Создание высокоаффинных гетеродимерных фотоаптамерных конструкций к тромбину

Рахметова, Светлана Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание высокоаффинных гетеродимерных фотоаптамерных конструкций к тромбину
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Создание высокоаффинных гетеродимерных фотоаптамерных конструкций к тромбину"

004

1.09683

На правах рукописи

Рахметова Светлана Юрьевна

СОЗДАНИЕ ВЫСОКОАФФИННЫХ ГЕТЕРОДИМЕРНЫХ ФОТОАПТАМЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ К ТРОМБИНУ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 о СЕН 2010

Москва 2010

004609683

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Радько Сергей Павлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ипатова Ольга Михайловна

доктор биологических наук, профессор Карпухин Александр Васильевич

Ведущая организация:

Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Защита состоится «21» октября 2010 года в 11.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН по адресу: 119121, г. Москва, ул. Погодинская, д.Ю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН.

Автореферат разослан « сентября 2010 г. Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наук

/ у

Е.А.Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Широкомасштабный экспериментальный и биоинформационный анализ, выполненный в прошедшее десятилетие, создал огромный массив протеомных данных, позволивших идентифицировать тысячи потенциальных белковых маркёров различных онкологических заболеваний (Polanski М. et al., 2006). Как ожидается, подавляющее большинство потенциальных белковых маркёров онкопатологии может присутствовать в крови в концентрациях ниже 10'15 М (Archakov A.I. et al., 2007). Однако чувствительность существующих сегодня методов иммунохимического анализа за редким исключением не выходит за пикомолярные концентрации, что во многом определяется ограниченной аффинностью моноклональных антител (Jackson Т.М et al., 1986; Foote J. et al., 1995; Houk K.N. et al., 2003; Ling M.M. et al., 2007). Таким образом, задача исследования клинической значимости белковых маркеров и последующее создание тест-систем делает актуальным разработку новых подходов к детекции белка, присутствующего в сложной биологической жидкости (плазма или сыворотка крови) в ультранизких концентрациях.

Один из возможных подходов к решению проблемы измерения ультранизких концентраций белка (менее 10"15 М) состоит в повышении аффинности и селективности аффинных реагентов. Особый интерес представляют аффинные реагенты, позволяющие получать необратимые комплексы, «фиксируя» их путем образования ковалентной связи (Chmura A.J. et al., 2001; Gander T.R. et al., 2005; Holm L. et al., 2009). Прямой подсчёт числа таких комплексов с помощью так называемых «молекулярных счётчиков», работающих на принципах сканирующей атомно-силовой и ближнепольной оптической микроскопии, делает возможным детекцию белка, присутствующего в концентрациях ниже 10"15 М (Archakov A.I. et al., 2007; Ivanov Y.D. et al., 2006). При этом переход от обратимого к необратимому (ковалентному) специфическому связыванию приводит к понижению концентрационного предела детекции на несколько порядков (Archakov A.I. et al., 2009).

Среди аффинных реагентов, способных формировать ковалектные комплексы с мишенью, наиболее перспективными с точки зрения практического применения являются «фотоаптамеры», представляющие особый класс аптамеров (Gander T.R., 2005; Petach Н., 2004). Аптамеры представляют олигонуклеотиды с высоким сродством к заданной мишени, отбираемые методом селекции in vitro в комбинаторных библиотеках нуклеотидных последовательностей (Jayasena S.D., 1999). Использование библиотек, состоящих из олигонуклеотидов с галогенсодержащими основаниями, позволяет получать «фотоаптамеры» с помощью отбора одновременно по аффинности и по способности образовывать фотоиндуцированные ковалентные связи (фотосшивки) селективно с белком-мишенью (Golden М.С. et al., 2000; Smith D. et al., 2003). В отличие от таких аффинных реагентов, как Fab и аффитела, где придание способности к образованию ковалентных

комплексов с молекулярной мишенью не всегда возможно и требует знания структуры комплекса с мишенью (Chmura A.J. et al., 2001; Holm L. et al., 2009), фотоаптамеры могут быть получены практически к любому белку без знания о структуре комплекса (Gander T.R. et al., 2005).

Опубликованные экспериментальные данные указывают на существование корреляции между аффинностью фотоаптамера к белку-мишени и выходом ковалентных комплексов (Воск С. et al., 2004; Smith D. et al., 2003). Однако селекция одновременно по двум параметрам (аффинности и способности формировать фотосшивки) ведет в общем случае к отбору олигонуклеотидов с более низким сродством, чем при селекции только по аффинности. Это требует разработки подходов к повышению аффинности фотоаптамеров с целью создания высокоэффективных аффинных реагентов для измерения ультранизких концентраций белка.

Аффинность аптамеров может быть значительно усилена, используя молекулярное конструирование. В процессе химического синтеза аптамерные последовательности могут быть легко объединены в единую полинуклеотидную цепь. Это позволяет создавать «линейные» аптамерные конструкции, где аптамерные последовательности соединены либо нуклеотидными линкерами, либо линкерами неиуклеотидной природы (Davis К.А. et al., 1996; LinY. et al., 1997; Ringquist S. et al., 1998; Umehara T. et al., 2005; Müller J. et al., 2007; Hasegawa H. et al., 2008; Kim Y. et al., 2008; Tian L. et al., 2009). Особый интерес представляют гетеродимерные конструкции, содержащие два аптамера, узнающих разные участки поверхности одного белка. Такие конструкции показали в целом усиление аффинности и/или функциональной активности по отношению к белку-мишени по сравнению с исходными аптамерами (Umehara T. et al., 2005; Müller J. et al., 2007; Hasegawa H. et al., 2008; Kim Y. et al., 2008; Tian L. et al., 2009).

Можно предположить, что объединение фотоаптамера и аптамера, узнающих разные участки поверхности белка-мишени, в гетеродимерную фотоаптамерную конструкцию также приведёт к созданию аффинного реагента с улучшенными характеристиками. В настоящее время известны аптамер и фотоаптамер к тромбину, взаимодействующие с разными поверхностными сайтами белка. Их использование в качестве модельной системы даёт возможность экспериментально проверить, приведёт ли объединение аптамера и фотоаптамера в фотоаптамерную гетеродимерную конструкцию к значимому с практической точки зрения понижению концентрационного предела детекции ковалентных комплексов.

Цель и задачи исследовании

Целью работы является экспериментальное обоснование возможности понизить концентрационный порог формирования ковалентных комплексов фотоаптамера с белком-мишенью путём включения фотоаптамера в гетеродимерную аптамерную конструкцию, используя алтамеры и фотоаптамеры к тромбину как модельную систему.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Синтезировать гетеро- и гомодимерные конструкции анти-тромбиновых аптамеров с длиной политимидинового линкера, варьирующей в широком диапазоне. Исследовать их взаимодействие с тромбином на оптическом биосенсоре Biacore-ЗООО для нахождения длины линкера, обеспечивающей максимальную аффинность.

2. Синтезировать 5-йод-урацил- и 5-бром-урацил-содержащие антитромбиновые фотоаптамеры и провести сравнительный анализ их способности формировать фотоиндуцированные ковалентные комплексы с тромбином.

3. Синтезировать антитромбиновые гетеродимерные фотоаптамерные конструкции с длиной политимидинового линкера, оптимизированной по аффинности. Оценить выход ковалентных комплексов с тромбином в зависимости от дозы облучения ультрафиолетовым излучением и концентрации лиганд/мишень в растворе.

4. Провести анализ процесса фотоинактивации фотоаптамеров и фотоаптамерных гетеро димерных конструкций.

Научная новизна работы

Впервые проведён сравнительный анализ аффинности гетеро- и гомодимерных аптамерных конструкций, образованных с помощью полинуклеотидного линкера, в широком диапазоне длин линкера. Впервые получены оценки термодинамических параметров взаимодействия тромбина с антитромбиновыми аптамерами и гетеродимерной аптамерной конструкцией. Впервые получен бром-урацил-содержащий фотоаптамер к тромбину. Впервые показано, что объединение фотоаптамера и аптамера в гетеродимерную конструкцию приводит к понижению концентрационного порога детекции ковалентных комплексов фотоаптамер/тромбин более чем в сто раз.

Практическая значимость исследований

Результаты, полученные в работе, могут служить отправной точкой для развития «инженерного» подхода к созданию высокоэффективных аффинных реагентов, способных формировать фотосшивки селективно с белком-мишенью. Высокоаффинные антитромбиновые аптамерные гетеродимерные конструкции представляют интерес как исходный материал для создания антикоагулянтов нового поколения. Полученные линейные гетеродимерные фотоаптамерные конструкции будут использованы при разработке подхода к количественному определению белка с помощью «молекулярных счетчиков».

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на IV Международной конференции «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine» (Москва, 2008), на VI Международной конференции «Bioinformatics of genome regulation and structure" (Новосибирск, 2008), на научной конференции, посвященной 25-летию ИХБФМ СО РАН «Химическая биология. Фундаментальные проблемы

бионанотехнологии» (Новосибирск, 2009), на V Международной конференции «Genomics, Proteomics, Bio informatics and Nanobiotechnologies for Medicine» (Москва, 2010). Материалы диссертации представлены в 3 статьях и в 5 публикациях в материалах сборников научных конференций.

Структу ра Ii объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав обзора литературы, главы «Материалы и методы», 3 глав раздела «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 257 источников. Работа изложена на 132 страницах текста, содержит 38 рисунков и 3 таблицы.

Исследование выполнено на базе ИБМХ РАМН в рамках научной программы РАМН «Протеомика для медицины и биотехнологии».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Реагенты и растворы

В работе использовались реактивы производства Acres Organics (Бельгия), Glen Research (США) и Sigma-Aldrich (США), качества ACS или выше. Белки были приобретены в Sigma-Aldrich, за исключением L-аспарагиназы, которая была любезно предоставлена лабораторией медицинской биотехнологии ИБМХ РАМН. Концентрацию раствора бычего сывороточного альбумина (БСА) определяли спектрофотометрически, исходя из известного коэффициента экстинкции: Е1%=6,67 на 280 нм (Simonian М.Н. et al., 2006). Концентрации растворов других белков определяли методом Брэдфорд, используя растворы БСА как стандарт. Концентрацию растворов олигонуклеотидов определяли спектрофотометрически (1 O.E. при 260 нм и оптическом пути 1 см соответствует 33 мкг/мл). Перед использованием растворы олигонуклеотидов инкубировали в течение 5 мин при 95°С и быстро охлаждали во льду.

Синтез и очистка олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды синтезировали на ДНК-синтезаторе ASM-800 (Биоссет, г. Новосибирск, Россия) в направлении от 3'- к 5'-концу методом твердофазного синтеза в соответствии со стандартными протоколами фирмы-производителя. При синтезе биотиннлированных и галоген-содержащих олигонуклеотидов в протоколы синтеза были внесены изменения в соответствии с рекомендациями фирмы-поставщика фосфоамвдитов (www.glenresearch.com). Олигонуклеотиды длиной до 50 нт деблокировали (удаление 5'-концевой диметокситритильной группы) и очищали на установке OPS-201 (Биоссет, Новосибирск) с использованием хроматографии на обращенной фазе в соответствии со стандартными протоколами фирмы-производителя. Олигонуклеотиды длиной более 50 нт деблокировали на синтезаторе и очищали с помощью электрофореза в 12% геле в денатурирующих условиях (7 М мочевины). Хранились олигонуклеотиды в виде водного раствора при -20°С до использования. Обозначения и последовательности использованных в

работе олигонуклеотидов приведены в таблице 1. В приведённых последовательностях «В» указывает биотин, ЫНг - аминогруппа, сШ - случайный нуклеотид.

Таблица 1. Обозначения и последовательности олигонуклеотидов.

А1 В-5'-ГСАСТСССТССТАССССАССТТССССТСАСТО'

А2 В-5'-Л 7С7СТАСТССТТССТСТССТТССОТАС-3'

А1(35) В-5'-ГСАСТСССТССТАССССАССТТССССТСАСТ-ро1у(<1Т)з5-3'

(35)А2 В-5'-роШЛ„-СТАСТССТТССТСТССТТСОСТАО-3'

N30 5'-ро1у(с1М)зо

N74 5'-ро1у(с1^74

А1(п)А2 В-5'-ГСАСТСССТССТАССССАССТТССССТСАСТ-ро1у((1Т)п-СТАСТССТТССТСТССТТССОТАС-З'

А2(п)А1 В-5'-Л гОГСТАСТССТТССТСТСС ГТССОТАО- роК'(с!Т1-АСТСССТССТАССССАССТТССССТСАСТ-З'

А1(п)А1 В-5'-7ГАСТСССТССТАССССАССТТССССТСАСТ. ро1у(аТ)п-АСТСССТССТАССССАССТТССССТСЛСТ -3'

А2(п)А2 В-5'-^ТО7СТАСТССТТССТСТССГТССОТАО-ро1у(аг)„-СТАСТССТТССТСТССТТСОС.ТАС-З'

015(Вг) 5'-GGTTGGTGTGG(5-BrdU)TGG-3'

рС(Вг) 5'-GG-(5-BrdU)GG•3'

рТ(Вг) 5'-ТТ(5-Вгаи)ТТ-3'

А1Р11(1) 5-АСТСССТССТАССССАСС{5-Ии)ТССССТСАСТ-3'

А1РЬ(Вг) 5'-АСТСССТССТАССССАСС(5-Вгаи)ТССССТСАСТ-3'

А1РВД1Л 5'-ЛЛСАСТСССТССТАССССАСС(5-Ии)ТССССТСАСТ-3'

А1РЬ(1)Ы-В В-5'-ЛЛСАСТСССТССГАССССАСС(5-Ии)ТССССТСАСТ-3'

А1РЬ(1)Ь2 5'-АСТСССТССТАССССАСС{5-Ми)ТССССТСАСТ7"ССГОСЛ-3'

А1РЬ(1)Ь2-Ш3 5'-АСТСССТССТАССССАСС(5-Ми)ТССССТСАСТ7ШГСОЛ-3'-ЫНз

А1РЬ(1)Ы/Ь2 В-5'-/4/)СЛСТСССТССТАССССАСС(5-Ыи)ТССССТСАСГГСОГССЛ-3'-ХН3

А1РЬ(1)-С15 5-АСТСССТССТАССССАСС(5-Ии)ТССССТСАСТ-ро1у(аТ)з5-ССТТССТСТССТТСС-З'

А1РЬ(Вг)-А2 5'-АСТСССТССТАССССАСС<5-Вгаи)ТССССТСАСТ-ро1уУТ)з5-СТАСТССТТССТСТССТТССОТАО-З'

А1РЬ(1)Ы/Ь2-А2 В-5'-/!/(САСТССетССТАССССЛСС(5-Ыи)ТССССТСАСТ ГСС7ШЛ-ро1уОТ),,-СТАСТССТГССТСТССТТССОТАО-3'-ЫН,

Масс-спектрометрический анализ

Масс-спектрометрический анализ олигонуклеотидов и пептидов проводили на МА1ЛЭ1-ТОР масс-спектрометре МюгоПех (Вгикег, Германия). При анализе олигонуклеотидов в качестве матрицы использовали водный раствор 3-гидроксипиколиновой кислоты (10 мг/мл) и

диаммониумгидрогениитрата (1 мг/мл). Масс-спектрометрический анализ пептидов проводили, используя в качестве матрицы а-циано-4-гидрокси-В-фенилакриловую кислоту (10 мг/мл), растворённую в водном растворе этанола и ацетонитрила (50% и 30%, соответственно). Полученные масс-спектры обрабатывали с помощью программы FlexAnalysis (Bruker, Германия). Набор масс пептидов анализировали с помощью поисковой программы MASCOT Peptide Mass Fingerprint (www.matrixscience.com).

