Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Спектроскопическое изучение ДНК-актиномициновых комплексов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Спектроскопическое изучение ДНК-актиномициновых комплексов"

На правах рукописи

Савннцев Иван Витальевич

Спектроскопическое изучение ДНК-актиномнциновых комплексов

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2004

Работа выполнена в Путинском государственном университете на базе Института биофизики клетки РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Н. Л. Векшин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук О. Н. Озолинь

кандидат физико-математических наук А. К. Сурин.

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А.Эигельгардта РАН.

Защита диссертации состоится > 'Х март 2004 г. в ' / часов на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 в Институте биофизики клегки РАН, г, Пущино, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Путинского НЦБИ РАН.

Автореферат разослан

февраля 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук.

Т. И. Смолнхмна.

Ъ61Ъ^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. Антнбиотики-актиномицины в течение " нескольких десятилетий используются в медицинской практике для лечения инфекционных и опухолевых заболеваний [Планельес Х.Х. 1962, Терентьева Т.Г. 1977, Frei Е. 1974].. Такое применение основано на способности актиномицинов формировать устойчивый комплекс с молекулой ДНК, ингибировать РНК-полимеразную реакцию и, таким образом, подавлять биосинтез белка, рост клеток и тканей.

Однако до сих пор не сформировано однозначного представления о механизме взаимодействия актиномицинов с ДНК и структуре формирующегося комплекса; существуют лишь противоречивые модели

[Сазыкин Ю.О. 1965., Егоров Н.С. 1985]. Наиболее распространенная из них предусматривает решающее значение интеркаляции хромофора актиномицина между азотистыми основаниями ДНК [Jain S.C. 1971, 1972, Sobell Н.М. 1972]. Согласно другой, модели, комплексообразование происходит за счет встраивания хромофора и пептидной части молекулы в малую бороздку ДНК [Гурский Г.В. 1969].

Кроме того, существуют данные о том, что актиномицин связывается преимущественно со шпилечными образованиями ДНК и что для эффективного комплексообразования необходимо наличие участков, богатых гуанином [Егоров Н.С. 1985, Krugh Т. 1972, Wadkins R. 1991,1998].

Ранее 'бьши изучены механизмы встраивания гетерохромофорных молекул в ДНК и сформированы представления о закономерностях таких взаимодействий [Полетаев А.И. 1976, Борисова О.Ф. 1973, Жузе А.Л. 1980, 1985,1998]. '

Актиномицины являются эффективными противоопухолевыми препаратами, однако их медицинское использование ограничено выраженным побочным токсическим действием, обширным рядом противопоказаний.

Недостаточное понимание ДНК-актиномицинового взаимодействия препятствует поиску путей оптимизации медицинского использования антибиотиков на основе актиномицинов, связанных с разработкой способов трансмембранного переноса, направленной доставке препарата в клетку, снижению побочных токсических эффектов при противоопухолевой терапии.

Необходимо детальное изучение механизма комплексообразования актиномицинов с ДНК. При этом представляется важным сделать акцент на исследовании при малых (терапевтических) концентрациях и в 'зависимости от агрегатного состояния ДНК. Актуальной задачей также является поиск путей направленной доставки актиномицина в клетку.

Научная новизна. Методологической новизной данной работы является применение комплекса спектроскопических методов (абсорбционная спектроскопия в УФ, видимой и ИК-областях; стационарная, фазово-модуляционная, поляризационная и «stopped-flow» флуоресцентная спектроскопия). Кроме ДНК использованы модельные нуклеотидные

системы в сочетании с применением флуоресцирующего аналога актиномицина. Впервые для анализа интеркаляционной способности актиномицина (одной из основных характеристик механизма этого комплексообразования) используется высокочувствительный метод анализа декстеровского обменного переноса энергии.

Показано отсутствие интеркаляционных механизмов в формировании ДНК-актиномициновых комплексов в растворе.

Установлено, что феноксазоновый хромофор актиномицина находится ,

в окружении азотистых оснований ДНК, в состав комплекса входят молекулы воды, но комплексообразование не сопровождается формированием комплекса стэкингового интеркаляционного типа.

При сравнительном анализе взаимодействия актиномицинов с *>

растворенной и конденсированной ДНК обнаружены принципиальные различия механизмов комплексообразования и свойств формирующихся комплексов.

Обнаружено и исследовано явление перемещения актиномицина из комплекса со шпилечным олигонуклеотидом на ДНК. Показана способность шпилечного олигонуклеотида выполнять функцию трансмембранного переносчика актиномицина к ядерной ДНК на клетках асцитной карциномы.

Научно-практнческая ценность.

Показанное отсутствие интеркаляции при формировании ДНК-актиномициновых комплексов при микромолярных (терапевтических) концентрациях может быть основанием для разработки производных актиномицина для оптимизации его медицинского использования.

Обнаруженное различие механизмов комплексообразования актиномицина с растворенной и конденсированной ДНК дает возможность для дифференциации понимания актииомицинового эффекта в отношении "свободной" цитоплазматической ДНК и ДНК в составе нуклеопротеидных и нуклеолипидных комплексов. Это потенциально позволяет вносить корректировки в выбор производных актиномицина и учет схем и дозировок актиномициновой терапии в зависимости от состояния клеточного хроматина, стадии клеточного цикла и митотической активности ткани.

Способность шпилечного олигонуклеотида выполнять функцшо 1

переносчика актиномицина в клетке дает возможность развития нового направления повышения эффективности этого препарата при противоопухолевой терапии.

Целыо работы является спектроскопическое изучение механизма комплексообразования ДНК с актиномицином в растворе и пленках, мест встраивания актиномицина и свойств формирующегося комплекса, а также поиск возможных способов направленной доставки актиномицина в клетку к ядерной ДНК.

Задачи работы;

1. Исследовать комплексообразующую способность актиномиМинов в отношении агрегатов гуанина и полигуаниловой кислоты как системы, моделирующей участки ДНК, обогащенные остатками гуанина.

2. Определить способность актиномицина к- формированию интеркаляционного комплекса с ДНК, шпилечным олигонуклеотндом, полигуаниловой кислотой,

3. Сравнить комплексообразующие свойства актиномицина D и его флуоресцентного аналога 7-аминоактиномицина D в отношении полигуаниловой кислоты, гуанина и шпилечного олигонуклеотида НР1.

4. Оценить сродство актиномицина к шпилечным образованиям ДНК и способность шпилечных структур выполнять функцию переносчика актиномицина.

5. Определить характер молекулярного окружения актиномицина в комплексе с ДНК, наличие в нем молекул воды и значение водородных связей.

6. Провести сравнительный анализ механизма комплексообразования актиномицина с растворенной ДНК и с ДНК, конденсированной в пленку.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VIII Зимней международной молодежной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии." (Москва, Институт биоорганической химии, 7-9 февраля 2001 г.); на У конференции молодых ученых г. Пущино"Биология - наука 21 века." (16-20 апреля, Пущино, 2001 г.); на VI конференции молодых ученых г. Пущино "Биология - наука 21 века." (20-24 мая, Пущино, 2002 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на-f&& страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения и списка литературы ("/Уер ссылок). Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и содержит 11 таблиц.

Список сокращений. AMD - актиномицин D, 7AAMD - 7-аминоактиноми-цин D.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использовали актиномицин D ("Reanal", Венгрия), 7- амино-актиномицин D ("Fluka", Чехия), олигонуклеотид НР1 ("Midland Certified Reagent Company". Также использовали несколько видов ДНК: ДНК тимуса теленка ("Serva", Германия), ДНК спермы лосося No 101500 ("ICN") и ДНК фага X No 25250-010 ("GibcoBRL",CHIA)

Для получения спектров УФ-поглощения л флуоресценции использовали растворы веществ в какодилатном буфере концентрации 10 мМ (рН = 7.6). Для флуоресцентных измерений методом "stopped-flow"

использовали растворы в 10 мМ Tris-HCl буфере с 0.5 мМ ЭДТА (pH 7.6) и 20 мМ Tris-HCl буфере (pH 7.6). При флуоресцентных исследованиях концентрация 7AAMD и этидия бромида составляла 1 мкМ, концентрация ДНК, поли-G и НР1 в пересчете на нуклеотиды - 6 мкМ. При изучении комплексов методом абсорбционной спектроскопии использовали более высокие концентрации (в 2-3 раза).

Спектры поглощения растворов исследуемых веществ в ультрафиолетовой и видимой областях регистрировали на спектрофотометре "Specord М-40" (Германия) в 1-см кварцевых кюветах в диапазоне 220-700 нм.

ИК-спектры пленок ДНК и ее комплексов регистрировали в диапазоне 4000-900 см'1 на спектрофотометре "Specord М80" (Германия). ИК спектры растворов в тяжелой воде были получены на этом же приборе с помощью флюоритовых кювет толщиной 70 мкм.

