.И., Бездетко П.А., Зинченко В.Д. Опубл. 1981, Б И N 48, с.2П.

5. A.c. 1040884 СССР G0IN 24/08. Устройство для автоматического контроля процесса камерной сушки / Пушкарь Н.С., Моисеев В.А., Зинченко A.B., Зинченко В.Д., Шевырев Н.С., Токарик Э.Ф., 1983. В открытой печати не публикуется.

6. Zinohenko V.D., Mank V.V., Moiseyev V.A. Nuolear magnetic resonanoe study of moleoular Interaotion In aqueous solution of polyethyleneglyools // Abstracts XXth congress AMPERE, August 21-26. - Tallin, 1978. - D 3312.

7. Ac. 553529 СССР G01N 25/56. Устройство для определения интегральной теплоты десорбции жидкостей и газов / Пушкарь Н.С., Моисеев В.А., Зинченко A.B., Зинченко В.Д. - Опубл. Б.И. 1977 N 13.

8. A.c. I0I8485 СССР F26B, Р26В 5/06. Устройство для конотроля теплового потока / Пушкарь Н.С., Моисеев В.А., Зинченко A.B., Зинченко В.Д., Токарик Э.Ф., Нежута A.A. 1983 г. В открытой печати не публикуется.

9. A.c. 1204007 СССР P26/I3, 25/22, 21/10, 5/06 Измеритель теплового потока/ Пушкарь Н.С., Моисеев В.А., Зинченко A.B., Зинченко В.Д., Токарик Э.Ф., Нежута A.A. 1985 г. В открытой печати не публикуется.

Ю.Зинченко В.Д., Моисеев В.А. О протонном обмене в тройной системе вода-полиэтиленгликоль-белок // IV Всесоюз. конф. по спектроскопии биополимеров: Тез. докл. - Харьков, 1981.

II.Pushkar N.S., Moiseev V.A., Zinchenko A.V., Zinchenko V.D. A differential miorokalorimeter for studying water desorption in biological systems // Abstracts International Simposium on Biooalorlmetry. - Tbilisi, 1980

12.Болдырев В.П..Подлатов Г.Г.,Белоус А.М.,Шраго М.И..Зинченко В.Д. Исследование эффективности применения криоп, гекторов для повышения морозоустойчивости виноградных растений// Труды ВНИиВ "Магарач": Ялта.- 1981. - т.ХХ. - С. 69-77.

13.Зинченко В.Д., Воротилин A.M., Моисеев В.А. Исследование проникновения неэлектролитов через клеточные мембраны // I Всесоюз. биофиз. съезд: Тезисы докладов. - М.: Ин-т биол.физики АН СССР, 19827 - т.IV. - С. 17.

14.3инченко В.Д., Моисеев В.А. О гидрофобных взаимодействиях и протоннном обмене в тройной системе сывороточный альбумин-полиэтиленгликоль-вода// I/ Всесоюз. биофиз. съезд: Тезисы докладов.

- М.: Ин-т биол.физики АН СССР, 1982. -JV. - С.19.

15.3инченко В.Д. О гидратации сывороточного альбумина человека в присутствии полиэтиленгликоля-400// Спектроскопия биополимеров: Тез. докл. V Всесоюзная, конф. - Харьков, 1984. - С. 44.

16.Белоус A.M., Зинченко В.Д., Бкезовский В.М., Поволоцкий М.И., Бабийчук Л.А. Влияние полиэтиленгликоля-1500 на сотояние 2,3

- дифосфоглицерата в эритроцитах человека при подготовке к криоконсервированию// Доклады АН УССР. - 1991. -II 4. - С. 153-156.

17.Зинченко В.Д., Кнубовец Т.Л., Сибельдина Л.А. Изучение проникающей способности криопротекторов через мембраны эритроцитов методом Р-ЯМР спектроскопии // Вторая Всесоюзная конференция по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии: Тезисы докладов.-Харьков, 1984. - I. - С.39.

18.Зинченко ВТД., Кнубовец Т.Л., Сибельдина Л.А. Сравнение различных способов криоконсервирования по данным Р-ЯМР спектроскопии //Вторая Всесоюзная конференция по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии: Тезисы докладов.- Харьков, 1984.-]_. - С.207.

19.Кнубовец Т.Л., Зинченко В.Д., Сибельдина Л.А. Исследование проницаемости мембран эритроцитов для криопротекторов методом

Р-ЯМР спектроскопии высокого разрешения// Биол.мемб. - 1985. - 2- N 7.- С. 747-754.

20.Кнубовец Т.Л., Зинченко В.Д., Сибельдина Л.А. Исследование действия«, диметилсульфоксида на мембраны эритроцитов человека методом Р-ЯМР// Биол.мемб. - 1987. - 1.-NI.-C. 84-89.

21.Зинченко В.Д., Кнубовец Т.Л., Сибельдина Л.А., Воротилин A.M., Моисеев В.А. Исследование методом 3'Р-ЯМР метаболизма некоторых фосфатов ьритроцитов человека при криоконсервировании с I,2-пропандиолом// Криобиология. - 1987. - 2. - С. 37-42.

22.Ворютилин A.M., Мирошников A.M., Гучок В.М., Зинченко В.Д. Криопротекторные свойства эфиров этиленгликолей при замораживании эритроцитов человека// Криобилогия. - 1987. - 3. - С. 31-34.

23.Нежута A.A., Маслов Г.Ю., Зинченко В.Д. Применение датчика тепловых потоков в технике сублимационной сушки // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. -Москва: ВНИИТИБП Госалропрома СССР. - 1987. - С. 3-6.

-24.Н&«ута A.A., Маслов Г.Ю., Зинченко В.Д. Определение момента форсированного перехода на фазу досушивания при сублимационной сушке биопрепаратов с помощью датчика тепловых потоков // Научные основы технологий промышленного производства ветеринарных биологических преапаратов: Тезисы докладов III Всесоюзной конференции. - Москва, 1987. - С. 263-264.

25.Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Нежута A.A., Ковальская Л.А., Панферов В.В., Блехерман Б.Б., Константинов В.М., Лихтенштейн Г.И., Зинченко В.Д. Теоретические предпосылки и методические подходы к стабилизации активности биологических препаратов // Научные основы технологий промышленного производства ветеринарных

биологических препаратов: Тезисы докладов ИТ Всесоюзной конференции. - Mookbîi, ¡987. - С. 263-264.

Йб.Зинчьнко A.B., Зинченко В.Д., Моисеев В. А. О низкотемпературных фазовых пеиеходах в водных растворах псдиатилвнргаа:длей// Рук. д^и. в "BVïKMTW 29.04.87 и 3021 - В37. -2 ; С.

27.Чередниченко В.М., Вездетко П.А., Зинченко В.Д. Исследование методом ЯМ? дегидратации стекловидного тела, вызванной кгиопротркторо« ПЭ0-400 // Криобиология. - !Э87. - Г,. - П. 45-4F.

?.8. АС 434Г-4! СССР 00Гм 25/20. Устройство дифференциального термического анализа / Зинченко В.Д., зинченко A.B. .Подоттригора Л.П., Моисеев Б.А. Опубл. Б.И. I9S8 N 40, с. 203.

23. Кнубсвец Т.Д., Зинченко В.Д., Сибельдинз Д.А. '-:Р-ЯМР исследование влияния криопротекторсв на метаболизм эритроцитов человека // Достижения и перспективы развития криобиология и крномедициш: Тез. докл. Мевд. кснф. - Харьков, 1938. - С. 18.

ЗО.Тегентьев А.Н., Зинченко /.В., Зинченко В.Д., Мусатов В.И., Щетинский U."Л. Влияние некоторых криоггротекторов на состояние вода в клетках Y.Pestis KV76 при замораживании - оттаивании // Криобиология. - 1973. - N1. - С. 20-26.

31.Зинченко В.Д., Щетинский М.И., Мусатов В.И., Моисеев В.А. О влиянии сывороточного альбумина человека на протонный к изотопный обмен в системе в 0-глицерин // VT конференция по спектпоскопии биополимеров: Тез. докл. - Харьков, 1986. - С. 138-139.

32.Зинченко В.Д. Использование метода ЯМР для исследования механизмов криоповреждения и криозащиты // Моделирование криобиологических процессов: Сб. н. тр. - Харьков: ИПкиК АН Украины, 1988. - С. 146-153.

33.Мануильский В.Д., Пачепская Л.Б., Моисеев В.А., Зинченко В.Д., Шетинский М.И. Изменение прочности связи воды с макромолекулами у тканей зимующих древесных при формировании устойчивости к низким температурам // Проблемы физиологии и биохимим древесных растений: Тез. докл. III Всес. конф.-Петрозаводск, 1939. - С.36-37.

34.АС 1511639 G01N 13/04 Осмометр // Зинченко В.Д. Опубл. 30.09.89 Б.И. 1989, N 36.

35.Зинченко В.Д., Щетинский М.И. Исследование методом ЯМР молекулярной и протонной подвижности в системе вода-глицерин // Биохимические аспекты ' криоповреждения и криозащиты клеточных систем: Сб.науч.тр. - Харьков: ИПКиК АН Украины, 1989. - С. 58-63.

36.Зинченко В.Д., мусатов В.И. Об изменении внутриклеточного pH в эритроцитах после замораживания-оттаивания под защитой 1,2-ПД // Биохимические аспекты криоповреждения и криозащиты клеточных систем: Сб. науч. тр. - Харьков: ИПКиК АН Украины, ¡989. - С. 34-37.

37.Зинченко В.Д., Генсицкий И.П., Щетинский М.И., Моисеен^В.А. Состояние воды в куколках насекомых при температурах ниже О С по данным метода ЯМР и холодовые повреждения // магнитный резонанс в биологии и медицине: Тез. докл. VIII Всесоюз. конф. - Черноголовка, 1990. - с. 49.

38.Мусатов В.И., Зинченко В.Д. Влияние охлаждения и криозащитных веществ на состояние 2,3-ДФГ в эритроцитах человека // Магнитный резонанс в биологии и медицине: тезисы докл. viit Всесоюз. конф. - Черноголовка, 1990. - С. 50.

39.Зинченко В.Д., Загнойко В.И., Трачевский B.R., Пащенко Е.А. Исследование фосфорсодержащих соединений в печени зимоспящих животных методом Р-ЯМР // Магнитный резонанс в биологии и медицине: Тезисы, докл. vin Всесоюз. конф. - Черноголовка, 1990. -

с.51

40.Грищенко В.И., Белоус A.M. Моисеев В.А., Загнойко В.И., Зинченко В.Д., Андриенко А.Н., Трачевский В.В., Пащенко Е.А Метаболизм фосфорсодержащих соединений в печени длиннохвостых сусликов (citez lue UndulatusJ при раЗЛИЧНЫХ фИЗИ0Л0ГИЧ0СКИХ состояниях // ДАН СССР. - 1990. - ¿12. N 4. - С. 996-999.

41.Зинченко В.Д., Загнойко В.И., Мусатов В.И., Бжезовский В.М. О метаболизме некоторых фосфорсодержащих соединений в .. (ени и эритроцитах зимоспящих животных методом Р-ЯМР // Механизмы зимней спячки: Тез. докл. Всес. симп. - Махачкала, 1990. - С. 49.

42.Грищенко В.И., Белоус A.M., Моисеев В.А., Загнойко В.И., Зинченко В.Д., Андриенко А.Н., Трачевский В.В., Пащенко Е.А. Изучение метаболизма фософорсодержащих соединений ,в печени длиннохвостах сусликов (ctteîius unduiatuB) методом Р-ЯМР // Биохимия. - 1990. - s3, N 10. - С. 1860-1867.

43.Мануильский В.Д., Моисеев В.А., Зинченко В.Д., Щетинский М.И., Пачепская Л.Б. Протонный магнитный резонанс воды при изменениях оводненности древесных в зимний период // Физиология растений.- 1991. - за, N 3. - С. 552-559.

44.Зинченко В.Д., Терентьев А.Н., Зинченко A.B., Мусатов В.И., Щетинский М.И. О состоянии воды в клетках j.vestía EV76 при замораживании-отогреве в присутствии криопротекторов проникающего и непрокикаодего типов// vil конференции по спектроскопии биополимеров: Тез. докл. - Харьков, 1991. - С. I09-II0.

45.Щетинский М.И., Зинченко В.Д., Чеканова В.В., Ханина Л.А. О межмолвкулярных взаимодействиях в водных растворах N-метилацетамида // Физико-химические процессы в криобиологических системах: Сб. науч. тр. - Харьков: ИПКиК АН Украины, 1991. - С. 166-170.

46.Ыусатов В.И., Зинченко В.Д., Бжезовский В.М. Влияние криопротекторов на состояние 2,3-ДФГ в эритроцитах по данным

Р-ЯМР// Физико-химические процессы в криобиологических системах: Сб. науч. тр. - Харьков: ИПКиК АН Украины, 1991. - С.96-101.

47.Моисев В.А., Зинченко В.д., Нардид O.A. О некоторых молекулярных механизмах криозащиты биологических объектов// Физико-химические процессы в криобиологических системах: Сб.науч. тр. -Харьков: ИПКиК АН Украины, 1991. - С. 78-95.

48. Зинченко В.Д., Мусатов В.И., Моисеев В.А., Кушнир И.Э., Бабак 0.Я. ' Применение метода Р-ЯМР при некоторых заболеваниях печени// Научно-технические проблемы современнвй терапии: Тез. докл. Научн.-практ. конф. - Харьков, 1989 - С.177-179.

49.Генсицкий И.П., Зинченко В.Д., Моисеев В.А., Щетинский М.И. ЯМР исследования фазового перехода воды у куколок американской бабочки Нуphan.trla Cunea Dr. при НИЗКИХ температурах // ВЛИЯНИе охлаждения на биологические объекты: Сб. науч. тр. - Харьков: ИПКиК АН Украины, 1990. - С. 22-24.

50.А.С. 1642342 СССР G0IN 24/08, 33/483 Способ оценки проникновения веществ в клеточные суспензии / Зинченко В.Д., Путинский М.И., Мусатов В.И., Моисеев В.А. Опубл. 15.04.91, Б.И. N 14.

51.Зинченко В.Д. Исследование метаболизма макроэргических соединений в криоконсервированных эритроцитах методом Р-ЯМР// Успехи современной криобиологии: Тез. докл. II Меадународн. конф. -Харьков, 1992. - С. 72-73.