Измерение аффинности антитромбиновых аптамеров и их димерных конструкций на оптическом биосенсоре Biacore 3000

Эксперименты по исследованию взаимодействия аптамеров с белками выполняли на 4-х канальном оптическом биосенсоре Biacore 3000 (GE, США), принцип детекции которого основан на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (ГП1Р) (Rich R.L. el al, 2000; Majka J. et al., 2007). Измерения проводили при 37°C с использованием стандартных протоколов фирмы-производителя. При проведении термодинамического анализа температуру варьировали в интервале от 10°С до 40°С. Сигнал биосенсора (в резонансных единицах, RU) регистрировался в каждом канале независимо и представлялся в виде сенсограммы, показывающей изменение во времени разницы сигналов в выбранном и референсном каналах. В качестве референсного канала служил канал, в котором не были иммобилизованы олигонуклеотиды. Обработка сенсограмм проводилась с помощью программного пакета BIAevaluation v.4.1 (GE, США). В работе использовались оптические чипы типа SA (GE, США), несущие на рабочих поверхностях иммобилизованный стрептавидин. Иммобилизация 5-биотинилированных олигонуклеотидов на рабочей поверхности канала оптического чипа SA осуществлялась путём инжекции в выбранный канал биосенсора 1 мкМ раствора олигонуклеотида в буфере HBS-P, содержащем 150 мМ NaCl, 0,005% Р20, 10 мМ HEPES (рН 7,4), при скорости потока 5 мкл/мин. На каждом чипе иммобилизовали три аптамерных или две аптамерных и одну контрольную олигонуклеотидные последовательности в случайных комбинациях. Для учёта возможной гетерогенности чипов, измерения для каждой аптамерной последовательности и контрольных олигонуклеотидов выполняли по крайней мере на трёх чипах.

Взаимодействие аптамер-тромбин исследовали, инжектируя раствор белка в различных концентрациях в буфере RA (20 мкМ БСА, 100 мМ NaCl, 50 мМ КС1, 1 мМ MgCh, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5) при скорости потока 5 мкл/мин. Некоторые дополнительные измерения были выполнены при скорости потока 20 мкл/мин. Связывание БСА с аптамерами и аптамериыми конструкциями исследовали в буфере R (100 мМ NaCl, 50 мМ КС1, 1 мМ MgCl2, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5). Регенерацию поверхности оптического чипа проводили, пропуская 0,05% раствор SDS в течение 0,5 мин при скорости потока 50 мкл/мин. Кажущиеся равновесные константы диссоциации комплексов тромбина с аптамерами и

димерными конструкциями вычисляли методом нелинейной регрессии, используя программный пакет BIAevaluation v.4.1, из уравнения (Majka J. et al., 2007):

R.</Rma. = C/(KD + C),

где R;q - равновесный сигнал биосенсора при данной концентрации тромбина, Rmax -максимальный сигнал биосенсора при данном количестве иммобилизованных олигонуклеотидов; С - концентрация тромбина в растворе; KD - кажущаяся равновесная константа диссоциации. Для вычислений Ко использовали значения R«,, полученные из сенсограмм для 7 и более концентраций тромбина.

Облучение комплексов фотоаптамер/тромбин

Комплексы фотоаптамер/тромбин формировали, смешивая растворы фотоаптамера или фотоаптамерных конструкций с раствором тромбином в эквимолярных концентрациях в буфере R. Смеси инкубировали при 37°С в течение 30 мин, после чего помещали в кварцевую кювету и подвергали воздействию УФ-излучения с длиной волны 308 нм, используя эксимерный лазер CL-5000 (Оптосистемы, г. Троицк, Россия). Облучение проводили на воздухе при комнатной температуре в 0,5 мл кювете с оптическим путем 1 см. Мощность излучения составляла 10 мДж/импульс, частота - 10 Гц. Облучённые пробы при необходимости концентрировали ультрафильтрацией, используя микроконцентраторы Microcon YM-3.

Электрофоретический анализ облучённых комплексов фотоаптамер/тромбин

Облучённые и необлученные пробы анализировали с помощью денатурирующего ПААГ-электрофореза в ТВЕ-буфере в присутствии 7 М мочевины, используя 8% и 12% гели (Рис. IA). Полосы, соответствующие олигонуклеотидам, визуализировали сканированием гелей на флуоресцентном сканере Typhoon 9400 (Amersham Biosciences, США) на длинах волн 488 нм (возбуждение) и 526 нм (эмиссия) после окраски флуоресцентным красителем SYBR Green I (Invitrogen, США). Суммарное количество олигонуклеотидов, наносимое на дорожку геля, составляло 300, 60 или 30 нг. Электрофореграммы анализировали с помощью программы ImageQuant 5.2 (Amersham Biosciences), позволяющей представлять полосы в виде пиков и вычислять в условных единицах флуоресценции их площади (Рис. 1Б). Поскольку флуоресцентный сигнал для свободных фотоаптамеров (пик 1) при нанесении 300 нг на дорожку лежал в нелинейной области, то оценку относительного количества фотоаптамеров, необратимо связанных с белком, F (%), проводили с использованием площади пика 1 при нанесении 30 или 60 нг (S1*), по формуле: F = [S2/(S2+n-Sl*)]-100%, где S2 - площадь пика при нанесении 300 нг, п равно 10 или 5.

Трипсинолиз белка в ковалентном комплексе с фотоаптамером

Анализ белка, находящегося в полосе, отнесенной к ковалентным комплексам олигонукяеотид/тромбин, проводили, используя метод трипсинолиза белка в геле, предложенный Shevchenko A. et al. (Shevchenko A. et al., 1996).

1 2 3 4 5 6 7

Ц... Г ! Щ ЯЕ -* « $ Ш I

■ f « f f f II

ж v

ff sf p • -fr w

Рис. 1. Типичный результат электрофоретического анализа УФ-облучбнных и необлучённых смесей тромбина с фотоаптамерами и фотоаптамерными конструкциями. Панель А: Гетеродимерная конструкция AlPh(I)Ll/L2-A2. 1 - тромбин; 2 - необдуманный комплекс; 3, 4, 5, б и 7 - облучение 100, 200, 400, 800 и 1200 импульсами, соответственно. Эквимолярная смесь, концентрация тромбина 0,75 мкМ. Область 1 - полоса, появляющаяся после облучения комплексов; область 2 - полоса, соответствующая аптамерам. Панель Б: Типичный результат сканирования дорожки геля на флуоресцентном сканере. Пик 1 соответствует полосе области 2, пик 2 - полосе области 1, появившейся после облучения комплексов аптамер/тромбин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор пары аптамеров и создание димерных конструкций антитромбиновых аптамсров

Антитромбиновые аптамеры представляют удобную модель для изучения свойств гетеро- и гомодимерных аптамерных конструкций, так как они взаимодействуют с двумя анион-связывающими участками поверхности тромбина, расположенными приблизительно на противоположных сторонах белковой молекулы и известными как экзосайты 1 («фибриноген-узнающий сайт») и 2 («гепарин-связывающий сайт») (Macaya R.F. et al., 1995, Paborsky L.R. et al., 1993; Tasset D.M. et al., 1997; Tsiang M. et a!„ 1995; Wu Q. et al., 1992). Дополнительно, один из анги-тромбиновых аптамеров был конвертирован в фотоаптамер, способный формировать фотоиндуцированную ковалентную связь с фенилаланиновым остатком, принадлежащим экзосайгу 2 тромбина (Tasset D.M. et al., 1997). Используя анти-тромбиновый фотоаптамер, можно создать фотоаптамерные гетеродимерные конструкции и изучить их свойства.

В качестве одного из аптамеров для создания димерных аптамерных и фотоаптамерных конструкций был выбран аптамер AI и его фотоактивный аналог AlPh(l). Последовательность аптамера AI, выделенная жирным шрифтом (Табл. 1), иденгична последовательности аптамера 60-18, взаимодействующего с экзосайтом 2 тромбина (Tasset

Courts 1000004

[LINE-11 (width = 1}

..........

Б.М. « а!., 1997). Два нуклеотида на 5'-конде (выделены курсивом) были добавлены как дополнительный гибкий линкер между биотином и аптамерной последовательностью 60-18. Наличие подобных дополнительных линкеров, как правило, улучшает связывание тромбина с иммобилизованными аптамерами (СЫаШа V. й а!., 2008). Последовательность фотоаптамера А1Р11(1) (Табл. 1) идентична последовательности фотоаптамера, полученного Тазэе! й а1. из аптамера 60-18 (Тагза О.М. е1 а1., 1997), и отличается от последовательности аптамера А1 отсутствием нуклеотидов «линкера» и заменой одного из тимидинов на 5-1(Ю.

В качестве второго аптамера был выбран аптамер А2 (Табл. 1). Последовательность А2 состоит из последовательности, идентичной последовательности аптамера в 15, узнающего экзосайт 1 тромбина (РаЬогеку Ь.И. е1 а!., 1993; Т$1ап§ М. й а1., 1995; Wu Q. И а]., 1992), двух фланкирующих последовательностей, способных формировать дуплекс (выделены подчеркиванием) и 4-х нуклеотидов, добавленных с 5'-конца как дополнительный гибкий линкер (выделены курсивом). Модификация 015 путём добавления дуплексной части была сделана по аналогии с антитромбиновыми аптамерами, полученными Масауа е1 а1. (Масауа Я.Р. е1 а!., 1995). Наличие дуплексной части у аптамсров, полученных Масауа й а1., существенно понижало (в 4-10 раз) Ко комплексов аптамер/тромбин.

Димерные конструкции антитромбиновых аптамеров были получены путем объединения двух аптамерных последовательностей в единую полинуклеотидную цепь в процессе химического синтеза с помощью политимидинового линкера различной протяжённости, от 5 до 65 нт. Предполагаемая структура гетеродимерной конструкции

представлена на Рис. 2. Гетеродимерные аптамерные конструкции обозначаются как А1(п)А2 или А2(п)А1 в зависимости от порядка аптамеров в цепи в направлении от 5'-к 3'- концу, гомодимерные - как А1(п)А1 и А2(п)А2. Число в скобках, п, означает длину политимидинового линкера в нт (Табл. 1).

Рис. 2. Схематческое изображение гетеродимерной аптамерной конструкции

Аффинность гомо- и гетеродимерных конструкций анти-тромбиновых аптамеров

На Рис. 3 представлены типичные сенсограммы, отражающие взаимодействие тромбина с иммобилизованными аптамерами, их димерной конструкцией и контрольными олигонуклеотидами. Наблюдается быстрый рост сигнала, отражающий связывание тромбина с аптамерами или аптамерными конструкциями, с последующим выходом на плато, что соответствует значению равновесного сигнала биосенсора при данной концентрации

гт П0Л1-МТ М11НК£-р Т

Т оиошн

А'А

А "

б-юлртвш

А2

Рис. 3. Типичные сенсограммы. Взаимодействие тромбина и БСА

иммобилизованными

олигонуклеотидами. Скорость потока - 5 мкл/мин. Кривые 1, 2, 3,4 и 5: взаимодействие тромбина с А1(25)А2, А1, А2, 74Ы и ЗОЫ, соответственно. Тромбин в буфере ЯА. Концентрация тромбина - 100 нМ. Кривая 6:

-200 0 200 400 600 800 юоо 1200 1400 взаимодействие БСА с аптамером

Нулевое время - начало инжекции раствора белка после уравновешивания оптического чипа биосенсора буфером. Стрелкой показано окончание инжекции раствора белка и начало инжекции буфера. На вставке представлены кривые 4,5 и 6 в увеличенном масштабе.

тромбина, Уменьшение сигнала биосенсора при последующей инжекции буфера КА отражает диссоциацию сформированных комплексов. Присутствие в буфере БСА улучшало характеристики связывания тромбина (предположительно благодаря уменьшению неспецифического связывания тромбина с поверхностью чипа), что проявлялось в улучшении воспроизводимости сенсограмм. При этом БСА в концентрации 20 мкМ практически не взаимодействовал с иммобилизованными аптамерами и их конструкциями как видно на примере А2 (Рис. 3, кривая 6). Не наблюдалось существенного взаимодействия тромбина с контрольными олигонуклеотидами 74Ы и ЗОМ (Рис. 3, кривые 4 и 5). Аффинность гетеродимерных аптамерных конструкций А1(п)А2 увеличивалась при возрастании длины ро1у((1Т)-линкера до 35 нт и начинала уменьшаться после 55 нт (Рис. 4). Средние значения Ко для аптамерных конструкций с оптимальной длиной ро1у((1Т)-линкера 35-55 нт лежали в

Время инжекции, с

А2. БСА в буфере Я. Концентрация БСА - 20 мкМ.

Рис. 4. Зависимость константы диссоциации, Кс, комплексов тромбина с аптамерами и аптамерными гетеродимерными конструкциями от длины ро1у(сГГ)-линкера. Темные круги

соответствуют

исходным

О 10 20 30 40 50 60 70 Длина поли-(с!Т)-линкера (нт)

аптамерам (п=0) и гетеродимерным конструкциям А1(п)А2, светлые круги - А2(п)А1. Темные треугольники - гомодимерным конструкциям А1(п)А1, светлые треугольники - А2(п)А2. Приведены среднеарифметические значения ± среднеквадратичные отклонения, полученные из трёх и более независимых экспериментов.

треугольники

интервале 0,3-0,4 нМ, что приблизительно в 30 раз меньше значений Ко для аптамеров А1 и А2 (11 и 9 нМ, соответственно). Увеличение аффинности зависело от последовательности аптамеров в конструкции по отношению к иммобилизованному концу цепи: значения Ко гетеродимерных конструкций А2(25)А1 и А2(35)А1 лежали заметно выше, чем у А1(25)А2 и А1(35)А2. Аффинность гомодимерных конструкций увеличивалась при возрастании длины ро1у(с1Т)-линкера до 35 нт всего в 2-3 раза: К0=(4,5±1,2) нМ и (2,8±0,6) нМ для А1(35)А1 и А2(35)А2 против (0,38±0,14) нМ для А1(35)А2, соответственно. Политимидиновый линкер либо не влиял на взаимодействие с тромбином, либо приводил к некоторому уменьшению аффинности: Ко=(21±5) нМ и (7±2) нМ для А1(35) и (35)А2, соответственно. Как видно из Рис. 5, скорость диссоциации комплекса тромбина с А1(35)А2 была ниже, чем скорости

диссоциации комплексов тромбина с исходными аптамерами. Это указывает на то, что комплексы тромбина с гетеродимерной конструкцией более стабильны, чем с аптамерами А1 и А2.

Рис. 5. Нормализованные сенсограммы. Значения сигнала биосенсора в момент остановки инжекции раствора тромбина приняты за 100%. Иммобилизованные олигонуклеотиды: 1 - А2, 2 - А1, 3 -А1(35)А2. Концентрация тромбина - 50 нМ. Скорость потока - 20 мкл/мин.

