Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание вирусоустойчивых трансгенных растений, экспрессирующих гены дефектных транспортных белков фитовирусов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Создание вирусоустойчивых трансгенных растений, экспрессирующих гены дефектных транспортных белков фитовирусов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Р Г 5 од

л а. г л ---------_

к шг г» шин J I/гЬ.Ы)/

На правах рукописи 576.8

НАЗАРОВА Шия Вадимовна

ИЗДАНИЕ ВИРУСОУСТОИЧИВЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИИ. ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ' ГЕНЫ ДЕФЕКТНЫХ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ ФИТОВИРУСОВ

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факульте МГУ.

Научные руководители: доктор биологических наук М.Э.Тальянский

кандидат биологических наук С.И.Малшпенк

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С.К.Завриев

кандидат биологических наук В.Г.Джавахия

Ведущая организация: Институт микробиологии РАН

Зашита состоится ^/"<^€¿^¡£¿¿¡1995 г. в часов на заседай Специализированного совета ■ Д.053.05.70 . при Московск Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 11989 Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологическо факультета МГУ.

Автореферат разослан 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета ■кандидат химических наук

В.Н.Каграма:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Одной из важных проблем растительной вирусологии является изучение механизмов, контролирующих устойчивость и восприимчивость растений к вирусным заболеваниям. Решение этой проблемы позволит разработать ькоивриментя,яьнн9 подхода для создания вируcoyстоЯчивых сортов. С конца 80ых годов широкое распространение получила гипотеза о том, что генетические элементы самих фитовирусов, будучи экспрессированы в трансгенных растениях, могут индуцировать в них . противовирусную устойчивость. В соответствии с этим предположением к настоящему времени продемонстрирована устойчивость трансгенных растений, зкспрессирувдих различные вирусспецифические нуклеотидные последовательности: гены структурных белков и РНК-полимераз, последовательности, соответствующие сателлитным и дефектным интерферирующим РНК, антисмысловым РНК и т.д.

Настоящая работа посвящена изучению возможности индукции противовирусной устойчивости в трансгенных растениях, продуцирующих дефектные траспортные белки. Известно, что для успешного развития инфекции вирусный геном должен попасть из первичноинокулированных в окружающие здоровые клетки. Системное распространение (транспорт) вирусов в зараженных растениях-является одним из ключевых процессов развития вирусной инфекции. Вирусы растений кодируют особые транспортные белки (ТЕ),-контролирующие этот процесс. Механизм действия ТБ до конца не выяснен, однако, предполагается, что ТБ взаимодействуют с особыми клеточными компонентами, локализованными в районе плазмодесм (цитоплазмзтических мостиков между клетками растений), - и

модифицируют последние, увеличивая их размер. (Deom et ai., 1990

Citovsky et Zambriskl, 1991). МОЖНО бЫЛО ОЖИДаТЬ, ЧТО блокирована

клеточных факторов дефектными ТБ, которые могут взаимодействоват] с ними, но не способны выполнить транспортную функцию полностью приведет к подавлению распространения вирусов. Таким образоь данные растения будут обладать определенной степенью устойчивости, Исследования в данной области имеют не только практическое, но и теоретическое значение, так как позволяют глубже поняи фундаментальные механизмы, контролирующие межклеточный транспорт.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось создание виру coy стойчивых трансгенных растений, экспрессирущю гены дефектных ТБ фитовирусов. При этом были поставлены следующие задачи:

1. Получить конструкции генов дефектных ТБ, в качестве которых были выбраны гены: дефектного при непермиссивной температуре ЗОН ТБ температурочувствительного (ts) мутанта вируса табачной мозаики (ВТМ) - N12519, и нефункционального в табаке 32К ТБ вируса мозаики костра (ВМК).

2. Провести с помощью полученных конструкций трансформацию и регенерацию растений N.tabacum cv. Samsun.

3. Изучить выражение встроившихся генов в отобранных на селективной среде регенерантах.

4. Оценить устойчивость различных линий трансгенных растений к инфекции ВТМ.

