Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование ДНК-актиномициновых комплексов при низких концентрациях методами флуоресцентной спектроскопии
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика
Автореферат диссертации по теме "Исследование ДНК-актиномициновых комплексов при низких концентрациях методами флуоресцентной спектроскопии"
/
На правах рукописи
КОВАЛЕВ АЛЕКСАНДР ЭДУАРДОВИЧ
ИССЛЕДОВАНИЕ ДНК-АКТИНОМИЦИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ПРИ НИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ МЕТОДАМИ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
03.00.02 - Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Пущино 2005
Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН, г. Пущино.
Научный руководитель: доктор биологических наук,
Векшин Николай Лазаревич
Официальные доктор физико-математических наук,
оппоненты: Акатов Владимир Семенович
доктор биологических наук, Зинченко Валерий Петрович
Ведущая организация: Институт биохимической физики
РАН, г Москва
Защита диссертации состоится «¿18 » ^-¿-е^г-^с^Ср 2005 г. в ¿£^часов на заседании Диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ул. Институтская, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московской области, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН
Автореферат разослан " 2005 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д 002.093.01 кандидат физико-математических наук
Н.Ф. Ланина
■//£30
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Актиномицины - группа антибиотиков, образуемых различными актиномицетами, обладающих антибиотическим действием против грамположительных бактерий и некоторых грибов. Антимикробные свойства актиномицина нашли применение в биохимических и микробиологических исследованиях. В медицинской практике из актиномицинов широкое применение получил только актиномицин Д (АМД). Именно поэтому главным объектом исследования данной работы является актиномицин Д АМД успешно применяется в противоопухолевой терапии с сороковых годов прошлого столетия и по сей день. Применяют АМД самостоятельно или, чаще, в сочетании с другими лекарственными средствами (например, с адриамицином) и лучевой терапией при различных саркомах, хориокарциноме матки, опухоли Вильмса, опухоли Юинга, злокачественных опухолях яичка, лимфогранулематозе, при комбинированной химиотерапии диссеминированной меланомы и других опухолях. Действие АМД основано на том, что он прочно связывается с ДНК, блокируя, тем самым, полимеразную активность. АМД и его производные способны блокировать обратную транскриптазу вируса иммунодефицита человека, специфически связываясь с одноцепочечными ДНК, ДНК/РНК гибридами. Недавно обнаруженная способность актиномицина специфически связываться с ЦТГ/ЦАГ повторами [М.-Н Нои, 2002] позволяет надеяться, что актиномицин найдет свое применение и при лечении ряда наследственных неврологических заболеваний' болезни Хутингтона, миотонической дистрофии, спиноцеребралыюй атаксии, миотонической атрофии спинного и продолговатого мозга.
Лечебные концентрации АМД в организме лежат в микро- и субмикромолярном диапазоне При таких концентрациях наиболее рационально использование флуоресцентных методов. Уместно использование флуоресцентных методов и для исследования возможности использования АМД в фотодинамической терапии. Необходимо отметить, что при применении препарата возможны множественные побочные эффекты, вызванные его высокой цитотоксичностью В связи с чем в настоящее время ведётся активный поиск более эффективных в терапевтических целях и менее токсичных производных актиномицинов. Вышесказанное, в контексте роста числа онкологических заболеваний [A. Jemal, 2004], объясняет повышенный интерес к изучению физико-химических свойств и деталей механизмов действия рассматриваемого противоопухолевого агента.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение с помощью флуоресцентных методов физико-химических свойств 7аАМД, АМД и их комплексов с ДНК при малых концентрациях.
В соответствии с целью работы были сформулированы следующие задачи:
Охарактеризовать энергетику взаимодействия 7аАМД с ДНК при низких концентрациях, оценить вклады водородного связывания в энергию взаимодействия 7аАМД с ДНК и определить степень участия воды в формировании комплекса.
- Определить энергетически наиболее выгодную конфигурацию 7аАМД и НР1 в образуемом ими комплексе.
- Попытаться установить механизмы, определяющие кинетику ассоциации/диссоциации 7аАМД с Д
Исследовать электронно-возбужденное состояние 7аЛМД в комплексе с ДНК, его фотохимическую активность.
- Найти причины необычно сильного "красного" сдвига максимума спектра поглощения 7аАМД при его взаимодействии с ДНК.
Охарактеризовать шпилечный олигонуклеотид и мицеллу как модели средств адресной доставки АМД, представляющие интерес в терапевтических целях. Кроме того, необходимо было решить ряд методических задач
Совместить ФКС измерения с измерениями поляризации флуоресценции для обеспечения на порядок более высокой чувствительности ФКС к размеру флуоресцирующих частиц.
- Выполнить поиск и адаптацию алгоритма, позволяющего оценивать молекулярные параметры в эксперименте ФКС в присутствии фоновой флуоресценции для флуорофоров с низким квантовым выходом Исследовать свойства неспецифической адсорбции 7аАМД, найти условия, позволяющие устранить влияние этой адсорбции на ход эксперимента. Научная новизна работы Впервые было показано, что способность
акцептировать водород при образовании водородной связи у феноксазина 7аАМД выражена слабо и при комплексообразовании с ДНК не задействована Связываясь с двухцепочечными участками, АМД вызывает медленные конформационные изменения в ДНК Была показана возможность встраивания 7аАМД в большую бороздку НР1 при высокой концентрации ионов Установлено, что одноцепочечный олигонуклеотид принимает форму шпильки, похожую на Б-ДНК, при образовании комплекса с 7аАМД. Красный сдвиг в спектре возбуждения 7аАМД при его переходе из водного окружения в ДНК определяется образованием водородной связи аминогруппы феноксазинового цикла 7аАМД с кислородом фосфатной группы ДНК. Основания ДНК существенно экранируют 7аАМД от взаимодействия с водой В электронно-возбужденном состоянии карбонильный кислород хинола либо 012 образуют водородную связь Показано, что энергетический барьер конкурентной замены 7аАМД на АМД в комплексе с НР1 очень мал. Охарактеризована неспецифическая адсорбция 7аАМД с использованием уравнения Фрейндлиха.
Изучена фотохимическая активность 7аАМД Установлено, что она возрастает в ряду мицеллы тритона Х-100 - водный раствор - димеры с АМД - комплекс с ДНК. Наиболее фотохимически активным оказалось состояние во фрагментированной тимусной ДНК, наименее фоточувствительным - в плазмидной ДНК Фотолеструкция 7аАМД имеет как минимум два характерных времени. Мицеллы и одноцепочечные олигонуклеотиды не позволяют актиномицину адсорбироваться на центры с низкой константой диссоциации, но при этом не затрудняют взаимодействие со специфическими центрами связывания В случае олигонуклеотида НР1 происходит быстрая адсорбция комплекса 7аАМД*НР1 на ДНК, затем медленная, в течение минуты, диссоциация 7аАМД из комплекса с быстрым локальным связыванием на ДНК В случае мицеллы тритона Х-100 ДНК проникает в мицеллу и уже в гидрофобном окружении происходит взаимодействие 7аАМД с ДНК
Практическое значение Знание особенностей взаимодействия 7аАМД с ДНК, других физико-химических свойств 7аАМД необходимо для создания новых, более эффективных медикаментов. Заметное увеличение фотохимической активности 7аАМД при взаимодейстбии с ДНК может позволить использовать его в фотодинамической терапии На мицеллах тритона Х-100 и одноцепочечном , 2
олигонуклеотиде НР1, как на модельных системах, было продемонстрировано значение гидрофобного окружения 7аАМД в средствах адресной доставки препарата. К научно-практической значимости можно отнести продемонстрированную на примере 7-аминоактиномицина Д возможность увеличить на порядок чувствительность флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС) к изменению размера флуорофора, возможность расширить рамки метода ФКС на измерения с использованием флуорофоров с низким квантовым выходом.
Апробаиия работы Материалы диссертации были представлены на 45-ом заседании биофизического общества (Бостон, США 2001) на Пятой и Шестой конференции молодых учёных (Пущино, 2001; 2002), на международных конференциях "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002)," Математика Компьютер. Образование" (г Дубна, 2002), "Евроанализ-12" (Дортмунд, Германия 2002).
Публикации По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего ссылок, приложений Работа
изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована
рисунками и содержит Ф таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования служили актиномицин Д, его флуоресцирующий аналог - 7-аминоактиномицин Д, различные вилы природной ДНК и
синтетический олигонуклеотвд НР1 (5'-AAAAAAATAGTTTTAAATATTTTTTT-3').
где R = Н в случае АМД и R = NH2 в случае 7аАМД.
Регистрация флуоресценции на спектрофлуоримстре SLM-4800 в различных растворителях выполнялась в диапазоне 550 - 750 нм при возбуждении 530 нм, со щелями 4 нм в монохроматорах канала возбуждения и канала регистрации. Спектры флуоресценции корректировались по эталонному спектру родамина 6Ж Ошибка измерения определялась в независимом эксперименте и составила около одного процента при напряжении на ФЭУ 800 В Фазовое время жизни определялось при положении монохроматоров возбуждения/регистрации 530/650 нм, частота модуляции 30 МГц, входная щель - 2 нм, выходная щель - 8 нм Поляризационные измерения выполнялись при одинаковых шелях - 8 нм
Размер флуоресцирующих частиц находился из уравнения Левшина-Перрена [Левшин, 1994]
где Р - значение поляризации флуоресценции, Р0 - предельная поляризация (определяется по флуоресценции из стеклообразных растворов), к - константа Больцмана, Т - абсолютная температура, г- среднее время жизни возбужденного состояния, ц - вязкость растворителя, V - эффективный объём флуоресцирующей частицы.
Если в растворе имеются п флуоресцирующих частиц с различными значениями поляризации Р„ то измеряемое значение поляризации Рар представляется следующим выражением [Дж Лакович, 1986]-
где/ - интенсивность флуоресценции частиц соответствующего типа, fcxp - общая регистрируемая флуоресценция от образца.
Флуориметрия в остановленном потоке выполнялась на stopped-flow флуориметре SX18MV-R (Applied Photophysics). Возбуждение флуоресценции -570 нм, регистрация флуоресценции в диапазоне >610 нм. Щели обоих монохроматоров - 8 нм. По 0,5 мл свежеприготовленных растворов вносилось в шприцы stopped-flow флуориметра за минуту до измерения. Для определения временных констант выполнялась подгонка экспериментальных данных в виде суммы начального уровня флуоресценции и одной - трех экспонент с различными весами и характерными временами Поиск определяемых параметров осуществлялся методом Гаусса-Ныотона.
Расчеты с использованием молекулярной динамики выполняли на комплексе 7аАМД с НР1 в присутствии 0,25 М ионов натрия. Структуру 7аАМД получали добавлением 7-аминогруппы к АМД, извлеченному из структуры 2D55 (код PDB) Структуры шпилечного олигонуклеотида НР1 в различных конформациях создавали в программе Hyperchem 6.03 из двухцепочечной Б-ДНК Комплексы создавали с положением 7аАМД в большой и малой бороздке ДНК, с нормальной и инверсной ориентацией аденина, с расположением 7аАМД с 5' и с 3' стороны относительно гуанина. После оптимизации геометрии (базис ST03G) и расчета зарядов на сетке в программе GAUSSIAN 03 (Gaussian com) производили восстановление точечных зарядов на атомах 7аАМД с помощью пакета RESP Затем, средствами Hyperchem 6.03, к комплексу 7аАМД*НР1 добавлялись противоионы натрия, задавались периодические условия и добавлялась TIP3 вода Далее, стандартно: оптимизировалась вода, затем ионы, в течение 1 пс температура повышалась о г 0 К до комнатной Выполнялся расчет одной наносекунды молекулярной динамики. Молекулы воды считались принадлежащими первой гидратной оболочке, если расстояние между молекулой сольвента и ближайшим атомом воды было меньше 4,5 А.
Измерения на установке ConfoCor. построенной на базе микроскопа Axiovert 200 (Zeiss, Germany) ФКС измерения выполнялись с использованием 40х водно-иммерсионного конфокального объектива с апертурой 1,2 От каждого образца регистрировалось пять корреляционных функций (рис 1А). которые использовались в дальнейшем анализе.
Для нахождения параметров ФКС численно решалось уравнение
(2)
G
1.025
1
-6 -4
l.o
1 02
G
iX
-2 0
Ig(x)
-6 -5 -4
-3 -2 -1
A
Б
Рисунок 1. Первый этап обработки корреляционных функций (КФ).
А - исходные данные, Б - усредненная и восстановленная из решения КФ.
где /¡У - регистрируемая корреляционная функция, ф(т) - функция распределения частиц по размерам с учетом вкладов от процессов более быстрых, чем броуновская диффузия, К(1, г) - ядро интегрального уравнения, имеющее следующий вцд:
Структурный параметр (К), равный отношению продольного размера конфокального объёма к поперечному, был определен в контрольных измерениях 100 нМ раствора родамина 6Ж Его значение было равно 5,0 и считалось неизменным. Если вторая функция в представлении ядра учитывает распределение частиц по размерам, то экспоненциальная функция включает в себя вклады от переходов в триплетное состояние и процессов более быстрых, чем броуновская диффузия. Решение уравнения (3) в классе гладких функций выполнялось согласно модификации алгоритма, описанного в [S.W. Provencher, 1982] (см. рис 1Б и описание далее). Данный алгоритм был выбран по результатам сравнения десяти алгоритмов, реализованных в виде программ в среде Matlab v 4.0, MathWorks Inc., как оптимальный для восстановления функции распределения по корреляционным функциям, измеряемым в ФКС Модификация алгоритма производилась с целью оптимизации и повышения стабильности получаемого решения.
В экспериментах, если не оговорено особо, использовались следующие концен1рации. 100 нМ раствор 7аАМД, 5 мМ какодилатный буфер (pH = 7,0), бычий сывороточный альбумин в концентрации 25 мкг/мл, 100 мМ KCl, 1 мкМ АМД, 0,02% Triton Х-100, одноцепочечная ДНК в концентрации 1 мкМ и двухцепочечные ДНК -10 мкМ нуклеотидов.
При титровании 7аАМД раствором НР1 к 300 мл НР1 соответствующей концентрации добавлялось 6 мкл 5 мкМ 7аАМД. Затем раствор удалялся из ячейки и готовился вновь. Было найдено, что достаточно четырех таких приготовлений, чтобы концентрация 7аЛМД в растворе длительное время оставалась постоянной.
Уравнение i етерогенной абсорбции Фрейнддиха. обычно, исиользуется для описания систем с развитой поверхностью, с концеш рацией сорбента в микромолярном диапазоне Но при наномолярных концентрациях сорбента даже
(4)
стеклянная поверхность кюветы оказывает существенное влияние на его объемную концентрацию Принимая во внимание закон сохранения масс и то, что отношение эффективного поверхностного объема к общему объему составляет величину порядка 10"6 для кубической кюветы 10x10x10 мм и 10 приповерхностного слоя (характерный размер 7аАМД), уравнение Фрейндлиха запишется в следующем виде: С0 - Су - 10~6к(Су)а = 0, где С0и Су- начальная и объёмная (установившаяся) концентрация вещества, а - безразмерная константа, а к имеет фрактальную размерность [(моль/л)'"0].