Данные, полученные на модели анти-тромбиновых аптамеров, показывают, что объединение аптамеров в гстеродимерные конструкции позволяет значительно увеличить аффинность при правильном подборе длины линкера. Это открывает возможность конструирования аффинных реагентов с существенно улучшенным сродством к белковой мишени, используя агггамеры как модульные блоки.

Оценка термодинамических параметров взаимодействия тромбина с анти-тромбиновыми аптамерами и их гетеродимерной конструкцией

На Рис. 6 приведены температурные зависимости равновесных констант диссоциации для аптамеров А1 и А2 и конструкции А1(35)А2. Для проведения измерений аптамеры и конструкция были иммобилизованы в разных каналах одного чипа. Температуру варьировали в интервале от 10°С до 40°С. Для каждой температуры измерения были выполнены на трёх чипах. Полученные зависимости константы диссоциации от обратной температуры, 1 Я, в полулогарифмическом масштабе имели близкий наклон как для аптамеров А1 и А2, так и конструкции А1(35)А2. При этом значения Ко для конструкции

0 -■—1

0 200 400

Время, с

Рис. 6. Зависимость равновесной константы диссоциации от величины, обратной абсолютной температуре измерения, для комплексов тромбина с иммобилизованными алтамерами и аптамерной конструкцией. Темные круги - А1; светлые круги - Л2; треугольники - А1(35)А2. Приведены среднеарифметические значения ± среднеквадратичные отклонения, полученные из трех независимых экспериментов.

лежат на графике существенно ниже. Величины изменений энтальпии и энтропии связывания тромбина с аптамерами А1, А2 и аптамерной конструкцией А1(35)А2 вычисляли методом линейной регрессии из зависимостей на Рис. 21 в соответствии с уравнением изобары Вант-Гоффа:

1п (Кп) = (А1Ш)(1Я) - (ДШ), где ДН и Д5 - соответственно изменения энтальпии и энтропии реакции комплексообразования, II (8,31 ДжМ'-К"1) - универсальная газовая постоянная, Т -абсолютная температура. Полученные оценки изменений энтальпии и энтропии формирования комплексов приведены в Табл. 2.

Таблица 2. Изменения энтальпия и энтропия реакции комплексообразования тромбина с иммобилизованными аптамерами А1 и А2 и гетеродимерной конструкцией А1(35)А2.

3,3 3,4 1000°КЯ

Лиганд АН, кДж-моль'1 ДБ, Дж-моль'-К"' 1=25°С

-ТДБ, кДж-моль"' ДО, кДж-моль"'

А1 -<31,б±3,3) (49,9а: 12,4) -14,9 -46,5

А2 Ч34,2±2,4) (42,5±8,3) -12,7 -46,7

А1(35)А2 429, ад, 3) (81,5±10,0) -24,3 -54,2

Полученные оценки термодинамических параметров процесса образования комплексов тромбина с антитромбиновыми аптамерами и с их гетеродимерной конструкцией показывают, что усиление аффинности гетеродимерных конструкций полностью определяется увеличением абсолютного значения энтропийной составляющей изменения свободной энергии реакции комплексообразования.

Анти-тромбиновые фотоаптамеры и фотоаптамерные гетеродимерные конструкции.

С целью выяснить, приведет ли замена 5-И11 в антитромбиновом фотоаптамере на его фотоактивный аналог, 5-Вг(Ш, к сохранению способности к формированию

фотоиндуцированных ковалентных комплексов с тромбином, в данной работе были синтезированы два галоген-содержащих олигонуклеотида, AlPh(I) и AlPh(Br) (Табл. 1). Последовательность первого идентична последовательности анти-тромбинового фотоаптамера, полученного Tasset et al. (Tasset D.M. et al., 1997), второго - отличается от него заменой 5-IdU на 5-BrdU (Табл. 1).

Облучение смесей как AlPh(I), так и AlPh(Br) с тромбином приводило к появлению на геле при последующем электрофоретическом анализе медленно мигрирующей полосы, аналогичной показанной на Рис. 1А. Облучение аптамера AI в сходных условиях не приводило к появлению дополнительных полос на геле. Относительное количество олигонуклеотидов в этой полосе нарастало с дозой, выходя на насыщение при дозе облучении около 500 импульсов (Рис. 7), что было интерпретировано как формирование фотоиндуцированных ковалентных комплексов аптамеров с тромбином. Максимальный выход фотосшивок при облучении смесей тромбина с фотоаптамерами составлял 10-12%.

Рис. 7. Зависимость доли олигонуклеотидов, ковалентно связанных с тромбином (Р), от дозы УФ-облучеиия.

Аотитромбиновые фотоаптамеры А1РВД (темные круги) и А1РЬ(Вг) (светлые круги). Эквимолярные смеси фотоаптамер/тромбин. Концентрации тромбина 0,2 мкМ. Приведены среднеарифметические значения ± среднеквадратичное отклонение, полученные из трёх независимых экспериментов.

1600

На Рис. 8 представлены результаты облучения

400 600 800 1000 1200 Количество импульсов

эквимолярных смесей тромбина с фотоаптамерами А1РЬ(1) и А1РЬ(Вг) в дозе 1000 импульсов при разных концентрациях. Видно, что относительный выход ковалентных комплексов снижается по мере уменьшения концентрации компонентов смеси. Как дозовые, так и концентрационные зависимости выхода комплексов для обоих фотоаптамеров практически не отличаются. Таким образом, замена тимидина в позиции 12 антитромбинового аптамера 60-18 на 5-Вйи приводит к появлению фотоаптамера с такими же характеристиками, как и его замена на 5-Ми.

Гетеродимерные фотоалтамерные конструкции были созданы путём объединения фотоаптамерных последовательностей А1РЬ(1) или А1РЬ(Вг) с аптамерной последовательностью А2 с помощью ро1у(сГГ)-лишсера длиной 35 нт (Табл. 1). Такая длина

• A1Ph(l) О A1Ph(Br)

'О о

Оо.

10-= ю-8 10-' 10^ ю-5 ю-4

Концентрация эквимолярной смеси тромбин/агттамер (М)

линкера была выбрана как наименьшая длина, обеспечивающая достижение нижних значений константы диссоциации комплексов тромбин/гетеродимерная конструкция (Рис. 4).

Рис. 8. Доля олигонуклеотидов в ковалентном комплексе с тромбином как функция концентрации. Фотоаптамеры А1РЬ(1) и А1РЬ(Вг). Эквимолярные смеси аптамер/тромбин, доза облучения - 1000 импульсов.

Как и в случае исходных фотоаптамеров, облучение эквимолярных смесей тромбина с фотоаптамерными конструкциями приводило к появлению дополнительной медленно мигрирующей полосы на геле (полоса I, Рис. 1А), интенсивность которой нарастала с дозой облучения и выходила на плато в области 500 импульсов. На Рис. 9 представлен относительный выход фотосшивок F, для гетеродимерной фотоалтамерной конструкции AlPh(Br)-A2 и фотоаптамера AlPh(Br). Как можно видеть, в том диапазоне концентраций, где наблюдается падение выхода ковалентных комплексов для фотоаптамера, выход остается приблизительно постоянным в случае конструкции. Нижний предел исследованной концентрационной области определялся чувствительностью метода детекции олигонуклеотидов в геле с использованием флуоресцентного красителя SYBR Green.

Рис. 9. Доля олигонуклеотидов в ковалентном комплексе с тромбином как функция концентрации. Фотоаптамер А1РЬ(Вг) и гетеродимерная фотоаптамерная

конструкция А1РЬ(Вг) -А2. Эквимолярные смеси аптамер/тромбин, доза облучения - 1000 импульсов.

g 8 u-

6 4 2 О

О 00 о о "о

0 0 о

• • • •

• A1Ph(Br) о А1 Ph(Br)-A2

108 10* ю-7 10-« 10"= ю-1 Для того чтобы убедиться, что Концентрация эквимолярной смеси тромбин/аптамер (М)

медленно мигрирующая полоса при электрофоретическом анализе облученных смесей тромбина с AlPh(Br)-A2 представлена ковалентными комплексами белок/фотоатттамер, был проведен трипсинолиз материала, находящегося в данной полосе. Результаты масс-

спектрометрического анализа продуктов трипсинолиза представлена в Табл. 3. На основе данного набора масс пептидов белок был идентифицирован как протромбин с индексом достоверности идентификации 77 (уровень статистически значимого скоринга 64), используя поисковую программу Mascot.

Таблица 3. Массы пептидов и отношение сигнал/шум.

m/z SN m/z SN m/z SN m/z SN

434,109 10.0 645,603 7,7 660,061 25,5 836,158 73,5

463,677 6,4 555,596 10,0 690,119 8.3 842,247 28,0

490,977 7,1 567,909 13,2 712,137 8,5 858,141 14,8

491,863 8,7 574,093 18,3 720,161 9,4 874,208 18.0

493,685 8,2 589,072 12,0 724,140 24,6 896,210 40,7

499,912 7,8 591.099 11,8 734,125 174,3 1027,204 25.4

501,027 7,8 596,089 26,2 735,101 24,1 1189,246 14,2

502,980 9,9 620,755 7,3 742,143 12,5 1194,261 70,8

504,785 14,0 638,070 151,8 756,105 36,0 1216,241 9,1

515,084 55,8 646,090 65,2 798,225 96,0 1273,291 22,2

545,062 41,7 655,820 40,7 820,202 24,1

Сравнительный анализ выхода фотоиндуцированных ковалентных комплексов был проведён также для фотоаптамера А1РЬ(1)1Л/Ь2 и гетеродимерной конструкции А1РЬ(1)Ь1/Ь2-А2. Фотоаптамер А1РЬ(1)1Л/Ь2 представляет алтамер А1РЬ(1), модифицированный путём добавления к фотоаптамерной последовательности концевых нуклеотидных последовательностей (гибких линкеров), к которым присоединён биотин (с 5'-конца) и аминогруппа (с З'-конца) (Табл. 1). Такая модификация позволяет потенциально иммобилизовать фотоаптамер на поверхностях с карбоксильными группами или с ковалентно присоединённым стрептавидином. Как можно видеть на Рис. 10А, выход сшивок как для фотоаптамера, так и для конструкции также достигает насыщения при дозе облучения около 500 импульсов. Для конструкции сравнимый выход фотоиндуцированных ковалентных комплексов достигается при концентрациях эквимолярной смеси на два порядка ниже, чем в случае фотоаптамера (Рис. 10Б). Таким образом, включение фотоаптамера в состав гетеродимерной конструкции существенно понижает концентрацию эквимолярной смеси олигонуклеотидов с тромбином, необходимую для эффективного образования фотоиндуцированных ковалентных комплексов при заданной дозе.

Вероятно, более высокая эффективность фотоапгамерных гегеродимерных конструкций в отношении формирования фотосшивок определяется их более высокой аффинностью к белку-мшпеци по сравнению с исходными фотоаптамерами. Действительно, значения Ко для комплексов тромбина с иммобилизованными фотоаптамером А1РЬ(1)Ь1/Ь2 и фотоаптамерной конструкцией А1Р11(1)1Л/1,2-А2, определённые на оптическом биосенсоре

О 200 400 600 800 1000 1200 1400 Количество импульсов

10» 10« 10-' 10s 10-5 10-» Концентрация тромбина, М

Рис. 10. Панель А: Зависимость доли олигонуклеотидов, ковалентно связанных с тромбином, F, от дозы УФ-облучения. Эквимолярные смеси фотоаптамер/тромбин. Темные символы - A1P(I)L1/L2-А2, 0,75 мкМ; светлые символы - AlPh(I)Ll/L2, 2,5 мкМ. Приведены среднеарифметические значения ± среднеквадратичное отклонение, полученные из трёх независимых экспериментов. Панель Е; Доля олигонуклеотидов в ковалентном комплексе с тромбином как функция концентрации. Эквимолярные смеси фотоаптамер/тромбин Темные символы - A1P(I)L1/L2-A2, светлые символы -AlPh(I)L!/L2. Облучение - 750 импульсов.

Biacore-3000, равнялись (190±35) нМ и (5,3±0,6) нМ. То, что выход фотосшивок может зависеть от аффинности фотолиганда к мишени, следует из математической модели, описывающей формирование фотосшивок между фотоаптамером и белком с учётом возможной фотоинактивации лиганда (Smith D. et al., 2003; Koch Т.Н. et а!., 2004). Предполагается (Koch Т.Н. et al., 2004), что при УФ-облучении смеси аптамер/белок идут два конкурирующих процесса - образование фотосшивок и инактивация фотоаптамеров, как свободных, так и находящихся в комплексе с белком. Образующийся при облучении в результате разрыва связи между атомами брома и углерода урацил-радикал с определёнными вероятностями может атаковать дезоксирибозу или основание прилегающего нуклеотида, либо прореагировать с соответствующим аминокислотным остатком белка-мишени. Относительный выход ковалентных комплексов будет с очевидностью определяться тем, какая доля фотоаптамеров находится в комплексе с белком-мишенью при данной концентрации.

Аффинность иммобилизованного фотоаптамера AlPh(l)Ll/L2 значительно отличается от аффинности агггамера AI: средние значения Kd равны соответственно 190 и 11 нМ. При этом аптамер А1(35), имеющий дополнительный 5'-концевой политимидиновый участком длиной 35 нт (Табл. 1), характеризовался средним значением Ко, равным 21 нМ. Таким образом, наблюдаемое значительное различие в аффинности иммобилизованных аптамеров AI и AlPh(I)Ll/L2 связано либо с наличием 5'-концевого полинуклеотидного линкера

определённой последовательности, либо с заменой тимидина на 5-IdU. Следует отметить, что ухудшение аффинности аптамеров при их конвертация в фотоаптамеры методом «перебора» вариантов замены тимидина на его фотоактивный анапог наблюдалось ранее. Так, замена одного из тиминов на 5-йод-урацил в РНК-аптамерах к VEGF хотя и приводила к появлению фотоиндуцированных сшивок с белком-мишенью, но сопровождалась значительным понижением сродства (Ruckman J. еtal., 1998).

Концентрационная зависимость выхода сшивок в случае фотоаптамера AlPh(I)Ll/L2 лежит в области концентраций, по меньшей мере на порядок превышающих концентрации, при которых наблюдается сравнимый выход фотосшивок в случае фотоаптамера AlPh(I) (Рис. 7 и 9). Фотоаптамер AlPh(I)Ll/L2 отличается от AlPh(I) наличием концевых полинуклеотидных линкеров с бнотином и аминогруппой (Табл. 1). Для того, что бы проверить, не являются ли линкеры или концевые функциональные группы причиной наблюдаемого ухудшения эффективности формирования фотоиндуцированных комплексов, были синтезированы четыре варианта фотоаптамера AlPh(I), различающиеся добавлением одного из линкеров с концевой группой или без неё (Табл. 1, фотоаптамеры AlPh(l)Ll, AlPh(I)Ll-B, AlPh(J)L2, AlPh(I)L2-NH3). Облучение их эквимолярных смесей с тромбином при заданной концентрации (0,2 мкМ) привело к приблизительно 2-кратному уменьшению выхода фотосшивок. При этом наличие биотина или аминогруппы практически не влияло на образование ковалентных комплексов. Представляется наиболее вероятным, что присутствие двух концевых линкеров является причиной понижения выхода фотосшивок. Это указывает на то, что образование фотосшивки очень чувствительно к изменениям во взаиморасположении фотоактивного основания и соответствующего аминокислотного остатка - даже возможное незначительное нарушение структуры комплекса фотоаптамер/мишень из-за появления концевых линкеров может привести к существенному понижению эффективности фотосшивания.

