Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДНК-зависимые ДНК-полимеразы Acholeplasma laidlawii PG-8

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ДНК-зависимые ДНК-полимеразы Acholeplasma laidlawii PG-8"

РГ6 од

АКАДЕМ Ш НАУК УКРА11Ш 1 ^^(¡Шу^ЗЯЗробюлогП i в!русологП 1м.Д.К.Заболсшюго

На правах рукопису

Безуглий C.B.

ДНК-заяежи1 ДНК-пшймерази Acholeplasma laidlawii Р8-8 03.00.07. - MiKpoöicuioriH

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на адобуття вченого ступени кандидата б!олог1чних наук

К и I в - 1 9 9 3

Робота виконана у в1дд1л1 м1коплазмологП 1нституту логП 1 в!русологП 1м.Д.К.Заболотного АН Укра1ни

доктор 01ол. наук, член-кор. АН Укра1ни ЬГ.Скрипаль

доктор б1ол. наук, Заслужений д1яч науки Укра)ни

професор Захарова 1.Я.

кандидат 61 ол. наук Пилипенко В.Г.

Ведуча орган!зац1я: Науково-досл1дний 1нститут уролагН та нефролог!! МОЗ Укра!ни

Захист в1дбудеться 21 кв1тня 1993 року о 1000 на вас1данн1 спец1ал1зованоЧ ради Д.016.06.01 при 1иститут1 м1кроб1олог11 та в!русолог11 1м.Д.К.Заболотного АН Укра1ни ва адресою: 252143, Ки1в-143, вул.Заболотного.164.

3 дисертац!ею можна овнайомитися в б1бл!отец1 1нс.титуту м1кроб1олог11 та в1русолог11 1м.Д.К.Заболотного.

Автореферат роз 1 слано "_" _ 1903 року.

Науковий кер1вник:

Оф1ц1йн1 опоненти:

Вчений секретар спец1ал1аовано! ради кандидат 01ол. наук

Е.О.Коваленко

загалы1а характеристика роюти

Антуайыпкть пройлсмп. Молшути стали зручним об'ектоы для вир1шення фундаментальна та прикладник вавдаш, м!кроб1ологИ. 1нтерес до вивчення цих м1кроорган1зм1ь нопеню-еться незвичайною природою цих м1кроорган1ь*м1в. ¡по зашають пром1жяе положения как бактер1ями та в1русзми , а такок тою роллю, яку вопи вШграгать у р1ених сферах д1яльност1 людппи. Мол1кути, будучи паразитами з достатньо широким ареалом хазя1в ( рослини, тварини, людина) вигсликають у них р!зноман1тн1 аах-ворювання, завдаючи велико'! шкоди людству.

Ферменти нуклеинового обмшу мол1кут:в одна з найважлив!-ших ланок функЩювання '¡х кл1тшш тому IX детальне вивчення дозволить п!знати ыехан1зм обм1ну нукле!нових кислот та набли-зитися до розуьиння б1ологП цих м1кроорган1зм1в, IX м!сця серед 1нших м!кроб1в. ДНК-залежи! ДНК-пол1мерази, як основна с кл адова частина решпкативного апарату кл1тини, в ключовими ферментами цього обм1ну. Вщцлення ДНК-пол1мераз, вивчення 1х властивостей, дозволить з'ясувати механ1зм репл!кацП ДНК в кл1тин1 мол1кута, а такал розробити принципи контролю цього процесу.

В науков1й л1тератур1 е публ1кацП щодо вщцлення та вивчення ДНК-валежних ДНК-пол!мераа у р!аних представшшв класу МоШс^еБ , але вс1 ц! роОоти мають характер попередн!х пов1-домлень, як1 вимагають подальших доавджень.

Саме тому вивчення у мол1кут!в системи синтезу ДНК , П основних складових частин б своечасним та актуакьним завдан-ням.

Те, що ц1 ферменти у мод1куИв практично не вивчен!, по-яснювться, головним чином, складн1стю одержання б1омаси,

в яко! потр1Сно вид1лити достатню '¡х к!лък1сть.