Испускание флуоресценции 7AAMD регистрировали в дипазоне от 580 до 700 нм (возбуждение - 530 нм), этидия бромида - в диапазоне от 570 до 670 нм (возбуждение - 500 нм) на флуориметрах "Perkin-Elmer MPF44B" (США) и «SLM-4800» (США) со щелями монохроматоров 8 нм на возбуждении и 4 нм на испускании. Спектры возбуждения флуоресценции регистрировали в диапазоне от 240 до 300 нм в ультрафиолетовой и от 450 до 650 нм в видимой областях со щелями монохроматоров 4 нм на возбуждении и 8 нм на испускании при положении монохроматора испускания 650 нм для 7AAMD и 610 нм для этидия бромида.

Время жизни флуоресценции определяли фазово-модуляционным методом на фазово-модуляционном спектрофлуориметре «SLM-4800» (США) при частоте модуляции 30 МГц и щелях монохроматора возбуждения - 1 нм и монохроматора излучения 16 нм.

Значения деполяризации флуоресценции определяли на спектрофлуориметре «SLM-4800» (США) в стационарном режиме и статическом положении поляризаторов (параллельно и перпендикулярно плоскости поляризации световой волны) при щелях монохроматора возбуждения и испускания 8 нм.

В основе методики сравнительного спектроскопического изучения пленок и растворов исследуемых веществ лежало сравнение оптических и спектральных свойств раствора и пленки одного и того же комплекса. При этом выполнялись условия, при которых пучок света спектрального прибора проходил через часть образца (пленки и раствора), содержащую одинаковое количество вещества.

Быструю кинетику связывания 7AAMD с НР1 или ДНК в миллисекундном временном диапазоне изучали по изменению интенсивности испускания флуоресценции, которое регистрировали на "stopped-flow" флуориметре "Applied Photophysics" (CILIA) с возбуждением 550 нм.и эмиссионным фильтром > 570 нм.

Изменения интенсивности испускания флуоресценции при связывания 7AAMD с ДНК и перемещении 7AAMD с НР1 на ДНК в минутном

временном диапазоне регистрировали на стандартном спектрофлуориметре "Регкт-Е1тег МРР44В" (США) в 1-см кварцевых кюветах на 610 нм (при возбуждении 570 нм).

Количество молекул (Ы), донирующих возбуждение на одну молекулу акцептора, и эффективность переноса энергии (0) определяли по формулам [Векшин Н.Л. 1998,2002]:

N = Рва £а / Ра ей (1)

О = Рва еа [а] / Ра ее! Щ (2)

Здесь рБа - интенсивность сенсибилизированной флуоресценции акцептора, возбуждаемого в донорной полосе поглощения, Ра -интенсивность флуоресценции акцептора, возбуждаемой в его собственной полосе, еа - коэффициент- экстинкции акцептора, ее! - коэффициент экстинкции донора, [а] - концентрация акцептора. М - концентрация донора.

Эффективный объем флуоресцирующей частицы определяли по известному уравнению Левшина-Перрена:

(3)

Здесь Ро - предельная поляризация (она равна 0.5 для 7AAMD в замороженных растворителях), Р - это измеренная поляризация, т - время жизни, г] - вязкость водного раствора (0.012 пуаз для воды при 13°С), Т -абсолютная температура (286К), R- универсальная газовая постоянная и V -эффективный объем частицы. .

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Взаимодействие актиномицинов с гуанином и полнгуаннловой кислотой.

Методом абсорбционной спектроскопии по нелинейной зависимости коэффициента экстинкции от концентрации показано, что гуанин в растворе формирует агрегаты за счет гидрофобных взаимодействий и водородных связей между аминогруппами и карбонильными группами соседних молекул.

Изучено взаимодействие AMD с агрегатами гуанина. При анализе УФ-спектров показано, что взаимодействие AMD с гуанином сопровождается гиперхромизмом полосы поглощения гуанина при 260 нм (степень гиперхромизма достигала 32 %). По-видимому, AMD за счет гидрофобных взаимодействий и водородных связей конкурентно встраивается в агрегаты гуанина и разрушает их, что приводит к увеличению количества свободных

хромофоров и повышению коэффициента экстинкции (рис. 1). Этот гиперхромный эффект сходен с тем, который наблюдался при температурном плавлении гуаниновых агрегатов и разрушении их карбамидом.

D

Рис. 1. Изменение

0,27

оптической плотности (X = 260 нм.) растворов гуанина (1) и комплекса гуанина с AMD (2) при нагревании.

Концентрации гуанина и AMD - 15 и 3 мкМ, соответственно;

0 20 <10 60 80 100 Температуря,°С

Одним из показателей образования устойчивого интеркаляционного комплекса "стэкингового" типа между ДНК и флуорофором является наличие существенного переноса энергии с фотовозбужденных нуклеотидов на флуорофор. Эффективность переноса детектируется по появлению в спектре возбуждения флуорофора интенсивной полосы нуклеотидов на 260 нм [Векшин Н. JI. 1998]. Используя указанный подход для обменного декстеровского переноса мы оценили интеркаляционную способность 7AAMD в сравнении с типичным интеркалирующим красителем этидиум бромидом [Paoletti J. 1971, Колесников Д. В. 1998], имеющим в УФ интенсивное поглощение в районе 284 нм, т.е. в другой области, чем нуклеотиды. Этот методический прием по сравнению интеркаляционных свойств актиномицинов и этидия бромида был использован на протяжении практически всей экспериментальной работы.

Отсутствие нуклеотидной полосы в спектрах возбуждения флуоресценции 7AAMD в присутствии гуанина и поли-G в растворе свидетельствует об отсутствии интеркаляционного комплекса. Спектры этих систем сходны со спектрами комплексов 7AAMD с другими нуклеотидными компонетами в растворе (рис.4), По данным УФ-поглощения не обнаружено изменения интенсивности и сдвигов полос поглощения поли-G в присутствии AMD и 7AAMD. Кроме того, термоустойчивость поли-G (отсутствие спектральных изменений при нагревании до 90°С) не изменилась при добавлении актиномицинов. Из этих результатов следует, что, либо актиномицины не встраиваются в поли-G, либо их встраивание происходит "поверхностно", не приводя к изменению структуры поли-G.

Напротив, в спектре возбуждения флуоресценции комплекса поли-G/бромистый этидий (рис. 2) помимо полосы этидия (при 284 нм)

присутствует очень интенсивная нуклеотидная полоса, что свидетельствует о переносе энергии на интеркалирующий краситель.

К%)

100-

Рис. 2. Спектры возбуждения флуоресценции растворов:

1 - этидий бромид,

2 - комплекс этидия бромида с поли в,

3 - комплекс этидия бромида с НР1.

Дальнейшее направление исследований было связано - с изучением комплексообразования актиномицинов с ДНК и синтетическим шпилечным олигонуклеотидом, а также поиском закономерностей эффективного комплексообразования в зависимости от нативности нуклеиновой системы и сравнению комплексообразующих свойств 7AAMD и AMD в отношении шпилечных структур ДНК.

2. Способность актиномицинов к формированию ннтеркаляционного комплекса с ДНК и шпилечным олигонуклеотидом НР1 в растворе.

НР1 является олигонуклеотидом, содержащим лишь один гуаниновый остаток [Wadkins R. 1998, 2000] (рис. 3). В растворе он формирует шпилечную структуру с образованием девяти комплементарных пар. Согласно данным работ Р. Вадкинса [Wadkins R. 1998, 2000], 7AAMD обладает высоким сродством к таким шпилечным образованиям ДНК.

В спектре возбуждения флуоресценции комплекса 7AAMD-HP1 нет нуклеотидной полосы при 260 нм, т.е. перенос энергии отсутствует (рис. 4). Это свидетельствует о том, что формируется комплекс не по интеркаляционному типу. В случае же с бромистым этидием имеет место не только возрастание его излучения при связывании с НР1, но и появление интенсивной нуклеотидной полосы при 260 нм за счет переноса энергии (рис.2). Это свидетельствует об образовании интеркапяционного комплекса стэкингового типа.

Рис. 3. Структурная формула олигонуклеотида НР1.

б'-АААААААТАОТТТ

I I I I ■ I

З'-Т ТТ ТТТ ТАТАААТ

Испускание флуоресценции 7ААМЛ в комплексе с НР1 сильно поляризовано, а время жизни т заметно больше, чем свободного 7ААМБ. Комплекс имеет гораздо более плотную упаковку, чем его отдельные компоненты (таб. 1)

В спектре возбуждения комплекса 7ААМБ с ДНК также отсутствует нуклеотидная полоса при 260 нм (рис. 4), т.е. переноса энергии не происходит. Таким образом, 7ААМБ не интеркалирует в ДНК.