Поскольку объединение фотоаптамера с аптамером А2 в гетеродимерную конструкцию приводило к значительному понижению концентрационного порога детекции ковалентных комплексов с тромбином, было интересно проверить, не будет ли его объединение с аптамером G15 также приводит к понижению концентрационного порога детекции. На Рис. 11 представлены зависимости относительного выхода ковалентных комплексов от концентрации тромбина в эквимолярных смесях с фотоаптамером AlPh(l) и фотоаптамерной конструкцией AlPh(I)-G15. Конструкция представляет полинуклеотид, где последовательности фотоаптамера AlPh(I) и аптамера G15 соединены ро1у(ёТ)-линкером длиной 35 нт (Табл. 1). Как можно видеть, концентрационная зависимость для фотоаптамерной конструкции несколько сдвинута в область более низких концентраций по сравнению с зависимостью для фотоаптамера AlPh(I). Однако понижение

концентрационного порога детекции ковалентных комплексов значительно меньше, чем в

случае конструкций с

14 •

12 -10 ■ 8 ■

■ °

о 0#» •

о*

О О

• A1Ph|l) О A1Ph(l)-G15

аптамером А2. Это может указывать на то, что аптамер А2

Рис. 11. Доля олигонуклеотидов в ковалентном комплексе с тромбином как функция концентрации. Фотоаптамер

AlPh(I) и гетеродимерная фотоаптамерная конструкция AlPh(I) -G15. Эквимолярные смеси аптамер/тромбин, доза облучения -1000 импульсов.

имеет большее сродство к

10"» 1СН> ю-7 ю-8 10"5 10"4 Концентрация эквимолярной смеси тромбин/аптамер (М)

тромбину в растворе, чем G15, или что длина политимидинового линкера 35 нт не является оптимальной для пары AlPh(I) и G15.

Фотоинактивация анти-тромбиновых фотоаптамеров и фотоаптамерных конструкций под воздействием ультрафиолетового излучения

Выход ковалентных комплексов фотоаптамеров с белками-мишенями никогда не достигал 100% (Tasset D.M. et а!., 1997, Jensen K.B. et al, 1995; Ruckman J. et al, 1998; Golden M.C. et al, 2000; Smith D. et al, 2003; Koch Т.Н. et al, 2004). Основываясь на этом, было предположено, что эффективность образования фотосшивок ограничена идущим параллельно процессом инактивации фотоаптамеров, связанным с возникающими при УФ-облучении повреждениями галоген-содержащих олигонуклеотидов (Smith D., et al 2003; Koch Т.Н. et al, 2004). Другая возможная причина - повреждение белка-мишени. Хотя УФ-излучение с длиной волны выше 300 нм как правило не вызывает существенной фотодеградации белка (Meisenheimer K.M. et al, 1997), известны случаи, когда оно приводило к значительным фотоиндуцированным повреждениям белковой компоненты при исследовании специфических белковых комплексов с нуклеиновыми кислотами (Gott J.M. et al, 1991).

Для того, что бы определить причину, ограничивающую выход ковалентных комплексов в случае антитромбиновых фотоаптамеров и фотоаптамерных конструкций, растворы тромбина или олигонуклеотидов были подвергнуты воздействию УФ-излучения до их смешивания в эквимолярном соотношении («предоблучение»). После инкубации смесей 30 мин при 37°С, их облучали и определяли относительный выход ковалентных комплексов, F, с помощью элеирофоретического анализа. УФ-облучение тромбина в буфере R в дозе, соответствующей 2000 импульсам, не привело к сколь либо заметному изменению выхода

фотосшивок. В отличие от тромбина, предоблучение фотоаптамера AlPh(Br) в такой же дозе уменьшало выход фотосшивок более чем в два раза. Исследование воздействия «предъоблучения» в диапазоне от 0 до 2500 импульсов показало (Рис. 12), что выход

ковалентмых комплексов падает с дозой предъоблучения как в случае фотоаптамера AlPh(Br), так и фотоаптамерных конструкций

А1 Ph(I)L 1/L2-A2 и А1 Ph(Br)-A2. Рис. 12. Зависимость выхода ковалентных комплексов тромбина с фотоаптамером AlPh(Br) и фотоаптамерными

конструкциями от дозы «предоблучения». AlPh(Br), AlPh(Br)-A2 и AlPh(I)L 1/L2-A2 в концентрации 1 мкМ были облучены в буфере R. Предоблучённые растворы использовали для приготовления эквимолярных смесей с тромбином (0,5 мкМ). Доза облучения - 1000 импульсов. Светлые круги -AlPh(Br); темные круги - AlPh(I)Ll/L2-A2; треугольники - AlPh(Br)-A2. Приведены среднеарифметические значения ± среднеквадратичное отклонение, полученные из трех экспериментов.

Инактивация фотоаптамеров не сопровождалась фрагментацией олигонуклеотидов. Как видно на Рис. 13, облучение AlPh(I)Ll/L2-A2 дозами до 2000 импульсов не приводило к появлению дополнительных полос. Не было также обнаружено продуктов фрагментации при масс-спектрометрическом анализе фотоаптамера AlPh(I)Ll/L2, облучённого в воде (Рис. 14): спектр был представлен различными зарядными состояниями молекулярного иона с массой 12911 Да (ожидаемая молекулярная масса - 12920Да). Таким образом, можно заключить, что при облучении анти-тромбиновых фотоаптамеров и фотоаптамерных конструкций не происходит образования однонитевых разрывов и их инактивация определяется другими видами фотоиндуцированных молекулярных повреждений.

Рис. 13. Электрофоретический анализ влияния УФ-облучения на фотоаптамерную конструкцию AlPh(I)Ll/L2-A2. Необлученные (дорожка 1) и облученные 500, 1000 и 2000 импульсами (дорожки 2,3 и 4, соответственно) образцы. Концентрация облучаемых растворов AlPh(I)Ll/L2-A2 - 0,5 мкМ. Облучение в буфере R. Денатурирующий ПААГ-электрофорез в присутствии 20 М формамида.

Масс-спектрометрический анализ модельного олигонуклеотида G15(Br), чья последовательность была идентична последовательности аптамера G15 с заменой тимидина в позиции 12 на 5-BrdU (Табл. 1), показал, что УФ-облучение приводит к появлению

500 1000 1500 2000 2500 Количество импульсов

12 3 4

300 Ьр —г

150Ьр ^ ^

■«• Ш5ШГ -ЩЩв: ЩЯШ;

10 Ьр $

intz

дополнительных пиков в масс-спектре (Рис. 15). Они представляли молекулярные ионы, чьи массы отличались от массы G15(Br) на 63 и 133 Да (Рис. 15А). Бром-содержащий нуклеотид

Рис. 14. Масс-спектр фотоаптамера AlPh(I)Ll/L2. Облучение: 5000 импульсов, в деионизованной воде, концентрация -10 мкМ.

находится в G15(Br) в окружении тимидина и гуанизина. Изменения молекулярной массы, которые можно было бы ожидать, исходя из известных молекулярных повреждений, возникающих в бром-урацил-содержащей ДНК при облучении ультрафиолетом (Hutchinson F.Q., 1973; Sugiyama Н. et al, 1993; Sugiyama H. et al., 1996; Zeng Y. et al., 2006), должны были бы составить 81 Да (фотосшивка между основаниями), 214 или 174 Да (потеря брома и отщепление гуанинового или тиминового оснований с образованием дезоксирибонолакгона) и 226 или 192 Да (потеря брома и отщепление гуанинового или таминового оснований с формированием щёлочелабильного сайта). Однако наблюдаемые изменения молекулярной массы в случае G15(Br) не совместимы ни с одним из этих повреждений. В случае облучения модельного олигонуклеотида pG(Br), где наряду с бром-уридином присутствуют только гуанизины (Табл. 1), наблюдалось появление молекулярных ионом, которые отличались по массе на 63 и 81Да (Рис. 15В). В случае другого модельного олигонуклеотида, рТ(Вг), где бром-уридин окружён только тимидинами, при тех же условиях облучения не наблюдалось появления

100

во

Рис. 15. Масс-спектр модельных олигонуклеотидов. Панель A: G15(Br), облучение - 4000

импульсов. Панел В: pG(Br), облучение - 6000 импульсов. Панель С: рТ(Вг), облучение - 6000 импульсов. Облучение проводили в деионизованной воде, концентрация олигонуклеотидов - 300 мкМ.

каких-либо дополнительных молекулярных ионов (Рис. 15С). В то время как появление молекулярного иона с молекулярной массой, измененной на 81Да (Рис. 15В) указывает на формирование фотосшивки, появление молекулярного иона с массой, уменьшенной на 63Да может указывать на потерю брома с замещением его на водород и присоединением гидроксила в позиции С-2 дезоксирибозы. Возможность фотохимической реакции с образованием таких продуктов была показана в работе Oyoshi el a). (Oyoshi Т. et а!., 1999). Появление молекулярного иона с массой, изменённой на 133Да, в случае облучения олигонуклеотида G15(Br) не удалось связать ни с одним из известных в литературе повреждений бром-уридин-содержащей ДНК при облучении длинноволновым ультрафиолетом.

Таким образом, фотоиидуцированные молекулярные повреждения возникают в бром-уридин-содержащих олигонуклеотидах, где 5-BrdU находится в окружении таких же нуклеотидов, как в случае бром-содержащего анти-тромбинового аптамера, и могут быть ответственны за инактивацию антитромбиновых фотоаптамеров и фотоаптамерных конструкций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследования взаимодействия гетеродимерных фотоаптамерных конструкций с белком-мишенью, выполненные на модели антитромбиновых аптамеров, показали, что включение фотоаптамера в гетеродимерную конструкцию позволяет значительно понизить величину концентрационного порога формирования ковалентных комплексов фотоаптамер/мишень. Это указывает на принципиальную возможность конструирования фотоактивных аффинных реагентов с существенно улучшенной эффективностью формирования фотосшивок с белковой мишенью, используя аптамеры и фотоаптамеры, узнающие разные поверхностные участки мишени, как модульные блоки.

Понижение величины концентрационного порога формирования ковалентных комплексов в случае гетеродимерных конструкций достигается повышением аффинности по сравнению с аффинностью исходных аптамеров. Объединение аптамеров в гетеродимерные конструкции позволяет значительно увеличить аффинность при правильном подборе длины линкера. Зависимость величины концентрационного порога формирования фотосшивок от аффинности определяется конкуренцией между процессом формирования ковалентных комплексов и процессом фотоинактивации фотоаптамеров в результате химических изменений, возникающих в олигонуклеотидах при поглощении фотона галоген-содержащими основаниями.

Предварительные результаты исследования селективности фотоаптамерной конструкции, выполненные на модели антитромбиновых аптамеров, показали, что формирование ковалентных комплексов между конструкцией и белком-мишенью происходит специфично. Однако результаты исследования взаимодействия тромбина с антитромбиновыми аптамерными гетеродимерными конструкциями указывают на то, что в общем случае селективность взаимодействия с молекулярной мишенью может ухудшиться. Таким образом, наряду с аффинностью, требуется скрининг гетеродимерных конструкций в отношении их селективности.

Данные, полученные в результате сравнительного термодинамического анализа процесса образования комплексов тромбина с антитромбиновыми аптамерами и их гетеродимерной конструкцией показывают, что усиление аффинности гетеродимерных конструкций полностью определяется увеличением абсолютного значения энтропийной составляющей изменения свободной энергии реакции комплексообразования.

выводы

1. Объединение анти-тромбиновых аптамеров в гетеродимерные конструкции с помощью политимидинового линкера приводит к усилению сродства к тромбину. При длинах линкера от 35 до 55 нуклеотидов, равновесные константы диссоциации комплексов тромбина с иммобилизованными гетеродимерными конструкциями антитромбиновых алтамеров достигали минимума и были в среднем в 30 раз меньше, чем для составляющих их аптамеров.

2. Заменой 5-И11 на 5-Вг(Ш получен новый фотоаптамер к тромбину. Установлено, что эффективности формирования фотоиндуцированных ковалентных комплексов тромбина с бром-урацил-содержащим фотоаптамером и йод-урацил-содержащим фотоаптамером практически не отличаются.

3. Объединение анти-тромбиновых алтамера и фотоаптамера в гетеродимерную конструкцию позволяет понизить концентрационный порог формирования фотоиндуцированных ковалентных комплексов на два порядка. Понижение концентрационного порога определяется более высокой аффинностью гетеродимерных фотоаптамерных конструкций.

4. Предоблучение длинноволновым ультрафиолетом фотоаптамеров и фотоаптамерных конструкций приводит к уменьшению количества фотоактивных олигонуклеотидов, способных формировать ковалентные комплексы с тромбином.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

HEPES - М-(2-гидроксиэтил)пиперан-М'-этан сульфоновая кислота

БСА - бычий сывороточный альбумин

ППР - поверхностный плазмонный резонанс

шАЬ - моноклональные антитела

Fab - антиген-связывающий фрагмент антитела

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Радько С.П., Рахметова С.Ю., Бодоев Н.В., Арчаков А.И. Аптамеры как перспективные аффинные реагенты для клинической протеомики //Биомедицинская химия. - 2007. - Т. 53,№ ]. - С. 5-24.

la. Radko S.P., Rakhmetova S.Yu., Bodoev N.V., Archakov A.I. Aptamers as perspective affine reagents for clinical proteomics // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry.-2007. - Vol. 1, №3. - P. 198-209.

2. Рахметова С.Ю., Радько С.П., Гнеденко O.B., Бодоев Н.В., Иванов А.С., Арчаков А.И. Гетеродимерные фотоаптамерные конструкции как новый подход к повышению эффективности формирования фотосшивок с белком-мишенью // Биомедицинская химия. - 2010. - Т. 56, № 1. - С. 72-81.

2а. Rakhmetova S.Yu., Radko S.P., Gnedenko O.V., Bodoev N.V., Ivanov A.S., Archakov A.I. Photoaptameric heterodimeric constructs as a new approach to enhance the efficiency of formation of photocrosslinks with a target protein // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. - 2010. - Vol. 4, №. I. - P. 68-74.

3. Рахметова С.Ю., Радько С.П., Гнеденко O.B., Бодоев Н.В., Иванов А.С., Арчаков А.И. Сравнительный термодинамический анализ взаимодействия тромбина с антитромбиновыми аптамерами и их гетеродимерной конструкцией // Биомедицинская химия. - 2010. - Т. 56, № 3. - С. 404-411.

4. Rakhmetova S.Yu., Ivanov A.S., Radko S.P., Gnedenko O.V., Bodoev N.V., Veselovsky A.V., Shcherbinin D.S., Archakov A.I. Heterodimeric constructs of anti-thrombin aptamers as model biorecognizing elements with enhanced affinity for biosensing // The sixth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure. - Novosibirsk, 2008. - P. 203.

5. Рахметова С.Ю., Радько С.П., Гнеденко O.B., Бодоев Н.В., Иванов А.С., Арчаков А.И. Взаимодействие димерных конструкций аптамеров с тромбином //IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008. - С. 173.