0держан1 нами результати щодо властивостей ДНК-пол1мераз мол!кут!в св1дчать про деяку схок!сть цих фермент1в 1в ДНК-пол1меразами 1нших прокар1отичних орган!зм1в. Вони дають можлив!сть просл1дкувати 1х ф!логенетичн1 звязки, зрозум!ти особливост! функцЮнування як репл!кативно1 системи, так 1 всього метабол1зму ДНК в кл!тин1 мол1кута . Кр1м того.розроб-лен1 п!дходи селективного впливу на процеси життед1ялыгаст1 цих м1кроорган!зм1в.

Мета та завдання досл!дження. Метою роботи було: вид!лен-ня та розробка економ1чних васоб!в очищения ДНК-залежних ДНК-пол1мераз ia обмежено! к1лькост1 бюмаси Acholeplasma laidlawii PG-8, всеб1чне вивчення 1х властивостей. Для досяг-нення ц!б1 мети потр!бно було вир!шити так! завдання: l.Poepo-бити спос!б одержання ДНК-пол!мераа 1з м1н!мально1 к1лькост1 б1омаси. 2. Розробити умови очищения фермент!в 1 одержання "1х у гомогенному стан!. 3.Провести вивчення властивостей ДНК-по-ламераз мол!кут!в в пор1внянн! з подгбними ферментами !нших орган!зм!в.

Наукава новизна. Ферменти вперше вщцлен! та очищен! до гомогенного стану; показано !снування двох форм ДНК-валежних ДНК-пол!мераз у репл!кативн!й систем! Acholeplasma laidlawii Р6-8. Створен1 засоби одержання ДНК-пол1мераз Acholeplasma laidlawii PG-8i3 обмежено'1 к!лькост! б!омасси; встановлен! ве-личини молекулярних мае фермент1в; вивчен1 ф!зико-х1м1чн1 та молекулярно-б!олог1чн! властивост1 фермент!в, к!нетичн! пара-метри взаемодП ДНК-пол1мераз з субстратом, д1я р!зноман1тних за властивостями речовин на продес функц!онування ДНК-залежних ДНК-пол1мераз in vitro.

Встановлено деяку под!бн1сть ДHK-пoлiмepaз мол!кут1в 1в ДНК-пол1меразами !нших прокар!отичних орган1зм!в, що, поперше, св1дчить про "ix ф!логенетичну спор!днен1сть 1, подруге, вказуе на мсшшв!сть використання загальних приндип1в контролю над решИкац1ею. В той же час вивчення ДНК-пол1мераз мол!кут!в дозволило встаковити деяку piomnso м1к цими ферментами та ДНК-псшмерааами 1нших прокар1отичних орган!вм1в, що дае змогу розробити ориг!нальн1 засоби селективно! боротьби з мол!кутами на piBHi репл1кацП.

Практична ц1нн1сть роботи.Створена система швидкого в!д-бору in vitro речовин, як! б ефективно блокували процес репл!-кацП ДНК мол!кут!в. Це може бути використане для пошуку висо-коефективних• npenapaTiB для боротьби з мол1кутами та хворобами, що вони викликають.

Розроблений метод одержання ДНК-залежних ДНК-пол1мераз може бути використано при одержали! под1бних фермент1в !нших MiKpoopraHiBMiB.

Апробац!я роботи. Матер!али дисертацП Сули викладен! на конкурс! po6ir секцИ молекулярно! б!олог!3 Институту м!кроб1-

ологП та в1русолог1"1' 1м.Д.К.Заболотного (Ки5в,1991) "М1жна-родн1й школ1 в швидко! д1агностики мйсоплазм" Иерусалим, 1992) , спыьному зас!данн1 в!ддШв м1коплазыологП «генетики MiKpoopraniBMiB, молекулярно'1 б!ологП BipyciB, репродук-цП BipyciB та BipyciB водоростей (Кшв,1992).

Пу&йкацП. Основн! положения дисертацП викладен! в 6 друкованих роботах.

Структура та об'ем дисертацП. Дисертац1йна робота викла-дена на 119 сторижах друкованого тексту 1 складасться з всту-пу, огляду л1тератури, матер!ал1в та >«етод1в досл1дження, ре-зультат1в та !х обговорення . висновк!в та списку використано! л1тератури. Дисертац1я мае 4 таблищ та 29 малюнк1в. '

3MICT РОБОТИ

Огляд л!тературн. Огляд л1тератури м1стить в1домост1 про стан проблеми, hobIthI досягнення в галуз1 вивчення ДНК-залеж-них ДНК-пол1мераз, методи Чх вид1лення та способи функщону-вання фермент!в в кл1тин1.