Таблица 1. Значения времени жизни возбужденного состояния (г), поляризации флуоресценции (Р) 7ААМО в свободном состоянии и в комплексах с (олиго-) полинуклеотидами; эффективные объемы частиц (V).

Образец X, не Р V, А1

7ДАМБ 0.8 ±0.1 0.31 ±0.01 4400

7ААМО / поли-0 0.6 ±0.1 0.32 ±0.01 4600

7ААМО/НР1 1,7 ±0,1 0,39 ± 0,01 22860

I

1-

Рис.4. Нормированные спектры возбуждения флуоресценции растворов: 1-7ААМО,

2 - комплекс 7ААМБ с НР1,

3 - комплекс 7ААМБ с тимусной ДНК.

240 250 260 270 260 200 300

Л

Квантовый выход флуоресценции 7AAMD возрастает в несколько раз при образовании комплекса с олигонуклеотидом, но при добавлении избытка AMD — падает до исходного уровня (рнс. 5). Таким образом, AMD полностью вытесняет собой 7AAMD из комплекса. Эти акганомицины конкурируют при связывании с олигонуклеотидом НР1, 7AAMD является аналогом природного актиномицина при взаимодействии с такими шпилечными структурами.

1(%)

100-

Рис. 5. Спектры испускания флуоресценции растворов:

1 - комплекс НР1 с 7AAMD,

2 - комплекс НР1 с 7AAMD после добавления AMD (концентрация AMD в 10 раз выше, чем 7AAMD),

3 - 7AAMD.

640 660 680 700

3. Комплексообразование и перемещение актиномицннов в нуклеотндных системах в растворе.

Удаление гуанина из нуклеотидной последовательности олигонуклеотида ведет к значительному снижению его комплексообразующей способности. Причина этого заключается в том, что удаление гуанина ведет к потере олигонуклеотидом способности I формировать шпилечную структуру.

Комплексообразование AMD, или 7AAMD с НР1 сопровождается гипохромным эффектом. Коэффициент экстинкции олигонуклеотида на полосе 260 нм уменьшается, ч В случае формирования комплекса 7AAMD с НР1 кинетика связывания

содержит лишь быструю фазу. Формирование комплекса происходит за 0.3 сек (рис.6). Связывание происходит как моментальный процесс, свидетельствующий о быстром проникновении феноксазонового хромофора актиномицина в шпилечную структуру.

зованиисНР1(1) и при его замещении наАМБ в комплексе сНР1(2).

Рис. 6. Изменение интенсивности

испускания флуоресценции

7ААМО при его комплексообра-

0.20

Т1п;с (8есот1а)

0.2

0.4

0.6

0.8

Время вытеснения 7ААМО актиномицином Б составляет 0.3 секунды (рис.б). Это время не отличается от времени связывания 7ААМБ с НР1. Не существует значительного энергетического барьера при конкурентном связывании этих актиномицинов со шпилечным олигонуклеотидом.

Процесс возрастания интенсивности флуоресценции при комплексообразовании 7ААМО-ДНК включает две фазы: 4.6 секунды и 40 секунд (рис.7). Первая компонента имеет гораздо более высокую амплитуду. Вероятно, быстрая фаза связана со встраиванием актиномицина в шпилечные структуры ДНК. Однако, эта быстрая фаза на порядок продолжительнее, чем в случае связывания с НР1. По-видимому, шпилечные образования ДНК -это довольно жесткие структуры, в то время как шпилечный олигонуклеотид НР1 в водном растворе довольно подвижен и неупорядочен. НР1 более чем ДНК доступен для эффективного комплексообразования с актиномицинами. Вторая (медленная) фаза кинетики связана со встраиванием актиномицина внутрь молекулы ДНК, либо с постепенным появлением в структуре ДНК новых шпилечных образований в результате тепловых флуктуации.

Обнаружено, что интенсивность испускания флуоресценции 7ААМО зависит в определенной степени от типа ДНК. Наибольшие значения отмечены для случая с ДНК спермы лосося по сравнению, например, с тимусной ДНК и ДНК фага X. Это предположительно означает, что ДНК спермы лосося содержит большее количество шпилечных образований.

Рис. 7. Изменение

интенсивности

испускания

флуоресценции

7ААМБ:

1 - контроль

2 - после смешивания с ДНК фага X.

Изучены временные характеристики процесса перемещения 7AAMD из комплекса с НР1 на ДНК после ее добавления к раствору комплекса актиномицина с указанной шпилькой. Это было детектировано по уменьшению интенсивности испускания 7AAMD во время инкубации.

Первая стадия (al) этого процесса происходит быстро - в течение нескольких секунд после добавления ДНК, т. е. за "мертвое время " прибора. В случае избыточного количества ДНК кинетика содержит две компоненты -4.5 сек. и 101 сек с соотношением амплитуд 1.7 (таблица 2). В данном эксперименте медленная компонента (а2) имеет более высокую амплитуду.

При этом отмечалось, что чем выше концентрация ДНК, тем быстрее I происходит процесс перемещения. На основании этого можно предположить, что при столкновении комплексов 7AAMD-HP1 с ДНК происходит миграция актиномицина на сайты связывания ДНК двух типов. Увеличение ионной силы раствора (таблица 2) приводит к сокращению вклада первой компоненты кинетики в 1.8 раз, в то время как вклад медленной фазы остался почти неизменным. Это дает основание для предположения о том, что первая фаза процесса перемещения антибиотика происходит с участием ионных и полярных взаимодействий. На основании результата этой экспериментальной модели in vitro можно рассматривать шпилечный олигонуклеотид как потенциальный переносчик актиномицинов в клетке по направлению к ДНК.

Таблица 2. Быстрая и медленная фазы кинетики испускания 7AAMD при связывании с ДНК, НР1 и при перемещении с HP 1 на ДНК.

иьразец t1 (сек) VI (сек) а2/а1

7AAMD + НР1 0.3* - -

7AAMD и НР1 + ДНК 0.3* - -

7AAMD + ДНК 4.6 40 0.3

7AAMD и НР1 + ДНК 4.5 101 1.7

7AAMD, NaCI и НР1 + ДНК 4.9 147 3.5

* - данные, .полученные методом флуоресцентного "stoped-flow."

Г ьии 500 400 ЗОС 200 100 0 0

/

I 1 1 3 100 200 300 40 сек.

4. Стэкннговое л пестэкннговое связывание актлномпцпнов с ДНК в растворах и пленках.

При сравнительном спектральном изучении раствора и пленки комплекса ДНК с актиномицином обнаружено очень значительное уменьшение коэффициентов экстинкции в пленке по сравнению с раствором (степень гипохромизма 78%). Это объясняется резким увеличением степени конденсированности системы, выраженными межхромофорными взаимодействиями , эффектом сита. Аналогичный эффект показан и для комплекса ДНК с этидием бромидом.

Сравнительное исследование флуоресцентных свойств раствора и пленки комплекса показало, что при конденсации в пленку происходит падение интенсивности испускания в 44 раза (даже с учетом гипохромизма). Такое резкое падение квантового выхода комплекса в пленке по сравнению с раствором можно объяснить формированием стэкингового комплекса, характеризующегося плотной упаковкой феноксазонового хромофора между нуклеотидами, что создает условия для очень эффективной дезактивации возбужденного хромофора азотистыми основаниями нуклеотидов.

2-

1-

240 270 300 450 500 550 600 650

I

Рис. 8. Нормированные при 300 нм спектры возбуждения флуоресценции:

1 - раствора комплекса ДНК-7ААЖ>

2 - пленки комплекса ДНК-7ААМО.

В спектре возбуждения флуоресценции пленки присутствует ярко выраженная нуклеотидная полоса, что свидетельствует о формировании комплекса по типу стэкинга (рис. 8). Стэкинговая интеркаляция феноксазонового хромофора параллельно азотистым основаниям ДНК на расстоянии в несколько ангстрем создает условия для эффективного обменного переноса энергии на него. В растворе комплекса переноса энергии и интеркаляции не наблюдается.

Феноксазоновый хромофор 7ААМБ в пленке ДНК находится в плотном окружении азотистых оснований, оказывающих сильное тушащее действие на его флуоресценцию. Об этом свидетельствует также чрезвычайно малое время жизни флуоресценции 7ААМО в пленке комплекса - 0.4 не. Упаковка комплекса в пленке характеризуется такой плотностью, что азотистые основания в комплексе с феноксазоновым хромофором становятся очень эффективными тушителями; происходящие при этом значительные изменения положения дипольных моментов перехода ведут к резкому изменению значения поляризации флуоресценции (таб. 3).

Таблица 3. Флуоресцентные свойства комплекса ДНК-7ААМП> в пленке и растворе.