Устранение влияния сорбции/десорбции 7аАМД на ход эксперимента. Приготовить водный раствор 7аАМД с заданной низкой концентрацией -нетривиальная задача, так как 7аАМД является амфифилом (содержит гидрофобные и полярные группы) и поэтому является поверхностно активным При низких концентрациях пренебречь адсорбцией уже нельзя Замена стеклянной кюветы на кварцевую, как и обработка стекла перфтордеканом уменьшают адсорбцию. Увеличение ионной силы раствора и добавление альбумина вызывают дальнейшее уменьшение адсорбции. Но эти меры, как и силиконизация поверхности измерительной ячейки не обеспечивают постоянства концентрации 7аАМД в течение эксперимента. Наиболее эффективным способом оказалось насыщение поверхности многократным промыванием свежеприготовленным раствором (см. раздел "Измерения на установке СопАоСог").
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В самом начале диссертации описываются эффекты дейтерированных растворителей на флуоресценцию 7аАМД. Затем, для более наглядного восприятия последующих результатов, демонстрируется структурные данные Далее анализируется сольватохромный эффект 7аАМД и, с его помощью -энергетика взаимодействия интеркалирующей части 7аАМД с ДНК Следом делается попытка описать механизмы, объясняющие данные кинетики взаимодействия 7аАМД с ДНК Затем представлен алгоритм, используемый для анализа данных флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС), позволивший исследовать физико-химические свойства 7аАМД с использованием ФКС. В заключении с помощью ФКС изучается неспецифическая сорбция 7аАМД, его фотохимическая активность, определяется константа диссоциации 7аАМД из комплекса с одноцепочечным олигонуклеотидом НР1
1. Характеристика 7аАМД и его комплексов с ДНК в дейтерированных растворителях на основе флуоресцентных данных
Чтобы установить, взаимодействует ли хромофорная часть 7аАМД в комплексе с ДНК с водой, выполнялись измерения флуоресценции 7аАМД в дейтерий-замещенных растворителях Интегральная интенсивность флуоресценции 7аАМД в П20 была в 2,4±о,1 раза больше, чем в обычной воде, аналогично результатам [У -С Опао, 1979] (рисунок 2); в 1,50ю,07 раза больше в С2В500, чем в С2Н5ОН, но, в тоже время, практически одинаковая в бензоле и в С6П6. На основании чего можно заключить, что феноксазиновый цикл 7аАМД в возбужденном состоянии образует водородные связи, и существует принципиальная возможность выявить насколько менее доступным для молекул воды он будет после встраивания в ДНК. Замена в комплексе 7аАМД с НР1 водного окружения на 020 приводит к увеличению интегральной интенсивности флуоресценции в 1,82±0,09 раза (рисунок 2).
Рисунок 2. Спектры флуоресценции 7аАМД, комплекса 7аАМД*НР1 в обычной и тяжелой воде. Обозначения'
(•)- комплекс 7аАМД*НР1 в D20,
(■> комплекс 7аАМД*НР1 в
н2о,
(А) - 7аАМД в D2O, (♦)- 7аАМД в Н20 2 мкМ 7аАМД, 10 мкМ НР1
Следовательно, в комплексе с ДНК 7аАМД менее подвержен тушению молекулами воды, более изолирован от них. Эти результаты соответствуют приведённому в [В L Sailer, 1997] 020-зависимому увеличению интенсивности и времени жизни флуоресценции 7аАМД, связанного с хроматином ядер фиксированных клеток яичника китайского хомячка.
Для того чтобы лучше представить привязку описываемых свойств к структуре и рентгеноструктурным данным, ниже приводятся данные расчетов молекулярной динамики комплекса 7аАМД*НР1.
2. Молекулярная динамика комплекса 7аАМД с НР1
Расчеты выполнялись при повышенной, по сравнению с опытом, концентрации (-10 мМ), чтобы обеспечить конформационную стабильность НР1. Все восемь начальных структур комплекса оказались стабильными в течение времени расчета (одна наносекунда). Среднее число молекул воды в первой сольватной оболочке для четырех комплексов с 7аАМД в малой бороздке одинаково и больше среднего числа молекул воды для комплексов с 7аАМД в большой бороздке (которое было одинаковым и в этом случае). Следовательно, энтропия для комплексов с 7аАМД в малой бороздке - выше. Энтальпия взаимодействия, оцениваемая как простая сумма электростатических взаимодействий между лигандом и ДНК, была наибольшей для трех структур с расположением 7аАМД в большой бороздке. Таким образом, для этих трех структур гиббсова энергия будет минимальной. На рисунке ЗА представлена структура комплекса с минимальной энергией (вода и ионы удалены) Комплекс можно описать эллипсоидом с размерами 22,6 х 22,6 х 55,6 (А).
А Б
Рисунок 3. Общий вид (А) и детали строения (Б) комплекса НР1 с 7аАМД в большой бороздке.
Размер комплекса практически тот же в случае, если 7аАМД расположен в малой бороздке 7аАМД, в свою очередь, описывается эллипсоидом с размерами 17,2 х 17,2x11,4 (А).
Из рисунка ЗА видно, что ДНК, в целом, сохраняет свою форму Это все еще Б-ДНК, несмотря на небольшой изгиб в месте встраивания 7аАМД и наличие отклонений от параллельного расположения нуклеотидов в противоположных цепях.
Рассмотрим более внимательно четверку нуклеотидов (рисунок ЗБ), окружающих феноксазиновый цикл 7аАМД. Для удобства часть остатков олигопептидных колец 7аАМД удалена. Не изображены также следующие и предыдущие основания НР1 Первое, что бросается в глаза - деформированная структура нижней нестандартной АГ пары. Хорошо различима пара водородных связей, образуемых ЫН-группой треонина одного кольца (вверху) и карбоксигруппой другого треонина (внизу) с основаниями ДНК. Имеется также водородная связь между пептидолактонными циклами Между феноксазиновым циклом 7аАМД и кислородами фосфатов водородная связь отсутствует, так как встраивание в большую бороздку и наличие нестандартной пары АГ препятствуют ее формированию Интересно отметить, что тщательно выполненный начальный расчет уже предоставляет принципиально новую информацию, в последнее время во всех структурных работах по умолчанию предполагается, что АМД встраивается исключительно в малую бороздку ДНК.
Теперь можно вернуться к низким концентрациям флуоресцентных измерений.
3. Анализ сольватохромного эффекта 7аАМД
В данной части работы для анализа экспериментальных данных использовалось линейное соотношение для энергии сольватации, сформулированное в работе [М I Каш1е1, 1983], представляющее собой линейное уравнение зависимости сольватохромного эффекта от
полярности/поляризуемости (я) растворителя, его способности выступать в качестве донора (а) и в качестве акцептора (Д) водорода при образовании водородной связи:
ХГг = ХУг0 + $я+аа+ЬД (5)
¡де а, Ь и 5 - восприимчивости вещества к способности акцептировать водород (САВ), способности предоставлять водород (СПВ) и к полярности/поляризуемости растворителей.
Сольватохромный эффект достаточно явно проявляется не только в изменении величины Стоксового сдвига или положения максимума флуоресценции, но и в спектрах возбуждения. Было выделено пять параметров, характеризующих флуоресцентные свойства 7аАМД' положение максимумов спектров поглощения (увозб) и флуоресценции (уэм), значение ширины спектров на полувысоте (А\'ош6 и Ау5м), величина Стоксова сдвига (АуСт ) Были выполнены измерения соответствующих параметров в 20 различных растворителях
Полный корреляционный анализ позволяет выразить способность 7аАМД к полярным взаимодействиям, его способность образовывать водородные связи Наиболее простыми для интерпретации представляются результаты применения ЛСЭС для положения максимума спектра флуоресценции' V,,, = 17088±29 - 869±ззгг - 911±18а - 774+32/? [см-1]; г = 0,882,/) < 0,0001, (6) где р - вероятность, что приведенная модель окажется ложной, рядом с коэффициентами регрессии указаны их 95% доверительные интервалы Энергия поляризационных взаимодействий в возбужденном электронном состоянии
составляет чуть больше половины энергии образуемых 7аАМД водородных связей. Все связи стабилизируют возбужденное состояние и приводят к сдвигу спектра флуоресценции в красную сторону при усилении взаимодействия 7аАМД с растворителем. Это свидетельствует если не о появлении комплекса с переносом заряда, то о возникновении сильного дипольного момента в электронно-возбужденном состоянии. Значительно (в три раза) по сравнению с основным состоянием (см. ниже, vBm6) увеличивается энергия водородного связывания, когда 7аАМД выступает в роли акцептора водорода. Она даже становится немного выше по сравнению со случаем, когда 7аАМД выступает в роли донора водорода. Можно заключить, что отрицательный заряд на 7аАМД в электронно-возбужденном состоянии более локализован, чем положительный. Это означает, что карбонильный кислород 012, симметричный ему 012' и (или) кислород хинола образуют водородную связь.
Для положения максимума спектра возбуждения справедливо следующее выражение'
veoj6 = 19376+9 + 0±97г + 299+1 оа - 910±18Д [см"1]; г = 0,785,р = 0,003 (7)
Причем, в данном случае не было обнаружено статистически значимой зависимости от поляризации/поляризуемости растворителя. Это свидетельствует о наличие лишь небольшого дипольного момента у 7аАМД, как следствие, низкой растворимости в воде, что соответствует действительносги. Вместе с тем, выражение (7) демонстрирует наличие для растворителей, акцептирующих водород при водородном связывании, сдвига положения максимума спектра возбуждения в длинноволновую область вследствие стабилизации возбужденного электронного состояния (наблюдается корреляция с увеличением времени жизни флуоресценции). Для предоставляющих водородную связь растворителей наблюдается небольшой сдвиг спектра возбуждения в коротковолновую сторону, вследствие стабилизации основного электронного состояния Стабилизация возбужденного электронного состояния влияет на положение максимума спектра возбуждения Это влияние сравнимо с таковым на положение максимума спектра излучения.
Были также измерены параметры флуоресценции 7аАМД, связанного с ДНК (НР1 и тимусная ДНК теленка). На основании полученных уравнений регрессии и зная параметры флуоресценции комплекса можно решить обратную задачу -найти значения к, а vi ß для ДНК. В таблице 1 собраны данные, использованные для нахождения параметров я-, а и /? для ДНК.
Таблица 1. Представление уравнений регрессии для
Название P, - Po, cm'1 s, cm'1 a, cm'1 b, cm'1
параметра
Уввзб -1325 0 299 -910
Av«H« 50 729 572 0
Vi« -1714 -869 -911 -774
AvJU -880 -324 0 -618
Avrm 429 760 1198 0
Р1- ро обозначает разницу между измеренным значением параметра для комплекса 7аАМД с ДНК и предсказанным, согласно уравнению регрессии (5), значению параметра в гекеане
Из-за малого числа уравнений необходимо ввести верхний и нижний пределы на определяемые параметры. Если далее ограничить сверху значение /? единицей,
то получим следующие значения параметров для ДНК- ж = 0,57+0,06; а = 0,07±о oi. ß = 1 ±0,03 (г - 0,866), для НР1 7г — 0,56±0,0б; а = 0,01±0,01; ß = 0,97±о,оз Таким образом, значения параметров ж, а и ß для двухцепочечной и одноцепочечной ДНК очень близки. Что подтверждает правильность оценки, говорит об отсутствии различия в окружении хромофорной части 7аАМД в НР1 ив ДИК Практически совпадающие значения всех параметров для НР1 и. в то же время, значительно более высокое значение константы диссоциации для НР1 означают, что, в случае взаимодействия 7аАМД с ДНК, большее влияние на полную энергию оказывают взаимодействия групп вне хромофора и энтропийный фактор Отметим, что у ДНК значение а (способность предоставлять водород) отлично от нуля Интересным моментом является аномально высокое значение ß у ДНК, которое можно объяснить высокой способностью сахарофосфатного остова акцептировать водород при образовании водородных связей с аминогруппами феноксазина, что согласуется с рснтгеноструктурными данными [S Kamitory, 1994].
Сравнивая значения ж, а и ß для волы и для ДНК можно сделать вывод, что уменьшение длины волны максимума в спектре возбуждения после перехода 7аАМД из водного окружения в ДИК связано с уменьшением поляризуемости, практически экранированием хромофорной части 7аАМД от водородов воды (что подтверждается результатами экспериментов с тяжелой водой, см выше, и по определению времени жизни флуоресценции, см. ниже) и, вместе с тем, с усилением водородного связывания по донорному типу (образованием водородной связи с кислородом фосфата, как наиболее электроотрицательным атомом на ДНК).
Теперь осталось лишь оценить выигрыш в энергии взаимодействия 7аАМД при переходе из воды в ДНК. Взаимодействие 7аАМД с окружением в основном электронном состоянии из измеренных спектральных величин точнее всего характеризует положение максимума спектра возбуждения Умножив полученные для 7аАМД чувствительности (см уравнение 5) на разность соответствующих параметров для ДНК и для воды получим, что суммарный эффект равен: sa(xH20 -nnHK)+aJaH20- aMllK)+bJßHM - Рднк) = (0*(1,09- 0.57) + 0,299*0,17- 0,07) + 0,9!*(0,47 - 1))*2,86 = 0,94 - 1,38 = -0,44 кКал/моль Таким образом, выигрыш в энтальпии при встраивании феноксазинового цикла в ДНК - минимальный Получается, что образование более прочной водородной связи аминогруппы феноксазина с фосфатом ДНК компенсирует потерю водородных связей карбоксилов с водой, а взаимодействие 7аАМД с ДНК определяется главным образом изменением энтропии Оба вывода противоречат [X. Qu, 2003] и находятся в отличном согласии с большинством других работ, например, [J Ren, 2000].
Время жизни возбужденного состояния (т) также было проанализировано с применением ЛСЭС Непосредственно время жизни определяли с использованием метода фазовой модуляции лишь для 7аАМД в ДМСО, воде и D20. В прочих растворителях времена жизни вычислялись по значению степени поляризации (в предположении постоянства объема 7аАМД) согласно уравнению Левшина-Перрена, и, поэтому, они отражают "среднее фазовое" время жизни Зависимость времени жизни от параметров растворителей можно выразить следующим выражением'
т = 0,98±о,о5 - 0+о.озтг - 0,65±о,05а + 0,84±о,о7/? [не], г = 0,772. р = 0,007, (8)
переменные а и Ь (ем уравнение 5) имеют размерность наносекунд Таким образом, время жизни уменьшается в растворителях, донирующих водородную связь, и увеличивается - в акцептирующих Это не удивительно, поскольку атомы водорода, связанные с оттягивающим с них электронную плотность кислородом, имеют, как правило, разветвленную систему колебательных мод и являются эффективными тушителями флуоресценции Вклад поляризационного члена в уравнение регрессии статистически незначим
Ранее с помощью фазово-модуляционного метода было показано, что 7аАМД в водном растворе и связанный с оцДНК имеет двухкомпонентное время жизни с характерными временами 0,4 ив 1,9 не [Я.М. \Vadkins, 1991]. Амплитуды этих компонент различны для разного окружения 7аАМД Это приводит к тому, что среднее время жизни, определяемое по фазовому сдвигу, в воде составляет 0,75 не, а в комплексе с НР1 -1,65 не (таблица 2).