Об'ект та ыетоди доол1дження. Об'ектом досл!дження був штам Acholeplasma laidlawii PQ-8, родина Acholeplasmataceae, отриманий ia колекцП Шжнародного центру культур м!коплазм /Орхус, Датя/. Для одержання ДНК-залежних ДНК-пол1мераз культуру ахолеплазм вирощували протягом 72 годин при температур1 31°С на середовияД CM IMB-72.

Л1зис б!омаси проводили при 0-4°С та пост!йному nepeMimy-ванн1 додаванням НП-40 та деаоксихолагу натр!ю до к!нцево! концентрацП 5Х та 0.08Z в1дпов!дно.

Bci етапи вид1лення та очистки ДНК-пол1мераз проводили при температур! 0-4°С. Буфер ТЕДГ, щр внкристовувався нами для вид1лення фермент1в складався а 50 ММ Трис-HCI рН 7.9, 0.1 мМ ЭДТА, 26% гл!церину, а також фенилметилсульфон i лфториду (<ЩСЯ>) та дит!отре1толу (ДТТ) в концентрац!ях 1 мМ та 3 мМ , в!дпо-в!дно.

Активн1сть ДНК-пол1мераз на р!зних стад1ях вид1лення, очистки, та вивчения властивостей проводили в 0.1 мл реакц!й-Hoi сум!ш1,що складалася а: БО мМ трис-HCl рН 7.9, 10 мМ ОМСФ, 2 М ДТТ, 10 мкг бичачого сироваточного альоум1ну, Б мкг акти-вовано! ДНК селез!нки велико! рогато! худоби, 10 Ш MgCl2 ,10Х

гл!церину, 100 мкМ кожного в дезоксинукдеотидтрифосфат!в (д11ТФ) , кргм ы!ченого, концентрац1я котрого обладала Юмкм /1 м1сКи/. та 15 М1сл в1дпов1дно1 фракцП .

Сум1ш !нкубували 30 хвилин при 37°С. РеакцШ зупиняли внесениям 5% ТХУ. Дал1 проби фыьтрували через ф1льтри "У/Ь^тал" 6Р/С. 1нтенсивн1сть включения ГНЭ] дТТФ зашряли в сцинтиляц!иному л1чильнику "Весктап", США , використовуючи сцинтиллящйну р1дину ЖС-8 .

За одиницю активност1 ферменту приймали к1льк1сть фермен-' ту, що катайзуе в стандартних умовах включения 1 нмоль ГН3] дттф.

Чистоту вид1лених фермент1в та !х молекулярну масу визна-чали за допомогою електрофорезу б1лк1в в пол1акрилам1дному ге-л! з 0.1% додецилсульфату натр1ю, використовуючи трис-гл!ци-нову буферну систему Леммл!.

Молекулярну масу ДНК-пол1мераз в нативному стат визиача-ли за допомогою гель-ф!льтрац15 на Тойо-перл1 HW-60. .

Концентрацш б!лку на р1зн1х етапах очищения визначали за допомогою методу Бредфорда.

Для розд1лення, очищения, та одержання чистого ферменту використовували методи р1динно! хроматограф!! на р!зноман1тних сорбентах : ДЕАЕ-целюлоз1, Гепарин-сефароз1, Пол1 У-сефаро-гп, Пол! А-сефароз!.

Результата та 1х обговорення. Вирощен! на середовищ! СМ 1МВ-72 кл1тини збирали в логарифм!чн!й фаз! росту за допомогою дентрифугування при 17000 в!дмивали вхд залипнув культу-рального середовигца десятикратною юльк2стю буфера ТЕДГ. Л1зис проводили на протяз! 20 хвилин. Л!зат центрифугували при 17000 5 для осадження нел!зованих кл!тин та залишйв мембран.