Объект г (не) Р Q(%) N

7ААМО-ДНК пленка 0,4 ±0,1 0,16 70 4

7AAMD-ДНК раствор 1,9 ±0,1 0,45 3 0,06

В пленке резко возрастает эффективность переноса энергии (Q) и количество донирующих этот перенос нуклеотидов (N) (в растворе эти значения почти равны нулю)

Существуют принципиально различные пути формирования структуры комплекса ДНК-7ААМЕ) в растворе и в пленке. При конденсации в пленку происходит такое перераспределение связей и преобразование групп атомов, ответственных за взаимодействие, которое создает условия для формирования жесткого стэкингового интеркаляционного комплекса. Проведен сравнительный анализ различий комплексообразования с ДНК в растворе и пленке актиномицина и этидия бромида. На его основании можно заключить, что 7AAMD в пленках ДНК является даже гораздо более эффективным интеркапятором, чем бромистый этидий в растворе и пленках. Можно ожидать различий актиномицинового эффекта и в случае взаимодействия со "свободной" цито(карио)плазматической и конденсированной ядерной ДНК в клетке,

Как было установлено, 7AAMD является полным комплексообразующим аналогом AMD для шпилечных олигонуклеотидов Данные о преимущественном связывании 7AAMD со шпилечными образованиями ДНК при малых молярных соотношениях (когда не все потенциальные места связывания ДНК насыщены актиномицином) дают основания считать, что актиномицины являются комплексообразующими аналогами в отношении ДНК при таких условиях.

Поставлена задача исследовать различие комплексообразующих свойств 7AAMD и AMD и их способность изменять вторичную конформацню ДНК в случае высококонцентрированных растворов и пленок.

На основе разработанных к настоящему времени ИК-спектроскопических критериев различных конформаций ДНК [Tsuboi М. 1965, Ito К. 1970, Sukhorukov В. 1.1900, 1994.] проведен анализ информационного состояния ДНК в пленках комплексов с актиномицинами.

0.5.

Рис. 9. Спектры ИК поглощения пленки нативной ДНК (а) и пленки комплекса ДНК-АМО (б) при о. в. 75%.

1800 ¡500 1200 900

Из сопоставления ИК спектров пленок комплексов со спектрами ДНК в двухспиральном и расплетенном состояниях (рис.9, 10) видно, что полоса поглощения двухспиральной ДНК 1712 см"' наблюдается в спектре пленки ДНК-AMD (рис.9(б) и отсутствует в спектре пленки ДНК-7ААМО (рис. 10(6). ИК-спектроскопические критерии в области сахаро-фосфатного остова также свидетельствуют о том, что ДНК в пленке с 7AAMD существует преимущественно в расплетенной форме, а в пленке с AMD - в двухспиральной конформации, со спектральными показателями, характерными для В-формы ДНК.

В растворе комплексов в D2O обнаружено такое же влияние этих актиномицинов на вторичную структуру ДНК.

В растворе и пленке комплекса ДНК-7ААМО нарушена двухцепочечная структура, молекула ДНК находится преимущественно в однонитевом состоянии (рис. 10, 11). Об этом свидетельствует отсутствие выраженного пика поглощения стопки азотистых оснований! В растворе и пленке комплекса ДНК-АМО молекула ДНК сохраняет нативное двуспиральное состояние (рис 10, 11). Это означает, что при достаточно высокой концентрации 7AAMD (1 на 10 нуклеотидов) этот флуоресцентный зонд не является полным аналогом АМД.

Рис. 10. Спектры ИК поглощения пленки денатурированной ДНК (а) и пленки комплекса ДНК-7ААМЕ) (б) при о. в. 75%.

1800

1500

1200

900

1 -

о -

Рис. 11 .Нормированные спектры ИК-поглощения растворов комплекса ДНК-АМБ (а) и ДНК-7ААМБ (б) вБ20.

1800 1650 1500 1350

см"'

Существуют принципиально различные способы формирования структуры комплекса ДНК-7ААМЕ) в растворе и в пленке. При конденсации в пленку происходит формирование стэкингового интеркаляционного комплекса ДНК-7ААМО, в то время как в растворе это комплексообразование не сопровождается стэкингом феноксазонового хромофора и азотистых оснований ДНК.

5. Моделирование пуклеотпдного окружения аклшомнцннов в комплексах с ДНК.

Проведен анализ спектральных параметров 7AAMD в различных растворителях, различающихся по степени гидрофобноста, полярности, тушащему флуоресценцию действию. Из анализа этих данных следует, что 7AAMD в комплексах с ДНК и НР1 имеет минимальные различия флуоресцентных параметров (изменение квантового выхода, положение максимумов спектров испускания и возбуждения, полуширина спектров) с его раствором в пиридине (по сравнению с другими растворителями). Полученные данные дают основание утверждать, что в комплексе" с ДНК и шпилечным олигонуклеотидом актиномицин находится в довольно плотном окружении азотистых основании. Формирование этого комплекса характеризуется глубоким проникновением флуоресцирующего феноксазонового хромофора в структуру нуклеиновой молекулы.

Показано, что амплитуда испускания флуоресценции 7AAMD в тяжелой воде примерно в 3 раза выше, чем НгО; в 1.5 раза выше в CzDjOD, чем в CjHjOH и практически неизменна при замене бензола на дейтерированный бензол. Бензол, также как и азотциклические основания ДНК обладает низкой способностью к формированию водородных связей по донорно-акцепторному механизму. Полученные данные с дейтерированными растворителями подтверждают высокую гидратационную способность актиномицина и то, что образование водородных связей в комплексах с ДНК происходит в значительной степени с молекулами воды в составе комплекса, а не только с собственно нуклеиновыми компонентами. :

6. Цитотоксичекое действие актиномициновых комплексов на клетки карциномы Эрлиха.

Известный факт подавления бактерицидной функции актиномицинов после предварительного добавления к ним ДНК [Kersten W. 1960, Wheeler G. 1962] воспроизведен в данной работе в отношении клеток асцитной карциномы Эрлиха (рис. 12).

Совершенно противоположный результат был получен при использовании комплекса актиномицина D со шпилечным олигонуклеотидом НР1. При инкубировании клеток в среде с таким комплексом гибель клеток карциномы Эрлиха возрастала почти в 4 раза (рис. 12). Эти результаты дают основание рассматривать подобного рода шпилечные олигонуклеотиды как перспективные эффективные трансмембранные переносчики актиномицина.

Количество погибших клеток, %

щ

Шш

ж

20%

[ШЗтИ

3 А S в

Варианты эксперимента

Рис. 12.

Цитотоксическое действие

актиномицииовых комплексов на клетки карциномы Эрлиха.

Методом флуоресцентной микроскопии показано, что свободный 7-аминоактиномицин D концентрируется на наружной поверхности и в толще плазматической мембраны. В случае же применения его комплекса с НР1 показано интенсивное тотальное прокрашивание антибиотиком ядерных структур клеток. Эти данные коррелируют с данными о смертности клеток в опытах с нефлуоресцирующим актиномицином D.

Выводы:

1. Установлена способность акпгномицина D формировать устойчивый комплекс с молекулами гуанина и разрушать их агрегаты. Флуоресцирующий аналог актнномицина D, содержащий дополнительную аминогруппу в положении 7 хромофора не обладает этой способностью. Наличие аминогруппы, таким образом, влияет на комплексообразующую способность актнномицина. Эти актиномицины не способны формировать комплекс с поли-G, не проявляют особой специфичности к связыванию с участками полинуклеотидов, содержащих остатки гуанина.

2. Показано, что 7 - аминоактиномицин D не является флуоресцентным зондом-интеркалятором; не встраивается по стэкинговому типу ни в агрегаты гуанина, ни между азотистыми основаниями НР1 и ДНК.

3. Установлено, что молекула 7-аминоактиномицина1 D эффективно конкурирует с AMD за связывание с олигонуклеотидом НР1 и является адекватным аналогом природного антибиотика при взаимодействии с этой шпилечной структурой. Исследована кинетика взаимодействия антибиотика с НР1 и определены характеристические времена комплексообразования.

4. В процессе комплексообразования ДНК с 7-аминоактиномицином D выявлены две фазы взаимодействия отличные по временным параметрам. Высказано предположение, что быстрая фаза взаимодействия обусловлена связыванием антибиотика со шпилечными образованиями ДНК и что актиномицин обладает к ним более высоким сродством, чем к другим местам связывания. Установлено, что молекула 7- аминоактиномицина D способна перемещаться с отдельного шпилечного олигонуклеотида НР1 на ДНК. НР1 способен выполнять функцию переносчика актиномицинов на ДНК.

5. Показано, что микроокружение феноксазонового хромофора актнномицина в комплексе с ДНК аналогично его микроокружению в растворе 7AAMD в пиридине. Следовательно, в комплексообразования антибиотка с ДНК могут участвовать азотистые основания ДНК. Кроме того, в состав комплекса ДНК-актиномицин входят молекулы воды, оказывающие непосредственное гидратирующее действие на молекулу антибиотика и структурообразующее действие на комплекс.