Таблица 2. Значения поляризации и времени жизни флуоресценции 7аАМД в воде и при взаимодействии с НР1._
* - доверительные интервалы для поляризации составили ±0,01 не
Время жизни возбужденного состояния 7аАМД в D20 увеличивается до 1,1 не против 0,75 не в Н20. Увеличение фазового времени жизни меньше, упоминаемого ранее увеличения интенсивности флуоресценции в тяжелой воде по сравнению с обычной водой, ввиду небольшого изменения быстрой компоненты времени жизни, маскирующего изменение медленной компоненты. Наблюдается изотопный эффект из-за того, что тяжелая вода является более слабым тушителем флуоресценции по сравнению с обычной водой [N. Boens, 1992], а 7аАМД в возбужденном состоянии образует водородную связь с водородом воды, тушащим флуоресценцию своей развитой системой колебательных мод Следовательно, увеличение интенсивности флуоресценции 7аАМД после связывания с НР1 обусловлено экранированием хромофора от водного окружения в комплексе.
Распространенным механизмом тушения флуоресценции в донирующих водородную связь растворителях является перенос протона в возбужденном состоянии [WR. Lows, 1979] Чтобы выяснить, не происходит ли переноса протона в возбужденном состоянии в нашем случае, мы измерили время жизни флуоресценции 7аАМД в водном растворе при различных значениях pH- 3,0, 7,0 и 10,0. Значение времени жизни оставалось постоянным для приведенных значений pH. Следовательно, в возбужденном состоянии переноса протона не происходит
Данные таблицы 2 позволяют также рассчитать, согласно уравнению Левшииа-Перрена, эффективный размер молекулы 7аАМД или комплекса с ее участием. Значения измеренные в D20, имеют большую точность, так как интенсивность флуоресценции в тяжелой воде выше, а, следовательно, выше отношение сигнал/шум Эффективный гидродинамический объем 7аАМД в D20 составил 2580±бо А3, а объем комплекса 7аАМД с НР1 в D20 - 15690±ш А3
поляри- время
Окружение
зация жизни, не
в воде
в НР1 в воде bD20
bHPI BD20
0,29 0,75
0,36 1,65
0,23 1,10
0,37 2,00
(радиус 15,5 А) В воде эффективный гидродинамический объем комплекса 7аАМД*НР1 составил 14380 А3 (радиус 15,1 А). Различие средневзвешенного объема может быть объяснено большей массой сольватной оболочки в случае комплекса в тяжелой воде Отношение эффективных объемов комплекса 7аЛМД с НР1 и свободного 7аАМД составляет 6,08, в то время как отношение молекулярных масс равно 7,35. По различию вышеназванных отношений можно определить продольный и поперечный размеры комплекса. Для этого предположим, что форма 7аАМД и его комплекс с НР1 описывается эллипсоидом с двумя характерными размерами (продольным и поперечным) Объем эллипсоида, как известно, вычисляется по формуле- V = (4/3)паЬгде а и Ь -длина и поперечный размер эллипсоида, соответственно Если далее предположить, что плотность молекулы 7аАМД и комплекса 7аАМД*ДНК одинаковы, то получим следующее выражение для зависимости отношения Ь/ас от Ь/ар где индексы/и с означают свободный 7аАМД и в комплексе с НР1
М, а.
h _Y (9)
> +2
b.
Ь,
aI
Примем, что 7аАМД можно описать эллипсоидом с отношением b/af ~ 17,2(Ä)/11,4(А) = 1,51 (смотри раздел посвященный молекулярной динамике) Тогда для комплекса 7аАМД с НР1 получим b/af ~ 0,40, практически тоже соотношение, что и найденное с помощью молекулярной динамики. Возможно, 7аАМД стабилизирует одноцепочечную ДНК настолько, что она при комнатной температуре и низкой ионной силе принимает конформацию шпильки с параметрами Б-формы ДНК, аналогично результатам, полученным при большой ионной силе в растворе [D R Brown, 1994], в противовес данным рентгеноструктурного анализа [S. Kamitory, 1994].
4. Исследование кинетики взаимодействия 7аАМД и ДНК
Формирование комплекса между ДНК и 7аАМД - это быстрый процесс, протекающий в секундном и даже миллисекундном диапазоне. Изучение подобных процессов возможно с использованием метода флуорометрии в остановленном потоке (stopped-flow) Знание константы скорости реакции позволяет судиггь о ее механизме.
С помощью метода флуорометрии в остановленном потоке нами было установлено существование лить только быстрой фазы в случае формирования комплекса 7аАМД с олигонуклеотидом НР1. Статистически достоверно существование медленной фазы (в минутном диапазоне) выявлено не было Формирование комплекса происходит за 0,29 сек, что соответствует константе скорости реакции 1,21*10^ М"'с"' На рисунке 4 представлена временная зависимость интенсивности флуоресценции 7аАМД при взаимодействии с НР1 (кривая 1) в диапазоне сотен миллисекунд. Характерная временная константа в 0,3 секунды (см. таблицу 3), означает, что встраивание феноксазиновой части актиномицина в шпилечную структуру ДНК происходит очень быстро
При добавлении избыточного количества АМД к комплексу 7аАМД с НР1 наблюдается падение интенсивности флуоресценции 7аАМД до значения, характерного для его свободного состояния. Это означает, что происходит практически нолная диссоциация комплекса 7аАМД из НР1. Временная зависимость интенсивности флуоресценции для это! о процесса изображена на
Ы1„ - к.) Рисунок 4. Кинетика флуоресценции
7аАМД при комплексообразовании.
По оси абсцисс отложены логарифмы разностей предельной флуоресценции и флуоресценции ц>и
1- комплексообразовании 7аАМД с НР1 (•),
2- замещении 7аАМД на АМД в комплексе с НР1 (♦).
Температура 26 ° С. Концентрация 7аАМД-1 мкМ, НР1 и АМД - 10 мкМ Возбуждение "рс*™,': флуоресценции при 570 нм, регистрация флуоресценции при 610 нм Щели обоих монохроматоров- 8 нм
рисунке 4 (кривая 2). Время вытеснения составляет 0,31 секунды (таблица 3) и практически не отличается от времени связывания 7аАМД с НР1. Следовательно, наличие дополнительной аминогруппы в феноксазиновом цикле энергию взаимодействия актиномицина с НР1 существенно не изменяет
Вместе с тем, как будет показано далее, константа диссоциации комплекса составляет порядка 7,8* 10"8 М, константа обратной реакции, в таком случае, будет характеризоваться временем в 106 секунд. То есть "узким местом" будет процесс диссоциации комплекса. Процесс диссоциации при наличии десятикратного избытка АМД может идти лишь напротив - медленнее. Соответственно, должен существовать эффективный, с низким энергетическим барьером, механизм замены 7аАМД в комплексе с одноцепочечным олигонуклеотидом на аналошчный ему АМД. Следовательно, 7аАМД стабилизирует олигонуклеотид лишь локально -вблизи места связывания, с высокой остаточной конформациошюй подвижностью.
При образовании комплекса с ДНК фага X хромофор антибиотика встраивается между основаниями ДНК и находится в гидрофобном окружении Это приводит к увеличению квантового выхода флуоресценции 7аАМД, хотя и не столь значительному, как в случае образования комплекса со одноцепочечным олигонуклеотидом [R.M Wadkins, 2000] Кинетика связывания 7аАМД с ДНК фага X имеет, по меньшей мере, две фазы - быструю (миллисекундную) и медленную (десятки секунд), аналогично данным приведенным в [R Bittman, 1975, С. Brown, 1987] На рис. 5 представлена кинетика связывания 7аАМД с ДНК фага X Комплексообразованис представляет собой реакцию первого порядка (ввиду избыточности концентрации ДНК)
Рисунок 5. Изменение интенсивности флуоресценции 7аАМД при
взаимодействии с ДНК фага X.
Биэкспоненциальная аппроксимация
быстрая (1), медленная (2) компоненты и их сумма (3)
Концентрации 7аАМД - 1 мкМ, ДНК - 44 мкМ нуклеотидов Условия измерения те же, что представлены в легенде к рисунку 4
время, с
Процесс возрастания интенсивности флуоресценции характеризуется как минимум двумя компонентами' 4,6 секунды и 40 секунд (таблица 3) Быстрая
компонента обчадает большим весом Несмотря на то, что в случае ДНК быстрая фаза имеет на порядок большее эффективное время, чем в случае НР1, можно сделать предположение, что быстрая фаза связана со встраиванием актиномицина в спонтанно образующиеся одноцепочечные структуры на ДНК Временные различия могут быть обусловлены различной длиной олигонуклеотида (НР1) и ДНК, и, соответственно, их разной конформационной подвижностью; более низким значением константы диссоциации для центров связывания 7аАМД на НР1 (смотри далее, 7,8*10"8 М) по сравнению с гетерогенной популяцией центров связывания на ДНК (с эффективной константой диссоциации в 7,4±0,2 мкМ, как было определено титрованием 7аАМД раствором ДНК фага X). Медленная компонента, как сообщалось в [R. Bittman, 1975], соответствует реакции первого порядка Следовательно, усиление флуоресценции происходит вследствие взаимных конформационных перестроек в формирующихся комплексах и перераспределения 7аАМД в более специфичные центры на ДНК, становящиеся доступными в результате тепловых флуктуаций. В пользу этого выступают два аргумента интенсивность флуоресценции из мест специфического связывания выше, а константа диссоциации из них существенно ниже.
Таблица 3. Характеристика быстрой и медленной компонент при
Образец tl (сек) t2 (сек) а2 (%)
7аАМД + НР1 0,29* - -
7аАМДиНР1 + АМД 0,31* - -
7аАМД +днк 4,6 40 23
7аАМД и НР1 + ДНК 4,5 101 63
7аАМД, NaCl и НР1 +днк 4,9 147 78
Удельный вес а1 = 100 - а2, [%] Концентрации 7аАМЭ - 2 мкМ, НР1 - 2,4 мкМ, ДНК фага к - 44 мкМ (эффективная концентрация нуклеотидов), ЫаС1 - 50 мМ Растворы готовились в 10 мМ трис-НС! буфере с 0,5 мМ ЭДТА, рН 7,6 Возбуждение при 570 нм, регистрация флуоресценции в диапазоне >610 нм Температура 26° С Доверительные интервалы для характерных времен составили <0,05 их абсолютной величины, для процента второго компонента ±1%
Для исследования возможности использования НР1 в качестве средства адресной доставки актиномицинов в клетку возникла необходимость исследования стабильности формирующегося комплекса. Ресорбция 7аАМД из комплекса с НР1 на ДНК регистрировалась по уменьшению интенсивности флуоресценции 7аАМД (рисунок 6). Процесс ресорбции аппроксимировался согласно двухкомпонентной модели с двумя характерными временами и амплитудами.
Рисунок 6. Кинетика ресорбции 7аАМД на ДНК фага X из комплекса с НР1 в зависимости от концентрации ДНК.
ЪЬГ'^^м^ Концентрации ДНК 22 мкМ (1) и 44 мкМ
* (2) Концентрации 7аАМО - 1 мкМ, НР1 -
2,4 мкМ Теоретические кривые показаны в
_ виде одноэкспоненциапьной (3) и
зм «о двухэкспоненциальной (4) моделей ч""' Условия измерений те же, что и в легенде к рисунку 4
Характерное время быстрой компоненты процесса ресорбции составляет ie же 4,5 секунды, чго и для образования комплекса 7аАМД с ДНК Из рисунка б видно (кривые 1 и 2), что амплитуда быстрой стадии зависит от концентрации ДНК Следовательно, первая стадия описывает реакцию второго порядка -вероятностный процесс столкновения комплекса 7аАМД*НР1 с ДНК фага ? Относительный вес медленной компоненты и ее характерное время значительно выше при ресорбции в сравнении с непосредственным взаимодействием 7аАМД с ДНК (таблица 3) Длительность медленной стадии практически в точности совпадает со временем диссоциации комплекса 7аАМД*НР1 Малая амплитуда быстрой стадии означает, что адсорбировавшийся на ДНК комплекс 7аАМД*НР1 меняет свою конформапию вблизи хромофорной части 7аАМД незначительно
Увеличение ионной силы раствора (50 мМ NaCl, таблица 3) приводит к двукратному уменьшению вклада быстрой компоненты процесса ресорбции, в то время как вклад медленной фазы остается почти неизменным Это дает основания предполагать, что формирование промежуточного комплекса HP 1 *7аАМД*ДНК определяется ионными (полярными) взаимодействиями, а ресорбция антибиотика контролируется гидрофобными (иеионными) взаимодействиями.
На основании результатов этой серии экспериментов in vitro можно рассматривать шпилечный олигонуклеотид как потенциальный переносчик актиномицинов к ДНК в клетке, исключающий неспецифическое связывание и повышающий концентрацию АМД в растворе.
5. Анализ корреляционных функций
Изучение слабо флуоресцирующих веществ во флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС) затруднено низким соотношением сигнал/шум, необходимостью особо тщательно контролировать фоновую флуоресценцию Стандартные одно- и двухкомпонентные модели, используемые для определения молекулярных параметров на установке ConfoCor, при этом не обеспечивают удовлетворительной воспроизводимости оцениваемых параметров В связи с этим возникла проблема поиска алгоритма обработки данных ФКС, позволяющего использовать метод для веществ с низким квантовым выходом (квантовый выход 7аАМД ~ 0,01). Выполним краткое сравнение алгоритмов, применяемых для численного решения подобных задач, с целью выбора наиболее подходящего для анализа корреляционных функций (КФ) в эксперименте ФКС.
Метод ФКС является непрямым методом Для нахождения функции распределения частиц по размерам необходимо решичь уравнение Фредгольма первого рода Точность восстановления функции распределения, во многом определяется качеством подгонки КФ. Функция распределения должна обладать следующими свойствами- быть положительно определенной, устойчивой к малым изменениям параметров уравнения, не должна содержать экстра-пиков
Алгоритм Ощепкова [С JI Ощепков, 1994] не чувствителен к начальным условиям, позволяет строить положительно-определённые решения, но имеет медленную сходимость Даже при числе итераций около 103 алгоритм Ощепкова не дает решения, обеспечивающего желаемую точность решения (рис 7) Функции распределения, а, как следствие, и КФ, получаемые с его помощью, выглядят очень сглаженными Метод наименьших квадратов, с введением дополнительного условия на неотрицательность решения [С L I.awson, 1995] обеспечивает гораздо более точную подгонку КФ (рисунок 7), но в ремгении
появляются дополнительные пики. От них можно избавиться, введя регуляризирующее условие
Рисунок 7. Сравнение различных алгоритмов решения уравнения Фредгольма первого рода (3).
Тихонов ■ - РгоувлсИвг — Оцепков
К группе регуляризирующих методов относятся: метод Тихонова [А.Н. Тихонов, 1963] с выбором оптимального значения регуляризирующего параметра с помощью, например, минимизации поточечной невязки [В.А. Морозов, 1981]; метод регуляризации для неотрицательного решения, алгоритмизированный [8.\У РгоуепсЬег, 1982]. Метод Тихонова обеспечивает наилучшее приближение КФ, давая, тем не менее, отрицательное значение для функции распределения частиц.
Как можно видеть из рисунка 7, алгоритм Провенчера позволяет найти компромиссное неотрицательное решение, удовлетворяющее как по качеству подгонки КФ, так и по отсутствию экстра-пиков на функции распределения. Поэтому, в конечном варианте процедуры обработки КФ было решено использовать модифицированный метод Провенчера для анализа КФ в эксперименте.