Першим етапом очищения ДНК-пол!мераз було фракц1онування л!зату на колонц! з ДЕАЕ-целюлозою ДЕ-52. В результат! було досягнуто розд!лення ДНК-пол1меразно! активност! на два п!ки: перший - у проскод!, другий - у фраквдях з !онною силою, що в1дпов!дала 0.3 М ИаС!.

Розпод!л двох форм ДНК-залежних ДНК-пол!мераз на ДЕАЕ-це-люлоз1 вказуе на р1зн!цю в поверхневих зарядах щх двох фер-мент!в. Перша форма, судячи з усього б1льш електронейтральна, в той час, як друга несе на соб! б1льше електронегативних труп.

Фракцш з ДЕАЕ-делюлози, щс м!стила ДНК-залежну ДНК-пол1-меразу I, наносили на колонку з Гепарин-сефаровсю. Едкий» проводили град!ентом ИаС1 0.05-0.5 М.

ВадЦлена б^лкова фрашдя мастила, кр1м ферменту, також баластн! б1лки.

ФракцП, що мали ДИК - полгмеразну активн1сгь, сб'еднува-ли та наносили на колонку з Пол! У-сефаровою . ДНК-шл!мераза вв'язувалас.я в колонкою. Елоц!ю проводили град1ентом НаШ. Фермент едюювався в колонки паком при !ошпй сил!, що дор1вш-вапа 0.3 М ИаС1 . Препарат було очищено у 103.3 рази 1 мав питому активн!сть Б0450 од/мг б1лку (Табл.1).

При електрофорез1 в ПААГ в ДДС-Иа фракЩя виявилась гомогенною 1 мала молекулярну масу 72 кД (Мал.1,а)

Другу фракц!ю ДНК-залежно! ДНК-иол1мерази наносили на колонку 1з Гепарин-сефарозою. Фермент, що зв'язався з колонкою, елюювали градгентсм !)аС1 в!д 0.05 до 0.5 М. ДНК-шшмера-за виходила з колонки при концентрацП сол1 0.25-0.3 М.,

Для останнього етапу очистки другой форми ДНК-поламерази було обрано аф!нний сорбент Пол! А-сефарову. Цей вибгр було вроблено в результат! селективно! роботи, що була направлена на максимальне розд!лення на сорбент! ДНК-пол!мерази та супут-н1х ДНК-залежних б!лк1в. Таким чином, незважагочи на б1льшу с.пециф!чн!сть ДНК-шшмерази до Пол! (У) матриц! ми, зупиншш св!й виб1р на Пол1 А-сефаров!.

Фракц!'! з Гепарин-сефарози, що мали ДНК-пол!меразу II наносили на колонку з Пол!-А сефарозою. Елюцхя ферменту починалась при 0.25 М N301. В результат! було отримано очищений у 1328.7 раа1в препарат, шр мав пчтому актившсть 95710 од/мг б1лку (Табл.2).

Зразки анал!зуваяи за допомогою едектрофорезу в ПААГ в ДДС-Ла. Фракц!я, що виявила максимальну ДНК-пол!меразну активность на електрофореграм! була представлена одн!ею полосою з молекулярной масою 45 кД (Мал.1,8).

Для встановлення молекулярно! маси ДНК-пол1мераз в натив-них умовах було використало метод гель-ф!льтрацП на колонц! в Тойо-перлом HW-60. В результат! проведеного експерименту, було отримано значения молекулярних мае ДНК-валежних ДНК-пол!мераз I та И , що становшш 137 та 351 кД, в!дг;ов!дно. Р1внидя у вначенн! молекулярних мае, отриманих эа допомогою гель-ф!ль-

а $ 4

Мал. 1 Електрофореграма двох форм ДНК-пол1мераз А.1а1сЛаиИ РВ-8. а - ДНК-пол1мераза I; б - маркерн! б!лки : фосфорилаза Б 94 кД; альбуьин 67 кД; овальбум!н 43 кД; карбо-анПдраза 30 кД; 1нги01тор трипсину 20 кД; «-лактапьбум!н 14 кД; в - ДНК-пол1мераза II.

100 «о во то ео с во

40

30 20 10 0-

рН

Мал. 2 Залелчпсть активност1 ДНК-полймераз Мд рН реагайй-но1 сум!ш1. 1 - ДНК-пол1мераза I; 2 - ДНК-пол1мераза II.