Научная новизна и практическая ценность- работы. В ходе выполнения ■ работы впервые разработан новый экспериментальный подход для получения вирусоустойчивыхтрадсгенныхрастений, который

»снован на введении в геном растений нуклеотидних юследовательностей, кодирующих дефектные вирусные ТБ. С этой 1елью были клонированы последовательности, соответствующие генам гэТБ n12519 и ТБ ВМК. Показано, что tsTБ N12519 и нефункциональный з табаке ТБ ВМК локализуются в трансгенных растениях в мембрашюй фракции (рзо) и во фракции клеточных станок \ мохлыаш свидетельствую? о свосоивзсга овдих'внных д^ктаых 1'Б юдавлять вирусную инфекцию. Таким образом, приемы, описанные в 1астоящей работе могут быть использованы для получения зирусоустойчивых,сортов важных сельскохозяйственных культур.

Апробация работы.. Результаты исследований были доложены на ¿1 Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1993), хх Международном конгрессе по вирусологии (Глазго, [993) и Юбилейной конференции Центра биотехнологии им. Отто ЗарСурга (Реховот, 1994). Основные материалы работы изложены в г научных статьях и 3 сообщениях. Диссертация была апробирована нз заседании кафедры вирусологии МГУ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Общий объем -/05 страниц машинописного текста, включая 6 таблиц, #рисунков. Список использованной литературы включает -^>~работ.

Результаты и обсуждение. I. Получение и иммуноблот-анализ трансгенных растений, экспрессируюцих ген ts30K ТБ N12519.

В настоящее время общепринята модель полидоменной структуры ТБ ВТМ, содержащего РНК-связывавдий домен, домен, отвечающий за связывание с хозяйскими факторами, домен, модифицирующий размер плазмодесм.а также домен фосфэрилирования. (citovsky et ai, 1992;

1993; Waigmann et al, 1994).М0ЖН0 бЫЛО предполагать, ЧТО

образование в трансгенных растениях ТБ, которые содержат лишь часть функционально активных доменов, приведет к устойчивости растений при инфекции вирусом дикого типа. Таким образом, исходной предпосылкой для настоящей работы было предположение о том, что дефектный tsTB, способный взаимодействовать с клеточными компонентами, будет конкурировать тем самым с- активным ТБ инфицирующего вируса, лишая его возможности правильно модифицировать плазмодесмы и выполнить транспортную функцию.

Для проверки настоящего предположения были сконструированы трансгенные растения табака N.tabacum cv..samsun, эксцрессирукхцие ген 30К--ТБ мутанта ВТМ Ni25i9 (ts по транспорту из клетки в клетку). Для получения гена ts30K ТБ была использована описанная ранее (Taiiansky et ai.,1992) рисзок плазмида, содержащая кДНК фрагмент ш штамма ВТМ (позиции 4254-5766), включающий ген ЗОН ТБ ui (позиции 4903-5706), фланкированный последовательностями, представляющими собой сайты для ecori рестриктазы. Известно, что единственная мутация, приводящая • к температурочувствительному фенотипу Ni2519 - arg(144)-»gly(144) - ОбуСЛОВЛеНЭ ЗЭМвНОЙ А—» G в ПОЗИЦИИ- 5332 РНК ВТМ (Zimmern et Hunter,1983) . Hindlll/ EcoRI

■мент ВТМ (позиции 5080-5766), содержащий сайт для введения щии N12519, был лигирован в Hi3mpi9 ДНК. Мутация A-*G в щии 5332 была получена сайт-направленным мутагенезом. Для 'о использовали олигонуклеотид из 22 оснований с гветствувдей ш.2519 заменой в качестве праймера для синтеза

>ВОЙ IHK. EcoRT /Ш чЛТТТ , byiiÜSÄ. CäJi

шрован в рисзок. есо31.1/ecori (позиции 4745-5766) фрагмент ученной плазмида рисзок- 2519 лигировали в экспрессирукшй гор PRT104 (Topfer et al., 1987) ПО Xhol И EcoRI Сайтам, положенным в районе полилинкера между 3ss промотором и сигналом иаденилирования гела нопалинсинтэзы. Hindin-фрагмент ученной плазмида рятэок-2519, содержащий химерный ген ЗОН ТБ 519, переносили В рВ1п19 плазмиду (Bevan et al.,1984), ержащую ген неомицинфосфотрансферазы и, сообщающий ■ойчивость к канамицину. рв1пзок-2519 была коньюгирована в ;umerfaciens LA4404, которая и использовалась для трансформации ¡товых дисков табака. Из полученных регенерантов для дальнейших ;периментов была выбрана линия Tni-i, эф!ективно экспрессирующая I tsTB. Анализ экспрессии гена проводился методом иммуноблота с юльзованием сыворотки, полученной к синтетическому пептиду, ¡дставляющему собой II С-концевых аминокислотных остатков ЗОК тка ВТМ.