Предложенный ниже подход, основанный на анализе КФ флуктуации флуоресценции контрольных и опытного образцов, позволяет использовать ФКС в случаях низкого квантового выхода исследуемых соединений при наличии фоновой флуоресценции, что важно также для внутриклеточных измерений. Для восстановления функции распределения (см уравнение 3) минимизировался следующий функционал:
^(Р.-оЯ+ (,0>
где Ц...Ц2 - среднеквадратичная мера, СЕ - усредненная по серии измерений и Ст • предсказанная корреляционные функции, С - матрица ковариации, Сг -матричный оператор взятия второй производной, А - параметр регуляризации (обеспечивающий гладкость решения, выбирался в интервале 10"4 -10"7). Решение уравнения (3), минимизирующее функционал (10), рассчитывалось из уравнения: ,___ (11)
где = КТСШК, а = З^ХГ', ШУ7 - разложение по собственным
значениям (элементам диагональной матрицы 5), 1} и V- матрицы поворота, такие что иит= УУТ=Е (Е - единичная матрица), сИа2() означает построение диагональной матрицы, б21 - диагональные элементы матрицы 5.1 Параметр а выбирался минимизирующим энтропию.
Среднее число частиц в конфокальном объёме и характерные времена вычислялись суммированием по интервалам:
Z,l>(r,)r,gn(r,)
N= „---
г,>40/* г, >40/«
где ¿>(Vj - квадратурные коэффициенты интегрального представления, g¡ 2 -значения функции распределения. Т, : - так называемые характерные времена триплетов. Эффективность флуоресценции определялась как Flu eff. = (Ig-Ib)/N, где Ig» 1ь - суммарная и фоновая интенсивность флуоресценции.
Описанный алгоритм обработки корреляционных функций был проверен на модельной системе, представляющей собой заполненные родамином Б липосомы, подвергнутые физико-химическим воздействиям различного типа Эксперименты проводились с целью моделирования кальций-зависимой неспецифической проницаемости митохондрий [A.B. Агафонов, 2002; A. Agafonov, 2003].
6. Измерение поляризации флуоресценции и ФКС на установке ConfoCor
Адсорбция 7аАМД на стенки измерительной ячейки На рис. 8 представлена зависимость интенсивности флуоресценции водного раствора 7аАМД от времени нахождения раствора в измерительной ячейке. Этот график демонстрирует кинетику адсорбции антибиотика на стенки ячейки За полчаса адсорбируется более 2/3 растворенного 7аАМД Для уменьшения сродства поверхности измерительной ячейки к 7аАМД ячейку обрабатывали перфлуордеканом, дихлордиметилсиланом, составом Rain X. Обработка поверхности заметно замедляла процесс сорбции в первые несколько минут (рис. 8). Особенно эффективной (но кратковременной) оказалась обработка Ram X, приводящая к увеличению флуоресценции 7аАМД в 3,6 раза. Но уже через 10 минут после внесения образца эффект от модификации поверхности практически исчезал. 250 -i Рисунок 8. Влияние обработки
1ф
200 150 100 -50 -0
поверхности на адсорбцию 7аАМД.
Без обработки (Д) Поверхность обработана дихлордиметилсиланом (•), составом Ram X (♦). Относительная ошибка измерения ±1%
0 10 20 30 иин.
Поверхностно активные вещества переводят 7аАМД со стенок ячейки в раствор практически полностью Добавка 0,02% Triton Х-100 приводила не только к восстановлению начальной концентрации 7аАМД в растворе, но и к усилению эффективности его флуоресценции и уменьшению фотодеструкции Конечно, связывание с поверхностно активными веществами заметно изменяет свойства исследуемых молекул Но такие системы могут рассматриваться как моделирующие состояние 7аАМД в клеточных мембранах, как системы адресной транспортировки 7аАМД При этом исключается взаимодействие антибиотика со множеством центров связывания, имеющих слабую константу диссоциации, и появляется возможность повысить его концентрацию в растворе
Фотохимическая активность 7аАМД в растворе. Другим фактором, вызывающим уменьшение интенсивности флуоресценции, является высокая
плотность возбуждающего света. Рис. 9 демонстрирует, что в ходе измерения происходит непрерывная фотодеструкция красителя и что зависимость фотодеструкции от времени плохо описывается одноэкспоненциальной зависимостью. При описании двухэкспоненциальной зависимостью у двух
Рисунок 9. Кинетика фотодеструкции 7аАМД в минутном диапазоне после включения лазера.
Одноэкспоненциальное (-) и
Двухэкспоненциальное(-) приближение.
1ф - интенсивность флуоресценции
компонент получаются примерно равные амплитуды с характерными временами 2 и 34 секунды В случае если существует единственное фоючувствительное состояние, флуоресценция не должна (с учетом диффузии) выходить на плато при столь большом значении или, что то же самое, падение интенсивности флуоресценции должно бьггь более крутым (как показывают результаты численного моделирования) Следовательно, 7аАМД в водном растворе существует как минимум в двух отличающихся по фотостабильности состояниях. Время жизни каждого из этих состояний больше времени диффузии через конфокальный объем.
Измерения с использованием метода Флуоресцентной корреляционной спектроскопии ФКС позволяет определять абсолютную концентрацию, коэффициент диффузии (подвижность) и долю фотохимически активных или перешедших в триплетное состояние флуорофоров. Рассмотрим основные эффекты, происходящие при взаимодействии 7аАМД с НР1. Взаимодействие 7аАМД с одноцепочечным олигонуклеотидом НР1 приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции 7аАМД в 1,5 раза за счёт снижения числа флуоресцирующих частиц в освещаемом объеме. Вместе с тем, происходи! увеличение эффективности флуоресценции остающихся частиц более чем в полтора раза за счет уменьшения их затушенности и рост их кажущейся «подвижности» на 22%. Схожее изменения флуоресценции 7аАМД наблюдаются при связывании его с фрагментированной тимусной ДНК и плазмидой рОЕМЗгГ(+): эффективность флуоресценции возрастает в два раза, а «подвижность» увеличивается на 37% для фрагментированной ДНК и на 21% для плазмиды. На фоне данных изменений происходит падение доли быстрого компонента корреляционной функции с 40 до 20 % (табл 4) Обычно, быстрый компонент связывают с переходом флуорофора в триплетное состояние. В данном случае, скорее всего, быстрый компонент связан с быстрым обратимым переходом 7аАМД из флуоресцирующего в нефлуоресцирующее (или затушенное) состояние. Аналогичное падение общей интенсивности флуоресценции при связывании с ДНК происходит из-за уменьшения числа флуоресцирующих частиц Уменьшение числа флуоресцирующих молекул не связано с адсорбцией, так как принимались специальные меры для насыщения адсорбирующих поверхностей. Учитывая высокую эффективность флуоресценции 7аАМД в комплексе с ДНК, можно сделать вывод
Таблица 4. Взаимодействие 7аАМД с различными веществами.
Добавки. F, кГц N Flu eff т, мкс Tr, % Т ,,мкс Т2, мкс
... *> 186,7 73,5 2,54 106 39 2,5 27
оцДНК 111,4 27,8 4,01 83 27 3,1 29
пДНК 138,2 28,0 4,94 84 21 2,9 19
ДНК 92,1 18,0 5,13 67 22 4
АМД 253,2 131,6 1,93 96 37 2,1 13
HP 1+AMD 236,2 97,2 2,43 90 26 3,4
ТХ-100 528,2 96,9 5,45 196 48 2,3 38
оцДНК+ТХ-100 511,5 98,3 5,20 145 41 2,4
' -100 нМ 7аАМД в 5 мМ какодилатном буфере
оцДНК - 1 мкМ одноцепочечный олигонуклеотид HPI, пДНК - плазмида pGEM3Zf(+) (Promega, 10 мкМ нуклеотидов),ДЖ-тимусная ДНК теленка, обработанная ультразвуком (10 мкМ нуклеотидов), АМД - 1 мкМ, IX-100 - 0,02% Triton Х-100 F - интенсивность флуоресценции, N - среднее число частиц т - время диффузии через конфокальный объем, Flu eff - F/N, Tr - процент триплетов, Ti 2 - характерные времена триплетов
о существовании двух состояний антибиотика, связанного с ДНК: одного, в котором 7аАМД крайне фоточувствителен и другого, в котором 7аАМД более фотостабилен.Скорее всего, это означает, что в конформации комплекса, в котором 7аАМД обладает повышенной фоточувствительностью, феноксазиновый цикл изолирован от молекул воды
Параметры флуоресценции 7аАМД зависят от типа ДНК, с которой антибиотик образует комплекс (табл. 4). Так, эффективность флуоресценции 7аАМД из одноцепочечного олигонуклеотида на 20% меньше, чем из двухцепочечных ДНК, а вероятность быстрых обратимых переходов в нефлуоресцируюшее состояние на 26% выше. Что касается свойств флуоресценции 7аАМД в комплексе с двухцепочечной ДНК (озвученной тимусной, по сравнению с плазмидной): "время диффузии" озвученной ДНК через конфокальный объём на 20% меньше, чем плазмидной, и на ней на 36% меньше центров, в которых 7аАМД фотостабилен Следовательно, наименее фотостабилен 7аАМД в тимусной озвученной ДНК. Кажущееся увеличение "подвижности" 7аАМД при связывании с намного большими по размеру молекулами ДНК затруднительно объяснить чем-либо иным, кроме высокой фотохимической активности связанного 7аАМД с эффективным временем жизни флуоресцирующего состояния, меньшим временем диффузии через конфокальный объём, то есть - порядка определяемого времени диффузии. За это время, при используемой мощности лазерного излучения, молекула 7аАМД успевает в среднем высветить один квант (а поглотить, следовательно, 10). В [J X. Pan, 2001J уже сообщалось о высокой фотохимической активности АМД в комплексе с ДНК и способности к радикалообразованию в мембранах. Приведенные данные наглядно демонстрируют возможность использования 7аАМД в фотодинамической терапии
Добавление 10-крагного избытка АМД к 7аАМД приводит к увеличению числа флуоресцирующих частиц в растворе в 1,8 раза По-видимому, это происходит из-за образования (при концентрации 1 мкМ) смешанных димеров АМД-7аАМД, в которых феноксазиновый цикл 7аАМД экранирован от молекул воды В пользу образования комплекса между 7аАМД и АМД свидетельствуei
также наличие тушения флуоресценции 7аАМД при добавке АМД на 24%. Доля димеров при этом составляет более 5%, аК, > 5,5*104 М"'. Вместе с тем, ранее определенная константа димеризации АМД составляет порядка 103 M"1 [J.B. Chaires, 1982], что при 1 мкМ концентрации АМД соответствует доле димеров лишь 0,1%, а не, как минимум 5%.
При добавлении к 7аАМД одноцепочечного олигонуклеотида в присутствии избытка АМД корреляционная функция флуктуаций флуоресценции 7аАМД становится ближе к таковой комплекса 7аАМД*ДНК: по проценту "триплетов", по снижению времени диффузии (рис. 10), а также повышается эффективность флуоресценции. Из приведённых данных можно заключить, что 7аАМД по сравнению с АМД имеет приблизительно в два раза более высокое сродство к шпилечной ДНК. Это является подтверждением правильности определенной далее константы диссоциации комплекса 7аАМД*НР1. Для АМД получается вполне реалистичная оценка константы диссоциации: >160 нМ.
Рисунок 10. Вид автокорреляционной функции 7аАМД. В комплексе с АМД (—), с
одноцепочечной ДНК (-),
с одноцепочечной ДНК в присутствии АМД (—); т -время корреляции (секунды)
В присутствии тритон Х-100 практически весь 7аАМД находится в мицеллах этого детергента и имеет высокую эффективность флуоресценции (так как защищён от молекул воды), гораздо более фотостабилен; вместе с тем, - имеет более высокий процент быстрой компоненты (процент молекул, находящихся в "триплетном состоянии") Добавление одноцепочечной ДНК к мицеллам тритона Х-100, содержащим 7аАМД, вызывает уменьшение процента "триплетов" и времени диффузии (из-за проникновения ДНК в мицеллу, взаимодействия ДНК с 7аАМД и, как следствие, уменьшения фотостабильности последнего).
В работе [F.M. Chen, 1993] было обнаружено существование двух характерных времен в процессе диссоциации комплекса 7аАМД с олигонуклеотидами в присутствии додецилсульфата натрия. Первая фаза, с меньшим временем, объяснялась диссоциацией 7аАМД из олигонуклеотида в конформации шпилки, в то время как вторая, более медленная - диссоциацией 7аАМД из молекул олигонуклеотида в двухцепочечном состоянии. Как можно заметить из таблицы 4, как таковой диссоциации 7аАМД из комплекса с олигонуклеотидом не происходит Напротив, олигонукпеотид проникает внутрь мицеллы тритона Следующим спорным моментом является более быстрая диссоциация из шпилечных структур. Так как константа диссоциации 7аАМД из двуцепочечных олигонуклеотвдов, обычно, выше, чем из шпилечных, а для скоростей ассоциации верно обратное, то скорость обратной реакций для шпилечного олигонуклеотида должна быть меньше скорости диссоциации из дуплекса.
Мицеллы тритона Х-100, а физиологичнее - липосомы, наряду с HPi могут использоваться в качестве переносчика 7аАМД к клеточной ДНК, так как в них 7аАМД фотостабилен, может находиться в высокой концентрации, не взаимодействуя при этом с веществами вне мицеллы Нахождение 7аАМД в мицелле не препятствует его взаимодействию с ДНК Уже давно известны успешные попытки использования липосом для доставки 7аАМД к ДНК раковых клеток [Y. Hashimoto, 1983]. АМД при этом был внутри липосом, а липосомы были покрыты антителами к опухолевым клеткам
Определение константы диссоциации 7аАМД из комплекса со одноцепочечным олигонуклеотидом НР1. Далее произведено сопоставление результатов измерения флуоресцентных свойств ДНК и 7аАМД различными методами при наномолярных концентрациях Выполнялось измерения степени деполяризации флуоресценции, регистрировались корреляционные функции флуктуаций флуоресценции исследуемого образца. Адсорбция учитывалась согласно эмпирическому уравнению Фрейндлиха. Добавление данных ФКС в модель позволило не принимать во внимание адсорбцию, определяя концентрацию как свободного, так и связавшегося с НР1 флуорофора Это заметно повлияло на качество модели, обеспечив необходимую степень её самосогласованности.
Поляризационные измерения
Для измерения степени поляризации флуоресценции совместно с ФКС измерениями на микроскопе Axiovert (Zeiss, Germany), служащем основой ФКС микроспектрометра, использовался объектив, имеющий низкую апертуру и создающий поэтому гораздо меньшую плотность излучения в исследуемом объёме по сравнению с высокоапертурным конфокальным объективом, используемым для ФКС. В опытах использовался объектив с апертурой 0,12 К тому же, у низкоапертурного объектива практически отсутствовал деполяризующий эффект. Экспериментально были определены положения поляризаторов, при которых принципиально возможны измерения поляризации флуоресценции на установке ConfoCor. Флуоресценция регистрировалась из малого объема раствора, благодаря наличию в канале регистрации точечной диафрагмы Поляризационные измерения продемонстрировали образование комплекса между 7аАМД и одноцепочечным олигонуклеотидом в исследуемых образцах (рис. 11).
Р
036 0 34 -f 0 32 030 0 28 026
______* Рисунок И. Зависимость степени
поляризации флуоресценции (Р) 7аАМД от концентрации У одноцепочечной ДНК (НР1).