трацП та електрофорезу в денатуруючих умовах вказув на муль-

Таблиця J. ПОКАЗНИКИ ОЧИЩЕНИЯ ДНК-ПОЛ1МЕРАЗИ I ACHOLEPLASMA LAIDLAW1I PG-8

Этапи Об'ем Б1лок Активн1сть Пт.акт. Ступ. Вих!д очищения (мл) (мг/мл) (од.) (од/мг) очист. (X)

1 Л!зат

2 ДЕАЕ-цел.

3 Гепарин

4 Пол1 У

20 175

20 62

3 0.16

2 0.08

30280.0 17999.9 8072.7

488:0 2Г7499.7 Б04Б0.1

1.0 100.0 76.8 59.4 103.3 26.6

Таблиця 2. ПОКАЗНИКИ ОЧИЩЕНИЯ ДНК-ПОЛIМЕРАЗИ II ACHOLEPLASMA LAIDLAWII PG-8

Этапи Об'БМ Б1лок Активн!сть Пт.акт. Ступ. Вих1д

очищения (мл) (мг/мл) (од.) (од/мг) очист. (X)

1 Л1зат 20 176.00

2 ДЕАЕ-цел. 4 66.00 18730.0 72.0 1.0 100.0

3 Гепарин 3 0.08 16876.5 70310.7 976.2 90.1

4 Пол! А 3 0.06 14356.Б 95710.0 1328.7 76.6

тисубодиничну структуру фермент!в; те, шр фракцП, проявляюч! ДНК-пал1меравну активн1сть на електрофорэграм! буди представлен! одн1бю полосою, св1дчить щр пол1меразна активн1сть належала субодшшц! саые а такою молекулярном масою; кратн1сть значень молекулярних мае фермент!в в нативному та денатурова-ному стан! дае можлив1сть запрпонувати модель функцЮнування In vivo ДНК-пол!мерааи I - у вигляд! димеру, а ДНК-пол1мерави II - у вигляд! тетрам1рно! структури.

Таким чином, результатом роботи стала розробка ориг!наль-но'1 схеыи одержання ДНК-пол1мераа в гомогенному отан!, високий ступ!нь чистоти довволив проводити подальше досл!дження 1х властивостей.

Встановлено, що'оптимум температури д11 обох форм ДНК-по-л!мераз становив 37°С.

Вивчення впливу рН на ДНК-пол1мерази А. 1а1сЛаш11 Рб-в проводили в днтервал1 рН в1д 6 до 9. Як було встановлено, ол-тимуми рН для обох форм ферментов совпадали 1 знаходилися в межах 7.8-8.0 (Мал.2).

Вплив двухвалентних кат!он!в Мг2"1" та Мп2+ на активн!сть ДНК-пол!мераз вивчали в !нтервал1 концентрацП 0-20 мМ. При-сутн!сть в реагуюч1й сум1ш! 2. Б мМ МвЕ+ приводить до десятира-зового п!двищення активност! 11 форми, (Мал.З) в той час, коли

I мала максимум активноет! при 5 мМ 1 виявляла лише трикратне Шдвищення активност1 . 1они Мпя+ також активували II форму в три рази, на ] форму д1 1они справляли 1нгибуючу д1ю (Мал.4).

Вивчення дП ЕДТА на активн!сть ДНК-пол1мераз виявило оберненопропорщйну залежн1сть м1ж присутн1стю ЕДТА в реакц!й-н1й сум!ш1 та активн!стга ДНК-пол1мераз (Мал.Б), але граф!ки впливу ЕДТА на ДНК-пол1мерази мали р1зн1 профШ: активн!сть 1 форми р1зко зменшувалась при переход1 концентрацП и в1д 0.3 до 0.6 мМ. Активн1сть 11 форми при п1двищенн1 концентрацП ЕДТА пов1льно зменшувалась.

Для вивчення к!нетичних характеристик фермент1в визначали константи М1хаел1са. Графики, побудован1 в систем! зворотн1х координат Лайнувера-Берка дозволили граф!чно визначити Км для обох форм ДНК-пол1мераз, що дор!внювали 180 та 2Б0 мкм дНТФ для 1 та 11 форми, в1дпов!дно.