Чтобы выяснить влияет ли ts-мутация в ЗОК ТБ Ni2si9 на /триклеточнуго локализацию этого белка нами была предпринята татка определения ЗОК белка во фракции клеточных стенок (pi) ив «бранной фракции (рзо). Как видно из Рис. 1,2 ЗОК ТБ, нтезируемый как при пермиссивной (24°С), так и при

непермиссивной (33°С) температуре, отличался по электрофоретической подвижности от контроля, в качестве которого использовался продукт трансляции in vitro РНК ВТМ (4 мкг).

±

Б 1

fr

^зок

Рис Л Иммуноблот-анализ внутриклеточного распределения ts30K ТБ в трансгенных растениях ní2519TB(+) при 24°с: (А) Р1-$ракция, (Б) рзо-фракция. pi - фракция клеточных стенок - осадок при 1000 д, рзо - фракция клеточных мембран - осадок при 30000 д, полученные из экстрактов I г листового материала растений Ni25i9TB(+) (дорожка I) и контрольных (не содержащих гена ТБ) ТБ(-) растений (дорожка 2). На дорожке 3 стрелкой указан ЗОК Оелок - продукт

ТраНСЛЯЦИИ in vitro 4 мкг РНК ВТМ.

В экстрактах клеток трансгенных растений ЗОК белок при электрофорезе обладал большей электрофоретической подвижностью по сравнению с ЗОК белком трансляционной смеси.• Этот эффект, вероятно, связан с посттрансляционной модификацией in vivo ЗОК

белка.

1 2 3 4 5

Рис.2. Иммуноблот-анализ внутриклеточного распределения ts30K ТБ в растениях Ш2519ТБ(+) при 33°С (дорожка 2 - pi фракция, 3 - рзо фракция).В качестве контролей использовали pi (дорожка I) и рзо фракции (дорожка 4) из экстрактов растений ТБ(-), а также продукт трансляции in vitro 4 мкг РНК ВТМ (дорожка 5).

Как видно из Рис.1,2, температура не влияла на внутриклеточную локализацию tsTB: как при 24°С, так и при 33°С ЗОК ТБ Ni25i9 выявлялся и во фракции клеточных стенок (Р1), ив мембранной фракции (рзо). Получанныя результаты позволяют предположить, что домены, ответственные за внутриклеточную

локализацию не инактивированы ts-мyтaциeй N12519.

В ряде случаев независимо ох температуры, при коа содержались растения, в экстрактах, выделенных из их листьев, белок при электрофорезе (Рис.3) выявлялся^ по-видимому, в С! димеров (56К), обнаруженных ранее оеош et а'1.(1990) в трансге по гену 1:гЗОК ТБ ш ВТМ растениях. Одним из возмс объяснений образования димерных молекул могут быть особенн выделения и электрофореза белков. (Сеош е! а1.,1990).

Рис.З". Димерные формы ЗОН ТБ N12519, обнаруженные иммуно анализом в Ы12519ТБ(+) растениях, при 24°С (дорожка I) и при (дорожка 2,3). На дорожках 4,6 - р1 и рзо фракции контрол ТБ(-) растений при 33°С.

В ходе предварительных исследований было обнаружено, содержание ЗОК белка N12519 зёвисит от возраста и полож

анализируемого листа. Для дальнейших экспериментов по оценке устойчивости трансгенных растений важно было установить возраст листьев, при котором накопление tsЗOK ТБ N12519 является наибольшим. Для этого отбирались растения, содержащие от 8 до 10 листьев. Условно листья таких растений подразделяли на 3 яруса:

нижний (соляпляпгал лист?-!' -1С 12 ийбямий I птгтгоа ^'"т"

7-10 см) и верхний (длина листа 5-7 см). Методом иммуноблот-анализа было показано, что наибольшее количество tsЗOK белка 'содержится в клеточной стенке листьев нижнего и среднего яруса. Как видно из Рис.4, tsTБ N12519 в молодых листьях (верхнего яруса) локализуется в. основном в рзо фракции.

