Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание трансгенных растений Nicotiana Tabacum и Solanum Tuberosum, устойчивых к гербициду фосфиногрипину

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание трансгенных растений Nicotiana Tabacum и Solanum Tuberosum, устойчивых к гербициду фосфиногрипину"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ км.ВА-ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577.21

Падепшас Линае СтанкслоЕогкч

СОЗДАНИЕ ТРЛНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ №СО"ПЛЖ ТАВАСиМ и БЫАЖПЛ ТШЕЯОЗиМ, УСТОЙЧИВЫХ К ГЕРБИЦИДУ ФОСФЙНОГРИДИНУ

03.00.03 - Молекулярная бпопошя

Автореферат йгсгерЕггяп ка соксхшгве учено« стелена кадвдаага пмотесклх :;г/к

Ыоскм 1593

Работе выполнена а лаборатории генетической шггенерни растений Института малосулярной биологии им.ВАЗигсяыардгг РАН и лаОорагорни генетической инженерии Центра "Бионнжекерля" РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор бпойопкесок наук, профессор

член-корр. РАСХН КГ.Скряби*.

кандидат хликческих наук 0-А.Шульгг

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОШОНЕНШ:

доктор Сяаюгачсских наук, профессор Ю.В.Козлов

доктор СЕМогячесхЕЗ ваух, профессор Э.СЛарузля

ВВДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Биологический фахунтег

Московского государственного университета км.М.Е Ломоносова

Защита состсгпся г. ^ часов на заселанж

специализированного coserá Д.002.79.01 при Институте мшекуляркой биологии нм-БЛЭигсльгардта РАН по адресу. 1179S4, Москва, уд.Вавилога, д.32

С дгеиртапвей ыохно ознакомится ' в бналяотеке Института молс:суляркой биологии км.В-А.Знгельгардта РАН.

Автореферат разослан "¿2- <■-

• Ученый секретарь специализированного совета хандндат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. Химические методы борьбы с сорняками являются составной частью современной агропромышленное™. Подсчитано, что наличие сорняков уменьшает урожайность по меньшей мере на 12%. В настоящее Еремя в мире используют более 100 фжготоксических материалов в зиле коммерческих гербицидов. Только в США на эти пелн ежегодно тратят пять мнллиардоз долларов.

Однахо, существуют экологические проблемы, тесно с вязаные с использованием гербшшцов. Большинство гербшшдов, используемых в сельском хозяйстве в качестве средств защита растений - хлор-, ртуть- и мшпьяксодсрхащке соединения, получаемые с помощью химического синтеза. Tsiae согдгиекия, как прзвшга, с трудом рззлагаются после применения в сагьском хозяйстве, накапливаются в почве и растениях, что вызывает серьезные каругоенм экологической с5станогК2. В связи с этим возросла необходимость использования в качестве гербияадов таких соединений, которые после оказания воздействия исчезают га окружающей среда. Наиболее эффективно биодгградаюш подзгрггкзгея гербвшкн» являющееся шгпабкоттамк.

Другая .проблема, связанная с ж« пользованием гербицидов - это ограниченная селективность гербидидаого дгйсгвня или, вообще, отсутствие селективности. Гсрбютды, в оснозвом, воздействуют на процессы, которые являются уникальными для растений, например, ка путл фотосинтеза или на пути бпоезнгеза незаменимых ашаюкислот. Tax как эти пропесси часто совпадают у культурных растений и сорняков, то шгогке гербициды являются неселекшвкыми.

Поскольку некоторые растяшя обладают прсродаой устойчивостью х гербвНАШг, то в результате скрмщграюпя н сеяекпин это свойство мозгет быть перекесеыко в родегкякне растенья. Так, путем скрешязания культурных видов Srassic?. с дажимн были нолучг.чы культурные растенкя, устойчивые к трЕззкку. Аналогичным способом была, получека соя, устойчивая к метрзбузкну. Но сгрысивашю поддаются только блкзко родственные растения, а для игсколиозск гербжепузг вообще неебкорузекио природной устойчивости в рггтепиях, поэтому приходится применять носы; подходы.

Изучение пркх-дней устойчнзоста, прогресс, достхпгнугый в понимании метшзноз воздействия гербищшоа и метода генной ияжешрвз ргстеилй открыли новые возможности для создания растений, устойчивых к гербицидам. В настоящее время существуют две наиболее раслострапскггь'е страггтш ссзлгичя тррксгекнкх ргстеякй, устойчивпх к гербгшидам. Одна из

них предусматрикает создание растений, которые будут синтезировать ингнбнруеный бедок в очень больших количествах, г поэтому определенное количество гербяпвда не сможет его ингибнровать. Иди же можно эхспрессироватъ * растениях мугакгнкй гея фермента, который не будет взаимодействовать с гербицвдон. Другой подход заключается в переносе в растения чужеровяого гею, продукт которого разлагает гербшшд иди модифицирует сто s неактазную фориу.

Оба упошиушх подхода были с успехом использованы для создания трансгенных расташй, устойчивых к различным гербипадам.

О дням из капбояее перспективных гербшидов-антЕблотакэБ тотального действия являются бигясфос. Бвзлофос - этотрЕлапвд действующим началом которого гвляегся L -фскфшотрялли (РРТ). Данный гербнпид примечателен тем, что быстро разлагаете« в почве н растениях, а также не оказывает вредного воздейегшя на животных и людей.