Як в1домо ДНК-пол!мерази - ферменти, що потребують для свое.! д11 два види субстратов : ДНК та дНТФ. дНТФ е ун1вер-сальнкм субстратом для ус!х пол!мераз, тому ми вивчали взаемо-д1ю ДНК-пол!мераз 1з нуклеЗновими кислотами природного та штучного походження. Показано, що серед штучних матриць макси-мальну спор1днен1сть ДНК-пол!мерази виявляли до Пол! (У) та Пол1 (А), причому спор!днен!сть нав!ть вишу н!ж до ДНК селе-з1нки велико! рогато! худоби (Мал.6). Природн! матриц! розта-шувалися по порядку зменшення спор!днености до них ДНК-пол1ме-раз: ДНК А.1а!с11аш1! Р6-8,ДНК фагу X , ДНК селез!нки велико! рогато! худоби, для I форми, та ДНК А.1а1с)1а»11 РСЗ-8, ДНК се-лез!нки крупно! рогато! худоби, ДНК фагу X - для II (Мал.7).

Нал1диксова кислота - 1нгиб!тор прокар!отичних ДНК-пол!-мераз, не д1яла на I форму при концентрацП 25 та 50 мкг/мл.

II форма п!ддавалася пригн1ченню на 30% .вже 25 мкг/мл ' (Мал.8).

Мал.4 Вплив íohíb ДНК-псшмерази 11.

двухвшюнтних

метши в

на активность

0 OS О» О.» О IS » mW

Мал.б Гряф1гс впдиву ЕДТА на ДНК-пол1мераэи A.laidlawii PG-8. I - ДНК-пол1мераза 1; II - ДНК-жтмераза II.

Мал.6 0пециф1чн1СТЪ ДНК-Пол1мераэ A.laidlawii PQ-8 по в1дношенню до матриць синтетичного походження. I - Пол1 (У); II -Пол1 (А); III - ДНК селез1нки велико! рогато! худоби (прийнята за 100%); IV - Пол! (С); 1 - ДНК-шшмераза I; 2 -ДНК-псмпмераза II.

- и -

Мал.7 Специф1чн1сть ДНК-пол1мераа A.laidlawii PQ-8 по вЧдношению до матрицъ природного походження. I - ДНК A.laidlawii ; II - ДНК селеэ!нки велико! рогато! худоби (прий-нята за lOOZ); III - ДНК фагу \ ; 1 - ДНК-пол1мераза I; 2 -ДНК-пол1мераза II.

Мал.8 Вплив нал1диксово1 кислоти на активность ДНК-полг-мераз A.laidlawii PG-8. I -ДНК-пол1мераза I; II - ДНК-штме-раза II.

- 12 -

При вивченн! репаращйнсЯ функцП ДНК-пол1мераз Суло ви-явлено, що I форма не мала З'-Б'-екзонуклеазно! активност1, в той час, як ДНК-шшмераза II була здатна вменшувати р!вень рад1оактивност1 пом!чено! ДНК на 17-25%.

0дн1ею 1з суттевих особливостей ДНК-пол1мераз е ïx в!дно-шення до аф1д1кол1ну, який адатний пригн1чувати активнЮть ДНК-пол1мераз а-типу. Було показано, що ДНК-пол1мераза I зг!д-но з ц1ею ознашо ыоже бути в!днесена до ДНК-пол1мераз а-типу, тод1, як II форма виявляе меншу валежшсть в1д цього реагенту (Мал.9).

Шдоыо, щр SH-блокуюч! речовини i в тому числ1 п-етилма-ле1м!д (NEM), вдатн1 пригн!чувати прокарютичн1 ДНК-пол1мерази II та III типу та не д1ють на ДНК-пол1меразу I E.coli. Резуль-тати, що приведен! на мал.10 дають вмогу вробити висновок, що ва uieio овнакою ДНК-полгмерази A.laldlawii PG-8 мають схожЮть ia ДНК-пол1меразою I E.coli.

Вивчення дП етанолу, як розчинника багатьох б!олог!ч-но-активних речовин на ДНК-шшмерази, виявило стаб1льн!сть I форми до uie'i речовини. II форма п!двищувала свою активнЮть п1д д1ею 15% етилового спирту .