J
/ Концентрация 7аАМД - 100 нМ
I Температура 20° С Возбуждение
флуоресценции при 543 нм ---,----------, регистрация флуоресценции >610
100 200 300 400 50С 600 нм НР1.ИМ
Эффективные гидродинамические радиусы вращения 7аАМД и комплекса 7аАМД с НР1, рассчитанные из полученных данных по уравнению Лёвшина-Перрена, составляют 8,8 и 16,1 А соответственно Такое изменение радиуса
вращения соответствует увеличению объёма в 6,2 раза Нужно отметить, что точность определения размера частиц для поляризационных измерений на порядок выше, чем для измерений ФКС Приведенная оценка размера свободного 7аАМД (Сличается от оценки сделанной ранее на стационарном флуориметре ввиду различия концентрации (степени агрегированности) флуорофора' наномолярные концентрации в первом и микромолярные концентрации во втором случае.
Если оценить константу диссоциации 7аАМД из комплекса с одноцепочечным олигонуклеотидом НР1 без данных по поляризации, основываясь лишь на данных ФКС, то, даже учитывая адсорбцию согласно уравнению Фрейндлиха, мы получаем заниженное значение константы диссоциации комплекса. Для параметров уравнения Фрейндлиха, характеризующего адсорбцию 7аАМД на поверхность стенок измерительной ячейки получим к ~ 3350, а ~ 0,255 Меньшее единицы значение а означает, что адсорбция 7аАМД на стекло, скорее всего, это самоингибируемый процесс. Нельзя, впрочем, отрицать существования на стекле множества центров связывания с распределением констант диссоциации статистически отличным от нормального.
Дополнение поляризационных измерений данными ФКС позволяет не учитывать адсорбцию, что уменьшает число определяемых параметров и, как следствие, повышает достоверность определения параметров системы При этом к уравнению (2) добавляется дополнительно уравнение Ne=(a/Nj+ ab:Ni)/fg2, где Ne -эффективное число частиц в конфокальном объеме (пропорциональное абсолютной концентрации). В итоге имеем: Kd ~ 78±7 нМ (-9,5 кКал/моль). Предельно низкое значение константы диссоциации подтверждается опытом с вытеснением 7аАМД из комплекса с НР1 с помощью АМД. Определенное здесь значение характеризует наиболее специфическое связывание 7аАМД на НР1; оно свободно от влияния сорбции/десорбции на стенки и от образования димеров (которые нельзя сбрасывать со счетов при более высоких концентрациях, учитывая приведенную выше оценку). Это значение в полтора раза меньше найденного ранее в диапазоне концентраций 7аАМД до 10 мкМ [R M. Wadkins, 1996]. Необходимо отметить, что измерение поляризации выполнялось в том же диапазоне концентраций, с тем же образцом, в той же ячейке, что и ФКС, за времена, сравнимые со временами измерения ФКС.
ВЫВОДЫ
1. Определена энергетика интеркаляционного взаимодействия хромофорной части 7аАМД с ДНК, вычленены энтропийный вклад, вклад водородного связывания. Показано, что способность акцептировать водород при образовании водородной связи у 7аАМД выражена слабо и при комплексообразовании с ДНК не задействована.
2 В электронно-возбужденном состоянии, стабилизируемом любыми взаимодействиями с молекулами окружения, 7аАМД акцептирует водородную связь При этом переноса протона не происходит. Основное электронное состояние 7аАМД стабилизируется водородным связыванием по акцепторному типу и дестабилизируется водородным связыванием по донорному типу
3 Показана возможность встраивания 7аАМД в большую бороздку НР1 при высокой ионной силе. Установлено, что при образовании комплекса с 7аАМД
НР1 принимает форму Б-ДНК Окружение хромофорной части 7аАМД в ДНК, по сравнению с водным окружением, характеризуется в два раза более сильной способностью акцептировать водородные связи, благодаря кислородам фосфатных групп, и слабой способностью водородные связи предоставлять ДНК в значительной мере экранирует 7аАМД от взаимодействия с молекулами воды
4 Адсорбция 7аАМД на ДНК контролируется ионными и полярными взаимодействиями Образование комплекса характеризуется константой ассоциации в 2*10* М 'с'1 За процессом ассоциации следует конформационная подстройка 7аАМД и ДНК и перераспределение 7аАМД на ДНК с характерным временем в 40 с Процесс десорбции 7аАМД контролируется гидрофобными взаимодействиями 7аАМД на ДНК связан преимущественно в центрах с невысокой специфичностью Высокоспецифичными центрами связывания (константа диссоциации 78 нМ) являются одноцепочечные участки ДНК Наблюдается практически безбарьерное замещение 7аАМД на АМД в комплексе с НР1.
5 В водном растворе 7аАМД имеет два отличных по фотостабильности состояния На природной ДНК, в отличие от олигонуклеотида НР1, имеются центры связывания 7аАМД, в которых он существенно затушен. Вероятность обратимых переходов 7аАМД в нефлуоресцирующее состояние на природной ДНК выше, чем на НР1 на 26%. 7аАМД менее фотостабилен в ДНК обработанной ультразвуком по сравнению с нативной ДНК.
6. Были решены следующие методические задачи: Реализована возможность использования ФКС для флуорофоров с низким квантовым выходом. Дополнение ФКС поляризационными измерениями позволило в десять раз подшпь чувствительность ФКС к изменению объема флуоресцирующих частиц Установлено, что уравнение адсорбции на гетерогенную поверхность Фрейндлиха адекватно описывает неспецифическую адсорбцию 7аАМД на стекло со следующими параметрами, к = 3350, а = 0,255. Найдены условия, обеспечивающие постоянство низкой концентрации 7аАМД в ходе эксперимента.
7 В качестве модельных систем адресной доставки АМД к ДНК предлагается использовать олигонуклеотид НР1 и мицеллы тритона Х-100 Гидрофобное окружение 7аАМД в мицелле или в НР1, позволяющее достичь высоких концентраций 7аАМД в растворе, не препятствует взаимодействию 7аАМД с ДНК, но исключает неспецифическое взаимодействие 7аАМД Показано, что комплекс 7аАМД*НР1 легко адсорбируется на ДНК, но это не влияет на скорость его диссоциации Фотохимическая активность 7аАМД при связывании с ДНК заметно увеличивается, что обуславливает возможность использования 7аАМД в фотодинамической терапии Фотоустойчивость 7аАМД значительно повышается в мицеллах тритона Х-100.
СПИСОК РАБОТ АВТОРА, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. А.Э. Ковалев, А.А. Яковенко, Н Л. Векшин Исследование взаимодействия 7-аминоактиномицина с ДНК методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии. / Биофизика 2004, т. 49, N 6, с. 1030-7.
2. A. Agafonov, Е Gritsenko, К. Belosludtsev, A. Kovalev, О. Gateau-Roesch, N.-Б L. Saris, G.D. Mironova A permeability transition in liposomes induced by the formation of Ca2+/palmitic acid complexes. / Biochirmca et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 2003, V. 1609, Issue 2, p. 153-160.
3. A.B Агафонов, E.H. Гриценко, K.H. Белослудцев, А.Э. Ковалев, Г.Д. Миронова Связывание кальция с анионами пальмитиновой кислоты в мембране липосом приводит к формированию липидных пор. / Труды конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", г Пущино, 11-14 ноября 2002 г., с. 43.
4. Ю.В Шаталин, А.Э. Ковалев, И.В. Савинцев, Н.Л. Векшин Комплексы актиномицинов с олигонуклеотидами и ДНК. / Труды конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", г. Пущино, 11-14 ноября 2002 г., с 146.
5 A. Kovalev FCS Measurements of low fluorescent dye m nanomolar concentrations. / Theses of the "Euroanalysis-12" Dortmund, Germany. 8-13 September 2002, p. 231.
6. А. Ковалев Системный подход в флуоресцентной спектроскопии / Тезисы 6-ой Путинской конференции молодых ученых. Пущино, 20-24 мая 2002, с. 257.
7. А.Э. Ковалёв, Ю.В. Шаталин Выбор оптимального алгоритма для обработки данных флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС). / Тезисы IX международной конференции Математика. Компьютер. Образование, г Дубна, 28 января - 2 февраля 2002.
8. А.Э. Ковалев Выбор оптимального алгоритма для обработки данных флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС) / Труды IX международной конференции Компьютер Образование, г. Дубна, 28 января -
2 февраля 2002, вып. 9, ч. 2, с. 674. ;
9. И.В. Савинцев, А.Э. Ковалев, Н.Л. Векшин Механизм формирования ДНК- 1 аюиномициновых комплексов. / Сборник тезисов 5-ой конференции молодых
ученых 1. Пущино "Биология - наука 21 века" Пущино, 16-20 апреля 2001, с 48.
10 N. Vekshm, I. Savintsev, A. Kovalev, R. Yelemessov, and R.M. Wadkins Soivatochromism of the Excitation and Emission Spectra of 7-Aminoactinomycin
D: Implications for Drug Recognition of DNA Secondary Structures./ The Journal 1
of Physical Chemistry B, 2001, V. 105, N. 35, p. 8461-8467.
11 N. V ekshm, I. S avintsev, A. Kovalev, E. S mirnov, R. Y elemessov, D E. G raves, ■ and R.M. Wadkms Forces stabilizing the complex formed between 7-ammoactinomycin D and a DNA hairpin Soivatochromism and NMR studies./
Biophys. J. (Annual Meeting Abstracts) 2001, p. 487a.
Принято к исполнению 26/08/2005 Заказ № 994
Исполнено 29/08/2005 Тираж- 90 экз
ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru
$15445
РНБ Русский фонд
2006-4 11590
Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Ковалев, Александр Эдуардович
Принятые сокращения.
Введение.
Обзор литературы.
1.1 Историческая справка.
1.2 Общая характеристика актиномицинов.
1.3 Структура комплекса АМД - ДНК.
1.4 Специфика взаимодействия АМД с ДНК.
1.5 Энергетика взаимодействия АМД с ДНК.
1.6 Кинетика взаимодействия АМД и ДНК.
1.7 Выражение Камлета-Тафта: Линейное соотношение энергии сольватации.
1.8 Время жизни и поляризация флуоресценции. Уравнение Левшина -Перрена.
1.9 Флуориметрия в остановленном потоке (stopped flow).
1.10 Флуоресцентная корреляционная спектроскопия.
1.11 Уравнение Фредгольма первого рода.
1.12 Уравнение гетерогенной адсорбции Фрейндлиха.
Материалы и методы.
2.1 Используемые реактивы.
2.2 Регистрация спектров флуоресценции 7аАМД и его комплексов с ДНК, измерение поляризации и времени жизни флуоресценции.
2.3 Корреляционный анализ.
2.4 Флуориметрия в остановленном потоке.
2.5 Поиск оптимального алгоритма обработки КФ и их последующий анализ.
2.6 Поиск оптимальной по энергии структуры 7аАМД при помощи молекулярной динамики.
2.7 Измерения на установке ConfoCor.
2.8 Уравнение гетерогенной абсорбции Фрейндлиха.
2.9 Устранение влияния сорбции/десорбции 7аАМД на ход эксперимента.
Результаты и обсуждение.
3.1 Характеристика актиномицина и его комплексов с ДНК в тяжелой и обычной воде на основе спектральных данных.
3.2 Молекулярная динамика комплекса 7аАМД с НР1.
3.3 Анализ сольватохромного эффекта 7аАМД.
3.4 Исследование кинетики взаимодействия 7аАМД и ДНК.
3.5 Анализ корреляционных функций.
3.6 Измерение поляризации флуоресценции и ФКС на установке ConfoCor.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование ДНК-актиномициновых комплексов при низких концентрациях методами флуоресцентной спектроскопии"
Актуальность
Аюгиномицины - группа антибиотиков, образуемых различными актиномицетами, обладающих антибиотическим действием против грамположительных бактерий и некоторых грибов. Антимикробные свойства актиномицина нашли применение в биохимических и микробиологических исследованиях. В медицинской практике из актиномицинов широкое применение получил только актиномицин Д, реже используется актиномицин Ц и прочие актиномицины. Поэтому главным объектом исследования данной работы является именно актиномицин Д. Актиномицин Д (АМД) успешно применяется в противоопухолевой терапии с сороковых годов прошлого столетия и по сей день. Применяют АМД самостоятельно или, чаще, в сочетании с другими лекарственными средствами (адриамицин, циклофосфан и др.) и лучевой терапией при трофобластической болезни (например, хориокарцинома матки), опухоли Вильмса и саркоме Эвинга, рабдомиосаркоме у детей, ретикулосаркоме, опухоли Юинга, злокачественных опухолях яичка, лимфогранулематозе, при комбинированной химиотерапии диссеминированной меланомы и других опухолях [J. Verweij, 1996]. Действие АМД основано на том, что он прочно связывается с ДНК, блокируя, тем самым, полимеразную активность. АМД и его производные способны блокировать обратную транскриптазу (например, вируса иммунодефицита человека), специфически связываясь с одноцепочечной ДНК, ДНК/РНК гибридами [М. Shinomiya, 1995]. Недавно обнаруженная способность актиномицина специфически связываться с ЦТГ/ЦАГ повторами [М.-Н. Нои, 2002] позволяет надеяться, что актиномицин найдет свое применение и при лечении ряда наследственных неврологических заболеваний: хорее Гентингтона, миотонической дистрофии, спиноцеребральной атаксии, миотонической атрофии спинного и продолговатого мозга. Вместе с тем, при применении препарата возможны множественные побочные эффекты: тошнота, рвота, повышение температуры тела, стоматит, кожные высыпания, алопения, лейкопения, тромбоцитопения, панцитопения. При попадании АМД под кожу развивается некроз кожи.
В настоящее время ведётся активный поиск более эффективных в терапевтических целях и менее токсичных производных актиномицинов [Е.Б. Морошкина, 2000]. Вышесказанное, в контексте роста числа онкологических заболеваний [A. Jemal, 2004], объясняет повышенный интерес к изучению физико-химических свойств и деталей механизмов действия противоопухолевых агентов.
Наиболее вероятный механизм действия АМД состоит в том, что он связывается с высокой специфичностью с уже существующими или возникающими в результате тепловых флуктуаций одноцепочечными участками ДНК, содержащими гуанин и способными образовывать шпилечные структуры, стабилизирует их в конформации шпильки. Низкая константа диссоциации АМД из комплекса с ДНК (порядка 100 нМ) и низкая скорость диссоциации комплекса (с характерным временем порядка 100 с) объясняют эффективность блокирования ДНК-матрицы для считывания полимеразами. Этот механизм объясняет также способность АМД блокировать обратную транскриптазу [R.L. Rill, 1996].
Методы исследования
Большинство современных моделей межмолекулярного взаимодействия базируются на данных рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса (ЯМР). С помощью ЯМР исследуются достаточно концентрированные растворы. Для проведения рентгеноструктурного анализа, как известно, исследуемое вещество должно находиться в кристаллическом состоянии. Для клинического использования производных АМД важно знать механизм их действия в физиологических (микро- и субмикромолярных) концентрациях. Изучение механизма межмолекулярных взаимодействий при низких концентрациях позволяет исключить влияние кооперативных и неспецифических эффектов. Результаты ЯМР и рентгеноструктурного анализа, тем не менее, могут быть взяты за основу для построения модели взаимодействия ДНК - противоопухолевое вещество в растворе. Необходимо отметить, что исследования в области низких концентраций могут быть сопряжены с рядом технических трудностей, таких как неспецифическая адсорбция, уменьшение соотношения сигнал/шум.