6. Показаны принципиальные различия способов формирования структуры комплекса ДНК с 7-аминоактиномицином D в растворе и в пленке. В пленке происходит формирование прочного стэкингового интеркаляционного комплекса, в то время как в растворе это комплексообразование не сопровождается стэкингом. В растворе и пленке комплекса ДНК-7ААМО нарушена двухцепочечная структура, молекула ДНК находится преимущественно в однонитевом состоянии. В растворе и пленке комплекса ДНК-AMD молекула ДНК сохраняет нативное двуспиральное состояние.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Савинцев И.В., Векшин Н.Л. "Нестэкинговое связывание 7-аминоактиномицина D и актиномицина D с ДНК и модельными нуклеотвдными системами в растворах". Журнал молекулярной биологии, 2002 г., том 36, № 4., с. 725-730.

2. Vekshin N., Savintsev I,, Kovalev A., Yelemessov R., Wadkins R. "Solvatochromism of the excitation and emission spectra of 7-aminoactinomycin D: implications for drug recognition of DNA secondary structures". Journal of physical chemistry. B. (USA) 2001, V. 105, p. 8461-8467.

3. Савинцев И.В., Векшин Н.Л. "Формирование комплексов актиномицинов с ДНК в растворе и пленках". Журнал "Прикладная биохимия и микробиология", №3,2004 г.

4. Савинцев И.В., Елемесов Р.Е., Ковалев А.Э., Измайлов Ю.Е., Векшин Н. Л., Вадкинс Р. "Стабилизация нуклеотид-актиномициновых комплексов". Сборник тезисов VIII Зимняя международная молодежная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва, Институт биоорганической химии,7-9 февраля 2001 г.

5. Савинцев И.В., Ковалев А.Э., Векшин Н. Л. "Механизм формирования ДНК-актиномициновых комплексов". Сборник тезисов V конференции молодых ученых г. Пущино "Биология - наука 21 века". 16-20 апреля, Пущино, 2001 г.

6. Шаталин Ю.В., Савинцев И.В., Векшин Н.Л. "Неинтеркаляционное связывание актиномицина D с ДНК и модельными структурами". Сборник тезисов VI конференции молодых ученых г. Пущино "Биология - наука 21 века". 20-24 мая, Пущино, 2002 г.

7. Vekshin N., Kovalev A., Smirnov Е., Savintsev I., Yelemesov R., Graves D.E., Wadkins R.M. "Forces Stabilizing the Complex Formed between 7-Aminoactinomycin D and DNA Hairpin: Solvatochromism and NMR Studies". Biophysical Journal, 80,487a., 2001

Типография ИМАШ РАН, г. Москва, М. Харитоньевский пер., 4

Лиц. ГШ № 00492 от 12.04.2000

Зак. № э К от 40. ОТ- 200^ тир. 400 экз.

г

РНБ Русский фонд

2007-4 18438

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савинцев, Иван Витальевич

страницы

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. История открытия и изучения молекулярной структуры актиномицинов.

1.2. Механизм комплексообразования актиномицинов с ДНК.

1.2.1. Интеркаляционная модель комплексообразования.

1.2.2. Модель "поверхностного встраивания.".

1.2.3. Взаимодействие актиномицинов с одноцепочечными олиго- и полинуклеотидами.

1.3. Физиологическое действие и фармакологическое использование актиномицинов.

1.4. Фазово-модуляционная и поляризационная спектроскопия

- методы изучения веществ при микромолярных концентрациях.

1.5. ИК-спектроскопическое изучение комплексов ДНК с биологически активными веществами.Г.35"

Экспериментальная часть.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Используемые вещества.

2.2. Приготовление растворов.

2.3. Абсорбционная спектроскопия.

2.4. Стационарная флуоресцентная спектроскопия.

2.5. Фазово-модуляционная и поляризационная спектроскопия.

2.6. Методика сравнительного спектроскопического анализа пленок и растворов комплексов.

2.7. Методика флуоресцентного "stopped-flow".

2.8. Оценка переноса энергии фотовозбуждения и определение размеров флуорофоров

2.9. Исследование цитотоксического действия актиномициновых комплексов.

Результаты и их обсуждение.

Глава 3. Взаимодействие актиномицинов с гуанином и полигуаниловой кислотой.

3.1. Изучение способности к комплексообразованию актиномицинов с агрегатами гуанина и полигуаниловой кислотой в растворе.

3.2. Флуоресцентные свойства комплексов

7-аминоактиномицина с гуанином и полигуаниловой кислотой.

Глава 4. Способность актиномицинов к формированию интеркаляционного комплекса с ДНК и шпилечным олигонуклеотидом НР1 в растворе.

Глава 5. Комилексообразование и перемещение актиномицинов в нуклеотидных системах в растворе.

Глава 6. Стэкинговое и нестэкинговое связывание актиномицинов с ДНК в растворах и пленках.

6.1. Оптические свойства и структура пленок ДНК-7ААМО и ДНК-EtBr.

6.2. Флуоресцентные параметры растворов и пленок комплексов.

6.3. ИК-спектроскопические исследование пленок комплексов.

Глава 7. Моделирование нуклеотидного окружения актиномицинов в комплексах с ДНК.

Глава 8. Цитотоксичекое действие актиномициновых комплексов на клегки карциномы Эрлиха.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Спектроскопическое изучение ДНК-актиномициновых комплексов"

Антибиотики актиномицинового ряда в течение нескольких десятилетий используются в медицинской практике для лечения инфекционных и опухолевых заболеваний [1,2]. Такое применение основано на способности актиномицинов формировать устойчивый комплекс с молекулой ДНК, ингибировать РНК-полимеразную реакцию и, таким образом, подавлять биосинтез белка, рост клеток и тканей.

Актиномицины являются эффективными противоопухолевыми препаратами. Кроме того, существуют данные о том, что актиномицины -эффективные пролонгаторы жизненного цикла животных организмов [3]. Однако их медицинское использование имеет существенные ограничения, связанные с побочным токсическим действием на организм [1, 4 ]. Не сформировано однозначного представления о механизме взаимодействия актиномицинов с ДНК и структуры формирующегося комплекса; существуют лишь противоречивые модели [4, 5, 6]. Вероятно, это является причиной того, что до сих пор не разработаны способы направленной доставки препарата в клетки на уровне организма и отсутствуют методы снижения токсического действия. Неполное понимание молекулярных основ ДНК-актиномицинового взаимодействия препятствует поиску путей повышения фармакологического статуса препарата.

Детальное изучение механизма комплексообразования актиномицинов с ДНК и его зависимости от физико-химических условий является практическим шагом к поиску эффективных молекулярных переносчиков, пролонгаторов физиологического действия, ингибиторов токсического эффекта; а также это необходимо для оптимизации терапевтических дозировок и схем применения. Только на основании полного представления о клеточном и молекулярном механизме действия актиномицина, на понимании его зависимости от состояния ДНК и клетки возможна оптимизация медицинского использования актиномициновых препаратов.

Для изучения ДНК- актиномициновых взаимодействий представляется важным сделать акцент на исследовании комплексов, формирующихся при малых (терапевтических) концентрациях лиганда, а также зависимости комплексообразования от агрегатного состояния ДНК. Это требует использования высокочувствительных методов, в первую очередь, спектроскопических.

Методологической новизной данной работы является применение комплекса спектроскопических методов (абсорбционная спектроскопия в УФ, видимой и ИК-областях; стационарная, фазово-модуляционная, поляризационная и «stopped-flow» флуоресцентная спектросокпия). Впервые проводится сравнительный анализ комплексообразования актиномицина с растворенной и конденсированной (в пленках) ДНК. Кроме ДНК, используется ряд модельных нуклеотидных систем в сочетании с применением флуоресцирующего аналога актиномицина.

Впервые для анализа интеркаляционной способности актиномицина (одной из основных характеристик механизма комплексообразования) используется высокочувствительный метод декстеровского обменного переноса энергии.

Целью работы является спектроскопическое изучение механизма комплексообразования ДНК с актиномицином в растворе и пленках, мест встраивания актиномицина и свойств формирующегося комплекса, а также поиск возможных способов направленной доставки актиномицина в клетку к ядерной ДНК.

Задачи работы:

1. Исследовать комплексообразующую способность актиномицинов в отношении агрегатов гуанина и полигуниловой кислоты как системы, моделирующией участки ДНК, обогащенные остатками гуанина.

2. Определить способность актиномицина к формированию интеркаляционного комплекса с ДНК, шпилечным олигонуклеотидом, полигуаниловой кислотой.

3. Сравнить комплексообразующие свойства актиномицина D и его флуоресцентного аналога 7-аминоактиномицина D в отношении полигуаниловой кислоты, гуанина и шпилечного олигонуклеотида НР1.