Д1я сперм1дину на ДНК в б1льшост1 випадк1в приводить до активацП роботи репл1кад!йного комплексу, бо сперм1дин здат-ний стабШзувати вторинну структуру ДНК, що полегшуе роботу ДНК-пол1мерави, Наш! досл1дження виявили невеликий, до 8Х, для I , та 3QZ для II форми, активуючий ефект сперм1дину.

Ьикористання високоспециф1чних ангиохторхв синтезу нукле-1нових кислот в труп хромошцюпв (натр1ева с1ль ол!вом1дину), антрацикл!н!в (кары!ной!дин та доксоруб!цин) та стрептон1грину (брунеом1цин) дозволяе детально вивчити властивост! ДНК-под1-мерав, ïx фушсц!ювання в кл1тшй.

Досл1джено вплив цих речовин на синтез ДНК. Встановлено. що ол1вом!дин, як "Г-Ц" валежна речовина пригн!чуе активн1сть, як I, так 1 II форми ДНК-пол!мераз пропорц!йно вростанню коне-центраЩю антиб!отика в реагуючому середовищ!; карм!ном!цин при конце нтрацП б!ля 1 ыкг/мл в проб! повн!стю пригн1чував синтез ДНК обома формами ДНК-шШмерав. До доксоруб1цину, ДНК-пол1мерави проявили 1ндив1дуальне в!дношення: активн!сть I форми повн!стю пригн!чувалась при концентрацП антибиотика в реагуючому середовищ1 1 мкг/ыл , а II форма ДНК-пол!мерази,

О • 10 50

mM

Мал. 9 Д1я аф1диколп!у на ДНК-псиймераэи A.lnidlnwii PG-8. I - ДНК-псшмераза I; Il - ДНК-пол1мераза II.

Мал. 10 Залешпсть ДНК-псипмераэнсч активност1 в!д присут-HOCTi NEM в реакщшпй cyMimi. 1 - ДНК-псупмераза I; II -

ДНК-псл1мераза П.

як1й властива З'-Б'- екзонуклеазна функц!я практично виявялася иечутливою до д11 ще! речовини. Корисним для диференц!ювання форм ДНК-пол!ыераз 1 визначення !х функц1й виявився стрепто-н1гр1н (брунеомЩин): 11 форма ДНК-псш1мерази ( що несе репа-рац1йну функц1ю) п!ддавалася дП ц!б! речовини пропорцШо йо-го концентрацП в реагуючому середовшЦ. Поперем!ннош д1ею доксоруб1цину та Срунеом!цину ыожна досягти селективного приг-н1чення Т1Б'1 або 1ншо! форми ДНК-под1мераз, чи 1дентиф1кувати вид1лену форму ферменту.

Таким чином, одержан! нами експериментальн! дан1 св1д-чать.щр по основним принципам фушсц1ювання в кл!тин1 ДНК-пол1-мерааи А.1а1сЛаш! РЗ-8 не в!др1зняються в!д ДНК-пол!мераз 1н-ших оргатзм1в. Деяк1 в!дм1ни спостер1гаються при вивченн! 1х ф1зико-х!м!чних властивостей та впливу речовин р!зного поход-ження.

ВИСНОВКИ

1. У АсЬо1ер1аша laidlawli РБ-В вперше було показано на-явн!сть двох форм ДНК-валежних ДНК-пол!мераа: ДНК-пол!мера8и I. що не зв'язувалася з ДЕАЕ-целшюзою та ДНК-пол1мерази II, яка адсорбувалася ц!ею колонкою.

2. Розроблен! методи очищения ДНК-залежиих ДНК-пол!мераз

I та II А. 1а1с11а«11 РО-8 до гомогенного стану за допомогою аф1нно"1 хроматограф!! на Гепарин-сефароз!, Пол! У-сефаров!, ПсиИ А-сефароа!.

3. За допомогою гедь-ф1дьтрацП встановлено, щр ДНК-пол!-мераза I мала нативну молекулярну масу 137 кД, а ДНК-пол!ыера-за И - 351 кД.

4. Показано, що пол!меразна активность ДНК-пол!мераз I та

II асоц!йована а пол1пептидами молекулярного масою 72 кД та 45 кД, в!дпов!дно.