Флуоресцентные методы обладают гораздо большей чувствительностью и позволяют проводить исследования в диапазоне микро- и даже наномолярных концентраций исследуемого вещества. У АМД имеется флуоресцирующее аминопроизводное - 7-аминоактиномицин Д (7аАМД) с идентичным биологическим действием [Y.-C. Chiao, 1979]. Оно и являлось основным объектом настоящего исследования. Для изучения взаимодействия 7аАМД с ДНК нами использовались стационарная флуорометрия и флуорометрия в остановленном потоке, флуоресцентная корреляционная спектроскопия; производились измерения времени жизни и поляризации флуоресценции; исследовался сольватохромный эффект.
Как относительно малоизвестный необходимо в нескольких словах представить метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС), позволяющий характеризовать очень малые количества флуорофора. Метод ФКС позволяет в объёме порядка 10"15 литра одновременно измерять: абсолютную концентрацию флуоресцирующих частиц (в наномолярном диапазоне), степень их связанности (например, с ДНК) и характеризовать микроокружение флуоресцирующих частиц (по изменению эффективности флуоресценции). Область применимости данного метода, кроме возможности непосредственного изучения флуоресцирующих веществ, включает в себя возможность исследовать флуоресцирующие аналоги исследуемых соединений, вещества, способные связывать флуоресцирующие вещества, исследовать конкурентные взаимоотношения исследуемых и флуоресцирующих веществ. С помощью корреляционной спектроскопии имеется возможность зарегистрировать лишь существенные изменения объёма флуоресцирующих частиц - на порядок, что далеко не всегда бывает достаточно для изучения процессов комплексообразования.
Цель и объекты исследования
Несмотря на огромное количество публикаций, многие вопросы относительно АМД до сих пор остаются без ответа, существуют в литературе и некоторые противоречия. Так до сих пор не была выполнена оценка роли воды и водородных связей при образовании комплекса между АМД и ДНК, несмотря на попытки использования АМД в фотодинамической терапии не были охарактеризованы его электронно-возбужденное состояние и его фотохимическая активность. До сих пор не известна конфигурация комплекса АМД*ДНК в растворе, существуют противоречивые объяснения механизмов образования и диссоциации комплексов, не были исследованы процессы конкурентного замещения АМД в комплексе АМД*ДНК, не оценивалась неспецифическая адсорбция, являющаяся причиной цитотоксичности, не были должным образом охарактеризованы системы адресной доставки АМД к ДНК клетки, не ясно чем объясняется красный сдвиг спектра поглощения 7аАМД при взаимодействии с ДНК.
В связи с вышеизложенным, цель настоящего исследования - дальнейшее изучение физико-химических свойств взаимодействия 7аАМД и АМД с ДНК при низких концентрациях флуоресцентными методами.
В опытах использовались АМД, флуоресцирующий 7аАМД, различные виды природной ДНК, фрагментированная ультразвуком ДНК тимуса телёнка, одноцепочечный шпилечный олигонуклеотид - НР1.
Задачи исследования
Для достижения сформулированной выше цели предполагалось решить следующие задачи:
- Охарактеризовать энергетику взаимодействия 7аАМД с ДНК при низких концентрациях, оценить вклады водородного связывания в энергию взаимодействия феноксазинового цикла 7аАМД с ДНК и определить степень участия воды в формировании комплекса.
- Определить энергетически наиболее выгодную конфигурацию 7аАМД и НР1 в образуемом ими комплексе.
- Попытаться установить механизмы, определяющие кинетику ассоциации/диссоциации 7аАМД с ДНК.
- Исследовать электронно-возбужденное состояние 7аАМД в комплексе с ДНК, его фотохимическую активность, ввиду важности этой информации для фотодинамической терапии.
- Найти молекулярные причины "красного" сдвига максимума спектра поглощения 7аАМД при его взаимодействии с ДНК.
- Охарактеризовать шпилечный олигонуклеотид и мицеллу как модели средств адресной доставки АМД, представляющие интерес в терапевтических целях.
Кроме того, необходимо было решить ряд методических задач:
- Совместить ФКС измерения с измерениями поляризации флуоресценции для обеспечения на порядок более высокой чувствительности ФКС к размеру флуоресцирующих частиц.
- Выполнить поиск и адаптацию алгоритма, позволяющего оценивать молекулярные параметры в эксперименте ФКС в присутствии фоновой флуоресценции для флуорофоров с низким квантовым выходом.
- Исследовать свойства неспецифической адсорбции 7аАМД, найти условия, позволяющие устранить влияние этой адсорбции в ходе эксперимента.
Полученные экспериментальные данные определяют выбор адекватных молекулярных моделей взаимодействия ДНК - противоопухолевое вещество в растворе, представляют ценную информацию для разработки лекарственных препаратов нового поколения.
Обзор литературы
Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Ковалев, Александр Эдуардович
Выводы
1. Определена энергетика интеркаляционного взаимодействия хромофорной части 7аАМД с ДНК, вычленен энтропийный вклад, вклад водородного связывания. Показано, что способность акцептировать водород при образовании водородной связи у феноксазина 7аАМД выражена слабо и при комплексообразовании с ДНК не задействована. Основное электронное состояние 7аАМД стабилизируется водородным связыванием по акцепторному типу и дестабилизируется водородным связыванием по донорному типу. В электронно-возбужденном состоянии, стабилизируемом любыми взаимодействиями с молекулами окружения, у 7аАМД появляется и реализуется способность к водородному связыванию по акцепторному типу. Переноса протона при этом не происходит.
2. Была показана возможность встраивания 7аАМД в большую бороздку НР1. Установлено, что НР1 в комплексе с 7аАМД принимает форму Б-ДНК. Окружение хромофорной части 7аАМД в ДНК, по сравнению с водным окружением, характеризуется в два раза более сильной способностью акцептировать водородные связи, благодаря кислородам фосфатных групп, и слабой способностью водородные связи предоставлять. ДНК в значительной мере экранирует 7аАМД от взаимодействия с молекулами воды.
3. Адсорбция 7аАМД на ДНК контролируется ионными и полярными взаимодействиями. Образование комплекса характеризуется константой ассоциации в 2*104 М-1 с1. За процессом ассоциации следует конформационная подстройка 7аАМД и ДНК с характерным временем в 40 с. Процесс десорбции 7аАМД контролируется, в основном, гидрофобными взаимодействиями. Высокоспецифичными центрами связывания (константа диссоциации 78 нМ) являются одноцепочечные последовательности способные образовывать шпиличные (крестообразные) структуры. Наблюдается практически безбарьерное замещение 7аАМД на АМД в комплексе с НР1.
4. При взаимодействии с ДНК растет эффективность флуоресценции 7аАМД, уменьшается доля затушенных молекул флуорофора, но происходит уменьшение фотостабильности последнего. В водном растворе 7аАМД имеет два отличных по фотостабильности состояния. На природной ДНК, в отличие от олигонуклеотида НР1, имеются центры связывания 7аАМД, в которых его флуоресценция существенно затушена. Вероятность обратимых переходов 7аАМД в нефлуоресцирующее состояние на природной ДНК выше, чем на НР1 на 26%. 7аАМД менее фотостабилен в обработанной ультразвуком по сравнению с нативной ДНК.
5. Были решены следующие методические задачи: Выбран и адаптирован алгоритм оптимальный для обработки результатов ФКС для флуорофоров с низким квантовым выходом. Дополнение ФКС поляризационными измерениями позволило в десять раз поднять чувствительность ФКС к изменению объема флуоресцирующих частиц. Установлено, что уравнения адсорбции на гетерогенную поверхность Фрейндлиха адекватно описывает адсорбцию 7аАМД на стекло со следующими параметрами: к = 3350, а -0,255. Найдены условия, обеспечивающие постоянство низкой концентрации 7аАМД в ходе эксперимента.
6. В качестве модельных систем адресной доставки АМД к ДНК предлагается использовать олигонуклеотид НР1 и мицеллы тритона Х-100. Гидрофобное окружение 7аАМД в мицелле или в НР1, позволяющее достичь высоких концентраций 7аАМД в растворе, не препятствует взаимодействию 7аАМД с ДНК, но исключает неспецифическое взаимодействие 7аАМД Процесс ресорбции 7аАМД с НР1 на ДНК протекает в две стадии: в начале происходит адсорбция комплекса 7аАМД*НР1 на ДНК, затем самопроизвольная диссоциация 7аАМД из комплекса с НР1 и формирование комплекса с ДНК. Фотохимическая активность 7аАМД при связывании с ДНК заметно увеличивается, что обуславливает возможность использования 7аАМД в фото динамической терапии. В мицеллах тритона Х-100 фотоустойчивость 7аАМД значительно повышается.
Список опубликованных работ по теме диссертации
1. А.Э. Ковалев, А.А. Яковенко, H.JI. Векшин Исследование взаимодействия 7-аминоактиномицина с ДНК методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии. / Биофизика 2004, т. 49, N 6, с. 1030-7.
2. A. Agafonov, Е. Gritsenko, К. Belosludtsev, A. Kovalev, О. Gateau-Roesch, N.-E.L. Saris, G.D. Mironova A permeability transition in liposomes induced by the formation of Ca2+/palmitic acid complexes. / Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 2003, V. 1609, Issue 2, p. 153-160.
3. A.B. Агафонов, E.H. Гриценко, K.H. Белослудцев, А.Э. Ковалев, Г.Д. Миронова Связывание кальция с анионами пальмитиновой кислоты в мембране липосом приводит к формированию липидных пор. / Труды конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", г. Пущино, 11-14 ноября 2002 г., с. 43.
4. Ю.В. Шаталин, А.Э. Ковалев, И.В. Савинцев, H.JI. Векшин Комплексы актиномицинов с олигонуклеотидами и ДНК. / Труды конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", г. Пущино, 11-14 ноября 2002 г., с. 146.
5. A. Kovalev FCS Measurements of low fluorescent dye in nanomolar concentrations. / Theses of the "Euroanalysis-12" Dortmund, Germany. 8-13 September 2002, p. 231.
6. А. Ковалев Системный подход в флуоресцентной спектроскопии. / Тезисы 6- ой Пущинской конференции молодых ученых. Пущино, 20-24 мая 2002, с. 257.
7. А.Э. Ковалёв, Ю.В. Шаталин Выбор оптимального алгоритма для обработки данных флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС). / Тезисы IX международной конференции Математика. Компьютер. Образование, г. Дубна, 28 января - 2 февраля 2002.
8. А.Э. Ковалев Выбор оптимального алгоритма для обработки данных флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС). / Труды IX международной конференции. Компьютер. Образование, г. Дубна, 28 января - 2 февраля 2002, вып. 9, ч. 2, с. 674.
9. И.В. Савинцев, А.Э. Ковалев, H.JI. Векшин Механизм формирования ДНК-актиномициновых комплексов. / Сборник тезисов 5-ой конференции молодых ученых г. Пущино "Биология - наука 21 века". Пущино, 16-20 апреля 2001, с. 48.
10. N. Vekshin, I. Savintsev, A. Kovalev, R. Yelemessov, and R.M. Wadkins Solvatochromism of the Excitation and Emission Spectra of 7-Aminoactinomycin D: Implications for Drug Recognition of DNA Secondary Structures./ The Journal of Physical Chemistry B, 2001, V. 105, N. 35, p. 84618467.
11. N. Vekshin, I. Savintsev, A. Kovalev, E. Smirnov, R. Yelemessov, D.E. Graves, and R.M. Wadkins Forces stabilizing the complex formed between 7-aminoactinomycin D and a DNA hairpin: Solvatochromism and NMR studies./ Biophys. J. (Annual Meeting Abstracts) 2001, p. 487a.
Заключение
В данной работе для анализа межмолекулярного взаимодействия использовались различные флуоресцентные методы, работающие при исключающих кооперативные эффекты, эффекты неспецифического связывания физиологически-низких концентрациях антибиотика. 7-аминоактиномицин Д (7аАМД) обладает высоким сродством к одноцепочечным участкам ДНК способным образовывать шпилечные структуры. В процессе комплексообразования с ДНК АМД в первую очередь связывается с ними, но на природной ДНК концентрация таких центов мала. Поэтому АМД связывается с менее специфическими центрами, число которых во много раз больше. Энергия взаимодействия 7аАМД с усредненным центром на природной ДНК на -2,7 кКал/моль ниже энергии взаимодействия с наиболее специфичным центром. Связываясь с двухцепочечными участками, АМД вызывает медленные конформационные изменения в ДНК. Было показано, что в основном электронном состоянии аминогруппа феноксазинового цикла 7аАМД образует водородную связь с фосфатной группой ДНК. Это взаимодействие и определяет красный сдвиг в спектре возбуждения 7аАМД при его переходе из водного окружения в ДНК. В электронно-возбужденном состоянии карбонильный кислород хинола либо 012 образуют водородную связь. В комплексе с ДНК 7аАМД существенно экранирован от молекул воды. Актиномицин Д (АМД) способен, связываясь со шпилечным олигонуклеотидом, конкурентно вытеснять 7аАМД из комплекса, при этом энергетический барьер такой замены очень мал. Был обнаружен эффект сорбции комплекса 7аАМД*НР1 на ДНК и последующей ресорбции 7аАМД из комплекса с НР1 на ДНК. То есть НР1 способен выполнять функцию адресной доставки актиномицинов.
На примере 7-аминоакгиномицина Д была продемонстрирована возможность расширить рамки метода флуоресцентной корреляционной спектроскопии для измерений с использованием слабо флуоресцирующих поверхностно-активных флуорофоров. Результаты ФКС на первый взгляд выглядят необычно. Так, в отличие от стационарной флуориметрии, в ФКС наблюдается ослабление общей флуоресценции (но не квантового выхода)
7аАМД при связывании с ДНК. Нельзя сказать, что данные ФКС противоречат данным, полученным с помощью стандартной флуоресцентной спектроскопии. От части, различия результатов обусловлены фотохимической активностью 7аАМД и использованием гораздо большей плотности возбуждающего света в микроспектрофлуориметре ConfoCor по сравнению со стандартным спектрофлуориметром. В случае стандартной спектрофлуориметрии регистрируется флуоресценция от всех молекул 7аАМД. В случае ФКС - в основном от фотостабильной фракции (возможно, изоформы) 7аАМД.
Использование наномолярных концентраций 7аАМД в эксперименте осложняется высокой адсорбция 7аАМД на стенки измерительной ячейки. Но вклады, соответствующие сорбции красителя, могут быть исключены из уравнений, описывающих изучаемую систему, если данные ФКС дополнить измерениями поляризации флуоресценции.
Удалось показать, что 7аАМД на ДНК находится в двух состояниях: фотостабильном (меньшая часть, с вероятной локализацией красителя в пурин-пиримидиновом стэкинговом окружении) и в фотохимически-активном (большая часть), когда 7аАМД локализован в шпилечных (крестообразных) структурах и разрывах ДНК. 7аАМД связывается с ДНК прочнее, чем АМД. Уточнена константа димеризации АМД. Фотохимическая активность связанного 7аАМД возрастает в ряду: мицеллы тритона Х-100 - водный раствор - димеры с АМД - комплекс с ДНК.