Основной ыяыевь® L-фосфинсяршшна в ргстггельиой клетке является гаугаминсишзза <GS). В ргзуптате ингибированая GS происходит нахогпени; аммиака и пшоюздша, что приводит к подавлению фотосинтеза и гибели растения.

Настоящая работа посвяхзела экспрессии в растениях табака и картофеля гена Ьзг, кодирующего фосфшсггрштЕнацетклтраясфсразу' (PAT). PAT ацетижиругг ïfT в апкпа-РРТ, и таким образом кнахтквирует гербшшд, поскольку гщетил-PFT ие проявляет гербшшдного дейстгия.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в получении п вссаздэванни трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum) SRI а картофвая (Soiaraua tuberosum) среднераннето сорта Прнгожий-2, устойчивых к тербишду РРТ. В задачи исследования входило:

1- ыодийисщая bar гена с пелыо повышения эффективности ннягпяятши трансляции в эукзраогах;

2- созланве кассеты экспрессии в растении, с гетеролопгшым геном;

3- получение на основе решпшентаого ппаима LBA 4404 штамма агробахгерий, несущего созданную кассету экспрессии, для трансформации растений;

4- перенос созданной кассеты и экспрессия уодафицарованого гена Ваг в N.tahanim н S-tuberosnm;

5- исследование устойчивости трансгеннызс растений к обработке РРТ;

6- получение клубней трансгенного картофеля, пригодных для высадки в почву и дальнейшей селехнни.

Научная новизна и практическая ценность. При помоши полимеразион цеплоп реакции GTG кодон инициации трансляции гена Ваг был заменен на ATG. Сконструирована кассета экспрессии в растениях Ьаг-гена под контролем рсгуляториш элементов 35S РНК CaMV: даннгя песета перенесена я штамм Agrobacierium tumcfacierts LBA 4404, используемый -для трансформации растений. Получены трансгенные растения N.tabacum и S.wberosum (сорт Пригожий-2), эхспрессируюшае bar ген. Показано, что эти растения устойчивы к обработке гербицидом РРТ. На траисгеяных растениях N.tabacum продемонстрирована устойчивость првобретекного признака в втором поколении. Получены клубки трансгенных растений S.tuberosum, пригодные для высадки в почву и дальнейшей селскшш. Предложен новый метод выделения генокной ДНК растений пригодной для ППР анализа. На основе ПЦР разработан метод отбора трансгеннда растений, одновременно позволяющий определить возможное заражение, агробаз ериямя. Создана компьютерная программа, облегчающая полбор гтраймеров для П11Р-аналяза растений, регенерированных после трансформации.

Полученные результаты открывают новые возможности для получения фосфинотршпшустойчиБых сортов сельскохозяйственных растений. Созданные рекомбинантные шгазмиды и штаммы переданы в ряд других лабораторий Институтов РАН, где нашли применение в научно-исследовательской и практической работе.

Апробацш: работы. Представленные в диссертации результаты были доложены и сбсуядены на I Всесоюзном симпозиуме "Новпе методы биотехнологии растений" (Пушино, 1991), на II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пушино, 1993). на конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алма-Ата 1993) и на заседаниях коллоквиума лаборатории генетической йнженергн Центра "Биоиккенсрия" и Ученого Сонета КМЕ РАН.

Стртахурз и объем диссертации. Диссертация состоят из введения, обзора литературы, мгтеркзлез и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы. Материал изложен на 93 страницах машкнэписного текста, ыспшает 15 рисунков и библиографический список из 162 нгзкпгай.

Исчользованчме сокращения. РРТ- фосфпнотркшн. РАТ-фосфмнотркпЕияцетйлтргнсфераза, CaMV- вирус мозайкл цветной капусты, ПДР- полкмергзная ие.чягя реакция, GS- глугамш;си:ггстаза, NAA-нафгатуксуаггя хислота, ВАР- б-бензиламинонурин. NPT-неомищшфосфстрапсфграза.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

К моменту начала данной работы в НИИ генетики и сеяоксии промышленных иззсроорпанкзмог был получен стрепгомипетный клок BapR S.Iividans ТК64, уттойчизый к биалофосу. Устойчивость к гербициду была опосредована ллазиидой pVGB6, несущей встаьку геномной ДНК ш штамма Slrepiomyces hygnxcopicus АТСС 21705.

Исходя из рестрнхпкоикой карты клонированного фрагмента и ранге опубласованих литературных дакых (Murakami et al, 1986). г.хторы предположили, что клонирований юш фрагмент содержит ген фосфинсгфшпшаиггшпраксферазы (bar), определяющий усгойчивосп. гербкведу Скалофссу (Сезонов и соазт.. 1990).

Испш^огакая в данной работе пяазмица pVGB6 (ркс.1) была лг>5оз;;о предоставлена ГЛ.Сезонзвым.

Моднфикадая последовательности Ъаг гена.

Природный bar ген, выделенный из Streptomyces hygroscopicus, содержит GTG шлщиируюаий кодой (Thompson et al, 1987). Однако этот кодон малопригоден дня экспрессии гена в растениях. Гордоном и соавг. было показано, что даже находясь в игабалее благоприятном окружения (контексте) GTG яшщияруюиий кодой на SO-85% менее эффективен, чем ATG (Gordon et al, 1992). На нецелесообразность использования этого кодона в растениях указывает тот факт, что до сих пор не обнаружено ни одного природного растительного гена, инициация трансляции которого начиналась бы не с ATG кодона. Поэтому было решено GTG инишшруюшнй кодон заменить на ATG при помощи ПЦР.