Б. Встановлена спор!днен!сть фермент!в до дезоксинуклео-тидтрифосфат!в, виражена через константу М!хаел!са-Ментен що становила вначення Км 180 мкМ для ДНК-пол1мерази I 1 250 мкМ для ДНК-полхмерази II.

6. ДНК-пол1мерази А. 1а1с11аи11 РО-8 активувалися !онами Ыг2+ (20- 1 3-разово, в1дпов1дно для 1 та II форми); ДНК- по-л!мерава II активувадася 1онами Мля+ в концентрацП 2.5

мМ (3-разово); в той же^ час, ДНК-псшмераза I при цих умовах втрачала свсго актйвн!сть; обидва фермент» мал и оптимуми рН г/ри 7.9 1 температури при 37°С.

7. ДНК-пол1мераза I виявила резистентшсть до наШдик-сово! кислоти у концентрацП 50 мМ, при як1й ДНК-пол1мерава II гнижувапа свою активн1сть на 50%; обидв! пол1мерази ст!йк! до високих, до 20Х, концентрац1й етанолу, пригн1чувалися аф!д1ко-л1ном.

8. Доксоруб1цин в концентрацП 1 мет/мл повн1стю пригн!-чував активн!сть ДНК-пол1мерази I (репл1кази); ДНК-пол1мераза II (репараза) виявилася нечутливою до цього антиб1отика. Бру-неом!дин в концентрацП 1000 мкг/мл повн1стю пригн1чував ак-тивн!сть ДНК-пол1мерази II, тод1, як ДНК-пол1мераза I була резистентною до д!1 цб1 речовини.

, 9. ДНК-пол1мерази A.laldlawll PG-8 в1др1знялися за своими ф!зико-х1м1чними властивостями в1д под1бних фермент1в як мол1-кут1в, так 1 1нших м1кроорган!зм1в, що вказуе на високу сту-п!нь дивергенц11 ахолеплазм з другими прокар!отичними орган!з-мами.

СПИСОК Р0Б1Т, ЩО 0ПУБЛ1КОВАН 1 ПО TEMI ДИСЕРТАЦП

1. Безуглый С.В..Бабичев В.В., Скрипаль И.Г., Малиновская Л.П. Выделение и частичная очистка двух ДНК-зависимых ДНК-по-лимераз- Acholeplasma laidlawii PG-8 // Микробиол.журн.-1991.-53, N5.- С.26-30.

2. Безуглый С.В..Токовенко И.П..Скрипаль И.Г. Некоторые аспекты метаболизма пуриновых и пиримидиновых оснований у Acholeplasma laldlawll PG-8 // Микробиол.журн.- 1991.-53, N6.-С.41-46.

3. Bezugly S.V. DNA-polymerases from A.laldlawii PG-8 // Proc.FEMS Workshop * on: Rapid Diagnosis of Mycoplasmas'. Jerusalem, Israel, 1991, august 11.-23.

4. Безуглый С.В., Скрипаль И.Г., Бабичев В.В. Хроматогра-фические свойства ДНК-зависимых ДНК-полимераз из Acholeplasma laidlawii Р6-8 // Микробиол.журн.-1992.-54,N1.- С.51-57.

5. Безуглый С.В..Скрипаль И.Г. Бабичев В.В. Малиновская Л.П. Влияние некоторых физико-химических факторов на актив-

ность ДИК-аависимих ДНК-лсшшераэ Acholeplasma laldlawli P6-8. // Микробиол.журн.- 1392.- 54.N4.- С. 21-27.

6. Безуглый C.B..Скрипаль И.Г., Бабичев В.В. Изучение кинетических и функциональных характеристик ДНК-зависимых ДНК-полимераз Acholeplasma laldlawli PG-8. // Микробиол.журн.-1903.- 55,N2.- С.22 - 27.

Шдп. до друку. /i.ej.yj Формат ее "/'/// nanip<*?W2

Друк. офс. Умовн. друк. арк. 0,9.1^ Обл.-вид. арк. о,(£ чнр./ср Заи^ 334f.

КиЧвська книжкова друкарня науково! книги. Khïb, Peniiia, 4.