6. Radko S.P., Bodoev N.V., Rakhmetova S.Yu., Gnedenko O.V., Ivanov A.S., Archakov A.I. Aptamers multimeric constructs - a new road in developing synthetic affinity reagents for chip-based proteomics? H 4th international conference «Genomics, proteomics, bioinformatics and nanobiotechnologies for medicine». - Moscow, 2008. - P. 21.

7. Радько С.П., Рахметова С.Ю., Гнеденко O.B., Бодоев Н.В., Иванов А.С., Арчаков А.И. Молекулярные фотоаптамерные конструкции как подход к созданию новых аффинных реагентов // Сборник трудов научной конференции «Химическая биология -Фундаментальные проблемы бионанотехнологии». - Новосибирск, 2009. - С. 120

8. Rakhmetova S.Yu., Radko S.P., Gnedenko O.V., Bodoev N.V., Ivanov A.S., Archakov A.I. Photoaptameric heterodimeric constructs as a new approach to enhance the efficiency of formation of photocrosslinks with a target protein // 5th international conference «Genomics, proteomics, bioinformatics and nanobiotechnologies for medicine». - Moscow, 2010. - P. 64.

Подписано в печать: 15.09.2010

Заказ № 4109 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рахметова, Светлана Юрьевна

Список сокращений.

Введение.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическая значимость исследований.

Апробация работы.

Структура и объем диссертации.

1 Обзор литературы.

1.1 Аптамеры. Методы получения и области применения.

1.1.1 Методы получения аптамеров.

1.1.2 Особенности структуры аптамеров и их взаимодействия с белками-мишенями.

1.1.3 Аптамеры как терапевтические средства.

1.1.4 Аптамеры как аффинные реагенты для аналитических целей.

1.2 Фотоаптамеры.

1.2.1 Фотоиндуцированные ковалентные связи между белком и галогеносодержащими нуклеиновыми кислотами.

1.2.2 Получение и использование фотоаптамеров.

1.2.3 Фотохимические реакции в ДНК с участием галоген-урацилов.

1.3 Тромбин и антитромбиновые аптамеры.

1.4 Молекулярные аптамерные конструкции.

1.5 Исследование межмолекулярных взаимодействий методом поверхностного плазмонного резонанса.

1.5.1 Эффект поверхностного плазмонного резонанса (111UP) и его использование в оптических биосенсорах.

1.5.2 Получение кинетических и равновесных констант молекулярных взаимодействий методом ППР.

2 Материалы и методы.

2.1 Реагенты и растворы.

2.2 Синтез и очистка олигонуклеотидов.

2.3 Масс-спектрометрический анализ.

2.4 Измерение аффинности антитромбиновых аптамеров и их димерных конструкций на оптическом биосенсоре Biacore 3000.

2.5 Облучение комплексов фотоаптамер/тромбин.

2.6 Электрофоретический анализ облучённых комплексов фотоаптамер/тромбин.

2.7 Трипсинолиз белка в ковалентном комплексе с фотоаптамером.

3 Результаты и обсуждение.

3.1 Димерные конструкции антитромбиновых аптамеров.

3.1.1 Выбор пары аптамеров и создание димерных конструкций.

3.1.2 Исследование аффинности гомо- и гетеродимерных конструкций антитромбиновых аптамеров.

3.1.3 Селективность гетеродимерных конструкций антитромбиновых аптамеров.

3.2 Оценка термодинамических параметров взаимодействия тромбина с антитромбиновыми аптамерами и их гетеродимерной конструкцией

3.3 Антитромбиновые фотоаптамерные гетеродимерные конструкции.

3.3.1 Йод- и бром-урацил-содержашие антитромбиновые фотоаптамеры

3.3.2 Фотоиндуцированные ковалентные комплексы тромбина с антитромбиновыми фотоаптамерными гетеродимерными конструкциями.

3.3.3 Сравнительный анализ выхода ковалентных комплексов с тромбином для фотоаптамеров и фотоаптамерных конструкций.

3.3.4 Формирования фотосшивок между тромбином и фотоаптамерными конструкциями в присутствии других белков.

3.3.5 Фотоинактивация антитромбиновых фотоаптамеров и фотоаптамерных конструкций под воздействием ультрафиолетового излучения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание высокоаффинных гетеродимерных фотоаптамерных конструкций к тромбину"

Широкомасштабный экспериментальный и биоинформационный анализ, выполненный в прошедшее десятилетие, создал огромный массив протеомных данных, позволивших идентифицировать тысячи потенциальных белковых маркёров различных онкологических заболеваний (164). Как ожидается, подавляющее большинство потенциальных белковых маркёров онкопатологии может присутствовать в крови в концентрациях ниже 10"15 М (1). Однако чувствительность существующих сегодня методов иммунохимического анализа за редким исключением не выходит за пикомолярные концентрации, что во многом определяется ограниченной аффинностью моноклональных антител (96; 63; 89; 123). Таким образом, задача исследования клинической значимости белковых маркёров и последующее создание тест-систем делает актуальным разработку новых подходов к детекции белка, присутствующего в сложной биологической жидкости (плазма или сыворотка крови) в ультранизких концентрациях.

Один из возможных подходов к решению проблемы измерения ультранизких концентраций белка (менее 10"15 М) состоит в повышении аффинности и селективности аффинных реагентов. Особый интерес представляют аффинные реагенты, позволяющие получать необратимые комплексы, «фиксируя» их путём образования ковалентной связи (29; 65; 88). Прямой подсчёт числа таких комплексов с помощью так называемых «молекулярных счётчиков», работающих на принципах сканирующей атомно-силовой и ближнепольной оптической микроскопии, делает возможным детекцию белка, присутствующего в концентрациях ниже 10"15 М (1; 95). При этом переход от обратимого к необратимому (ковалентному) специфическому связыванию приводит к понижению концентрационного предела детекции на несколько порядков (3).

Среди аффинных реагентов, способных формировать ковалентные комплексы с мишенью, наиболее перспективными с точки зрения практического применения являются «фотоаптамеры», представляющие особый класс аптамеров (65; 162). Аптамеры представляют олигонуклеотиды с высоким сродством к заданной белковой мишени, отбираемые методом селекции in vitro в комбинаторных библиотеках нуклеотидных последовательностей (97). Использование библиотек, состоящих из олигонуклеотидов с галогенсодержащими основаниями, позволяет получать «фотоаптамеры» с помощью отбора одновременно по аффинности и по способности образовывать фотоиндуцированные ковалентные связи (фотосшивки) селективно с белком-мишенью (69; 189). В отличие от таких аффинных реагентов, как Fab и аффитела, где придание способности к образованию ковалентных комплексов с молекулярной мишенью'не всегда возможно и требует знания структуры комплекса с мишенью (29; 88), фотоаптамеры могут быть получены практически к любому белку без знания о структуре комплекса (65).

Опубликованные экспериментальные данные указывают на существование корреляции между аффинностью фотоаптамера к белку-мишени и выходом ковалентных комплексов (17; 189). Однако селекция одновременно по двум параметрам (аффинности и способности формировать фотосшивки) ведёт в общем случае к отбору олигонуклеотидов с более низким сродством, чем при селекции только по аффинности. Это требует разработки подходов к повышению аффинности фотоаптамеров с целью создания высокоэффективных аффинных реагентов для измерения ультранизких концентраций белка.

Аффинность аптамеров может быть значительно усилена, используя молекулярное конструирование. В процессе химического синтеза аптамерные последовательности могут быть легко объединены в единую полинуклеотидную цепь. Это позволяет создавать «линейные» аптамерные конструкции, где аптамерные последовательности соединены либо нуклеотидными линкерами, либо линкерами ненуклеотидной природы (43; 80; 107; 122; 142; 176; 206; 212). Особый интерес представляют гетеродимерные конструкции, содержащие два аптамера, узнающих разные участки поверхности одного белка. Такие конструкции показали в целом усиление аффинности и/или функциональной активности по отношению к белку-мишени по сравнению с исходными аптамерами (80; 108; 142; 206; 212).

Можно предположить, что объединение фотоаптамера и аптамера, узнающих разные участки поверхности белка-мишени, в гетеродимерную фотоаптамерную конструкцию также приведёт к созданию аффинного реагента с улучшенными характеристиками. В настоящее время известны аптамер и фотоаптамер к тромбину, взаимодействующие с разными поверхностными сайтами белка. Их использование в качестве модельной системы даёт возможность экспериментально проверить, приведёт ли объединение аптамера и фотоаптамера в фотоаптамерную гетеродимерную консрукцию к значимому с практической точки зрения понижению концентрационного предела детекции ковалентных комплексов. Цель и задачи исследования

Целью работы является экспериментальное обоснование возможности понизить концентрационный порог формирования ковалентных комплексов фотоаптамера с белком-мишенью путём включения фотоаптамера в гетеродимерную аптамерную конструкцию, используя аптамеры и фотоаптамеры к тромбину как модельную систему.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Синтезировать гетеро- и гомодимерные конструкции антитромбиновых аптамеров с длиной политимидинового линкера, варьирующей в- широком диапазоне. Исследовать их взаимодействие с тромбином на оптическом биосенсоре Biacore-3000 для нахождения длины линкера, обеспечивающей максимальную аффинность.

4. Провести анализ процесса фотоинактивации фотоаптамеров и фотоаптамерных гетеродимерных конструкций.

Научная новизна работы

Практическая значимость исследований

Результаты, полученные в работе, могут служить отправной точкой для развития «инженерного» подхода к созданию высокоэффективных аффинных реагентов, способных формировать фотосшивки селективно с белкоммишенью. Высокоаффинные антитромбиновые аптамерные гетеродимерные конструкции представляют интерес как исходный материал для создания антикоагулянтов нового поколения. Полученные линейные гетеродимерные фотоаптамерные конструкции будут использованы при разработке подхода к количественному определению белка с помощью «молекулярных счётчиков».

Апробация работы

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рахметова, Светлана Юрьевна

5 Выводы

1. Объединение антитромбиновых аптамеров в гетер одимерные конструкции с помощью политимидинового линкера приводит к усилению сродства к тромбину. При длинах линкера от 35 до 55 нуклеотидов, равновесные константы диссоциации комплексов тромбина с иммобилизованными гетеродимерными конструкциями антитромбиновых аптамеров достигали минимума и были в среднем в 30 раз меньше, чем для составляющих их аптамеров.

2. Заменой 5-IdU на 5-BrdU получен новый фотоаптамер к тромбину. Установлено, что эффективности формирования фотоиндуцированных ковалентных комплексов тромбина с бром-урацил-содержащим фотоаптамером и йод-урацил-содержащим фотоаптамером практически не отличаются.

3. Объединение антитромбиновых аптамера и фотоаптамера в гетеродимерную конструкцию позволяет понизить концентрационный порог формирования фотоиндуцированных ковалентных комплексов на два порядка. Понижение концентрационного порога определяется более высокой аффинностью гетеродимерных фотоаптамерных конструкций.

4. Предоблучение длинноволновым ультрафиолетовым излучением фотоаптамеров и фотоаптамерных конструкций приводит к их инактивации, что проявляется в понижении их способности формировать ковалентные комплексы с тромбином.

4 Заключение

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рахметова, Светлана Юрьевна, Москва

1. Archakov A.I., Ivanov Y.D., Lisitsa A.V., Zgoda V.G. AFM fishing nanotechnology is the way to reverse the Avogadro number in proteomics // Proteomics. 2007. - Vol. 7, № 1. P. 4-9.

2. Archakov A.I, Ivanov Y.D. Analytical nanobiotechnology for medicine diagnostics // Mol. Biosyst. 2007. - Vol. 3, № 5. - P. 336-342.

3. Archakov A., Ivanov Y., Lisitsa A., Zgoda V. Biospecific irreversible fishing coupled with atomic force microscopy for detection of extremely low-abundant proteins // Proteomics. 2009. - Vol. 9, № 5. - P. 13261343.

4. Baerga-Ortiz A., Bergqvist S., Mandell J. G., Komives E. A. Two different proteins that compete for binding to thrombin have opposite kinetic and thermodynamic profiles //Protein Sci. 2004. - Vol. 13, № 1. - P.166-176.

5. Bagalkot V., Farokhzad O.C., Langer R., Jon S. An aptamer-doxorubicin physical conjugate as a novel targeted drug-delivery platform //Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2006. - Vol. 45. - P. 8149-8152.

6. Baker B.R, Lai R.Y, Wood M.S, Doctor E.H, Heeger A.J, Plaxco K.W. // J. Am. Chem. Soc. 2006. - Vol. 128, № 10. - P. 3138-3139.

7. Baldrich E., Acero J.L., Reekmans G., Laureyn W., O'Sullivan C.K. Displacement Enzyme Linked Aptamer Assay // Anal. Chem. 2005. Vol. 77. - P. 4774-4784.

8. Baldrich E., Restrepo A., O'Sullivan C.K. Aptasensor development: elucidation of critical parameters for optimal aptamer performance // Anal. Chem. 2004. - Vol. 76, № 23. - P. 7053-63.

9. Bang G.S, Cho S., Kim B.G. A novel electrochemical detection method for aptamer biosensors // Biosens. Bioelectron. 2005. - Vol. 21, № 6. -P. 863-870.

10. Barbas A.S, White R.R. The development and testing of aptamers for cancer// Cur. Opin. Invest. Drugs. 2009. - Vol. 10, № 6. - P. 572-578.

11. Berezovski M., Nutiu R., Li Y., Krylov S.N. Affinity analysis of a protein-aptamer complex using nonequilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures // Anal. Chem. 2003. - Vol. 75, № 6. - P. 1382-1386.

12. Bini A., Minunni M., Tombelli S., Centi S., Mascini M. Analytical performances of aptamer-based sensing for thrombin detection / Anal. Chem. 2007. - Vol. 79. - P. 3016-3019.

13. Blank M., Weinschenk Т., Priemer M., Schluesener H. Systematic evolution of a DNA aptamer binding to rat brain tumor microvessels. Selective targeting of endothelial regulatory protein pigpen // J. Biol. Chem.-2001 Vol. 276.-P. 16464-16468.

14. Breslow R., Belvedere S., Gershell L., Leung D. The chelate effect in binding, catalysis, and chemotherapy // Pure Appl. Chem. 2000. - Vol. 72, №3.-P. 333-342.

15. Boder E.T, Midelfort K.S, Wittrup K.D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000. - Vol. 97, № 20. - P. 10701-10705.

16. Bock L.C , Griffin L.C , Latham J.A , Vermaas E.H., Toole J.J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin // Nature. 1992. - Vol. 355, № 6360. - P. 564-566.

17. Brody E.N., Gold L. Aptamers as therapeutic and diagnostic agents // J. Biotechnol. 2000. - Vol. 74. - P. 5-13.

18. Cai H., Lee T.M., Hsing I.M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay // Sens. Actuators Chem. -2006. Vol. 114, № 1. - P. 433-437.

19. Centi S., Tombelli S., Minunni M., Mascini M. Aptamer-based detection of plasma proteins by an electrochemical assay coupled to magnetic beads //Anal. Chem. 2007. - Vol. 79. - P. 1466-1473.

20. Charlton J., Kirschenheuter G.P., Smith D. Highly potent irreversible inhibitors of neutrophil elastase generated by selection from a randomized DNA-valine phosphonate library // Biochemistry. 1997. -Vol. 36, № 10. - P.3018-3026.