1 2 3 4 5 6 7 8ГК~Ь

30 К I 17 К-4

' I

Рис.4. Содержание ЗОК ТБ N12519 в листьях нижнего (дорожки 2,3), среднего (дорожки 4,5) и верхнего (дорожки 6,7) ярусов Ш2519ТБ(+) растений при 33°С по данным иммуноблота. К - экстракт листьев среднего яруса растений ТБ(-).Дорожки 2,4,6,8 - Р1 фракция,. 3,5,7, 9 - РЗО фракция.

3.Влияние температуры на восприимчивость к ВТМ трансгенных

растений N12519 ТБ(+).

3.1. Устойчивость инокулированных листьев.

Для оценки восприимчивости полученных трансгенных растений, экспрессируицих ген температурочувствительного ТБ N12519, к ВТМ использовали линию тп!-1. В качестве положительного контроля выбрали линию то-4, экспрессирупцую ген ТБ температурорезистентного т ВТМ (танапвку е! а1.( 1992). Как было показано ранее (таНапвку et а1., 1992), растения линии то-4 комплементируют ts по транспорту мутант ВТМ - ьв-1, что свидетельствует о функциональной активности синтезируемого в них ТБ. В качестве отрицательного контроля была выбрана линия тк-1, содержащая вектор, используемый для трансформации, но без гена ТБ. В этих и во всех последующих экспериментах, представленных в данной работе для инокуляции' трансгенных растений использовали штамм т дикого типа ВТМ.Для опытов по оценке устойчивости отбирались растения, содержащие 8-10 зрелых листьев (длиной 12 см).

В . первой серии экспериментов исследовалось влияние температуры на степень накопления ВТМ в инокулированных листьях. Как И' ожидалось, инокулированные листья растений. ш.2519ТБ(+), выращенных при 24°С, оказались восприимчивыми к вирусу. В Таблице 1,2 представлены данные ишуноферментного анализа (ИФА), усредненные для 10-20 листьев. Как видно из Таблица X, инокулированные листья растений ТБ(-), М2519ТБ(+), 01ТБ(+) при 24°С одинаково восприимчивы к ВТМ. Это свидетельствует о том, что функционально активный ТБ, синтезируемый в трансгенных растениях,

оказывает влияния на распространение в них вирусной инфекции.

Таблица I

сопление ВТМ в инокулированных зрелых листьях трансгенных растений збака, продуцирущих tsЗOK ТБ N12519

энсгенная Накопление ВТМ в инокулированных листьях через

линия 3-5 дней после заражения (мкг/г сытэой ткаш\

*

24°С 33°С 33^24°С

X I II III IV V VI I II

1-1 14.0 0.5 2.6 0.2 5.8 0.2 0.5 11.0 15.0

12519 ТБ(+)]

-4 28.0 14.0 НТ НТ НТ НТ НТ 18.0 НТ

1 ТБ(+)]

-1 15.0 12.0 46.0 64.0 25.0 54.0 20.0 20.0 22.0

Б(-))

имечание к Таблице I.

всь и в Таблицах 2-6 представлены усредненные для 10-20 листьев данные иуноферментного анализа (ИФА). В каждом опыте использовали от 3 до 6 стений каждой линии. Для инокуляции использовали ВТМ дикого типа (штамма ) в концентрации Змкг/мл. В квадратных скобках указан фенотип растений. VI- номер опыта.

- растения переносили с 33°С на 24°С и выдерживали при этой мпературе ?. недели перед заражением. Г-не тестировали.

Напротив, в тех случаях, когда трансгенные растения выдерживали при непермиссивной для ts30K ТБ температуре (33°С) до и после инокуляции, уровень накопления вируса в зрелых листьях Ni25i9TB(+) растений был существенно снижен по сравнению с контрольными. В случае, если трансгенные растения, выращенные при 33°С, переносили на 24°С перед инокуляцией и содержали в дальнейшем при этой температуре, восприимчивость к вирусной инфекции восстанавливалась (Таблица I).