Фотохимическая активность 7аАМД заметно возрастает, после того как он связывается с ДНК, что позволяет использовать его в фотодинамической терапии. Наиболее фотохимически активным оказалось состояние во фрагментированной тимусной ДНК, наименее фоточувствительным - в плазмиде pGEM3Zf(+). Фотодеструкция 7аАМД имеет как минимум два характерных времени. В мицеллах тритона Х-100 7аАМД наиболее фотостабилен. Мицеллы и шпилечные олигонуклеотиды не позволяют актиномицину адсорбироваться неспецифически, но, при этом, не затрудняют взаимодействие со специфическими центрами связывания. В случае олигонуклеотида НР1 происходит быстрая адсорбция комплекса 7аАМД*НР1 на ДНК, затем медленная, в течение минуты, диссоциация 7аАМД из комплекса с быстрым локальным связыванием на ДНК. В случае мицеллы тритона Х-100 ДНК проникает в мицеллу и уже в гидрофобном окружении происходит взаимодействие 7аАМД с ДНК.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Ковалев, Александр Эдуардович, Пущино
1. К.В. Балдин, О.Ф. Быстрое, М.М. Соколов Эконометрика. ЮНИТИ 2004, 254 с.
2. H.JI. Векшин Фотоника биологических систем. Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1988,164 с.
3. Дж. Лакович Основы флуоресцентной спектроскопии. Пер с англ. М., Мир, 1986.
4. Л.В. Левшин, A.M. Салецкий Оптические методы исследования молекулярных систем. Ч. 1. Молекулярная спектроскопия. М.: Изд-во МГУ, 1994. 320 с.
5. В.А. Морозов, Н.Л. Гольдман Численный алгоритм решения интегральных уравнений Фредгольма I рода методом поточечной невязки. В сб.: Методы и алгоритмы в численном анализе. М.: Изд-во МГУ, 1981, стр. 28-43.
6. Е.Б. Морошкина, Е.А. Кузьменко (Квачадзе), М.А. Кривцова, Е.Н. Глибин. Взаимодействие ДНК с амидами актиноцина. / Молекулярная биология 2000, Т. 34, N 3, с. 448-455.
7. Л. К. Мусалимова, Е. Г. Давыдова Клеточные оболочки дрожжей -сорбенты ионов тяжелых металлов. / Материалы XXXVII международной научной студенческой конференции. Новосибирск 1999.
8. А.И. Олемский, А.Я. Флат Использование концепции фрактала в физике конденсированной среды. / УФН 1993, Т. 163, N. 12, с. 1-50.
9. С.Л. Ощепков, О.В. Дубовик Оптимизированный итерационный метод для численного решения интегрального уравнения первого рода в положительно определенных значениях. / Физика атмосферы и океана, 1994.
10. И.В. Савинцев, А.Э. Ковалев, Н.Л. Векшин Механизм формирования ДНК-актиномициновых комплексов. / Сборник тезисов V конференции молодых ученых г. Пущино "Биология наука 21 века", Пущино 16-20 апреля 2001 г, с. 48.
11. А.Н. Тихонов О регуляризации некорректно поставленных задач. ДАН СССР 1963, т. 153, N 1.
12. В.В. Фролкис Старение и увеличение длительности жизни. Л. 1988, 237 с.
13. М.Н. Abraham / Journal of Chemical Society, Perkin Trans. 1972, V. 2, p. 1343.
14. S.R. Aragon, R. Pecora Fluorerescence correlation spectroscopy as a probe of molecular dynamics. /J. Chem. Phys. 1976, V. 64, p. 1791-1803.
15. A. Aretxaga, S. Romero, M. Sarra, T. Vicent Adsorption step in biological degradation of textile dye. / Biotechnol. Prog. 2001, V. 17, N. 4, pp. 664-8.
16. E.M. Arnett, L. Joris, E. Mitchell, T.S.S. Murty, T.M. Gorrie, and P.v.R. Schleyer / Journal of the American Chemical Society 1970, V. 92, p. 2364.
17. N. Asaad, M.J. den Otter, J.B. Engberts Aqueous solutions that model the cytosol: studies on polarity, chemical reactivity and enzyme kinetics. / Org. Biomol. Chem. 2004, V. 2(9), pp. 1404-12.
18. H.W. Atkin, and W.R. Gilkerson / The Journal of the American Chemical Society 1973, V. 95, p. 8551.
19. H.E. Auer, B.E. Pawlowski-Konopnicki, T.R. Krugh The absorption spectrum of actinomycin D. Evidence for three transitions in the visible band. / FEBS Letters 1977, V. 73, N2, pp. 167-170.
20. H.E. Auer, B.E. Pawlowski-Konopnicki, Y.-C.C. Chiao, T.R. Krugh Resolution of electronic absorption bands and nucleotide binding process in actinomycin D. / Biopolymers 1978, V. 17, pp. 1891-1911.
21. S.A. Bailey, D.E. Graves, R. Rill, and G. Marsch Influence of DNA base sequence on the binding energetics of actinomycin D./ Biochemistry 1993, V. 32, pp. 5881-7.
22. J. Basu, N. Padhy, A. Mookerjee An insight into the structure of DNA through melting studies. / Indian J. Biochem. Biophys. 1990, V. 27, N 4, pp. 202-8.
23. A.S. Benight, F.J. Gallo, T.M. Paner, K.D. Bishop, F.D. Faldasz, and M.J. Lane Advances in Biophysical Chemistry. JAI Press Inc., Greenwich, CT 1995, V. 5, pp 1-55.
24. K.M. Berland, P.T.C. So, E. Gratton Two-photon fluorescence correlation spectroscopy: Method and application to the intracellular environment. / Biophys. J. 1995, V. 68, pp. 694-701.
25. R. Bittman, L. Blau Stopped-flow kinetic studies of actinomycin binding to DNAs./ Biochemistry 1975, V. 14, p. 2138-2145.
26. G. Bonnet, O. Krichevsky, A. Libchaber Kinetics of conformational fluctuations in DNA hairpin-loops. / Proc Nad Acad Sci U S A 1998 Jul 21, V. 95, N 15, pp. 8602-6
27. H. Brakhage On ill-posed problems and the method of conjugate gradients in H.W. Engel & C.W. Groetsch (Eds.) Inverse and ill-posed problems, Academic Press, Boston, 1987.
28. L.G. Brooker, G.H. Keyes, D.W. Heseltine / J. Am. Chem. Soc. 1951, V. 73, pp. 5350-6.
29. L.G.S. Brooker, A.C. Craig, D.W. Heseltine, P.W. Jenkins, and L.L. Lincoln / The Journal of the American Chemical Society 1965, V. 87, p. 2443.
30. D.R. Brown, M. Kurz, D.R. Kearns, and V.L. Hsu Formation of multiple complexes between actinomycin D and a DNA hairpin: Structural characterization by multinuclear NMR. / Biochemistry 1994, V. 33, pp. 651-664.
31. S. Brownstein / Can. J. Chem. 1960, V. 38, p. 1590.
32. C. Brown, R. Shafer Kinetic studies of actinomycin D binding to mono-, oligo-, and polynucleotides. / Biochemistry 1987, V. 26, pp. 277-282.
33. J. Burgess / Spectrochimica acta Part A 1970, V. 26, p. 1957.
34. S.T. Burns, A.A. Agbodjan, M.G. Khaledi Characterization of solvation properties of lipid bilayer membranes in liposome electrokinetic chromotography. / J. Chromotogr. A 2002, V. 973, pp. 167-76.
35. P. Bustamante, A. Martin, M.A. Gonzalez-Guisandez Partial solubility parameters and solvatochromic parameters for predecting the solubility of single and multiple drugs in individual solvents. / J. Pharm. Sci. 1993, V. 82, N 6, pp. 635-40.
36. M.T. Chahine Determination of the temperature profile in an atmosphere from its outgoing radiance. / JOSA 1968, V. 58, No. 12, pp 1634-7.
37. J.B. Chaires, N. Dattagupta, D.M. Crothers Self-associacion of daunomycin./ Biochemistry 1982, V. 21, N 17, pp.3927-32.
38. K. Chattopadhyay, S. Saffarian, E.L. Elson, C. Frieden Measuring unfolding of proteins in the presence of denaturant using in fluorescence correlation spectroscopy. / Biophys. J. 2005, V. 88, N 2, pp. 1413-22.
39. F.-M. Chen, C.M. Jones, and Q.L. Johnson Dissociation kinetics of actinomycin D from oligonucleotides with hairpin motifs. / Biochemistry 1993, V. 32, p. 5554-9.
40. F.-M. Chen, F. Sha, K-H. Chin, and S.-H. Chou Binding of actinomycin D to single-stranded DNA of sequence motif d(TGTCTnG) and d(TGTnGTCT)./ Biophys. J. 2003, V. 84, pp 432-9.
41. F.-M. Chen, F. Sha, K-H. Chin, and S.-H. The nature of actinomycin D binding to d(AACCAXYG) sequence motif./ Nuc. Acid Res. 2004, V. 32, No 1, pp 271277.
42. S.C. Cheung, G. Medoff, D. Schlessinger, G.S. Kobayashi Response of yeast and mycelial phase of Histoplasma capsulatum to amorphotericin В and actinomycin D. / Antimicrob. Agents Chemother. 1975, V. 8, No. 4, pp. 498-503.
43. Y.-C. Chiao, K.G. Rao, J.W. Hook, T.R. Krugh, S.K. Sengupta 7-Amino-actinomycin D complexes with deoxynucleotides as models for binding of the drug to DNA. / Biopolymers 1979, V. 18, No. 7, pp. 1749-62.
44. L. Chinsky, P.Y. Turpin Ultraviolet resonance Raman study of DNA and of its interaction with actinomycin D. / Nucleic Acid Res. 1978, V. 5, N 8, pp. 296977.
45. A. Delon, Y. Usson, J. Derouard, T. Biben, C. Souchier Photobleaching, mobility, and compartmentalization: interference in fluorescence correlation spectroscopy. / J. Fluoresc. 2004, V. 14, N. 3, pp. 255-67.
46. K. Dimroth, C. Reichardt, T. Seipmann, and F. Bohlmann / Justus Liebigs Ann. Chem. 1963, V. 661, p. 1.
47. E.L. Elson, D. Madge Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. / Biopolymers 1974, V. 13, pp. 1-27.
48. A. Ehrenberg, R. Rigler Rotational Brownian-motion and fluorescence intensity fluctuations. / Chem. Phys. 1974, V. 4, pp. 390-401.
49. G.R. Famini, D. Aguiar, M.A. Payne, R. Rodriquez, L.Y. Wilson Using the theoretical linear solvation energy relationship to correlate and predict nasal pungency threshold. / J. Mol. Graph. Model 2002, V. 20,4, p.277-80.
50. Z. Foldes-Papp, U. Demel, G.P. Tilz Ultrasensitive detection and identification of fluorescent molecules by FCS: Impact for immunobiology. / Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Sep 25, V. 98, N 20, pp. 11509-14.
51. F.W. Fowler, A.R. Katritzky, and R.J.D. Rutherford / J. Chem. Soc. В 1971, V. 160, p. 460.
52. С.A. Frederick, G.J. Quigley, M.K. Teng, M. Coll, G.A. Van der Marel, J.H. Van Boom, A. Rich, A.H. Wang Molecular structure of an A-DNA decamer d(ACCGGCCGGT). / Eur J Biochem. 1989, V. 181, N 2, pp. 295-307.
53. H. Freundlich Colloid and Capillary Chemistry. Methuen. London. 1926.
54. X.C. Fu, Y.W. Dai Prediction of percutaneous drug permeability using modified theoretical linear solvation energy relationship. / Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2003, V. 32, N 4, pp. 352-5.
55. E.F. Gale, E. Cunliffe, P.E. Reynolds, M.H. Richmond, M.J. Waring The molecular basis of antibiotic action. / John Wiley and Sons, London, 1981.
56. J.E. Gill, M.M. Jotz, S.G. Young, E.J. Modest and S.K. Sengupta 7-Amino-actinomycin D as a cytochemical probe. I. Spectral properties. / J Histochem. Cytochem. 1975, V. 23, N 11, pp. 793-9.
57. T. Gramstad, and J. Sandstrom / Spectrochim. Acta Part A 1969, V. 25, p. 31.
58. A. Gomez-Hens, M.P. Aguilar-Caballos Stopped-flow fluorescence polarization immunoassay. / Comb. Chem. High Throughput. Screen. 2003, V. 6, N. 3, pp. 177-82.
59. J. Goodisman, R. Rehfuss, B. Wang, J.C. Dabrowiak Site-specific binding constants for actinomycin D on DNA determined from footprinting studies./ Biochemistry 1992, V. 31, pp. 1046-58.
60. D. Gurka, R.W. Taft, L. Joris, and P.v.R. Schleyer / The Journal of the American Chemical Society 1967, V. 89, p. 5957.
61. D. Gurka and R.W. Taft / The Journal of the American Chemical Society 1969, V. 91, p. 4794.
62. R. Hahin, A. Kondratiev ED50 AP block predictions for phenyl substituted n-alkanols / J. Membr. Biol. 2001, V. 180, p. 137-145.
63. P.C. Hansen The truncated SVD as a method for regularization. / ВГГ 1987, V. 27, pp. 543-553.
64. R.J. Hanson A numerical method for solving Fredholm integral equations of the first kind using singular values. / SIAM J. Numer. Anal. 1971, V. 8, N 3, pp. 616-22.
65. Y. Hashimoto, M. Sugawara, T. Masuko, H. Hojo Antitumor effect of actinomycin D entrapped in liposomes bearing subunits of tumor-specificmonoclonal immunoglobulin M antiody. / Cancer Res. 1983, V. 43, N 11, pp. 5328-34.
66. U. Haupts, S. Maiti, P. Schwille, W.W. Webb Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. Proc Nad Acad Sci U S A 1998 Nov 10, V. 95, N 23, pp. 13573-8.
67. J.H. Hildebrand, R.L. Scott The solubility of nonelectrolytes. 3rd ed.; Dover Publ.: NY, 1964.
68. J.C. Horng, S.M. Tracz, KJ. Lumb, D.P. Raleigh Slow folding of a three-helix protein via a compact intermediate. / Biochemistry 2005, V. 44, N 2, pp. 627-34.
69. M.-H. Hou, H. Robinson, Y.-G. Gao and A.H.-J. Wang Crystal structure of actinomycin D bound to the CTG triplet repeat sequences linked to neurological deseases. / Nucl. Acid Res. 2002, V. 30, N 22, pp. 4910-7.
70. Z. Huang, N.L. Thompson Imaging fluorescence correlation spectroscopy: nonuniform IgE distributions on planar membranes. / Biophys. J. 1996, V. 70, pp. 2001-2007.
71. R.D. Icenogle, E.L. Elson Fluorescence correlation spectroscopy and photobleaching recovery of multiple binding reactions. I. Theory and FCS measurements. Biopolymers 1983, V. 22, pp. 1919-1948.
72. T.N. Inada, K. Kikuchi, Y. Takahashi, H. Ikeda, T. Miyashi A comparative study on electron-transfer fluorescence quenching by aliphatic and aromatic amines. / J. Photochem. Photobiol. A. 2000, V. 137, pp. 93-97.
73. Y. Ishihama, N. Asakawa Characterization of lipophilicity scales using vectors from solvation energy descriptors. / J. Pharm. Sci. 1999, V. 88, pp. 1305-12.
74. E.A. Jares-Erijman , Е.А., R. Klement, R. Machinek, R.M. Wadkins, L.A. Marky, B.I. Kankia and T.M. Jovin Binding of actinomycin D to single-stranded DNA. / Nucleosides and Nucleotides 1997, V. 16, pp. 661-7.
75. S. Kamitory and F. Takusagawa Crystal structure of the 2:1 complex between d(GAAGCTTC) and the anticancer drug actinomycin D. / J. Mol. Biol. 1992, V. 225, N 2, pp. 445-56.