21. Chen Т., Cook G.P., Koppisch A.T., Greenberg M.M. Investigation of the origin of the sequence selectivity for the 5-halo-20-deoxyuridine sensitization of DNA to damage by UV-irradiation // J. Am. Chem. Soc. -2000.-Vol. 122.-P. 3861-3866.

22. Cheng A.K., Sen D., Yu H.Z. Design and testing of aptamer-based electrochemical biosensors for proteins and small molecules // Bioelectrochemistry. 2009. - Vol. 77, № 1. - P. 1-12.

23. Chmura A.J., Orton M.S., Meares C.F. Antibodies with infinite affinity // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. - Vol. 98, № 15. - P. 8480-8484.

24. Cho H., Baker B.R., Wachsmann-Hogiu S., Pagba C.V., Laurence T.A., Lane S.M., Lee L.P., Ток J.B. Aptamer-based SERRS sensor for thrombin detection //Nano Lett. 2008. - Vol. 8, № 12. - P. 4386-4390.

25. Chu T.C., Marks J.W., Lavery L.A., Faulkner S., Rosenblum M.G., Ellington A.D., Levy M. Aptamentoxin conjugates that specifi cally target prostate tumor cells // Cancer Res. 2006a. - Vol. 66. - P. 59895992.

26. Convery M.A., Rowsell S., Stonehouse N.J., Ellington A.D., Hirao I., Murray J.B., Peabody D.S., Phillips S.E., Stockley P.G. // Nat. Struct. Biol., 1998.-Vol. 5.-Vol. 133-139.

27. Cook G.P., Chen Т., Koppisch A.T., Greenberg M.M. The effects of secondary structure and 02 on the formation of direct strand breaks upon

28. UV irradiation of 5-bromodeoxyuridine-containing oligonucleotides // Chem. Biol. 1999. - Vol.6. - P. 451-459.

29. Cox J.C., Ellington A.D. Bioorg. Automated selection of anti-protein aptamers // Med. Chem. 2001. - Vol. 9. - P. 2525-2531.

30. Cox J.C., Rajendran M., Riedel Т., Davidson E.A., Sooter L.J., Bayer T.S., Schmitz-Brown M., Ellington A.D. Automated acquisition of aptamer sequences // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2002a. -Vol. 5. - P. 289-299.

31. Cox J.C., Hayhurst A., Hesselberth J., Bayer T.S., Georgiou G., Ellington A.D. Automated selection of aptamers against protein targets translated in vitro: from gene to aptamer // Nucleic Acids Res. 2002b. -Vol. 30.-P. 108-121.

32. Crothers D.M., Metzger H. The influence of polyvalency on the binding properties of antibodies // Immunochemistry. — 1972. — Vol. 9, № 3. P. 341-357.

33. Dahdah D.B., Morin I., Moreau M.J., Dixon N.E., Schaeffer P.M. Site-specific covalent attachment of DNA to proteins using a photoactivatable Tus-Ter complex // Chem. Commun. (Camb). 2009. -Vol. 7, № 21. - P. 3050-3052.

34. Daniels D.A., Chen H., Hicke B.J., Swiderek K.M., Gold L. A tenascin-C aptamer identified by tumor cell SELEX: systematic evolution of ligands by exponential enrichment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. -Vol. 100.-P. 15416-15421.

35. Dapic V., Abdomerovic V., Marrington R., Peberdy J., Rodger A., Trent J.O., Bates P.J. Biophysical and biological properties of quadruplex oligodeoxyribonucleotides // Nucleic Acids Res. 2003. - Vol. 31, № 8. -P. 2097-2107.

36. Davis K.A., Abrams В., Lin Y., and Jayasena S.D. Use of a high affinity DNA ligand in flow cytometry // Nucleic Acids Res. 1996. - Vol. 24. -P. 702-706.

37. Davis K.A., Lin Y., Abrams В., Jayasena S.D. Staining of cell surface CD4 with 2'-F-pyrimidine-containing RNA aptamers for flow cytometry //Nucleic Acids Res. 1998. - Vol. 26, № 17. - P. 3915-3924.

38. De Cristofaro R., De Candia E.JThrombin domains: structure, function and interaction with platelet receptors // Thromb. Thrombolysis. 2003. -Vol. 15, №3.-P. 151-163.

39. Dey A.K., Khati M., Tang M., Wyatt R., Lea S.M., James W. An aptamer that neutralizes R5 strains of human immunodeficiency virus type 1 blocks gpl20-CCR5 interaction // J. Virol. 2005. -Vol. 79. - P. 13806-13810.

40. Di Giusto D.A., King G.C. Construction, stability, and activity of multivalent circular anticoagulant aptamers // J. Biol. Chem. 2004. -Vol. 279. - P.46483-46489.

41. Dietz T.M., Von Trebra R. J., Swanson B.J., Koch Т.Н. Photochemical coupling of 5-bromouracil (BU) to a peptide linkage. A model for BU-DNA protein photocrosslinking // J. Am. Chem. Soc. 1987a. - Vol. 109, №6.-P. 1793-1797.

42. Dietz T.M., Koch Т.Н. Photochemical reduction of 5- bromouracil by cysteine derivatives and coupling of 5- bromouracil to cystine derivatives // Photochemistry and Photobiology. — 1989. Vol. 49, № 2. -P. 121-129.

43. Dietz T.M., Koch Т.Н. Photochemical coupling of 5-bromouracil to tryptothan, tyrosine and histidin, peptide-like derivatives in aqueous fluid solutions // Photochem.Photobiol. 1987b. - Vol. 46, № 6. - P. 971-978.

44. Drolet D.W., Moon-McDermott L., Romig T.S. An enzyme-linked oligonucleotide assay //Nat. Biotechnol. 1996. - Vol. 14, № 8. - P. 1021-1025.

45. Eaton B.E., Gold L., Hicke B.J., Janjic N., Jucker F.M., Sebesta D.P., Tarasow T.M., Willis M.C., Zichi D.A. Post-SELEX combinatorial optimization of aptamers // Bioorg. Med. Chem. 1997. - Vol. 5, № 6. -P. 1087-1096.

46. Edwards D.A. Refining the measurement of rate constants in the BIAcore //J. Math. Biol. 2004. - Vol. 49, № 3. - P. 272-292.

47. Ellington A. D., Szostak J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific Ligands // Nature. 1990. - Vol. 346. - P. 818-822.

48. Ellington A.D., Szostak J.W. Selection in vitro of single-stranded DNA molecules that fold into specific ligand-binding structures // Nature. -1992. Vol. 355. P. 850-852.

49. Eulberg D., Buchner K., Maasch C., Klussmann S. Development of an automated in vitro selection protocol to obtain RNA-based aptamers: identification of a biostable substance P antagonist // Nucleic Acids Res. -2005.-Vol. 33.-P. 45-54.

50. Famulok M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches // Curr. Opin. Mol. Ther. 2005. - Vol. 7, № 2. - P. 137-143.

51. Farokhzad О. C., Cheng J., Teply B. A., Sherifi I., Jon S., Kantoff P. W., Richie J. P., Langer R. Targeted nanoparticle-aptamer bioconjugates for cancer chemotherapy in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. -Vol. 103, № 16. - P. 6315-6320.

52. Fenton J.W., Fasco M.J., Stackrow A.B. Human thrombins. Production, evaluation, and properties of a-thrombin // J. Biol. Chem. 1977. - Vol. 252, № 11.-P. 3587-3598.

53. Folch F., Но H.A., Leclerc M. Label-free electrochemical detection of protein based on a ferrocene-bearing cationic polythiophene and aptamer // Anal. Chem. 2006. - Vol. 78. - P. 4727-4731.

54. Foote J., Eisen H.N. Kinetic and affinity limits on antibodies produced during immune responses // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995. - Vol. 92, №5. -P. 1254-1256.

55. Fredenburgh J.C., Stafford A.R., Weitz J.I. Evidence for allosteric linkage between exosites 1 and 2 of thrombin // J. Biol. Chem. 1997. -Vol. 272, № 41. - P. 25493-25499.

56. Gander T.R., Brody E.N. Photoaptamer chips for clinical diagnostics // Expert Rev. Mol. Diagn. 2005. - Vol. 5, № 1. -P. 1-3.

57. Gatto В., Palumbo M., Sissi C. Nucleic acid aptamers based on the G-quadruplex structure: therapeutic and diagnostic potential // Curr. Med. Chem. 2009. - Vol. 16, № 10. - P. 1248-1265.

58. German I., Buchanan D.D., Kennedy R.T. Aptamers as ligands in affinity probe capillary electrophoresis // Anal. Chem. 1998. - Vol. 70, №21.-P. 4540-4545.

59. Geyer H., Geyer R., Pingoud V. A novel strategy for the identification of protein-DNA contacts by photocrosslinking and mass spectrometry // Nucleic Acids Res.-2004.-Vol. 32, № 16.-P. el 32.

60. Golden M.C., Collins B.D., Willis M.C., Koch Т.Н. Diagnostic potential of PhotoSELEX-evolved ssDNA aptamers // J. Biotechnol. 2000. -Vol. 81, №2-3.-P. 167-178.

61. Golden M.C., Resing K.A., Collins B.D., Willis M.C., Koch Т.Н. Mass spectral characterization of a protein-nucleic acid photocrosslink // Protein Sci. 1999. - Vol. 8, № 12. - P. 2806-2812.

62. Gopinath S.C. Methods developed for SELEX // Anal. Bioanal. Chem. -2007. Vol. 387, № 1. - P. 171-182.

63. Gott J.M., Willis M.C., Koch Т.Н., Uhlenbeck O.C. A specific, UV-induced RNA-protein cross-link using 5-bromouridine-substituted RNA //Biochemistry. 1991a. - Vol. 30, № 25. - P. 6290-6295.

64. Gott J.M., Wilhelm L.J., Uhlenbeck O.C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA // Nucleic Acids Res. 1991b. -Vol. 19, № 23. - P. 6499-6503.

65. Griffiths A.D., Duncan A.R. Strategies for selection of antibodies by phage display // Curr. Opin. Biotechnol. 1998. - Vol. 9, № 1. - P. 102108.

66. Gronewold T.M., Glass S., Quandt E., Famulok M. Monitoring complex formation in the blood-coagulation cascade using aptamer-coated SAW sensors // Biosens Bioelectron. 2005. - Vol. 20, № 10. - P.2044-2052.

67. Haes A.J., Giordano B.C., Collins G.E. Aptamer-based detection and quantitative analysis of ricin using affinity probe capillary electrophoresis // Anal Chem. 2006. - Vol. 78, № 11. - P. 3758-3764.

68. Hall В., Micheletti J.M., Satya P., Ogle K., Pollard J., Ellington A.D. Design, synthesis, and amplification of DNA pools for in vitro selection // Curr. Protoc. Mol. Biol. 2009. - Chapter 24. - Unit 24.2.

69. Hansen J.A., Wang J., Kawde A.N., Xiang Y., Gothelf K.V., Collins G. Quantum-dot/aptamer-based ultrasensitive multi-analyte electrochemical biosensor // J. Am. Chem. Soc. 2006. - Vol. 128, № 7. - P. 2228-2229.

70. Hasegawa H., Taira K., Sode K. Ikebukuro K. Improvement of Aptamer Affinity by Dimerization // Sensors. 2008. - Vol. 8, № 2. - P. 10901098.

71. Healy J.M, Lewis S.D., Kurz M., Boomer R.M., Thompson K.M., Wilson C., McCauley T.G. Pharmacokinetics and biodistribution of novel aptamer compositions // Pharm. Res. 2004. - Vol. 21, № 12. - P. 2234-2246.

72. Hermann Т., Patel D.J. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers // Science. 2000. - Vol. 287, № 5454. - P. 820-825.

73. Hesselberth J., Robertson M.P., Jhaveri S., Ellington A.D. In vitro selection of nucleic acids for diagnostic applications // J.Biotechnol. -2000.-Vol. 74.-P. 15-25.

74. Hianik Т., Ostatna V., Sonlajtnerova M., Grman I. Influence of ionic strength, pH and aptamer configuration for binding affinity to thrombin // Bioelectrochemistry. 2007. - Vol. 70, № 1. - P. 127-133.

75. Hianik Т., Ostatna V., Zajacova Z., Stoikova E., Evtugyn G. Detection of aptamer-protein interactions using QCM and electrochemicalindicator methods // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005. - Vol. 15, № 2. -P. 291-295.

76. Hianik Т., Porfireva A., Grman I., Evtugyn G. EQCM biosensors based on DNA aptamers and antibodies for rapid detection of prions // Protein Pept. Lett. 2009. - Vol. 16, № 4. - P. 363-367.

77. Hicke B.J., Willis M.C., Koch Т.Н., Cech T.R. Telomeric protein-DNA point contacts identified by photo-cross-linking using 5-bromodeoxyuridine // Biochemistry. 1994. - Vol. 33, № 11. - P. 33643373.

78. Holm L., Moody P., Howarth M. Electrophilic Affibodies Forming Covalent Bonds to Protein Targets // J. Biol. Chem. 2009. - Vol. 284, № 47. - P.32906-32913.

79. Houk K.N., Leach A.G., Kim S.P., Zhang X. Binding Affinities of Host-Guest, Protein-Ligand, and Protein-Transition-State Complexes // Angew. Chem. Int. Ed. 2003. - Vol. 42. - P. 4872 - 4897.

80. Hu J., Zheng P.C., Jiang J.H., Shen G.L., Yu R.Q., Liu G.K. Electrostatic interaction based approach to thrombin detection by surface-enhanced Raman spectroscopy // Anal Chem. 2009. - Vol. 81, № l.-P. 87-93.

81. Hutchinson F. Q. The lesions produced by ultraviolet light in DNA containing 5-bromouracil // Rev. Biophys. — 1973. Vol. 6. - P. 201246.

82. Hwang J., Nishikawa S. Novel approach to analyzing RNA aptamer-protein interactions: toward further applications of aptamers // J. Biomol. Screen. 2006. - Vol. 11, № 6. - P. 599-605.

83. Ikebukuro K, Kiyohara C, Sode К Novel electrochemical sensor system for protein using the aptamers in sandwich manner // Biosens Bioelectron. 2005. - Vol.20, № 10. - P. 2168-2172.

84. Ito S., Saito I., Matsuura T. Acetone-sensitized photocoupling of 5-bromouridine to tryptophan derivatives via electron-transfer process // J. Am. Chem. Soc. 1980. - Vol. 102, №25.-P. 7535-7541.

85. Ivanov Y.D., Govorun V.M., Bykov V.A., Archakov A.I. Nanotechnologies in proteomics // Proteomics. 2006. - Vol. 6, № 5. - P. 1399-1414.

86. Jackson T.M., Ekins R.P. Theoretical limitations on immunoassay sensitivity. Current practice and potential advantages of fluorescent Eu3+ chelates as non-radioisotopic tracers // J. Immunol. Methods. -1986. Vol. 87, № 1. - P. 13-20.

87. Jayasena S.D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics // Clin. Chem. 1999. - Vol. 45, № 9. - P. 1628-1650.

88. Jellinek D., Green L.S., Bell C., Janjic N. Inhibition of receptor binding by high-affinity RNA ligands to vascular endothelial growth factor // Biochemistry. 1994. - Vol. 33. - P. 10450-10456.

89. Jenison R.D., Gill S.C., Pardi A., Polisky B. High-resolution molecular discrimination by RNA // Science. 1994. - Vol. 263, № 5152. - P. 1425-1429.