Нужно отметить, что противовирусную устойчивость демонстрировали лишь зрелые листья. Молодые инокулированные листья (менее 7 см длиной) в большинстве случаев не обнаруживали устойчивого фенотипа (Таблица 2). Таким образом, противовирусная устойчивость при 33°С верхних инокулированных листьев (если и существовала) была выражена в гораздо меньшей степени.

Эти результаты согласуются с приведенными выше данными иммуноблот-анализа о распределении эндогенного ts30K ТБ в растении (Рис.4) и опубликованными ранее данными сеош et ai. (1990>: и ts30K ТБ N12519, и tr30K ТБ ui ВТМ содержатся в клеточной стенке зрелых листьев в гораздо больших количествах, чем в молодых. Кроме

ТОГО, Wolf et al. (1989), Deora et al. (1990) ПОКазаЛИ, ЧТО

плазмодесмы в молодых листьях, экспрессирупцих ген ЗОК ТБ, не модифицированы по сравнению с плазмодесмами зрелых листьев.

Таблица 2

[акопление ВТМ в инокулированных молодых листьях трансгйнных растений табака, продуцирующих tsЗOK ТБ N12519 ^

'рансгенная линия Накопление 3-5 ВТМ в дней инокулированных листьях через после заражения (мкг/г сырой тканй

24 С зз°С

I I и ш IV V VI I и

№1-1 ¡N12519 ТБ(+)) 57.0 13.0 85.0 11.7 15.0 10.5 12,5 72.0 НТ

Го-4 ¡"1 ТБ( + )) 36.0 28.0 НТ НТ НТ НТ НТ 14.0 НТ

Ос-1 [ТБ(->] 42.0 38.0 92.0 12.0 11.0 125.0 15.0 24.0 56.0

Г) см. примечание к Табл. I.

3.2. Устойчивость к ВТМ системно инфицированных листьев.

В следующей серии экспериментов исследовалось влияние товышенной температуры на восприимчивость к ВТМ неинокулированных пистьев М12519ТБ(+) растений. Для этого инокулировали нижний лист выдержанных при Зз°с в течение 2 недель растений. Уровень накопления вируса в неинокулированных листьях определяли через 3

недели. Было показано, что снижение накопления ВТМ в растениях ш.2519ТБ(+), содержащихся при 33°С, было гораздо лучше выражено в системно шфщированных (неинокулированных) листьях (Таблица 3), чем в инокулированных (Таблица 1,2).

Таблица 3

Накопление ВТМ в неинокулированных листьях трансгенных растений табака, продуцирующих ген tsЗOK ТБ N12519

Трансгенная линия

X IX III

N листа (нуме- Т111-1 ■ Тк-1 Тп1-1 Тк-1 ТП1-1 Тк-1

рация сверху (N12519 (ТБ(-)] (N12519 (ТБ(-)1 (N12519 (ТБ(-)1

вниз) ТБ(+)) ТБ(+)) ТБ(+)<]

ы 0.5 10.0 НЕ НТ 1.8 3.5

Ь2 0.9 10.0 0.2 30.0 1.0 2.7

ь 3 0.3 8.0 0.2 35.0 1.2 3.6

1.4 0.2 7.0 0.2 40.0 1.2 0.5

Ь5 0.2 8.0 НТ НТ 0.5 3.8

Ь6 НТ НТ 0.2 10.0 0.5 1.8

I)- см. примечание к Таблице I. Содержание вируса (мкг/г сырой ткани) анализировали через 3 недели после заражения.

3.3. Временная зависимость накопления ВТМ .

В отдельных экспериментах исследовалась временная зависимость накопления ВТМ в Ы12519ТБ(+) и ТБ(-) растениях при 33°С. Рис.5'

иллюстрирует полученные результаты. Отсрочка в накоплении вируса по сравнению с контрольными растениями обнаруживалась как в иноку лированных (Рис. 5а). так и в неинокулированных (Рис. 5Б) листьях м!2519ТБ(+) растений.

Время 'после инокуляции (дней) Рис.5., Зависимость накопления ВТМ (мкг/г сырой ткани) в инокулированных (А) и неинокулированных (Б) листьях растений N125-1ЭТБ(+) (Ш ) от времени после инокуляции (по данным ИФА). В качестве контроля использовались ТБ(-) растения (□). Все растения до и после инокуляции содержались при 33°С. В (Б) показана концентрация вируса в 4-5 сверху листе.

3.4. Восприимчивость к ВТМ протопластов, выделенных из N12519 ТБ(+) растений.

Для доказательства того, что снижение уровня накопления ВТМ происходит на стадии транспорта вируса, а не в результате ингибирования его репликации, из растений Ы12519ТБ(+) и ТБ(-),

содержавшихся при 33°С, были выделены протопласты и инокулироваи ВТМ (все процедуры проводились при 33°С). Не было выявле ' существенных отличий в уровне накопления ВТМ: количества вируса обнаруживаемые при 33°С в Ш2519ТБ(+) и ТБ(-) протопластах, составляли, соответственно, 90 нг и 120 нг на I05 клеток. Эт результаты свидетельствуют о том. что описанная выше устойчивост трансгенных растений, продуцирующих tsTB, обусловлена подавление вирусного распространения.

Танее (Wolf et ai.(i99i) было показано, что tsTB може связываться с плазмодесмами, но не может увеличивать их размер Waigmann et al.,(1994) ЛОКЭЛИЗОВаЛИ ПЛаЗМОДвСМО-МОДИфИЦИРУЮЩИЗ домен ЗОК ТБ ВТМ в районе 126-224 аминокислотных остатка. Мутаци:

N12519 (arg(144)-*gly(144)) раСПОЛОЖвНЭ ИМвННО В. ЭТОМ ДОМвШ

Очевидно, при повышенной температуре (33°С) обратимые температурозависимые конформационные изменения tsTB приводят i инактивации - этого домена. Предложенная модель индукцш устойчивости в трансгенных растениях Ni2si9TB(+) предполагав1; зависимость степени устойчивости от уровня содержания дефектной белка. Вероятно, существует некоторый критический уровень, достаточный для блокирования сайтов связывания вирусспецифиЧескиз ТБ в плазмодесмах растительных клеток.

4. Получение и анализ трансгенных растений, экспрессирующих ген 32К ТБ ШК.

ВМК является трехкомпонентным вирусом. PHKI и РНК2 кодируют поненты репликазы, а РНКЗ содержит 2 гена: ген транспортного бел ген структурного белка.

кДНК 32К ТБ ВМК была синтезирована с РНКЗ ВМК с помощью затравки oiigo(dT), комплементарной, внутренней oiigo(A) последовательности РККЗ ВМК. (Aihquist et ai.,i98i). После синтеза комплементарной цепи была получена ДНК, содержащая последовательность ВМК с 69-1211 нуклеотид, включающая ген 32К ТБ (позиции 92-1000), которая далее была клонирована по saci сайту в Г|,,мв. seeST/Beritl Jpan.iüHX шлучшшоа р«юэ?к плаэмиде,. соответствующий последовательности ВМК был лигирован в полилинкер pRTlOi экспрессирующего вектора (Topfer et al.,1981) между 35S промотором и сигналом полиаденилировзния гена нопалинсинтазы. Hindin фрагмент рлтзгк, содержащий химерный ген 32К ТБ ВМК, переносили В pBinl9 (Bevan et al.,1984). ПОЛучеННЭЯ ШШЗМИДа pBin-32к содержала ген неомицинфосфотрансферззы и, сообщающий устойчивость к канамицину. рв1пзгк была коньюгированз в

A.tumerfaciens LA4404, С ПОМОЩЬЮ КОТОРОЙ Трансформировали ЛИСТ0ВЫ6

диски табака. Анализ экспрессии гена 32К ТБ ВМК в полученных регенерантах проводили методом Саузерн- и Нозерн-гибридизации, а также иммуноблот-анализом (Рис.6,7). Как видно из Рис.7, 32К ТБ ВМК в трансгенных растениях локализуется в pi и рзо ССракциях.

5.Устойчивость к БТМ трансгенных растений ВМК ТБ(+).

Дефектными можно считать и ТБ тех вирусов, которые реплицируются только в первичнозараженных клетках и протопластах устойчивых растений, но не распространяются в них (сублиминэльная инфекция), 32К ТБ ВМК является, го-видимому, дефектным в растениях табака, так как известно, что ВМК ня заражает табак, ко

реплицируется в табачных протопластах (sakai et ai.,1983).

2,4 т.н. 1,4 т.н.

Рис.6. Анализ мРНК в листьях линий Т-3, Т-2, Tbmv -i, Т-6, Т-7 трансгенных растений, содержащих ген 32К ТБ ШК (дорожки 1-5, с ответственно), а также'контрольных ТБ(-) растений (дорожка б).

1 2 34 5 6789

"> •>•...... • ..... г

'з

! ' i ■ ' f 1 32 К ~*1 ~~ - - ....... ............■ . .

г. .1

Рис.7. Содержание 32К ТБ ВМК в трансгенных растениях по данным иммуноблот-анализа. Дорожки 2-5 - мембранная фракция, дорожки 6 - фракция клеточных стенок линий Tbmv—i (дорожки 2,6), Т-2 (дор жки 3,7), Т-6 (дорожки 4,8), а. также контрольных ТБ(-) растений (дорожки 6,9). На дорожке I стрелкой указан 32К белок - продукт трансляции in vitro 3 мкг РНКЗ ШК.

Для экспериментов по оценке устойчивости полученных ВМК

1

ТВ(+) растений была выбрана линия тьгау-1, наиболее эффективно экслрессируюцэя ген 32К ТБ ВМК (Рис.7). В качестве контрольных были использованы растения линии тк-1 (ТБ(-)), трансформированные соответствующей векторной конструкцией, не содержащей, однако, гена 32К белка. В пяти экспериментах инокулмтняим яга листья рпсТсНЛИ, СОДОрлаши ох и ло

10 зрелых листьев.

Таблица 4

Накопление ВТМ в инокулированных зрелых листьях трансгенных растений продуцирующих 32К ТБ ВМК

Трансгеннзя Накопление ВТМ в инокулированных листьях

линия (мкг/г сырой ткани) через 5 дней после заражения

I IX III IV V

Tbmv-l [ВМК ТБ(+)) 0.5 2.0 0.6 0.2 0.6

Tk-l (ТБ(-)1 25 . 0 18.0 12.7 2.5 42 . С

I) - см. примечание к Табл.1.

Как видно из Таблицы 4,5 .уровень накопления ВТМ в инокулированных, как зрелых, так и молодых, листьях ВМК ТБ(+) растений оказался существенно снижен по сравнению с контрольными

ТБ(-) растениями.

Таблица 5

Накопление ВТМ в инокулированных молодых листьях трансгенных pací табака, продуцирующих 32К ТБ ВМК Г)

Трансгенная Накопление ВТМ в иноку лированных листьях

линия (мкг/г сырой.ткани) через 5 дней после заражения

I II. III IV

Tbmv-1 [ВМК ТБ(+)) 1.1 7.0 2.0 1.3

Тк-1 (ТБ(-) ] 82.0 42.0 НТ 62.0

I) - см. примечание к Табл.1.

В отдельных экспериментах исследовалось накопление ВТМ в системно инфицированных листьях ВМК ТБ(+) растений. Для этого инокулировали. 2-3 нижних листа. Неиноку лированные листья тестировали ИФА • спустя 3 недели. Результаты экспериментов, демонстрирующие устойчивость системно инфицированных листьев, представлены в Таблице 6.

Таблица 6

¡копление ВТМ в неинокулированных листьях трансгенных растений табзка, юдуцирувдих 32К ТБ ВМК ^

листа (нуме- Трансгенная линия

эция сверху -

ШЗ) ТЬшу-1 Тк-1

ы 0. .2 1. .5

Ь2 ' 0. .2 1. ,3

ЬЗ 0. .2 1. .5

Ы 0. .2 1. .5

Ь5 0, .2 1, .5

) - см. примечание к Табл.1. Содержание вируса (мкг/г сырой ткан пределяли через 3 недели после заражения.

Протопласты, выделенные из ТБ(-) и ВМК ТБ(+) растений, были юсприимчивы к ВТМ в одинаковой степени: уровень накопления вируса 1 них составлял 89нг и 60 нг на Ю5 клеток, соответственно. Это :видетельствует о том, что обнаруженная устойчивость (Таблицы 1,5,6) обусловлена блокированием транспорта, а не снижением уровня репликации в клетках ВМК ТБ(+) растений.

Таким образом, впервые продемонстрирована возможность индукции противовирусной устойчивости трансгенных растений за счет экспрессии в них генов дефектных транспортных белков. Хотя механизм зшгибирования в случае эндогенного ТБ ВМК, остается неясным, можно предположить, что в растениях табака ТБ ВМК, также как и ТБ N12519, оказывается способным связываться с хозяйскими

факторами плазмодесм, но не может модифицировать их для траспорта вирусов. При заражении трансгенных растений клеточные факторы , необходимые для экспрессии транспортной функции, окажутся заблокированными дефектным ТБ и тем самым недоступными для взаимодействия с активными (функциональными) ТБ инфицирующего вируса, в результате чего транспортная функция не сможет быть выполнена. Такие растения будут обладать противовирусной устойчивостью.

ВЫВОДЫ

1. Получены трансгенные растения N.tabacum cv. Samsun, содержащие гены дефектных ТБ:. I) температурочувствительного (ts) ЗОК ТБ мутанта ВТМ - Ы12519; 2) нефункционального в растениях табака 32К ТБ ВМК.

2. Продукция дефектных ТБ в полученных растениях подтверждена методом иммуноблот-анализа. Установлено, что ts30K ТБ ш.2519 и 32К ТБ ВМК локализуются во фракции' клеточных стенок и мембранной фракции полученных трансгенных растений, как при пермиссивной (24°С), так и при непермиссивной температуре (33°С).

3. Показано, что растения табака, продуцирующие ts ТБ приобретают определенный уровень устойчивости к вирусу дикого типа (си штамму ВТМ) _ при непермиссивной температуре (33°С). При переносе этих растений на пермиссивную температуру (24°С) восприимчивость к вирусной инфекции восстанавливается.

4. Показано, что эндогенный 32К ТБ ВМК индуцирует в трансгенных растениях табака устойчивость к инфекции ВТМ.

5. Протопласты, изолированные из трансгенных растений,

экспрессируадих как ts30K ТБ N12519, так и 32К ТБ ВМК, не обладали устойчивостью к ВТМ. Это обстоятельство свидетельствует о'том, что устойчивость полученных трансгенных растений обусловлена подавлением функции транспорта, а не репликации вируса.

гттмгпу "^■'"^Т'Л'П"" ПС

1. S.I.Malyshcnko, О.A.Kondakova, Ju.V.Nazarova, I.B.Kaplan, М.Е. Taliansky and J.G.Atabekov. (1993). Reduction of tobacco mosaic virus accumulation in transgenic plants producing non-functional viral transport proteins. Journal of General Virology, 74, p. 1149-1156.

2. С.И.Малышенко, О.А.Кондакова, Ю.В.Назарова, Г.В.Рассадина, Л.В.Крашенинникова, Л.М.Хромова, М.Э.Тальянский, И.Г.Атабеков. (1993). Антивирусная устойчивость трансгенных растений, продуцирующих "дефектные" транспортные белки вирусов. Доклады АН, том 328, N4, стр.517-519.

3. И.Г.Атабеков, М.Э.Тальянский, С.И.Малышенко, О.А.Кондакова, Ю.В.Назарова. Вирусспецифическая транспортная функция и конструирование устойчивых к вирусам трансгенных растений. Теэисн il Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений** г.Пущино, 1993, стр.6.

4. J.Atabekov, M.Taliansky, S.Malyshenko, O.Kondakova, Yu.Nazarova

Reduction of TMV accumulation in transgenic plants producing nonfunctional viral transport proteins. Abstracts of IX International Congress of Virology, Glasgow, 1993, p.336. 5.1 Taliansky M.E. , Maiyshenko S.X., Kondakova O.A., Nazarova YU.V., Kaplan 1.В., Nazarova J.N. and Atabekov J.a. Induction of antiviral resistance in plants by transformation with viral movement protein gene sequences. Proceedings of 10th Anniversary Symposium of the - • 25

Otto Warburg Center for Agricultural Biotechnology "Molecul Biology in Plant Breeding: , Theoretioal, Praotioal and lef Aspects", Rehovot, 1994, p.31.

Подписано в печать <6- <2.94 формат 60*84/16 Заказ 163

Усл.йеч.л. /, Тираж Н5

Типография Россельхозакадемии 115598, Москва, ул. Ягодная, 12.