76. S. Kamitory and F. Takusagawa Multiple binding models of anticancer drug actinomycin D: X-ray, molecular modeling, and spectroscopic studies of d(GAAGCTTC)-actinomycin D complexes and its host DNA. / J. Am. Chem. Soc. 1994, V. 116, pp. 4154-65.
77. M.J. Kamlet, R.W. Taft The solvatochromic comparison method. I. The уЗ-scale of solvent hydrogen-bond acceptor (HBA) basicities./ Journal of the American Chemical Society 1976, V. 98, N 2, pp. 377-387.
78. M.J. Kamlet, J.L. Abboud, and R.W. Taft The solvatochromic comparison method. 6. The n* scale of solvent polarities./ Journal of the American Chemical Society 1977, V. 99, N 18, p. 6027-6038.
79. P. Kask, R. Piksarv, U. Mets Fluorescence correlation spectroscopy in the nanosecond time range: photon antibunching in tdye fluorescence. Eur. Biophys. J. 1985, V. 12, pp. 163-6.
80. A.R. Katritzky, T. Tamm, Y. Wang, M. Karelson A unified treatment of solvent properties./ J. of Chemical Information and Computer Sciencies 1999, V. 39, N 4, pp. 692-8.
81. M.M. Khan, T.J. Lindell Actinomycin D binds with highest affinity to nonribosomal DNA. / J. Biol. Chem. 1980 Apr., V. 25, pp. 3581-3584.
82. M. Kinjo, G. Nishimura, T. Koyama, Mets, R. Rigler Single-molecule analysis of restriction DNA fragments using fluorescence correlation spectroscopy. Anal Biochem 1998 Jul 1, V. 260, N 2, pp. 166-72.
83. J. Klingler, T. Friedrich Site-specific interaction of thrombin and inhibitors observed by fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 1997, V. 73, pp. 2195-2200.
84. I.A. Koppel and V.A. Palm / Reakt. sposobn. org. soed. 1969, V. 4, p. 504.
85. I.A. Koppel and V.A. Palm "Advances in Linear Free Energy Realtionships", N.B. Chapman and J. Shorter, Ed., Plenum Press, London, Chapter 5,1972.
86. E.M. Kosower / The Journal of the American Chemical Society 1958, V. 80, p. 3253.
87. E.M. Kosower An introduction to physical organic chemistry. John Wiley & Sons, 1968.
88. T. Krai, M. Hof, M. Langner The effect of spermine on plasmid condensation and dye release observed by fluorescence correlation spectroscopy. / Biol. Chem. 2002, V. 383, N2, pp. 331-5.
89. H. Kurahashi, H. Inagaki, K. Yamada, T. Ohye, M. Taniguchi, B.S. Emanuel, and T. Toda Cruciform DNA structure underlies the etiology for palindrome-mediated human chromosomal translocations. / J. Biol. Chem. 2004, V. 279, N 34, pp. 35377-83.
90. A.F. Lagalante, A.Abdulagatov, and T.J. Bruno Kamlet-Taft thermosolvatochromic parameters of hydrofluoroethers and hydrofluoroether azeotropic mixtures. / J. Chem. Eng. Data 2002, V. 47, pp. 47-51.
91. W.R. Laws, L. Brand Analysis of two-state excited-state reactions. The fluorescence decay of 2-naphthol. / J. Phys. Chem. 1979, V. 83, pp. 795-802.
92. C.L. Lawson, R.J. Hanson Solving Least Squares Problems. / SIAM Press 1995, ISBN 0-89871-356-0.
93. C.-H. Lee, H. Mizusaa, T. Kakefuda Unwinding of double-stranded DNA helix by dehydration. / PNAS USA 1981, V. 78, N 5, pp. 2838-42.
94. J. Li, J.J. Masso, S. Rendon Quantitative evaluation of adhesive properties and drug-adhesive interactios for transdermal drug delivery formulations using linear solvation energy relationships. / J. Control Release 2002, V. 82, N 1, pp. 1-16.
95. W. Liu, H.M. Vu, D.R. Kearns 1H NMR studies of a 17-mer DNA duplex. / BBA 2002, V. 1574, N 1, pp. 93-9.
96. Y. Marcus, M.J. Kamlet, and R.W. Taft Linear solvation energy relationships. Standard molar Gibbs free energies and Enthalpies of transfer of ions from water into nonaqueous solvents./ J. Phys. Chem. 1988, V. 92, pp. 3613-3622.
97. L.A. Marky, J.G. Snyder, D.P. Remeta, K.J.J. Breslauer / Biomolec. Struct. Dyn. 1983, V. 1, pp. 487-507.
98. J. Meienhofer, E. Atherton Structure-activity relationship among the semisynthetic antibiotics. D. Perlman Ed., Academic Press Inc., NY 1977, pp. 427-529.
99. T. Meyer, H. Schindler Particle counting by fluorescence correlation spectroscopy. /Biophys. J. 1988, V. 54, pp. 983-993.
100. B. Mishra, K.I. Priyadarsini, M.K. Bhide, R.M. Kadam, H. Mohan Reactions of superoxide radicals with curcumin: probable mechanisms by optical spectroscopy and EPR. / Free Radic. Res. 2004, V. 38, N 4, pp. 355-62.
101. J.N. Murrell The theory of electronic spectra of organic molecules. Methuen, London, 1963, pp. 242 ff.
102. J.R. Neto, M.F. Colombo Water regulation of actinomycin-D binding to DNA: The interplay among drug affinity, DNA long-range conformation, and hydration. / Biopolymers 2000, V. 53, pp. 46-59.
103. C.G. Pack, G. Nishimura, M. Tamura, K. Aoki, H. Taguchi, M. Yoshida, M. Kinjo Analysis of interaction between chaperonin GroEL and its substrate usingfluorescence correlation spectroscopy. Cytometry 1999 Jul 1, V. 36, N 3, pp. 247-53.
104. J.X. Pan, Y. Liu, S.P. Zhang. T.C. Tu, S.D. Yao, N.Y. Lin, Photodynamic action of actinomycin D: an EPR spin trapping study. / Biochim Biophys. Acta 2001, V. 1527, N 1-2, pp. 1-3.
105. D. Papahadjopoulos, G. Post, W.J. Vail, and J.L. Biedler Use of lipid vesicles as carriers to introduce Actinomycin D into resistant tumor cells. / Cancer Res. 1976, V. 36, pp. 2988-2994.
106. T.M. Penning, Y. Jin, V.V. Heredia, M. Lewis Structure-function relationships in 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenases: a comparison of the rat and human isoforms. / J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2003, V. 85, N 2-5, p. 247-55.
107. P. Perez, A. Toro-Labbe, R. Contreras Solvent effects on electrophilicity. / J. Am. Chem. Soc. 2001, V. 123, pp. 5527-31.
108. M. Pitschke, R. Prior, M. Haupt, D. Riesner Detection of single amyloid beta-protein aggregates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's patients by fluorescence correlation spectroscopy Nat Med 1998 Jul 4, V. 7, pp. 832-4.
109. P.K. Ponnuswamy, R.F. McGuire, and H.A. Scheraga Refinement of the molecular structure of actinomycin D by energy minimization. / Intntl. J. Peptide and Protein Research 1973, V. 5, pp. 73-84.
110. L.A. Pothan, Y. Zimmermann, S. Thomas, S. Spange Determination of polarity parameters of chemically modified cellulose fibers by means of the solvatochromic technique. / Journal of Polymer Science, Part В 2000, V. 38, pp 2546-53.
111. S.W. Provencher / Comput. Phys. Commun. 1982, V. 27, pp. 213-27,229-42.
112. W. Qiquan, L. Weiping Correlation of imazapyr adsorption and desorption with soil properties. / Soil Science 1999, V. 164, N 6, pp. 411-16.
113. F. Quadrifoglio, A. Ciana, V. Crescenzi Letter: On the interaction between actinomycin D and DNA./ Biopolymers 1976, V. 15, N 3, pp. 595-7.
114. G.J. Quigley, A.H-J. Wang, G. Ughetto, G.A. van der Marel, J.H. Boom, A. Rich Molecular structure of an anticancer drug-DNA complex: Daunomycin plus d(CpGpTpApCpG). / PNAS USA 1980, V. 77, pp.7204-8.
115. J. Ren, T.C. Jenkins, and J.B. Chaires Energetics of DNA intercalation reactions. / Biochem. 2000, V. 39, pp. 8439-47.
116. D. Rentzeperis, D.W. Kupke, L.A. Marky Volume changes correlate with entropies and enthalpies in formation of nucleic acid homoduplexes: differential hydration of A and В conformations./ Biopolymers 1993, V. 33, N 1, pp. 117-25.
117. R. Rigler, J. Widengren, U. Mets Interactions and kinetics of single molecules as observed by fluorescence correlation spectroscopy. In Fluorescence Spectroscopy. O.S. Wolfbeis, editor. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg/New York, 1992, pp. 13-24.
118. R.L. Rill and K.H. Hecker Sequence-specific actinomycin D binding to single-stranded DNA inhibits HIV reverse transcriptase and other polymerases. / Biochemistry 1996, V. 35, pp. 3525-3533.
119. W. Sanger Principles of nucleic acid structure. Springer-Verlag 1984, pp. 368-84.
120. M. Shinomiya, W. Chu, R.G. Carlson, R.F. Weaver, F. Takusagawa Structural, physical, and biological characteristics of RNA*DNA binding agent N8-actinomycin D. / Biochemistry 1995, V. 34, pp. 8481-91.
121. C. Ray Smith & W.T. Grandy, Jr. (Eds.) Maximum-entropy and Bayesian methods in inverse problems. Reidel, Boston, 1985.
122. G. Smulevich, L. Angeloni and M.P, Marzocchi Raman excitation profiles of actinomycin D. / Biochem. Biophys. Acta 1980, V. 610, pp. 384-91.
123. H.M. Sobell, S.C. Jain, T.D. Sacore, C.E. Nordman / Nature, New Biol. 1971, V. 231, pp. 200-5.
124. H.M. Sobell, S.C. Jain Stereochemistry of actinomycin binding to DNA П. Detailed molecular model of actinomycin-DNA complex and it's implication. / J. Mol. Biol. 1972, V. 68, pp. 21-34.
125. J.S. Sobel, A.M. Albrecht, H. Riehm, J.L. Biedler Hybridization of actinomycin D- and amethopterin- resistant Chinese hamster cells in vitro. / Cancer Res. 1971, V. 31, N 3, pp. 297-307.
126. S. Spange, R. Sens, Y. Zimmermann, A. Seifert, I. Roth, S. Anders, and K. Hofmann A solvatochromic dye for probing significantly the dipolarity/polarizability of HBD (hydrogen bond donationg) environments. / New J. Chem. 2003, V. 27, pp. 520-4.
127. R.W. Taft, D. Gurka, L. Joris, P.v.P. Schleyer, J.W. Rakshys / Journal of the American Chemical Society 1969, V. 91, p. 4801.
128. R.W. Taft, M.J. Kamlet The solvatochromic comparison method. 2. The ar-scale of solvent hydrogen-bond donor (HBA) acidities./ Journal of the American Chemical Society 1976, V. 98, N 10, pp. 2886-2894.
129. J.C. Tai, W.S. Craig, B.P. Gaber On the electronic spectrum of actinomycin D. / J. Am. Chem. Soc. 1976, V. 98, N 25, pp. 7925-7.
130. N.L. Thompson Fluorescence correlation spectroscopy. In Topics in Fluorescence Spectroscopy, V. 1: Techniques. J.R. Lakowicz, editor. Plenum Press, New York. 1991, pp. 337-78.
131. S. Twomey Comparison of constrained linear inverse and an interactive nonlinear algorithm applied to the indirect estimation of particle size distribution. /J. Comput. Phys. 1975, V. 18, N 2, pp. 188-200.
132. J. Verweij, J.H.M. Schellens, T.L. Loo, H.M. Pinedo / Cancer Chemotherapy and Biotherapy / Eds B.A.Chabner, D.L. Longo. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers 1996, pp. 395-407.
133. N.L. Vekshin Photonics of Biopolymers. Moscow State University Press, M., 1999.
134. R.M. Wadkins, T.M. Jovin Actinomycin D and 7-aminoactinomycin D binding to single-strand DNA. / Biochemistry 1991, V. 30, N 39, pp. 9469-78.
135. R.M. Wadkins, E.A. Jares-Erijman, R. Klement, A. Ruediger, T.M. Jovin / J. Mol. Biol. 1996, V. 262, pp. 53-68.
136. R. M. Wadkins, C. Tunng, P. M. Vallone, A. S. Benight. The role of the loop in binding of an actinomycin D analog to hairpins formed by single-stranded DNA./ Archives of Biochemistry and Biophysics 2000, V. 384, pp. 199-203.
137. J. Widengren, R. Rigler, U. Mets Triplet-state monitoring by fluorescence correlation spectroscopy. / J. Fluorescence 1994, V. 4, pp. 255-258.
138. J. Widengren Fluorescence correlation spectroscopy, photophysical aspects and applications. Ph.D. thesis. Karolinska Institute, Stockholm, Sweden, 1996, 66 p.
139. J. Widengren, R. Rigler Fluorescence correlation spectroscopy as a tool to investigate chemical reactions in solutions and on cell surfaces. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 1998 Jul, V. 44, N 5, pp. 857-79.
140. L.Y. Wilson Using theoretical descriptors in quantitative structure-activity relationships: Some toxicological indices. / J. Med. Chem. 1991, V. 34, N 5, pp. 1668-74.
141. H. Winter, K. Korn, R. Rigler Direct gene expression analysis. / Curr. Pharm. Biotechnol. 2004, V. 5, N 2, pp. 191-7.
142. J. Wyman, S.J. Gill Binding and linkage: Functional chemistry of biological macromolecules. Univ. Science Books, Mill Valley, CA, 1981.
143. L.E. Xodo, G. Manzini, F. Quadrifoglio, N. Yathindra, G.A. van der Marel, J.H. van Boom A facile duplex-hairpin interconversion through a cruciform intermediate in a linear DNA fragment. / J. Mol. Biol. 1989, V. 205, N 4, pp. 777781.
144. C. Ybert, F. Nadal, R. Salome, F. Argoul, L. Bourdieu Electrically induced microflows probed by fluorescence correlation spectroscopy. / Eur. Phys. J. E Soft Matter, in press 2005.
145. R.L. Yu, G.R. Hu, Y.H. Zhao Comperative study of four QSAR models of aromatic compounds to aquatic organisms. / J. Environ. Sci. (China) 2002, V. 14, pp. 552-7.
146. M. Zander, U. Breymann, H. Dreeskamp, E. Koch / Z. Nuturforsch. A 1977, V. 32A, pp. 1561-3.
-
Ковалев, Александр Эдуардович
-
кандидата физико-математических наук
-
Пущино, 2005
-
ВАК 03.00.02
- Спектроскопическое изучение ДНК-актиномициновых комплексов
- Исследование комплексов ДНК-золотые наночастицы методами спектроскопии поглощения и динамического рассеяния света
- Молекулярные механизмы действия белков FtsZ, виллина и системы рестрикции-модификации Esp13961, исследованные флуоресцентными методами
- ДНК-ГИДРОЛИЗУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ К ДНК ПРИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ
- Создание аналогов субстратов системы эксцизионной репарации нуклеотидов и анализ их взаимодействия с белками клеточных экстрактов