90. Jhaveri S.D., Kibry R., Conrad R. et al. Designed Signaling Aptamers that Transduce Molecular Recognition to Changes in Fluorescence Intensity // J. Am. Chem. Soc. 2000. - Vol. 122. - P. 2469-2473.

91. Kankia B.I., Barany G., Musier-Forsyth K. Unfolding of DNA quadruplexes induced by HIV-1 nucleocapsid protein // Nucleic Acids Res. -2005. Vol. 33, № 14. - P. 4395-4403.

92. Kawazoe N., Ito Y., Imanishi Y. Bioassay using a labeled oligonucleotide obtained by in vitro selection // Biotechnol Prog. 1997. -Vol. 13, № 6.-P.873-874.

93. Kawde A.N., Rodriguez M.C., Lee T.M.H, Wang label-free bioelectronic detection of aptamer-protein interactions // J. Electrochem. Commun. 2005.-Vol.7, № 5. - P. 537-540.

94. Kim K.S., Lee H.S., Yang J.A., Jo M.H., Hahn S.K. The fabrication, characterization and application of aptamer-functionalized Si-nanowire FET biosensors //Nanotechnology. 2009. - Vol. 20, № 23. - P. 235-240.

95. Kim Y., Cao Z., and Tan W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor // Pros. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. -Vol.105. - P.5664-5669.

96. Kleinjung F., Klussmann S., Erdmann V.A., Scheller F.W., Furste J.P., Bier F.F. High-Affinity RNA as a Recognition Element in a Biosensor // Anal. Chem. 1998. - Vol. 70, № 2. - P. 328-331.

97. Koch Т.Н., Smith D., Tabacman E., Zichi D.A. Kinetic analysis of site-specific photoaptamer-protein cross-linking // J. Mol. Biol. — 2004. — Vol. 336, №5.-P. 1159-1173.

98. Kortt A.A., Dolezal O., Power B.E. Hudson P.J. Dimeric and trimeric antibodies: high avidity scFvs for cancer targeting // Biomol. Eng. -2001. Vol. 18, № 3. - P. 95-108.

99. Kubik M.F., Stephens A.W., Schneider D., Marlar R.A., Tasset D. High-affmity RNA ligands to human a-thrombin // Nucleic Acids Res. 1994. - Vol. 22, № 13. - P. 2619-2626.

100. Kulbachinskiy A.V. Methods for selection of aptamers to protein targets //Biochemistry (Mosc). 2007. - Vol. 72, № 13. - P. 1505-1518.

101. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol.227, № 5259. - P. 680685.

102. Lai R., Plaxco K., Hegger A. Aptamer-based electrochemical detection of picomolar platelet-derived growth factor directly in blood serum // Anal. Chem. 2007. - Vol. 79. - P. 229-233.

103. Lee J.F., Stovall G.M., Ellington A.D. Aptamer therapeutics advance // Curr. Opin. Chem. Biol. 2006. - Vol. 10. - P. 282-289.

104. Lee M., Walt D.R. A fiber-optic microarray biosensor using aptamers as receptors // Anal. Biochem. 2000. - Vol. 282, № 1. - P: 142-146.

105. Levy-Nissenbaum E., Radovic-Moreno A.F., Wang A.Z., Langer R., Farokhzad O.C. Nanotechnology and aptamers: applications in drug delivery // Trends in Biotechnology. 2008.-Vol. 26, № 8. - P. 442-449.

106. Li N, Ebright J.N., Stovall G.M., Chen X., Nguyen H.H., Singh A., Syrett A., Ellington A.D. Technical and biological issues relevant to cell typing with aptamers // J. Proteome Res. 2009. - Vol. 8, № 5. - P. 2438-2448.

107. Li N., Wang Y., Pothukuchy A., Syrett A., Husain N., Gopalakrisha S., Kosaraju P., Ellington A.D. Aptamers that recognize drug-resistant HIV-1 reverse transcriptase // Nucleic Acids Res. 2008. - Vol. 36, № 21. -P. 6739-6751.

108. Liaw P.C.Y., Fredenburgh J.C., Stafford A.R., Tulinsky A., Austin R.C., Weitz J.I. Localization of the thrombin-binding domain on prothrombin fragment 2 // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273, № 15. - P. 8932-8939.

109. Lin Y., Jayasena S.D. Inhibition of multiple thermostable DNA polymerases by a heterodimeric aptamer // J.Mol. Biol. 1997. - Vol. 271.-P. 100-111.

110. Ling M.M., Ricks C., Lea P. Multiplexing molecular diagnostics and immunoassays using emerging microarray technologies // Expert Rev. Mol. Diagn. 2007. - Vol. 7, № 1. - P. 87-98.

111. Lipovsek D., Pluckthun A. In-vitro protein evolution by ribosome display and mRNA display // J. Immunol. Methods. 2004. -Vol. 290, № 1-2.-P. 51-67.

112. Liss M., Petersen В., Wolf H., Prohaska E. An aptamer-based quartz crystal protein biosensor // Anal Chem. 2002. - Vol. 74, № 17. - P. 4488-4495.

113. Liu L.-W., Ye J., Johnson A.E., Esmon C.T. Proteolytic formation of either of the two prothrombin activation intermediates results in formation of a hirugen-binding site // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266, №35.-P. 23632-23636.

114. Lohndorf M., Schlecht U., Gronewold T.M.A., Malaуё A., Tewes M. Microfabricated high-performance microwave impedance biosensors for detection of aptamer-protein interactions // Appl. Phys. Lett. 2005. -Vol. 87. - P.243902.

115. Maehashi K., Katsura Т., Kerman K., Takamura Y., Matsumoto K., Tamiya E. Label-free protein biosensor based on aptamer-modified carbon nanotube field-effect transistors // Anal. Chem. 2007. - Vol. 79. - P. 782-787.

116. Macaya R.F., Schultze P., Smith F.W., Roe J.A., Feigon J. Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution // Proc. Natl. Acad. Sc. USA. 1993. - Vol. 90, № 8. - P. 37453749.

117. Mairal Т., Ozalp V.C., Lozano Sanchez P., Mir M., Katakis I., O'Sullivan C.K. Aptamers: molecular tools for analytical applications // Anal. Bioanal. Chem. 2008. - Vol. 390, № 4. - P. 989-1007.

118. Majka J., Speck C. Analysis of protein-DNA interactions using surface plasmon resonance // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2007. - Vol. 104.-P.13-36.

119. Myszka D.G., He X., Dembo M., Morton T.A., Goldstein B. Extending the range of rate constants available from BIACORE: interpreting mass transport-influenced binding data // Biophys. J. 1998. - Vol. 75, № 2. -P.583-594.

120. Marathias V.M., Bolton P.H. Determinants of DNA quadruplex structural type: sequence and potassium binding // Biochemistry. 1999.- Vol. 38, № 14. P. 4355-4364.

121. Marathias V.M., Bolton P.H. Structures of the potassium-saturated, 2:1, and intermediate, 1:1, forms of a quadruplex DNA // Nucleic Acids Res.- 2000 Vol. 28, № 9. - P. 1969-1977.

122. Mayer G. The chemical biology of aptamers // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009. - Vol. 48, № 15. - P. 2672-2689.

123. Mcnamara J.O., Andrecyek E.R., Wang Y., Viles K.D., Rempel R.E., Gildoa E., Sullenger B.A., Giangrande P.H. Cell type-specifi с delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras // Nat. Biotechnol. 2006. -Vol. 24.-P. 1005-1015.

124. Meisenheimer K.M., Koch Т.Н. Photocross-linking of nucleic acids to associated proteins // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1997. - Vol. 32, № 101-140.

125. Melkko S., Dumelin C.E., Scheuermann J., Neri D. On the magnitude of the chelate effect for the recognition of proteins by pharmacophores scaffolded by self-assembling oligonucleotides // Chem. Biol. 2006. -Vol. 13, № 2. - P.225-231.

126. Mir M., Vreeke M., Katakis I. Different strategies to develop an electrochemical thrombin aptasensor // Electrochem. Commun. 2006. -Vol.8, №3.-P. 505-511.

127. Missailidis S., Hardy A. Aptamers as inhibitors of target proteins // Expert. Opin. Ther. Patents. 2009. - Vol. 19, № 8. - P. 1073-1082.

128. Muller J., Wulffen В., Potzsch В., Mayer G. Multidomain targeting generates a high-affinity thrombin-inhibiting bivalent aptamer // Chembiochem. 2007. - Vol. 8. - P. 2223-2226.

129. Murphy M.B., Fuller S.T., Richardson P.M., Doyle S.A. An improved method for the in vitro evolution of aptamers and applications in protein detection and purification // Nucleic Acids Res. 2003. - Vol. 31, № 18. -P. 110.

130. Naryshkin N., Druzhinin S., Revyakin A., Kim Y., Mekler V., Ebright R.H. Static and kinetic site-specific protein-DNA photocrosslinking: analysis of bacterial transcription initiation complexes // Methods Mol. Biol. 2009. - Vol. 543. - P. 403-437.

131. Nimjee S.M., Rusconi C.P., Harrington RA, Sullenger BA. The potential of aptamers as anticoagulants // Trends Cardiovasc. Med. 2005. - Vol. 15, № 1.-P. 41-45.

132. Nimjee S.M., Rusconi C.P., Sullenger B.A. Aptamers: an emerging class of therapeutics //Annu. Rev. Med. 2005. - Vol. 56. - P. 555-583.

133. Norris C.L., Meisenheimer P.L., Koch Т.Н. Mechanistic studies of the 5-Iodouracil chromophore relevant to its use in nucleoprotein photo-cross-linking // J. Am. Chem. Soc. 1996. - Vol. 118, № 24. - P. 5796-5803.

134. Nutiu R., Li Y. Structure-switching signaling aptamers // J. Am. Chem. Soc. 2003. - Vol. 125, № 16; - P. 4771-4778.

135. Okumura Y., Kamikubo Y., Curriden S.A., Wang J., Kiwada Т., Futaki S., Kitagawa K., Loskutoff D.J. Kinetic analysis of the interaction between vitronectin and the urokinase receptor // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277, № 11. - P. 9395-9404.

136. Osborne S.E., Ellington A.D. Nucleic Acid Selection and the Challenge of Combinatorial Chemistry // Chem. Rev. 1997. - Vol. 97. - P. 349370.

137. O'Shannessy D.J., Winzor D.J. Interpretation of deviations from pseudo-first-order kinetic behavior in the characterization of ligand binding by biosensor technology // Anal. Biochem. 1996. - Vol. 236, № 2. - P. 275-283.

138. Ostatna V., Vaisocherova H., Homola J., Hianik T. Effect of the immobilisation of DNA aptamers on the detection of thrombin by means of surface plasmon resonance // Anal. Bioanal. Chem. — 2008. — Vol. 391, №5.-P. 1861-1869.

139. Oyoshi Т., Sugiyama H., Wang A. H.-J. Photoreactivlty of 5-iodouracil-containing DNA-Sso7d complex // Nucl. Acids Symp. — 1999. Ser. No. 42.-P. 171-172.

140. O'Sullivan C.K. Aptasensors—the future of biosensing? // Anal. Bioanal. Chem. 2002. - Vol. 72, № 1. - P. 44-48.

141. Paborsky L.R., McCurdy S.N., Griffin L.C., Toole J.J., Leung L.L.K. The single stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268, № 28. - P. 20808-20811.

142. Pagano В., Martino L., Randazzo A., Giancola C. Stability and binding properties of a modified thrombin binding aptamer // Biophys. J. 2008. - Vol. 94, № 2. - P. 562-569.

143. Patel D.J., Suri A.K., Jiang F., Jiang L., Fan P., Kumar R.A., Nonin S. Structure, recognition and adaptive binding in RNA aptamer complexes // J. Mol. Biol. 1997. - Vol. 272. - P. 645-664.

144. Pavski V., Le X.C. Detection of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase using aptamers as probes in affinity capillary electrophoresis // Anal. Chem. 2001. - Vol. 73, № 24. - P. 6070-6076.

145. Petach H, Gold L. Dimensionality is the issue: use of photoaptamers in protein microarrays // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. - Vol. 13, № 4. -P. 309-314.

146. Petach H., Ostroff R., Greef C., Husar G.M. Processing of photoaptamer microarrays // Methods Mol. Biol. 2004. - Vol. 264. - P. 1-10.

147. Polanski M., Anderson L.N. A list of candidate cancer biomarkers for targeted proteomics // Biomarker Insights. 2007. - Vol. 1. - P. 1-48.

148. Polsky R., Gill R., Kaganovsky L., Willner I. Nucleic acid-functionalized Pt nanoparticles: Catalytic labels for the amplified electrochemical detection of biomolecules // Anal. Chem. 2006. - Vol. 78, №7. -P. 2268-2271.

149. Potyrailo R.A., Conrad R.C., Ellington A.D., Hieftje G.M. Adapting selected nucleic acid ligands (aptamers) to biosensors //Anal. Chem. -1998. Vol. 70, № 16. - P. 3419-3425.

150. Pultar J., Sauer U., Domnanich P., Preininger C. Aptamer-antibody on-chip sandwich immunoassay for detection of CRP in spiked serum // Biosens. Bioelectron. 2009. - Vol. 24, № 5. - P. 1456-1461.

151. Radi A.E., Acero Sanchez J.L., Baldrich E., O'Sullivan C.K. Reagentless, reusable, ultrasensitive electrochemical molecular beacon aptasensor // J. Am. Chem. Soc. 2006. - Vol. 128, № 1. - P. 117-124.

152. Radi A.E., Sanchez J.L.A., Baldrich E., O'Sullivan C.K. Reusable impedimetric aptasensor // Anal. Chem. 2005. - VoL 77, № 19. - P. 6320-6323.

153. Raffel C., Deen D.F., Edwards M.S. Bromodeoxyuridine: a comparison of its photosensitizing and radiosensitizing properties // J. Neurosurg. -1988.-Vol. 69, №3.-P. 410-415.

154. Raffel C., Edwards M.S., Deen D.F. The effect of bromodeoxyuridine and ultraviolet light on 9L rat brain tumor cells // Radiat. Res. 1989. -Vol. 118, №3.-P. 409-419.

155. Ravelet R., Grosset C., Peyrin E. Liquid chromatography, electrochromatography and capillary electrophoresis applications of DNA and RNA aptamers // J. Chromatogr. A. 2006. - Vol. 1117, № 1. -P. 1-10.

156. Rich R.L., Myszka D.G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis // Curent opinion in biotechnology. — 2000. V. 11-P. 54-61.

157. Ringquist S., Parma D. Anti-L-selectin oligonucleotide ligands recognize CD62L-positive leukocytes: binding affinity and specificity of univalent and bivalent Ligands // Cytometry. 1998. - Vol. 33, № 4. - P. 394-405.

158. Rodriguez M.C., Kawde A.N., Wang J. Aptamer biosensor for label-free impedance spectroscopy detection of proteins based on recognition-induced switching of the surface charge // Chem. Commun. 2005. -Vol. 14, № 34. - P. 4267-4269.

159. Romig T.S., Bell C., Drolet D.W. Aptamer affinity chromatography: combinatorial chemistry applied to protein purification // J. Chromatogr. B. 1999. - Vol. 731, № 2. - P. 275-284.