Pst I Bind III

Pst ]/ Bgl li

Рис.1. Ресгрнкшюняая крта плазшды pVGBo.

Для того, чтобы облегчить манкпуляики с bar геном, Hiud III фрагмент, содержащий выше упомянутый ген, был клонирован в pUC19 вектор, обработаны!! энлонуклеазой рестрикции Hind III. Полученная таким сСразом pUCBar конструкция бша использована как матрица для ПЦР, а также для получения радиоактивно-меченых зондов.

На фирме "Feraentas" Литовская Республика были синтезированы олипшухлеоташ, комплементарные 5' и 3" концам bar гена. Оллгонуклеотшга отличалась от оригинальной последовательности единичными заменами и имели дополшггельные последовательности для эвдонухлезз рестрикции ВатН I к Sic I (Hell36 II) (рис.2).

Вага HI

I i

5' GGG.'iTCC aTGAGCCCAGAACGACG 3' (Прайнер 1)->

5'......GTGAGCCCAGAACGACG.............

I-po—

Нач?ло гена

Sac I

I-1

-5-3' GCAGTGGCICTAGATCTCGAGG 5' (Праймер 2)

......CGTCACCGAGATCTGA.....3'

I_I

Стоп кодон

Рнс.2. Последовательности прайыеров и фрагменты последовательности гена фосфснотршшнадестпрансфгразы, комгаемопгркыг прайлерам. Единичные, замены Еьаелега подчиркиугыи шрифтом.

ПЦР проводили в течение 30 шпелов (1.2 иен. при 95°С денатурация, 1.8 хан. при 40°С отзиг, 2.5 )яш. при 72°С синтез з 3 USH. при 65°С достраивание после тргащггого пзпета), ислолхлуя 1нг да»ричной ДНК (pUCBsr) и 4ед. T.'.q гешажразы фирмы "Amersharn" ш 100 шел реакционной ¿icecj. После згхершенм ПЦР S глш рггхпионкой сисси разделали в 2% аггрогном геле электрофорезом. Длана полученного ПНР фрагмента ссотпетсгвоюла о.-гидаемой (рис.3).

КзунОотйнний фрашеят ДНК был вкдеяен ю агпрозното геля а обработан экдонуклатзгии рестрикции Bam HI к Sac I. Однако, попытки ¡атонлро&ать этот фрагмент по лихккм концам была неукзчнъши. По-видимому, для эффективной рестрикция кеоЗхслжо, чтобы места уздавгдия рестргсстазаш* на^огаопюь бы подальше от концов фрагмента (New England Biolabs cat., I9?l). i7o3ic?rv когая пергпи ДНК была достроена фрагментом

Клснова ДНК-полймеразы I. обработана полинухлесггядхиназой и клонирована в дефосфоридированный Mi3nipl0 вектор в Sma 1 сайг.

1 2 3

Рлс.З. Аиалвз продухгов ПЦР. 1 - ДНК фага 1, обработанная зндонуклеазой рктрикаки Pstl, 2 - ДНК pUClJ, обработанная эндонухлеазой рестрихпии ivfepl, 3 - продукты ПЦР. Стрелка ухазывает на продукт охвдаемой длены.

¿Г

> *

Al'f ■ t.fmm

CP

I ¿¿а 1___ --

АССТ

cSf

!

<3<

^ 32

лР

сС

сГ

_____

A G С Т

Рис.4. Фрагменты сехвенируюшего геля с последовательностями 5' и 3' концов иодифшщкжшиого bar гена. Мутации в гене отмечены звездочками, а дополнительные последовательности для растепления эндонукл сазами рестрикции выделены подчеркнушл шрифтом.

Рекомбинантные клоны были отобраны по сгшс-всдому (р-гаюкозндаэному) теспу. Клоны с разной ориентацией сегмента бьт< установлены С-тестом.

Из двух клонов ÎMlîBarl и М13Ваг2). имеющих разку» оримггатпо фрагмента, была вьшмгна одноцепочечная фиговая ДНК и секвенировзна по истоду Сенгера. Тг.гаш образом, удалось прочитать примерно по 200 нуклеотшюв с каждого конца гена. Оказалось, что всс ояндаешле х<угапни произошли успешно (рпс.4), а последовательность остальной области гена сов1!адает с ране* описанной (Tompson et al, 1987).

Клонирование bar гена в вектор для трансформации растений.

Чтобы экспрессировать гетеродогичные гены в растениях, прежде всего необходимо помгет.ггь их под контроль растительных регулятор ных элементов, эффективно работзюпзш' в растениях.

Известно, что промотор 35S РНК вируса мозтнки пьегшой капусты ядляегся едннм ю езких сильных среди выделенных ка сегодняшний день растнкльнкх промоторов (Sanders et al, 1987; Lawtoa et al, 1987), поэтому было решено получить кассету экспрессии на основе регуяяторных элементов 35S РНК вг?руса мозаики даетной капуста. Для этого i: плазкице рВН21 (Jefierscm et al, 1987) ген GUS был заменен ка ген tar.

С этой целью плазмиду рС1121 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Ваш}! I н 2с1136 1 (тсонпионср Sdc I). В очищенный с помощью электрофореза вектор клонировали фрашент, полученный в результате обработки д1отаепочеч7юй фаговой ДНК М13Ваг1 энаонустеазамт: pecipрсопш BamH I а Ес113б I.

ДНК яз даз?: гаюнез, содерзншах ДЬЖ вегаьку, подвергались рестриюгкснному анализу путем обработки зето1"7Клеазами рестрикции BamH I к ЕсИЗб I. Оказалось, что только один из двух клонов даст фрггиент ожидаемой (55S и.п.) дяккьг после обработки млпеуномянугьыи зняочуклеалами рестркзыи. Этой йлазяаде было присвоено название рВШаг (ряс.5).

С

pBIBar

Рис.5. Кассета экспрессии bar гена в плаз ляде рВ13гг

s

Для получения контрольной конструкции pBIK. концы вектора были достроены фрагментом Кленом а сшита при помощи ДНК-лигазы.

Плазмиаы pBIBar и pBIK, содержащиеся и E.coIi НВ101, с ломоишс плазмиаы-помошника pRK2103: содеряащейся в E.coü МС1022, переносили в Agrobacteritiat mncfociens LBA4404 лутеи трсхродигельской коньюгашж штаммов (Hoekeica ei al, 1983). После двух пассажей на минимальной АВ-среде, содержащей 100 мг/л Km и 25 мг/л RiT, из агробахтеряй выделяли плазм иду, обрабатывали эвдонукл сазами рестрикции BamH I и £cil36 I и провозили анализ во методу Саузерна.

Таким образом, были получены штаммы агробакгерий LBA4404. содерхашие конструкции pBIBar и pBIK, которые в дальнейшем использовали для трансформации растений.

Экспрессия bar гена в растениях Nicotiana tabacuia и Solanum tuberosum.

Доя переноса tar гена в растения табака бнл есполъзоеан метод трансформации дпсговых дисков с помощью Agrobacteiium tutaefacicns -наибатее часто не пользуемый метод трансформации двудольных растений (Horsh et al, 1985).

Из листьев асептически выращиваемых растений Nicotiana isbacum cv Petit Havana SRI нарезали диски диаметром 0.5 сы и инкубяроьаяк их в MS-срсде, содержащей ночную культуру соответствующих штаммов A-tuaxfacjeis, разбавленную в 10 раз. в течение 10-20 минут. Затем диски перекосили ка MS-среду, содерхаиую 0.1 мг/л NAA. 1 ш/л ВАР, О.Хй ггара, 3% сахарозы и инкубировали в течение двух дней при 24°С при рассеяном дневном свете. При этом вокруг дисков иногда наблюдали образование "гэлло". Затем диски переносили на MS-среду для каллусообразования, содержащую 2% глюкозы. 500 мг/л нефотаксима и 100 мг/л канакнпнаа, через 3-4 недели вокруг дисхоз образовалась каллус пая ткакь, из которой в некоторых местах образовалась побега, в среди;», 2-3 побега на диск. Кота побеги выросли до 0.5-1 см, их срезали и передаете на безпзрмокатшую среду, содержащую 3% евхгрозы, 0.8% агара, 200 кг/л пефатоксяма и 50 мг/л канамшшна, для укоренения. В среднем процесс регенерации длился 10-12 недель.

Для переноса Ъат гена в растения картофеля (Solanum tuberosum сорт Пригожий-2) проводили трансформацию сегментов стебля агробактериаш (Newell et al, 1S91). Попытки трансформации листоьых дисков этою сорта картофеля методом описании ДеБлоком (De Block, 1988), оказались неудачными.

Из асептичесхм выращиваемых растений картофеля нарезали сегмеяпы стебля. Конды сегменгоз стебля зарахали трехдневной культурой

агроОактерий. выращенной на чашке, переносили на среду кокулктивврования с "кормящим слоем" и два дня инкубировали при 23°С. После кокультивирогания зксгиакш переносили на среду для каллусообразования PI, содержащую 100 мг/л каязмщщна. 500 мг/л кгрбеншшлнна и 100 т/л цефотаксима. Спустя месяц на концах сегментов стебля образовалось небольшое количество каллуса. Далее экеплангы ежемесячно пассировали ни среде для побегообразования Р2, содержащей прежнее количество антибиотиков. Побеги, достигшие 0.5-1 с» длины, срезали н переносили для ухоргнения на среду S1, не содехзщум гормонов к антибиотиков. Укоренение на среде с канэмгаишом происходило очень медленно. В среднем пропесс регенерации длился 5-8 месяцев.

На первом этапе анализа регеиергнты растений N.tabacum и S.tuberosuin, полученные после трансформации, тестврсталвгь при помошп П11Р. Однако применение ПЦ? для тестирования трансгежшх расгсяхй езязако с некоторыми трудностями. Одиа ез них состоит в тем, что зкепяанты растений после трансформации иогут оставаться зараженными агробзктершаш з теченье более чем двух месякз, несмотря на езенедгльное пассярорзнке на свегзя средах с пефотгхеимом (Ревеггкова и созвт., 1990). Таким образом, регенераяты. зарязенные агробаетерияки, могут давать лозгные подохптеяьйые сигналы при тестированта с пешшь.ю ГЩР. Другая трудность состоит в том, что нужно получать растительную геномную ДНК определенного качества. Показано, чего эффекпгшоегь амвтфнхапки р?ствтельной гекомной ДНК впрямую связана со степенью ее отчистки (Hamili et а], 1991; Beithonueu as) Meyer, 1991). Этт: обстоятельств привели иас к разработке собствегткого метода.

Вегстор рВ!К'19 (и его проязждаое рВ1321) содердзгг пени неонЕпкнфссфотрзнсферазы нз тралепозока INS (Beck et я1, 1982) (растетелькпй селк,тягн11й мархер) и из Stieptococcus (Trien-Cout and CouiA'rHin, 1983) (базстеркальнкй селективный мярклр). Таким образом, пажчис обоях геггов в растении будет укязызагь на заражение агроЗактеррчми. А присугстгше только растительного смекгнЕИого каркера свидетельствует! о том, что растеияе трзлегенкое, так как бгкгеряальнчй ослехппшпй шркет не входа в Т-сбласть :: не переносится в гексм растений прп тралсфармяпЕП. Поскольку выше упоулнутне reim не облгдют заметной гомологией (Trien-Cout and CcurvaUin, 1323), то еозу.сжно проведение двух ПЦР л одисЯ реакЕкскной смсгк г;з сотом образце ДНК г, в одияаховых условиях Таете.; образом, исиготаются ошибки, свя?чнме с загрязнением едггого нз двух оОрззиоъ, и ошибки, сзаклгные с рачпмк обогревом различных

лунок термоцихлера. Кроме того, вдвое уменьшается потребление всех компонентов реакционной смеси, за исключением праймеров.

Ваше изложенный подход позволяет провести первичный схринюгг регенерантов. полученных после трансформапии агробахтериямп, несущими бинарную систему на сснозе вектора рВШ19 (Веуаг, 39X4), к определить возможное заражение агробзиер шшя.

Суть предлагаемого метода состоит ь использовании двух пар прэймеро» в огней реакзщонкой смеси. Одна пара лраймероз (¿"N5-1 я 1Ы5-2) определяет синтез фрагмента ллжой 173 п.н. гею неомишшфосфотрансфграды II (МРП1) из транешзона ТМ5, г вторая агра (БТ! и 5Т2) - синтез фрагмента длиной 3^0 п.н. гена МР'ПИ ю 51герГососсш (ркс.6). Поскольку ген КРТТ1 из транснсзона ТМ5 является растительным селекшшгьш маркгрои, а ген ГчТТШ аз 5ггер(ососск - сака;рнальныи селекшвкш! маркером в конструкциях на основ: зектора рВ1К19, то синтез фрагмента длиной 173 пл. сзвдст&тьствует о том, что даккое растение тралегекное. Синтез осгопрсыенко деу4: фрагментов (173 к 340 п.н.) указывает на заражение агробгкгериякн.

Ц73Д.И.1

А

ИЦР

рВ1 Ват

врГПГ

ПЦР

Г340ад. I

Рис.б. Схема, похазывающая возможность синтеза фрагментов ДНК разной длины при ГЩР-гналкзе растений, регенерированных после трансформация.

М 1 234567+-

М 8 9 10 11 12 13 14 15 - + М

Рис.7. Результаты ПЦР анализа растений табака, регенерированных после тр?л!сформашга агробактеркями. М - риС19/М^р I ; "т" - продукты амплифихапии 1 кг плазшщы рВ1121; "-" - продукты амшификашш гено;.сгой ДНК нетрансформированного растения; 1-15. - продукты амплификации геномной ДНК тестируемых растений.

Результаты тестирования 15 растений табаха, которые были регенерированы после трансформации агробакгериямн, лредставдены на рис.7.

Исходя из выше описанного, мояю заключить, что растение под номером 5 - нетраисгенное, растения 13 и 15 заражены агробахтериями, а все остальные растения - трансгенкые.

Относительно четкие полосы на геле опосредованы методом выделения растительной геномной ДНК. Используя ранее описанные методы выделения

растительной ДНК {Edwards el al, 1991; Deilapom ei al, 19S3), мы чаще всего сталкивались с низкой эффективностью ПЦР и трудностями, связанными с идентификацией полос на геле. Кроме того, эффективность ГШР была различной дня ДКК одного растения, подученной в разных опытах. Растительная ДНК, выделенная разработанным нами методом, ашсгафицирсвалась хорошо, и получаемые результаты были стабильны.

По-зидимому, высэкая эффективность ПНР была обусловлена тем, что буфер для экстракции ДНК не содержал ионного детергента SDS, потенциального ингибитора Taq-ncma;epa3bi (Weyarn et al, 1990). Также вероятно, что используемый вместо него нсаонный детергент Triton Х-100, подобно другому кекниому детергенту Tween 20 (Demeke et al, 1992), могхст связывать растительные кислотные полисахариды, которые оказывают сильное ингабирукдаее действие иг Тг^-полцмеразу. Малораствориыый ь этаноле NaCl заменен на хорошо растворимый LiCl (Sainhrook et al, 1989). В ранее опубликованных метода ^ по выделению пяазмидаой ДНК из бактерий (Не et а!, 1990) показано, что ДНК, выделенная с применением LiCl, отличается высоким качеством, пригодна для обработки различными ферментами, чувствительными к загрязнениям, а также дш ППР. Присутствие 4M LiCl в предлагаемом экстракционном буфере поззоляет почти полностью освободиться от высокомолекулярной раститешьцой РНК и связанных с не» белков. Наконец, хелатаруюишй агент EDTA присутствует в огносителию низкой концентрации (ЮмМ), и поэтому не может соосаздаться с ДНК (SambrooJr et al, 19X9).

Для определения оптимальной температуры отжига Ъраймеров , (температуры отжига, при которой получается максимальный выход продукта г ПЦР) был кстлъзоЕан метод, предложенный Rychlik et al, 1990. Рассчитанная таким образом температура отжига для тиры праймеров TN55 и TN52 оказалась 50.3°С, а доя ST1 и ST2 - 52.4°С. Однако для того, чтобы увеличить специфичность ПЦР, Tumiepaiypy отжига пришлось поднять на <°С (до 54°С), что лссколько понизило выход продукта. (Если температуру отжига поднял, до 57°С, то гмшификэшш не происходит).

Быьа подобрана ошимальпач концентрация праймеров (0.48мМ) и Тао -пешшергзы (1ед./25 жл). Уменьшегаг вдвое или более одной из этих хонпентрапай скльнс снижало эффективность ПЦР, а повышениг приводило к гюяглечн'о песпенифгиескнх продуктов.

ДоЗгаленпе исконного дстерге;гта Nenidet NP40 до концентрации 0.5% замелю повышало эффеюизносп, амплификации.

Было устаноатено. что для ^ффестивноП ауплификашда на данном приборе требуется не иенее 36 циклов (0.5 мин. пря 95°С. I мин. при 54°С. 1 мин. при 72°С).

В результате анализа было отобрано 12 тоансгеиных растений табака.

Поскольку ре генерация трансформированного картофеля длится более пяти месяцев, и все это время эхеплаиты находятся на среде с высокими концентрациями юрбенашшна и цефотаксима, то вероятность заражения афобазстеркямн регенерированных растений счень мала. Поэтому ПЦР-аналш этих растений проводился только на присутствие bar гена. Так ках в предыдущем анализе возникли проблемы с синтезом неспепкфичных продуктов ПЦР, то праймеры для определения bar гена подбирались особым способом. Для этого была кепелъзэгана алея к.бл. В.Н.Миронова. Суть этой идеи состоит а следушеи. Последовательность прайкера можно сравнить с произвольно отобранными последовательностями растений, оценивая число совпавших нуклгогечоз з очхзх. Например, если in>r тестируем дзггшатлчленный праймер и в определенном «гсте растительной последозтельности совпадает 12 нуклеогндоз, то для этого siecra гомолопгсность прайиера оценивается з !2 очков. Подсчитав чисто положений, которые соответствуют всем возможным количествам очхов (в нашем примере от 0 до 20), woxho установить, кахое количество очков встречается чаще всего п каково стандартное отклонение. Разделив разницу мехцу ыахеимальныы юшпестзом очков а наиболее часто встречаемым на стандартное отклонение, мы получим величину выраженную числом стандартных отклонений (обозначим ее как- */SD). Чем эта величина будет больше, тем меньше вероятность того, что праймер будет нееяепифично отжигаться, й наоборот. Результаты расчета будут тем точнее, чем больше растительной последовательпоста будет просканировано с данным праймером.

Для решения этой задачи на языке программирования ТшЬо Basic была создана специальная программа.

Данная программа позволяет сканировать набор любых последовательностей, общая длина которых не превышает 100000 п.н. Длина подбираемых прайм еров может колебаться от 3 до 30 нухлеотвяов. Фрагмент последовательности, из которой будут отбираться праймеры для одновременного сканирования, не дадхен превышать 180 п.н. (например, для участка 180 п.н. может существовать 161 двадцатичленяый праймер). Таким образом, используя вьппе описанную программу, было просканировано 99265 п.н. табачных последовательностей с 322 праймерамн для bar гена. Из них была отобрана пара лрэймеров, для которых */SD величина 8.87 и S.9,

w

соответственно. (Дли сравнения можно отметать, что минимальная величина */SD в этом наборе прзймеров бьна на две единицы меньше).

Температура отжига, определяющая максимальную специфичность, была расчитаиа rio методу Wu ex al, 1991 (72°С) ПЦР проводили в течение 36 циклов (1мин при 94°С и 1мин при 70°С). И хотя процентный GC состав и pato еров превышал 50К (70%и 80% соответственно), что в общем случае не рекомендуется (bonis and Gelíand, 1990). никакой неспышфпхи не наблюдалось (рис.8).

Рис.8. Результаты ПНР анализа растений картофеля, регенерированных после трансфорцащш агроСахтераяда. 1,14- pUC19/Msp 1 ; 2-10 - проду>ли амютфнхашш ггкемкой ДНК гесшрувммх растений; 11 - продукты амгиифнхаанд гекомнай ДНК растения, трансформированного контрольной конструкцией рВ1К; 12 - продукт амплификаши геномной ДНК. нетрансформироваяного растения; 13 - продукты амшшфикпшг. 100 гт пзазмида pUCBar.

В результате ПЦР - анализ? било отобрано 3 растения каргофгля: Несушик bar П.Н .

На следующем этапе анализа трангг&киьк растений С>шо проведено определение числа копий bar гена, интегрированных в геном pacrtwii. Для этого суммарную ДНК, выдглекиую из листьев трансгскиых растении тгбгхг и каргофгяя (Deilapoita et al, 1933) обрабатывали эндо!гухдсазой ресгрюятел Есо RI, разгонята в 1% геле и провоктта блсгг-ГЕбридизашяо с фрагментом ДНК bar гена, метеным прь поыошя статистической едпгонуклеоткиной затразхи. Ка;: т. следовало ожидать из ресгрнкяиокноЕ карты лишении.! pBTBar, фрагменты геномной ДНК, ссжрглмкг bar ген, состояли белее чем из 2000 п.н. Результаты этого анализа представлены в таблице 1.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14

Растение Число копий Растение Число копий

bar гена bar гена

ТаЬВаг2 2 TabBarl2 1

ТаЬВаг4 1 TabBarD 1

TabBarí 1 ТаЬВаг24 1

ТаЬВзг7 2 ТаЬВаг26 2

TabBarS 1 П2Ваг2 2

ТгЬЕаг9 1 П2Взг5 1

ТгЬВатЮ ! ТТ2Ваг12 ил.

ТаЬВагП 3

Габл.1. Результаты гнбрадззалноннсго анализа ДНК тргнсгенньк растений

Таким образом, результаты проведенного глалнм позволяют утверлдгть. тго интеграция произошла г 1-3 местах растительной геномной ДНК. Образование гкбрздизующихсг фрагментов различной длкны еше раз подтверждает, что заражение агробактернямл отсутствует.

Однако следует ого2орнп.ся. что дэдньй метод определения числа юггегрнреванных колей не яеляетея абсолютно точным. В случае тандемной шгтеграигя двух копий фрагмезгга, когда правые Т-поэторы будут находиться зшотнузэ по отношению одкн с лр;л'о;.гу, будет выявлено наличие только одной кошт встроигшегося гена. В такой сл¡nzt о наличии двух копий можно судить лишь после проведения колнчествешюгс анализа шггенснвностн полос на радиоавтографе. С датой стороны, тгидемни интегрированные хогаш гена Зудут тссно cDeraemi, и в послелуюшях покслекагх будут наследоваться как одна копия.

Затем изучали эффеххивноегь транскротпки перенесенного гена в трансгенных растениях. При транскрипция интегрированного bar гена должны были образоваться транехршпы длиной примерно 350н., поскольку bar ген состоит из 558 н.п., a терминатор и полз(Л)- последовательность - 300 нухлеотидов. Результаты Нозерн блог анализа представлены на рнс.9 н ряс. 10.

Сразит уровень эксяресин с числом zmrrpxpo вмгакх хопнй bar гена, мозшо сделать вывод, что в большинстве случаев уровень экспрессии зависит от числа юягетрированкых копна гена (см. рис.9 и таб.1). Однако растение ТаЬВаг-12 отличается повышенной эффективностью транскрипции, а растение - П2Ваг-5 пониженной эффективностью транскрипции. В растении ТаЬВаг26 вообще не удалось обнаружить транскриптов bar гена (даже при наличии 2-х копий гена).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

рис.9. Анализ мРНКовых транскрпшсз б трансгеннш; растениях. 20 кхг суммарной РНК из растений табаха: 1- ТаЬВаг2, 2- ТаЬВат4, 3-Та'оВаг5, 4-ТаЬВгх7, 5-ТаЪВаг9, 6-ТаЬВагЮ, 7- ТаЬВагИ, 8-ТаЬВаг2б, 9-ТаЪК, 10- 5Р. 1, 11-3.7 нг риСваг.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

2322. 2027*

564-

рис. 10. Анализ мРККовых транскриигоз в трзнсгскных растен:ж. 20 мхг суммарно* РШС иа растений картофеля и таС-ка: 1- П2Ваг2, 2- П2Ваг5, 3-Л2Вгг12, 4- Ириго2Шй2, 5- ТаЬВагУ, 6- ТаЬВы12, 7-ТаЪВаг24, 8- ТаЪК, 9- БЯ 1, 10- 37С пг рЬ'СВзх, 11 - 3.7 иг рЦСБаг.

Возможно, что повышенная эффективность транскрипции обусловлена интеграцией кассеты экспрессии с bar геном в активно транскрибируемые лохусы генома растений. По-глшсиому, более слабая транскрипция иля отсугстчие транскрипция обусловлены метилированием. поскольку bar ген представляет GC (68%) обогащенную последовательность, содержащую много сайтсЕ лотгышально способ/гых мегплнромться.

Обработка т^ансгъикш" растений фссфиногржшиом и исследование второго похолениг-

Траксгенкые растаггя табака я картофеля были расчеренкованы и после уксренендя на аггрнзованной среде псренессны в грунт. Одновременно в грунт были перенесены контрольные иегрансгенные растения табака и хартофеяя. После 3-:ч месячного вырашиганяя в тепличных условиях растения табака бияи обработаны (опрысханы со всех четырех сгороя) 0.5% раствором Ьч^сфинотршш-на. а растеши картофеля - 1% растасроы коммерческого гербицила Basta (Basts содержит 20% сУ-фосфикотркоша).

Рис.И. Трансгешые растения табаха, устойчивые к гербициду фосфннотридЕНу. Стева - контрольное нетраксгенное растение, а справа -трансгенные растения. Сшагок сделан спустя 10 дней посте обработки трансгенных и кегрансгеяных растений табака 0.5% раствором фосфинотршшяа.

Рис.12. Грансгенные растения картофеля, устойчивые к гербициду фосфанотрипину. Слей - контрольные нетрансгешшс растения, а справа -трансгенные растения. Снимок сделан спустя 10 дней после обработки трансгенных и нетравсгенных растений та&иса раствором коммерческого гербипааа Basra.

Спустя 10 дней после обработки лербшщдом контрольные растения погибли. Все трансгенные растения, в которых были обнаружении гран скрштги bar гека, были устойчивы к такой обработке, независимо от числа копий bar гена и эффективности его трансхршисж (рис.11, рзс.12).

Подвергавшиеся терЗтшшой обработке траисгенные растения табака нормально шели и образовала семена. а трансгенкые растгнся картофеля -клубни. Клубни трансгекаого обработанного РРТ картофеля ке отличались по .величине и количеству ог клубне!! контрольных растений, которые не подвергались гербшшшой обработке.

Совместно с ЛИИ фитолатолопш (группа Джавахки ц.г.) были проведены преяпол&зые испытания траксгекного картофеля в кгмгргх искуственного климата. Было показано, что тргисгскные растеши устойчигы к герОинкшзЬ обработке до:ой 100 г(а.и.)/га.

Траясгениые растения табака TabBar4, TabBarS, Та'оВаг9, ТаЬВаг13 были исследованы на предмет наследования привнесенного признака в первом поколения. Для этого семена трансгенного табака, полученные б результате самоопыления, высевали на агарязовалную MS среду, содержащую \% сахарозы, 0.7% агара и 100 иг/я канамкшша. Спустя один месяц появилось различи« между устойчивыми и неустойчивыми к к2на»пшику растениями. Неустойчивые к ханаынцану растения были бледно-зелеными и имели всего по два листа. Результаты данного исследовали* 1тривгдены в таблице 2.

Растение Число Число Число а2 Вероят-

копий bar нгустой- устойчи- для соот- ность вы-

гена ЧНБЫХ к вых X Km ношения полнения

Km растений (3:1) (3:1 )

растений

ТаЬВаг-4 1 93 284 0.17469 0,6-0,7

ТгЬВаг-5 I 104 296 0.21333 0,6-0,7

ТгЬВаг-9 1 83 270 0.00335 >0,95

ТаЪВаг-13 1 88 260 0.00153 >0,95

Табл.2. Результаты анализа па устойчивость к канамшгону перюго походення трахсгеиках растений табака.

Статистический анализ Б! поколения лохазал, что привнесенный Еризнах наследуется согласно заходам Менделя.

Таким образом, были получены трансгекиые растеши табаха а картофеля, устойчивые х фосфинопришшу, хоторые могут быть использованы гш дальнейших полезкх испытаний и селекции.

ВЫВОДЫ

1. На основе бинарного вектора создана конструкция, несущая модифицированный bar гек под контролем 35S промотора и терминатора CaMV.

2. Полученная конструкция перенесена в агробакгерии, которые могут быть использованы для трансформации растений.

3. С помощью агрсбгисгерий (п.З) получены трансгенные растения N.îabacum cv Petit Нггапа SRI и S.tvberosuia - сорт ПрЕгссгий-2, экспрессирующие bar ген. Показано, что эти растения обладают устойчивостью к обработке 1% раствором Basta юга 0.553 ргстзсром L-фосфиштрпдана.

4. В результате вредполевых испытаний показано, что при ргэм^охгнзп трансгенных растений картофеля клубиямн призах устойчивости к L-фосфиногришну не теряется.

5. Усгановденно, что клубни трансгенного картофеля, подвергавшегося гербнцвдной обработке, фототипически не отличаются от клубней неграниенного картофеля, необработанного гербштгдом. Подгучейнке клубни трансгсняого хартофеяя »гагуг быть ислопьзовяян дп; дальнейших полевых испытаний и селекции.

6. Разработан кетод выделения из растений геномной ДНК, приголяой для ПНР анальза.

7. Создана компьютерная программа., позволяющая годсбрзть кякболее спенафнчные праймеры дм ПЦР-анаянза растений, регснерцрогаа-чых после трансформации.

8. На основе ПЦР разработан метод отбора траисгашых ргстскнй, позволяющий одновременно определить eoxíozhoí заражение агробгкгериями.

Результаты диссертация изложены в следующих статьях и докладах:

1. Пэдегахас Л, Шульпа О Л., Скрябин К.Г. -Получение траксгснкых растсшгЯ, устойчивых х гербшшду фосфшкгсршшпу - Тез. дохл. I Всесоюзного сн>шозиу>лг "Новые метогн биотехнологии растай", Пушило, 1991, с. 34.

2. Пздептмгс JL, Шульга О А., Скрябин К.Г. -Исследование трансгешгых раст-яшй, экспрессггрующнх ген фосфшотрппинаиспиггрансферазы из S.kygnscopicus - Тез. дохл. II Российского симпозиума "Новыг методы бяотехиелогзи рястекий", Пуаянс, 1993, с. 38.

3. Псдгпшг.с Д., Шуяьга ОА, Скр.т&та Х.Г. -Прнзках устойчивости х фосфязотришгау как средство сггахпгвного отбора траясгенных растений в полевых уиокки- Тез. докл. ксяфгрмщал "Бзшотия культашцругьш!: клеток ргсгсянЗ н баотехнолотЕя", Алка-Атг, 1993, с. IIS.

4. Падегаыгс Л, Шулыа ОЛ., Сюрлбнн К.Г. Тестнроваяйг траястектптх рсстен^й , прл помощи полгмеразнс.8 ценной реакции. -Молекулярная биология, 1993, т. 27, с. 947-951.

5. Пгдегпыгс TL, Шушта O.A., Скрябин К.Г. Создание ттаксгенных растений Nicctiasa tabacum и Solanum tuberosum, устойчивых к герб ¡жиду фосфинотряшму. -Мсхгхуяярна.? биология, 1993, (в петятн).