4. Оценить сродство актиномицина к шпилечным образованиям ДНК и способность шпилечных структур выполнять функцию переносчика актиномицина.

5. Определить характер молекулярного окружения актиномицина в комплексе с ДНК, наличие в нем молекул воды и значение водородных связей.

6. Провести сравнительный анализ механизма комплексообразования актиномицина с растворенной ДНК и с ДНК, конденсированной в пленку.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Савинцев, Иван Витальевич

Выводы:

1. Установлена способность актиномицина D формировать устойчивый комплекс с молекулами гуанина и разрушать их агрегаты.Флуоресцирующий аналог актиномицина D, содержащий дополнительную аминогруппу в положении 7 хромофора не обладает этой способностью. Наличие аминогруппы, таким образом, влияет на комплексообразующую способность актиномицина. Такие актиномицины не способны формировать комплекс с поли-G, не проявляют особой специфичности к связыванию с участками полинуклеотидов, содержащих остатки гуанина.

2. Показано, что флуоресцирующий 7 - аминоактиномицин D не является зондом-интеркалятором; не встраивается по стэкинговому типу ни в агрегаты гуанина, ни между азотистыми основаниями HPI и ДНК.

3. Установлено, что молекула 7-аминоактиномицина D эффективно конкурирует с AMD за связывание с олигонуклеотидом НР1 и является адекватным аналогом природного антибиотика при взаимодействии с этой шпилечной структурой. Исследована кинетика взаимодействия антибиотика с НР1 и определены характеристические времена комплексообразования.

4. В процессе комплексообразования ДНК с 7-аминоактиномицином D выявлены две фазы взаимодействия, отличные по временным параметрам. Высказано предположение, что быстрая фаза взаимодействия обусловлена связыванием антибиотика со шпилечными образованиями ДНК и что актиномицинн обладает к ним более высоким сродством, чем к другим местам связывания. Установлено, что молекула 7- аминоактиномицина D способна перемещаться с отдельного шпилечного олигонуклеотида НР1 на ДНК. НР1 способен выполнять функцию переносчика актиномицинов на ДНК.

5. Показано, что микроокружение феноксазонового хромофора актиномицина в комплексе с ДНК аналогично его микроокружению в растворе 7AAMD в пиридине. Следовательно, в комплексообразовании антибиотка с ДНК могут участвовать азотистые основания ДНК Кроме того, в состав комплекса ДНК-актиномицин входят молекулы воды, оказывающие непосредственное гидратирующее действие на молекулу антибиотика и структурообразующее действие на комплекс.

6. Показаны принципиальные различия способов формирования структуры комплекса ДНК с 7-аминоактиномицином D в растворе и в пленке. В пленке происходит формирования жесткого стэкингового интеркаляционного комплекса, в то время как в растворе это комплексообразование не сопровождается стэкингом. В растворе и пленке комплекса ДНК-7ААМО нарушена двухцепочечная структура, молекула ДНК находится преимущественно в однонитевом состоянии. В растворе и пленке комплекса ДНК-AMD молекула ДНК сохраняет нативное двуспиральное состояние

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савинцев, Иван Витальевич, Пущино

1. Планельес X. X. 1962. Аураптин — противоопухолевыйантибиотический препарат из группы актиномицинов. М.: Мир, 234.

2. Терентьева Т.Г.//Хим.-фармацевт. Журн. 1977. т. 11. с. 143-146.

3. Фролькис В. В. 1988. Старение и увеличение продолжительности жизни. Ленинград: Наука, 237 с.

4. Сазыкин Ю. О. 1965. Биохимические основы действия антибиотиков на микробную клетку.М. "Наука". С. 212-239.

5. Егоров I I. С., Силаев А. Б., Катруха Г. С. 1987. Антибиотики —полипептиды. Под ред. Егорова Н. С. М.: МГУ, с. 159 204.

6. Гурский Г. В. 1969. Структура комплекса ДНК- актиномицин. //Молекуляр. биология. 3, 749-756.

7. Waksman S. Actinomycins-nature, production, activities.!I Rev. Soc. Мех Hist Nat. 1969. V.30. P.301-306.

8. Frei E. The clinical use of actinomycin. //Cancer Chemother. Rep. 1974. Jan-Feb V. 58-1. P. 49-54.

9. Максимова Т. С., Ковшарова И. Н.// Антибиотики. 1964. Т. 9. С. 110-115.

10. Виноградова К. А., Полторак В.А., Петрова Л.И., Силаева А.Б.// Антибиотики. 1970. Т. 15. С. 718-721.

11. Кузнецов В. Д., Полторак В. А., Филиппова С. Н.//Антибиотики. 1973. Т. 18. С. 428-431.

12. Bostian М, McNitt К, Aszalos A, Berdy J. Antibiotic identification: a computerized data base system. J Antibiot (Tokyo) 1977 Jul 30:7 633-4.

13. Haese A, Keller U. Genetics of actinomycin С production in Streptomyces chrysomallus. J Bacteriol 1988 Mar 170:3 1360-8.

14. Шапошников В. H., Нефедова М.В. 1962. Аурантин. М., с. 15-25.

15. Sivak A, Van Duuren В. Studies with carcinogens and tumor-promoting agents109in cell culture. // Exp Cell Res 1968 Mar 49:3 572-83.

16. Keller U. Actinomycin synthetases. Multifunctional enzymes responsible for the synthesis of the peptide chains of actinomycin. J Biol Chem. 1987. Apr. V. 25-12 P. 5852-5866.

17. Muxfeldt H, Shrader S, Hansen P, Brockman H. The structure of pikromycin. Hi. Am. Chem. Soc. 1968. Aug. V. 14-17 P. 4748-4749.

18. Теренин A.H. Фотоника молекул красителей. Л., Наука, 1967.

19. Савинцев И. В., Векшин Н. Л. Нестэкипговое связывание 7-амино-актиномицина D и актиномицина D с ДНК и модельными нуклеотидными системами в растворах. //Молекуляр. биология. 2001.Т.36. Р. 725- 730.

20. Paoletti J., Le Recq J.-B. Resonance energy transfer between ethidiumbromide molecules bound to nucleic acids. Does intercalation wind or unwind the DNA helix? Hi. Mol. Biol. 1971.59,43-51.

21. Goldberg H., Reich E. Actinomycin inhibition ofRNA synthesis directed by DNA.II Federal Proc. 1964. 23, 5, 958-964.

22. Jain SC, Sobell HM. Stereochemistry of actinomycin binding to DNA. I. Refinement andfurther structural details of the actinomycin-deoxyguanosine crystalline complex.// J. Mol. Biol. 1972. Jul. V.14- 68:1. P. 1-20.

23. Sobell HM, Jain SC. Stereochemistry of actinomycin binding to DNA. II. Detailed molecular model of actinomycin-DNA complex and its implications. //J. Mol. Biol. 1972. Jul. V. 14 68:1. P. 21-34.

24. Sobell HM, Jain SC, Sakore TD, Nordman CE. Stereochemistry of actinomycin-DNA binding. //Nat. New. Biol. 1971. Jun. V. 16- 231:24. P. 200-205.

25. Pigram WJ, Fuller W, Hamilton LD. Stereochemistry of intercalation: interaction of daunomycin with ZW/f.//Nat. New. Biol. 1972. Jan. V. 5- 235:53 P. 17-19.

26. Wadkins R. M., Jovin Т. M. Actinomycin D and 7- aminoactinomycin Dbinding to single-stranded DNA. II Biochemistry. 1991.V. 3. P. 9469-9478.

27. Vekshin N., Savintsev I., Kovalev A., Yelemessov R., Wadkins R . Solvatochromism of the Excitation and Emission Spectra of 7-Aminoactinomycin D: Implications for Drug Recognition of DNA Secondary

28. Structures. //J.Phys.Chem.: B. 2001. V. 105. P. 8461-8467.

29. R. M. Wadkins, B. Vladu, C. Tunng. Actinomycin D Binds to Metastable Hairpins in Single-Stranded DNA. //Biochemistry. 1998. V. 37. P. 1191511923.

30. R. M. Wadkins, C. Tunng, P. M. Vallone, A. S. Benight. The role of the loop in binding of an Actinomycin D Analog to Hairpins formed by Single-Stranded DN.,11 Archives of Biochemistry and Biophysics. 2000. V.384. P. 199-203.

31. Muller W, Crothers DM. Studies of the binding of actinomycin and related compounds toDNA.ll. Mol. Biol. 1968. Jul. V. 28-35:2. P. 25190.

32. Морошкина E. Б., Юдина И.Г., Кривцова M. А., Глибин E. Б. Взаимодействия ДНК с амидами актиноцича, содержащими в амидных группах радикалы с катииоидиыми центрами. II Молекулярная биология. 2000. Т. 34. С. 448-455.

33. Морошкина Е. Б., Юдина И.Г., Кривцова М. А., Глибин Е. Б. Взаимодействие ДНК с амфолитами на основе актиноцина Н Молекулярная биология. 1998. Т. 32. С. 652-656.

34. Krugh Т. Association of actinomycin D anddeoxyribodinucleotides as a model for binding of the drug to DNA. И Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1972. Vol. 69.1. P. 311-314.

35. Schara R., Muller W. Binding of actinomycin С 3 to mono, di, and oligonucleotides II Eur. J. Biochem. 1972. Vol. 29. P. 210-216.

36. Chinsky L., Turpin P.Y.//Nucleic Acids Res. 1978. Vol. 5. P. 2969-2977.

37. Кривцова M. А., Морошкина E. Б., Хамман X., Глибин E. Б., Фрисман Э. В.//Мол. Биол. 1981. Т. 15. С. 613-621.

38. Никитин С.М., Жузе АЛ., Крылов А.С., Готтих Б.П.// Биоорган. Химия. 1980. Т. 6. С. 743-751.

39. Кривцова М. А., Морошкина Е. Б., Глибин Е. Б., Фрисман Э. В.// Мол. Биол. 1982. Т. 16. С. 149-155.

40. Kersten W., Kersten Н., Szybalcky W. Physiochemicalproperties of complexes between deoxyribonucleic acids and antibiotic which effect ribonucleic acid synthesis. //Biochemistry. 1966. V.5-1. P. 236-244.

41. Пермогоров В. И., Прозоров А. А., Шемякин М. Ф., Лазуркин Н. С., Хесин Р. Б. О механизме подавления актиномицином биологической активности ДНК. "Наука" Сб. "Молекулярная физика" 1965. С. 162-180.

42. F. М. Chen, С. М. Jones, Q. L. Johnson. Dissociation kinetics of actinomycin D from oligonucleotides with hairpin motifs. Biochemistry. 1993. V. 32. P. 5554-5559.

43. R. Bittman, L. Blau. Stopped-flow kinetic studies of actinomycin binding to DNAs.ll Biochemistry. 1975. V. 14. P. 2138-2145.

44. Д. В. Колесников, A. JI. Жузе, А. С. Заседателев. 1998.ДНК-специфичныенизкомолекулярные соединения. М.: МФТИ, 8 с.

45. Kamitori S, Takusagawa F. Crystal structure of the 2:1 complex between d(GAAGCTTC) and the anticancer drug actinomycin DM J. Mol. Biol. 1992. May. V. 20-225:2. P. 445-56.

46. Veselkov DA, Kodintsev VV, Pakhomov VI, Dymant LN, Davies DB, Veselkov N. 1H-NMR analysis ofheteroassociation of caffeine with antibiotic actinomycin D in the aqueous solution. II Biofizika. 2000. Mar-Apr. V. 45-2. P. 197-206.

47. Hou MH, Robinson H, Gao YG, Wang AH. Crystal structure of actinomycin D bound to the CTG triplet repeat sequences linked to neurological diseases. U Nucleic Acids Res. 2002. Nov. V. 15-30. P. 4910-4917.

48. Сазыкин Ю. О. 1968. Антибиотики как ингибиторы биохимических процессов. М. С.336-377.

49. Сазыкин Ю. О., Борисова Г. Н .Действие специфических ингибиторов на сиитех рибонуклеиновой кислоты в бактериальной клетке, разобщенный с синтезом белка бактериостатическшш антибиотиками. //Антибиотики. 1963. V. 8-4. С. 304-309.

50. Gomatos P., Krug R., Tamm I. Reovirus RNA-directedsynthesis of DNA. II J. Mol. Biol. 1965. V. 13-3. P. 802-816.

51. Chen F.„ ShaJF., Chin K., Chou S. Unique actinomycin D binding to selfcomplementary d(CXYGGCCY'X'G) sequences: duplex disruption and binding to a nominally base-paired hairpin. II Nucleic. Acids Res. 2003. Jul. V. 15-31. P. 4238-4246.

52. Brown P., KurzM., Kearns P., Hsu V. Formation of multiple complexes between actinomycin D and a DNA hairpin: structural characterization by multinuclear NMR. II Biochemistry. 1994. Jan. V. 25-33. P. 651-664.

53. Rill RL, Hecker KH. Sequence-specific actinomycin D binding to single-stranded DNA inhibits HIV reverse transcriptase and other polymerases. И Biochemistry. 1996. Mar. V. 19- 35. P. 3525-3533.

54. Hsieh YL, Li YT, Henion JD, Ganem B. Studies of non-covalent interactions of actinomycin D with single-stranded oligodeoxynucleotides by ion spray mass spectrometry and tandem mass spectrometry. II Biol. Mass. Spectrom. 1994. May. V. 23-5. P. 272-276.

55. SobeIl H. Actinomycin and DNA transcription. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. Aug. V. 82-16. P. 5328-5331.

56. Sinha В., Cox M, Chignell CF, Cysyk RL. Synthesis and biological properties of N2-substituted spin-labeled analogues of actinomycin D.I I J .Med. Chem. 1979. Sep. V. 22-9. P. 1051-5.

57. Sinha BK. Chignell CF. Interaction of antitumor drugs with human erythrocyte ghost membranes and mastocytoma P815: a spin label study. II Biochem Biophys. Res. Commun. 1979. Feb. V. 28-4. P. 1051-1057.

58. Sinha В. Cox M. Stimulation of superoxide formation by actinomycin D and its N2-substituted spin-labeled derivatives. H Mol. Pharmacol. 1980. V. 17. P. 2137.

59. Wheeler G. P., Bennett L. L. Studies related to the mode of action of actinomycin D. II Biochem. Pharmacol. 1962. V. 11. P. 353-370.

60. Крылова А. С. Антибиотики. 1982. Т. 27. С. 221-233.

61. Kersten W., Kersten H., Rauen H. Action of nucleic acids of the inhibition of growth by actinomycin D of Neurospora crasa. Nature. I960., 187., 473. P.60, 61.

62. Kawamata J., Imanishi M. Mechanism of action of actinomycin, ribonucleic acid.ll Nature. 1960. V.187. P. 1112-1113.

63. Kawamata J., Imanishi M. Mechanism ofaction of actinomycin with deoyxiribonucleic acids.ll Biken's J.1961.V. 4-1. P. 13-24.

64. Fraccaro M., Mannini A., Tiepolo L., Albertini A. Incorporation of tritium-labelled actinomycin in human cell line. II Exptl. Cell. Res., 1966. V. 43. 1. 136-147.

65. Kawamata J., Okudaira M., Akamatsu Y. Autografic studies on the intracellular distribution of H3- actinomycin S in TG-cells. II Biken's J. 1965.V.8.3. P. 119-127.

66. Bingman G., Sporn C., Actinomycine D and hydrocortisone: intracellular binding in rat liver. II Science. 1965. V. 49. P. 1251-1254.

67. Becker FF, Margolis AA, Troll W. In vivo complex formation of actinomycin D and deoxyribonucleic acid. //Nature. 1966. Jul. V. 2-44. P. 84-5.

68. Gellert M., Smith C., Neville D. Actinomycin binding to DNA: mechanism and specificity II. J. Mol. Biol. 1965. V.l 1- 3. P. 445-457.

69. Goldberg I., Rabinowitz M. Reich E. Basis on actinomycin action. I I Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1962. V.48-12. P. 2094-2101.

70. Kersten W. Interaction of actinomycin С with constituents of nucleic acids. Biochem. et. Biophys. Acta. 1961.47. 3. P. 610-611.

71. Scholtissek C., Rott R. Binding of prophlavine to deoxyribonucleic asid and ribonucleic asid and it biologal significance. //Nature. 1964. V. 204 P. 39-43.

72. Semmel M., Huppert. J. Interaction in vitro entre actinomycin D in RNA ribosomes. Biochim. et. Biophys. Acta. 1965. 103. 4. P. 702-704.

73. Reich E. Actinomycin: correlation of structure andfunction of it's complexes with purines and DNA. И Science. 1964. V.l 43. P. 684-689.

74. Tamaoki T. Mueller G. TNe effects of actinomycin D and puromycin on the formation of ribosome in Hela cells. II Biochem. et. Biophys. Acta. 1965.V. 108-1. P. 73-80.

75. Schwartz H., Garofalo M. Degradation of RNA in liver of rats treated with actinomycin D. // Mol. Pharmacol. 1967. Jan. V.3-1. P. 1-8.

76. Khan MM, Lindell TJ. Actinomycin D binds with highest affinity to nonribosomal DNA. //J. Biol. Chem. 1980. Apr. V. 25. P. 3581-3584.

77. Milko E., Egorov N., Vuitsik E. Comparison of the sensitivity of Rhodococcus rubropertinctus R, S and M variants to antibiotic action. II Antibiot. Med. Biotekhnol. 1987. Aug. V. 32-8. P. 576-8.

78. Rusanova E., Alekhov Т., Fedorova G., Katrukha G., Development of a new method for preparing biologically active compounds based on the typed strain Streptomyces werraensis. // Prikl. Biokhim .Mikrobiol. 2000. May-Jun V.36-3.P.312-6.

79. Kim H., Nam J., Han M., Son K., Choi J., Kwon В., Takusagawa H. Huang Y., Takusagawa F., Natural and synthetic analogues of actinomycin D as Grb2-SH2 domain blockers. II Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000. Jul. V. 3 . P. 1455- 1457.

80. Lackner H., Bahner I., Shigematsu N., Pannell L., Mauger A. Structures of five components of the actinomycin Z complex from Streptomyces fradiae, two of which contain 4- chlorothreonine. II J. Nat. Prod. 2000. Mar. V. 63-3. P. 352-356.

81. Amos H., Kuhn A., AndreSchwartz J. Protein synthesis in sonically damaged Escherichia coli. II J. Bacteriol. 1967. Jul. V. 94-1. P. 232-40.

82. Goldstein M., Hamm K., Amrod E. Incorporation of triated actinomycin D into drug-sensitive and drug-resistant HeLa cells. II Science. 1966. Mar. V. 25 -151. P. 1555-1556.

83. Perlman D., Mauger A., Weissbach H. Microbial metabolism of actinomycins and other heterodetic antibiotic peptides. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1966. Aug.V. 23-24. P. 513-8.

84. Perlman D., Mauger A., Weissbach H. Microbial transformations of peptide antibiotics. I. Degradation of actinomycins by Actinoplanes species. Antimicrobial Agents. //Chemother. 1966. V. 6. P. 581-586.

85. Орлова Т. И. Антибиотики. 1980., Т. 25., С. 540-546.

86. Sobell I I., Jain S., Sakore Т., Ponticello G. Concerning the stereochemistry of actinomycin binding to DNA: an actinomycin-deoxyguanosine crystalline complex. II Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol. 1972. V.36. P. 263-270.

87. Papahadjopoulos D., Poste G., Vail W., Biedler J. Use of lipid vesicles ascarriers to introduce actinomycin D into resistant tumor cells. // Cancer. Res. 1976. Sep. V. 36-9. P. 2988-2994.

88. Kedar A., Mayhew E., Moore R., Williams P., Murphy G. Effect of actinomycin D-containing lipid vesicles on murine renal adenocarcinoma. //J. Surg. Oncol. 1980. V. 15-4. V. 363-365.

89. Vugrin D., Whitmore W., Golbey R. Vinblastine, actinomycin D, bleomycin, cyclophosphamide and cis-platinum combination chemotherapy in metastatic testis cancer--a 1-yearprogram. J. Urol. 1982. Dec. V. 128-6.1. V. 1205-1208.

90. Melguizo C, Prados J, Marchal JA, Aranega AE, Alvarez L, Aranega A. Low concentrations of actinomycin D potentially cause therapeutic differentiation in human rhabdomyosarcoma cell line RD.Pathol Res Pract 1996 Feb 192:2 188-94

91. Takusagawa F., Carlson R., Weaver R. Anti-leukemia selectivity in actinomycin analogues. II Bioorg. Med. Chem. 2001. Mar. V. 9-3. P. 719-25

92. Hendrix M., Wagner H., Thomson S., Brothman A., Lindell T. Immunohistochemical localization of actinomycin D in human melanoma tumor cells. II Anticancer Res. 1984. May-Jun. V. 4-3. P. 97-102.

93. Creasey A., Doyle L., Reynolds M., Jung Т., Lin L., Vitt C. Biological effects of recombinant human tumor necrosis factor and its novel muteins on tumor and normal cell lines. II Cancer Res. 1987. Jan. V. 47-1 P. 145-149.

94. Левшин Л. В., Салецкий А. М. 1954. Оптические методы исследованиямолекулярных систем. М. МГУ. С. 134-231.

95. Лакович Дж. 1986. Основы флуоресцентной спектроскопии. М. Мир. С. 262.

96. Badea М., Brand L. Time-resolvedfluorescence measurements. //Methods Enzymol. 1979. V. 61. P. 378.

97. Bailey E., Rollefson R. The determination of the fluorescencelifetimesof dissolved substances by a phase shift method. II J. Chem. Phys. 1953. V. 21. 1315.

98. Muller A., Lumry R., Kokubun H. High-performance phase fluorimeter conctructed from commerciallsubunits. I I Rev. Sci. Instrum. 1965. V. 36. P. 1214.

99. Бонч-Бруевич A. M., Казарин И. M., Молчанов В. А., Широков И. В., Экспериментальный образец фазового флуорометра. И Приборы и техника эксперимента. 1959. №2. С. 53.

100. Bauer R., Rozwadawski М. A new type of fluorimeter. И Bull. Acad. Pol. Sci. Ser. Instrum. 1965. V. 8. P. 365.

101. Vekshin N. L. 2002. Photonics ofBiopolymers. Berlin. Springer. 229 p.

102. Tsuboi M. Infrared ray absorption. //Tanpakushitsu Kakusan Koso. 1965. P. 115-128.

103. Ito K., Shimanouchi T. Vibrational frequencies and modes of alpha-helix. Biopolymers. 1970. V. 9. P. 383-399.

104. Ito K. Katabuchi H. Shimanouchi T. Far-infrared bands of amino-acid residues with -helical and -form conformations. II Nat. New Bio. 1972. Sep. V. 13. P. 42-43.

105. Ito К, Oya M, Shimanouchi T. Far-infrared spectra of copoly(- -amino acids). Biopolymers. 1972. V. 11-6. P. 1137-1148.

106. Hartman K. The infrared spectra of some complexes of metal ions with nucleotides. I I Biochem. Biophys. Acta. 1967. Mar. V. 29. P. 192-195.

107. Hartman K. The structure of water and the stability of the secondary structure in biological molecules. An infrared and proton magnetic resonance study. //J. Phys. Chem. 1966. Jan. V. 70-1. P. 270-276.

108. Векшии H. JI. Миграция энергии в ДНК, оцениваемая по флуоресценции интеркалирующего красителя. И Журнал прикладнойспектроскопии. 1998. Т. 65. С. 794-798.

109. Шабарчина Л. И., Монтрель М. М., Сухоруков Г. Б., Савинцев И. В., Сухоруков Б. И. Получение мультислойных пленок ДНК-катионный амфифил методом последовательной адсорбции исследование их структуры. II Журнал физической химии. 2000. Т. 74. С. 2093-2100.

110. Векшин Н. Л. 1988. Фотоника биологических структур. Пущино: ОНТИ. НЦБИ АН СССР. 17 с.

111. Wadkins R. М., Vladu В., Tunng С. Actinomycin D Binds to Metastable

112. Hairpins in Single-Stranded DNA. //Biochemistry. 1998. V.37. P. 1191511923.

113. Wadkins R. M., Tunng C., Vallone P. M., Benight A. S. 2000. The role of the loop in binding of an Actinomycin D Analog to Hairpins formed by Single-Stranded DNA. 11 Archives of Biochemistry and Biophysics. V. 384. P. 199203.

114. Brown C., Shafer R. Kinetic studies of actinomycin D binding to mono-, oligo-, and polynucleotides. II Biochemistry. 1987. V. 26. P. 277-282.

115. Lu K., Prohovsky E., Van Zandt A. Vibrational modes of A-DNA,

116. B-DNA, and A-RNA backbones: an application of a green-function refinement procedure. Biopolymers 1977. V. 16. P. 2491-2506.

117. Sukhorukov В. I., Montrel' M.M. Infrared and X-ray diffraction study of the effect ofprotonationof DNA on its B-to-A transition II Biosens.

118. Bioelectron. 1990. V.ll. P. 913-922.

119. Химическая энциклопедия. 1988. Гл. ред. Кнунянц И. Л. М. Советская энциклопедия, с. 78.

120. Sukhorukov G. В., Feigin L. A., Montrel М. М., Sukhorukov В. I. Х-гау and infrared study ofLangmiur-Blodgett films of the complexes between nucleic acids and aliphatic amines. II Thin Solid Films. 1994. V. 259. P. 79.

121. Борисова О.Ф., Суровая А.Н. Применение флуоресцирующих красителей для изучения структуры нуклеиновых кислот. Молекулярная биология. Т. 1. "Физические методы в молекулярной биологии". Итоги науки и техники. М. 1973. С.141-189.

122. Полетаев А.И. Круговой дихроизм комплексов ДНК. Молекулярная биология. Т. 8. 4.2 "Физические методы в молекулярной биологии". Итоги науки и техники. М. 1976. С. 180-242.