160. Rye P.D., Nustad K. Immunomagnetic DNA aptamer assay //Biotechniques. 2001. - Vol. 30, № 2. - P. 290-295.

161. Sanchez J.L.A., Baldrich E., Radi A.E.G., Dondapati S., Sanchez P.L., Katakis I, Ciara K. O'Sullivan. Electronic Off-On Molecular Switch for Rapid Detection of Thrombin // Electroanalysis. 2006. - Vol. 18, № 19-20.-P. 1957-1962.

162. Santulli-Marotto S., Nair S.K., Rusconi C., Sullenger В., Gilboa E. Multivalent RNA aptamers that inhibit CTLA-4 and enhance tumor immunity // Cancer Res. 2003. - Vol. 63, № 21. - P. 7483-7489.

163. Schneider D.J., Feigon J., Hostomsky Z., Gold L. High-affinity ssDNA inhibitors of the reverse transcriptase of type 1 human immunodeficiency virus // Biochemistry. 1995. - Vol. 34, № 29. - P. 9599-9610.

164. Schultze P., Macaya R.F., Feigon J. Three-dimensional solution structure of the thrombin-binding DNA aptamer (GGTTGGTGTGGTTGG) // J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 235, № 5. - P. 1532-1547.

165. Seeman N.C. Structural DNA nanotechnology: an overview //Methods Mol. Biol. 2005. - Vol. 303. - P. 143-166.

166. Simonian M.H., Smith J.A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration // Curr. Protoc. Mol. Biol. 2006. - Chapter 10, Unit 10.1 A.

167. Smirnov I., Shafer R.H. Effect of loop sequence and size on DNA aptamer stability // Biochemistry. 2000. - Vol. 39. P. 1462-1468.

168. Smith D., Collins B.D., Heil J.5 Koch Т.Н. Sensitivity and Specificity of Photoaptamer Probes // Mol. Cell. Proteomics. 2003. - Vol. 2, № 1. - P. 11-18.

169. So H.M., Won K., Kim Y.H., Kim B.K., Ryu B.H., Na P.S., Kim H., Lee J.O. Single-walled carbon nanotube biosensors using aptamers as molecular recognition elements // J. Am. Chem. Soc. 2005. - Vol. 127, № 34.-P.l 1906-11907.

170. Speit G., Hochsattel R., Vogel W. The contribution of DNA single-strand breaks to the formation of chromosome aberrations and SCEs // Basic Life Sci. 1984. - Vol. 29, Pt. A. - P. 229-244.

171. Steel A.B., Heme T.M., Tarlov M.J. Electrochemical quantitation of DNA immobilized on gold //Anal. Chem. 1998. - Vol. 70, № 22. - P. 4670-4677.

172. Steen H., Petersen J., Mann M., Jensen O.N. Mass spectrometric analysis of a UV-cross-linked protein-DNA complex: tryptophans 54 and 88 of E. coli SSB cross-link to DNA // Protein Sc. 2001. - Vol. 10, № 10. - P. 1989-2001.

173. Sugiyama H., Tsutsumi Y., Fujimoto K., Saito I. Photoinduced deoxyribose C2' oxidation in DNA. Alkali-dependent cleavage of erythrose-containing sites via a retroaldol reaction // J. Am. Chem. Soc. 1993.-Vol. 115, № 11. - P. 4443-^1448.

174. Sugiyama H., Tsutsumi Y., Saito I. Highly sequence selective photoreaction of 5-bromouracil-containing deoxyhexanucleotides // J. Am. Chem. Soc. 1990. - Vol. 112, № 18. - P. 6720-6721.

175. O'Sullivan C.K. Aptasensors-the future of biosensing? // Anal. Bioanal. Chem. 2002. - Vol. 72, №1 - P. 44-48.

176. Swanson B.J., Kutzer J.C., Koch Т.Н. Photoreduction of 5-bromouracil. Ionic and free-radical pathways // J. Am. Chem. Soc. 1981. - Vol. 103, № 5.-P. 1274-1276.

177. Svitel J., Balbo A., Mariuzza R.A., Gonzales N.R., Schuck P. Combined affinity and rate constant distributions of ligand populations from experimental surface binding kinetics and equilibria // Biophys. J. -2003. Vol. 84, № 6. - P. 4062-4077.

178. Szwajkajzer D., Carey J. Molecular and biological constraints on ligand-binding affinity and specificity // Biopolymers. 1997. - Vol 44, № 2. — P. 181-198.

179. Taichman L.B. The use of ultraviolet light in the fractionation of chromatin containing unsubstituted and bromodeoxyuridine-substituted DNA // Nucleic Acids Res. 1979. - Vol. 6. - P. 2029-2038.

180. Tang Q., Su X., Loh K.P. Surface plasmon resonance spectroscopy study of interfacial binding of thrombin to antithrombin DNA aptamers // J. Colloid Interface Sci. 2007. - Vol. 315, № 1. - P. 99-106.

181. Tasset D.M., Kubik M.F., Steiner W. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes // J. Mol. Biol. 1997. - Vol. 272, №5.-P. 688-698.

182. Thiel K.W., Giangrande P.H. Therapeutic Applications of DNA and RNA Aptamers // Oligonucleotides. 2009. - Vol. 19, № 3. - P. 209-222.

183. Tian L., Heyduk T. Bivalent ligands with long nanometer-scale flexible linkers //Biochemistry. 2009. - Vol. 48, № 2. - P. 264-275.

184. Tombelli S., Minunni M., Mascini M. Analytical applications of aptamers // Biosens. Bioelectron. 2005. - Vol. 20, № 12. - P. 24242434.

185. Tsiang M., Jain A.K., Dunn K.E., Rojas M.E., Leung L.L., Gibbs C.S. Functional Mapping of the Surface Residues of Human Thrombin // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270, № 28. - P. 16854-16863.

186. Tsuji S., Tanaka Т., Hirabayashi N., Kato S., Akitomi J., Egashira H., Waga I., Ohtsu T. RNA aptamer binding to polyhistidine-tag // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2009.-Vol.386, № 1.-P.227-231.

187. Tuerk C., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase // Science. 1990. - Vol. 249. - P. 505-510.

188. Ulrich H., Martins A.H.B, Pesquero J.B. RNA and DNA Aptamers in Cytomics Analysis // Cytometry Part A. 2004. - Vol. 59 A. - P. 220231.

189. Umehara Т., Fukuda K., Nishikawa F., Kohara M., Hasegawa Т., Nishikawa S. Rational design of dual-functional aptamers that inhibit the protease and helicase activities of HCV NS3. // J. Biochem.-Tokyo. -2005.-Vol. 137.-P.339-347.

190. Vater A., Jarosch F., Buchner K., Klussmann S. Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX // Nucleic Acids Res.-2003 a.-Vol. 31, №21.-P. 130.

191. Vater A., Klussmann S. Toward third-generation aptamers: Spiegelmers and their therapeutic prospects // Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2003 b.- Vol. 6, №2.-P. 253-261.

192. Verhamme I.M., Olson S.T., Tollefsen D.M., Bock P.E. Binding of exosite ligands to human thrombin. Re-evaluation of allosteric linkage between thrombin exosites I and II // J. Biol Chem. 2002. - Vol. 277, №9.-P. 6788-6798.

193. Wang J. Survey and summary: from DNA biosensors to gene chips // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol. 28. - P. 3011-3016.

194. Wang J., Lv R., Xu J., Xu D., Chen H. Characterizing the interaction between aptamers and human IgE by use of surface plasmon resonance // Anal. Bioanal. Chem. 2008. - Vol. 390, № 4. - P. 1059-1065.

195. Wang K.Y., Krawczyk S.H., Bischofberger N., Swaminathan S., Bolton P.H. The tertiary structure of a DNA aptamer which binds to and inhibits thrombin determines activity // Biochemistry. 1993. - Vol. 32, № 42. -P. 11285-11292.

196. Wernems H., Lehtio J., Samuelson P., Stahl S. Engineering of staphylococcal surfaces for biotechnological applications // J. Biotechnol. 2002. - Vol. 96, № 1. - P. 67-78.

197. White R., Rusconi C., Scardino E., Wolberg A., Lawson J., Hoffman M., Sullenger B. Generation of species cross-reactive aptamers using "toggle" SELEX // Mol. Ther. 2001. - Vol. 4, № 6. - P. 567-573.

198. Wick K.L., Matthews K.S. Interactions between lac Repressor Protein and Site-specific Bromodeoxyuridine-substituted Operator DNA // J. Mol. Biol. 1991. - Vol. 266, No. 10. - P. 6106-6112.

199. Willis M.C., Hicke B.J., Uhlenbeck O.C., Cech T.R., Koch Т.Н. Photocrosslinking of 5-iodouracil-substituted RNA and DNA to proteins //Science. 1993.-Vol. 262.-P. 1255-1257.

200. Wilson D.S., Szostak J.W. In vitro selection of functional nucleic acids // Annu. Rec. Biochem. 1999. - Vol. 68. P. 611-647.

201. Winsor D. J., Jackson С. M. Interpretation of the temperature dependence of equilibrium and rate constants // J. Mol. Recogn. 2006. -Vol. 19, №5.-P. 389-407.

202. Wolberg A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure // Blood Reviews. 2007. - V. 21. - P. 131-142.

203. Wolf E., Hofmeister R., Kufer P., Schlereth В., Baeuerle P.A. BiTEs: bispecific antibody constructs with unique anti-tumor activity // Drug Discovery Today. 2005. - Vol. 10, № 18. - P. 1237-1244.

204. Win M.N., Klein J.S., Smolke C.D. Codeine-binding RNA aptamers and rapid determination of their binding constants using a direct coupling surface plasmon resonance assay // Nucleic Acids Res. 2006. - Vol. 34, № 19.-P. 5670-5682.

205. Wu Q., Tsiang M., Sadler J.E. Localization of the Single-stranded DNA binding site in the thrombin anion-binding exosite // J. Biol Chem. — 1992. Vol. 267, № 34. - P. 24408-24412.

206. Xiao Y., Arica L., Alan H., Kevin P. Label-Free Electronic Detection of Thrombin in Blood Serum by Using an Aptamer-Based Sensor // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2005 a. - Vol. 44. - P. 5456-5459.

207. Xiao Y., Piorek B.D., Plaxco K.W., Heeger A.J. A reagentless signal-on architecture for electronic, aptamer-based sensors via target-induced strand displacement//J. Am. Chem. Soc. -2 005 b. Vol. 127, № 51. - P. 17990-17991.

208. Xu D., Xu D., Yu X., Liu Z., He W., Ma Z. Label-free electrochemical detection for aptamer-based array electrodes // Anal. Chem. 2005. -Vol. 77, № 16.-P. 5107-5113.

209. Xu H., Мао X., Zeng Q., Wang S., Kawde A.N., Liu G. Aptamer-functionalized gold nanoparticles as probes in a dry-reagent strip biosensor for protein analysis // Anal. Chem. 2009. - Vol. 81, № 2. - P. 669-675.

210. Xu W., Ellington A.D. Anti-peptide aptamers recognize amino acid sequence and bind a protein epitope // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996. Vol. 93, № 15. - P. 7475-7480.

211. Xu Y., Yang L., Ye X., He P., Fang Y. Impedance DNA Biosensor using electropolymerized polypyrrole/multiwalled carbon nanotubes modified electrode // Electroanalysis. 2006. - Vol. 18, № 15. - P. 1449-1456.

212. Yan H., Zhang X., Shen Z., Seeman N.C. A robust DNA mechanical device controlled by hybridization topology //Nature. 2002. - Vol. 415, №6867.-P. 62-65.

213. Yao C., Qi Y., Zhao Y., Xiang Y., Chen Q., Fu W. Aptamer-based piezoelectric quartz crystal microbalance biosensor array for the quantification of IgE // Biosens Bioelectron. 2009. - Vol. 24, № 8. - P. 2499-2503.

214. Zayats M., Huang Y., Gill R., Ma C.A., Willner I. Label-free and reagentless aptamer-based sensors for small molecules // J. Am. Chem. Soc. 2006. - Vol. 128, № 42. - P. 13666-13667.

215. Zeder-Lutz G., Zuber E., Witz J., Van Regenmortel M.H. Thermodynamic analysis of antigen-antibody binding using biosensor measurements at different temperatures // Anal Biochem. 1997. Vol. 246, № l.-P. 123-132.

216. Zelada-Guillen G.A., Riu J., Dtizgun A., Rius F.X. Immediate detection of living bacteria at ultralow concentrations using a carbon nanotube based potentiometric aptasensor // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009. -Vol. 48, № 40. - P. 7334-7337.

217. Zeng Y., Wang Y. Sequence-dependent formation of intrastrand crosslink products from the UVB irradiation of duplex DNA containing a 5-bromo-2'-deoxyuridine or 5-bromo-2'-deoxycytidine // Nucleic Acids Res. 2006. - Vol. 34, № 22. - P. 6521-6529.

218. Zhang Y., Zhou H., Ou-Yang Z.C. Stretching single-stranded DNA: interplay of electrostatic, base-pairing, and base-pair stacking interactions //Biophys. J. 2001. - Vol. 81, № 2. - P. 1133-1143.

219. Zhang Z., Yang W., Wang J., Yang C., Yang F., Yang X. A sensitive impedimetric thrombin aptasensor based on polyamidoamine dendrimer // Talanta. 2009. - Vol. 78, № 4-5. - P. 1240-1245.

220. Zhou J., Li H., Li S., Zaia J., Rossi J.J. Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy //Mol. Ther. 2008. -Vol. 16.-P. 1481-1489.

221. Zhou X.H. The affinity-enhancing roles of flexible linkers in two-domain DNA-binding proteins. // Biochemistry. 2001. - Vol. 40, № 50.- P.15069-15073.

222. Власова И. E., Власов В. В. Молекулярная эволюция: Создание нуклеиновых кислот, способных к специфическому комплексообразованию и обладающих каталитическими функциями // Молекуляр.биология. 1993. - Т. 27, № 1. С. 5-13.

223. Добровольский А.Б., Титаева Е.В., Хаспекова С.Г., Спиридонова В.А., Копылов A.M., Мазуров А.В. Ингибирование активности тромбина ДНК-аптамерами // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2009. - Т. 147, №7.-С. 41-45.

224. Копылов A.M., Спиридонова В. А. Комбинаторная химия нуклеиновых кислот: SELEX // Мол. биол. 2000. - Т. 34, № 6. С. 1097-1113.

225. Серейская А.А., Пехник И.В., Осадчук ТВ. Действие различных форм тромбина на неспецифические высокомолекулярные субстраты // Биохимия. 1989. - Т. 55, № 4. - С. 645-652.

226. Спиридонова В.А., Копылов А. М. Аптамеры как узнающие элементы для создания биосенсоров // Наукоемкие технологии. -2003b.-Т. 1, №3. С. 34-40.

227. Спиридонова В.А., Копылов A.M. Аптамерные ДНК -принципиально новые узнающие элементы для биосенсоров. // Биохимия. 2002. Т. 67. № 6. С. 850-854.

228. Спиридонова В. А., Рог Е.В., Дугина Т. Н., Струкова С. М., Копылов А. М. Аптамерные ДНК — ингибиторы тромбина нового типа // Биоорг. химия. 2003а - Т. 29, № 5. - С.495-498.

Информация о работе

Рахметова, Светлана Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Создание высокоаффинных гетеродимерных фотоаптамерных конструкций к тромбину - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы