Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая инженерия коммерческих сортов картофеля

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая инженерия коммерческих сортов картофеля"

¿КЗ %ЭН€

На правах рукописи

СТАРОДУБЦЕВА Анастасия Михайловна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ КОММЕРЧЕСКИХ СОРТОВ КАРТОФЕЛЯ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2002

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии Центра «Биоинженерия» РАН

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор,

академик РАСХН

Скрябин Константин Георгиевич

Официальные оппонен- Доктор биологических наук, профессор, ты: академик РАН

Атабеков Иосиф Григорьевич Кандидат сельскохозяйственных наук Долгов Сергей Владимирович Ведущая организация: Институт Общей Генетнки РАН

Защита состоится 2002 г. в /У часов на заседании

диссертационного совета Д.220.043.10 в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49 Ученый совет МСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА Авторефера- разосл. : . г.

Ученый секретарь

диссертации овега,

кандидат 6„ол: • • ?ских наук

Г.И. Карлов

1. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность проблемы

Картофель, обладая ценными питательными свойствами, высокой продуктивностью и относительной простотой возделывания, является одной из наиболее важных агрономических культур в мире.

Россия потребляет 35 млн. тонн картофеля ежегодно и постоянно увеличивает его потребление на душу населения. Эта культура для России, несомненно, обеспечивает пищевую безопасность страны. Однако по ряду причин урожайность картофеля в России остается низкой и производители сталкиваются с проблемой защиты культуры от болезней, вредителей и сорняков (табл. 1). При существующем уровне развития картофелеводства потенциальные потери урожая оцениваются экспертами РАСХН в 4,1 млн. тонн картофеля на сумму 19,4 млрд. руб. Табл. 1.Потери урожая картофеля от воздействия различных неблагоприятных факторов

Факторы Потери, тыс. тонн % от валового урожая

Сорняки 600 2

Вредители 5400 18

Болезни 4800 16

Приведенные данные отражают ситуацию у государственных производителей. Однако, более 90% ежегодного производства картофеля сосредоточено в фермерских и в большинстве личных подсобных хозяйствах России, по различным оценкам, потери в частном секторе составляют до 70% возможного урожая.

В настоящее время для улучшения коммерческих сортов картофеля в мире широко используются методы работы с культурой in vitro, включающие соматическую гибридизацию, мутагенез и генетическую трансформацию. Созданные в последнее время методы генной инженерии открыли новые возможности для защиты растений. Разумное сочетание современных технологий и новейших биотехнологических методов способно значительно сократить потери урожая и повысить качество получаемой продукции.

В связи с народно-хозяйственной ценностью картофеля разработка подходов оптимизации системы трансформации посредством Agrobacterium tumefaciens с целью создания новых улучшенных коммерческих сортов картофеля представляет собой актуальную проблему.

ЦЕН Т РА ЛЬНАЛ-f

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. сольокочоз академии . им. К. А Тимирязева . _

Инг,.

1.2. Цели работы:

- разработать эффективные протоколы трансформации для следующих коммерческих сортов картофеля: Луговской, Невский, Голубизна и Чародей;

- получить трансгенные линии на основе сортов картофеля Невский, Луговской, Голубизна и Чародей, экспрессирующие ген устойчивости к гербициду фосфинотрицину Ваг,

- получить трансгенные линии на основе сортов картофеля Луговской, Невский, Голубизна и Чародей, экспрессирующие ген Таи //;

- провести первичный молекулярно биологический анализ полученных трансгенных линий картофеля сортов Луговской, Невский, Голубизна и Чародей;

- провести полевые испытания полученных трансгенных линий картофеля.

1.3. Научная новизна

Первые работы по трансформации картофеля были начаты в семидесятых годах. Возможность получения трансгенного картофеля методом бактериальной трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens впервые была показана в 1986 году [Ал G., Watson B.D., Chiang С.С. Plant Physiology, 1986, v. 81, p. 301-305] и в нашей лаборатории в 1990 - 1992г.г. [Глагоцкая Т.Д., Шульга O.A., Сидоров В.А., За-харьев В.М., Скрябин К.Г., Глеба Ю.Ю.ДАН СССР 314, №5, с. 12401242, 1990., Feher A., Skryabin K.G., Balazs Е., Preiszner J., Shulga O.A., Zakharyev V.M., Dudits D.yPlant Cell Reports, 1992, v. 11, p.48-].

Переход от лабораторной работы с модельными, легко трансформируемыми генотипами картофеля к получению реальных коммерчески значимых сортов потребовал разработки качественно новых протоколов трансформации, поскольку отбор фенотипически нормальных растений среди трансформированных линий возможен только при достаточном количестве исходного материала. Одним из важнейших параметров применяемого для трансформации метода является эффективность получения трансгенных линий, обеспечивающая подобный отбор. В результате обширной работы по созданию единой методики трансформации было показано, что эффективность трансформации определяется в основном конкретным генотипом (сортом). Следовательно, для каждого нового сорта картофеля необходима разработка нового протокола трансформации.

В данной работе описывается модификация метода трансформации с помощью A. tumefaciens нескольких основных сортов картофеля, районированных для различных регионов РФ.

1.4. Апробация работы

Материалы диссертации были представлены:

- на Международной конференции «Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку» (Москва, 2000)

- на II Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000)

- на Школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000)

- на Семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнологии-2001» (Пущино, 2001)

- как методика «Оптимизация протокола трансформации с помощью Agrobacteriшn Ште/аЫепз основных российских сортов картофеля Отработка лабораторного регламента протокола», награждена медалью «Лауреат ВВЦ» во время проведения выставки ВВЦ «Карто-фель-2001» с 21.02.2001 по 25.02.2001. Постановление № 13 от 23.02.2001

- как составная часть отчета по федеральной целевой научно-технической программе «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» — «Разработка антистрессовых биотехнологий для растений; трансгенные растения и регуляторы роста нового поколения» в 2001 г.

- как составная часть отчета научно-исследовательских работ по Госконтракту № 1991 от 25.09.2001 г., по теме: «Проведение сравнительной оценхи генетически модифицированных сортов картофеля российской селекции с лучшими зарубежными аналогами по комплексу хозяйственно-полезных иммунологических и качественных характеристик»

1.5. Публикации

По результатам исследования опубликовано 3 тезиса и 2 статьи, поданы четыре заявки на изобретение, в которых отражены основные положения диссертации.

1.6. Структура и объем работы

Работа изложена на_страницах машинописного текста, состоит из

введения, обзора литературы, главы материалы и методы, главы результаты и обсуждения и выводов; содержит 43 таблицы, 29 рисунков и библиографический список из 112 наименований.

2. Содержание работы

2.1. Введение

Во введении изложена общая характеристика работы.

2.2. Литературный обзор

В обзоре литературы освящено современное состояние проблемы эффективного получения трансгенных растений картофеля, обладающих новыми полезными признаками. Обобщены новейшие данные о взаимодействии растения хозяина и Agrobacterium tumefaciens, рассмотрены возможные способы модификации методики агробактериальной трансформации.

2.3. Материалы и методы исследования

Материалом для работы служили растения четырех генотипов картофеля Solanum tuberosum L. сорта Невский, Луговской, Голубизна, Чародей (табл.2). Для модификации растений картофеля использовали метод агробактериальной трансформации [Дрейпер Дж„ Скотт Р., Арми-тидж Ф„ Уолден Р./Москва «Мир». 1991 - 408 стр.]. . Табл. 2.Сорта картофеля, использованные в работе

Сорт Номер и дата патента, патентообладатель Адрес патентообладателя

Голубизна №87 от 26.03.1998 г. ВНИИКХ 140052, Моск. обл., Люберецкий р-н, ! п/о «Коренево» 1

Луговской Свободен от патентования — 1

Невский №215 от 9.12.1998 г., ООО «Картофель» 188356, Ленинградская обл., Гатчинский р-н, пос. Пригородный, Вы-рецкое ш., 12

Чародей Заявка на охрану №33076 от 4.06.1999 г.С.-З. НИИСХ, НПО «Белогорка», ИОГЕН —

В работе использовали агробактериальный штамм LBA4404, содержащий вектор pBIBar и вектор рВТ121. Плазмида pBIBar, сконструирована в лаборатории генетической инженерии Центра «Биоинженерия» РАН [ГІадегимас Л., Шульга O.A., Скрябин К.Г. уМол.биол. т. 27. с. 947-951.1993] и содержит кассету экспрессии bar гена, под контролем 35S промотора и jVOS терминатора.

В состав кассеты экспрессии плазмиды рВ1121, зходит синтетическая конструкция: 35S промотор-ген ТА УІІ — NOS 3 ' терминатор.

— 4 —

Экспланты получали из безвирусных стерильных растений, выращенных в культуре in vitro.

Первичную селекцию регенерантов проводили in vitro на питательных средах с различной концентрацией селективных агентов (канами-цин, фосфинотрицин).

Первичный молекулярно-генетический анализ трансформантов проводили при помощи ПЦР анализа со специфичными к трансгенной вставке праймерами. Первичный анализ экспрессии целевых генов проводили методом иммуноферментного анализа [Towbin Н, Staehelin Т, Gordon JProc. Natl. Acad. Sei. USA 1979. \\76(9):4350-4].

Все полученные результаты экспериментов были обработаны с помощью методов математической статистики (дисперсионный анализ) [Доспехов Б. A J М.: Агропромиздат.1985 - 351 с. ил.] и при помощи пакета программ Statistica 5.5.

Адаптацию трансформантов к почвенным условиям проводили на гидропонной установке «Минивит-2». Морфологический скрининг трансформантов проводили во время ограниченных полевых испытаний 2000-2001 гг.

2.4. Результаты и их обсуждение

2.4.1. Разработка эффективной системы трансформации коммерческих сортов картофеля

Различные генотипы обладают неодинаковым регенерационным потенциалом. Задачей первого этапа исследований являлось выявление для каждого сорта картофеля ключевых параметров трансформации на всех ее этапах (табл. 4, исследованные параметры выделены курсивом).

2.4.2. Изучение регенеративной способности различных типов экс-ппантов

Одна из важнейших задач при разработке методики генетической трансформации растений заключается в идентификации подходящих эксплантов, из которых может произойти эффективная регенерация побегов.

Для анализа исходных генотипов на способность к регенерации различных частей растения использовали два типа эксплантов: высечки из листовых пластинок и сегменты стебля. При этом использовали питательные среды, разработанные ранее в нашей лаборатории и принятые за базовые методики для данной работы.

Сравнительная оценка реакции генотипов на условия культивирования in vitro проводилась по следующим критериям: отсутствие формирования каллуса, образование морфогенного или неморфогенного каллуса, скорость формирования каллусной ткани, возможность сомати-

— J—

ческого эмбриогенеза, эффективность регенерации (отношение количества первичных регенерантов к общему количеству экстшантов).

В результате проведенных экспериментов было показано, что для всех четырех сортов картофеля возможно использование в качестве экс-плантов и стеблевых сегментов и листовых высечек. Эффективность регенерации при использовании листовых высечек была значительно ниже, чем при использовании стеблевых сегментов. Таким образом, для всех исследованных сортов картофеля, в качестве оптимального типа был определен эксплант - стеблевой сегмент.

2.4.3. Изучение влияния состава питательной среды на процессы каллусообразования и регенерации.

С целью изучения влияния состава питательной среды на образование каллуса и последующее формирование регенерантов нами была разработана схема, состоящая 12 комбинаций питательных сред (табл. 3) с различным сочетанием цитокининов (БАП, зеатин), которая в дальнейшем была испытана для каждого изученного сорта. Рабочий диапазон варьирования концентраций был выбран на основании анализа литературных данных, применяемых типов и концентраций цитокининов для различных зарубежных сортов картофеля.

Для оценки влияния комбинаций фитогормонов на образование каллуса и регенерацию исследовали следующие параметры: образование морфогенного или неморфогенного каллуса, скорость формирования каллуса, возможность соматического эмбриогенеза, эффективность регенерации, %.

Табл. З.Схема опыта по подбору оптимального сочетания

цитокининов в питательных средах

Вариант БАП, мг/л Зеатин, мг/л Вариант БАП, мг/л Зеатин, мг/л

1 (контроль) 0,0 0,0 7 1,0 0,5

2 0,5 0,0 8 5,0 0,5

3 1,0 0,0 9 0,0 1,0

>. 4 5,0 0,0 10 0,5 1 1,0

5 0,0 0,5 11 (базовый) 1,0 1,0

1 б 0,5 0,5 12 5,0 1 1,0

Табл. -¡».Основные факторы, влияющие на эффективность генетической модификации растений

Трансформация Регенерация Экспрессия

Генотип растения

Штамм бактерии (вирулентность, способ селекции, способ наращивания и приготовления суспензии и т.д.) Тип экспланта (часть листа, стебля, микроклубня и т.д) Появление «ложных» трансформантов

Тип плазмидного вектора (механизм интеграции в геном, протяженность вводимой последовательности, тип про-моторной и терминатор-ной областей, тип селективного маркера, и т.д.) Возраст и физиологический статус донор-ного растения Копийность введенного гена

Способ со-куль тивирования Состав питательной среды (состав солей, фитогормоны, сахара, витамины, антибиотики и т.д.) Проблема «замалчивания» введенного гена

Способ регенерации «Химерность» растения

Условия селекции (тип и концентрация селективного агента, продолжительность селекции) Получение фертильного потомства со стабильной экспрессией трансгена

Физиологические условия (температура, свет и т.д.)

Адаптация при переносе в грунт из культуры in vitro

2.4.3.1. Сорт Луговской

Наиболее результативными оказались варианты с концентрацией цитокинина 1 мг/л - 3, 6 и 9. Средняя эффективность регенерации соста-

вила 75,6° о, 84,4% и 75,6%, соответственно Основываясь на эффективности регенерации, фенотипических характерно шках (форма, цвет ти-стьев, габитус) и способности к укоренению полученных регенератов, 6 вариант быт признан оптимальным дтя сорта Луговской

2 4 3 2 Сорт Невский

На основании анализа полученных данных по вариантам можно предположить, что дтя эффективной регенерации сорта Невский тучше использовать природный цитокинин зеатин, чем синтетический БАП С увечичением концентрации зеатина возможно увеличение количества первичных регенерантов

2 4 3 3 Сорт Гопбизна

Основываясь на данных статистического анализа, можно выделить нескочько групп по эффективности регенерации Для протокола трансформации был выбран 4 вариант

2 4 3 4 Сорт Чародей

Не было замечено различий между вариантами опыта по фенотипи-ческим признакам первичных регенерантов Математический анализ подтвердил, что различия в эффективности регенерации по вариантам носят случайный характер и не зависят от действия изу чаемого фактора (Рфакт'-Итсор) Исходя из угого, дтя протокола трансформации было решено использовать базовый вариант

По результатам проведенных .жспериментов бы ш опредепень. оптимальные сочетания фитогормонов для каждого сорта (табп 5) Табл. Б.Оптимальные концентрации цитокининов в питательных средах для изученных сортов картофеля

I , 1~ Оптимальный

Сорт 1 I нерации в оптимальном вари'__, вариант___анте, %____1

Невский ! 9 , 80,0 I

Лугозской'_б____'_ 84£4_

Уолубизна!_4_'_____174,5_

'Чародей 1 11 (базовый)__|________65,9^

2 4 4 Определение оптимального срока начала применения гибперел-тна в питательной с,реде дчя регенерации Нами были протестированы три срока замены дчя каждого сорта Проведенные опыты показали, что оптимальным дтя всех четырех изученных сортов явтяется вариант, в котором гиббереллин в питательную среду добавляют на 8 день трансформации При атом дчя всех сортов

—

было показано, что при увеличении срока до 14 дней и 21 дня эффективность регенерации снижается.

2.4.5. Изучение влияния различных способов подготовки агробакте-риальных штаммов на эффективность трансформации

В данном эксперименте изучали, как влияют условия подготовки агробактериального штамма на эффективность трансформации, чтобы разработать способ подготовки к трансформации агробактерии, обеспечивающий максимальную вирулентность штамма. Было проанализировано два варианта подготовки, базовый и оптимизированный, отличающиеся условиями наращивания ночной культуры и способом разведения штамма непосредственно перед трансформацией. Сравнение вариантов проводили по конечному результату — эффективности трансформации. Были получены следующие результаты: при трансформации сорта Чародей эффективность трансформации в базовом варианте составила 10,2%, в оптимизированном варианте 11,95%, при НСР05=0,77%.

2.4.6. Изучение влияния различных типов со-культивации на эффективность трансформации

Целью данного эксперимента являлось подобрать такие условия со-культивации, которые позволили бы экспланту достаточное время оставаться жизнеспособным при контакте с агробактерией, чтобы обеспечить возможность трансформации без нарушения образования каллуса или регенерации побегов.

Для этого была проведена серия опытов, в которых варьировали продолжительность контакта растительных эксплантов с агробактери-альным штаммом и тип используемой среды. Эффективность проверяемого способа со-культивации оценивалась по следующим параметрам: эффективность регенерации, %, жизнеспособность эксплантов (отношение количества жизнеспособных после со-культивации эксплантов к количеству исходных, взятых в трансформацию эксплантов, в %).

При проведении данных экспериментов были получены следующие результаты (табл. 6).

2.5. Селекция трансформированных тканей и регенерация растений

В нашей работе для трансформации использовали генетические конструкции, содержащие селективные гены устойчивости к антибиотику канамицину и гербициду биалофосу (глюфосинат натрия).

Для определения эффективности антибиотика канамицина и гербицида фосфинотрицина как селективных агентов в зависимости от генотипа и типа экспланта, было проведено тестирование каждого исходного сорта на их действие. В результате были получены следующие данные: - наиболее эффективная селекция одновременно с регенерацией при помощи антибиотика канамицина достигается при концентрации

50 мг/1 для всех сортов (LD;5-89 мг¡i Д1я (.орта Луговской и Чародей, LDr)c=92 v т Д7я сорта Невский, LD^-99 мг/т дтя сорта Голубизна),

наибо lee эффективная селекция среди порченных первичных регенерантов (в пробирочной культуре, после окончания регенерации) при гомоши антибиотика канамицина достигается при концентрации 100 мг'з Д1я всех сортов,

наиболее эффективная сечекция среди полученных первичных регенерантов (после окончания регенерации) при помощи гербицида фосфинотрицина достигается при концентрации 5 мг/л для сортов Невский, Луговской, Чародей и при концентрации 10-15 мг/л дтя сор та Голубизна

Табл. б.Эффективность трансформации при различных способах со-культивации, %

Сорт

Невский

5

Со-культивация 'НСР0 Fos

i

на агаризованной | на жидкой среде __Среде_______

I

14J__' 9,7 t 4,2

Голубизна i 22,2 19,8 i — . Рфакт=б 39

___,_______ '___I FTeop-7,71_

1 Чародей Í 15,0__i_21,6___3 6,4 ___j

' Луговской [ 13,4 __23,8_ 5,9, ,______

2.6. Оптимизация протока ш трансформации для каждого сорта

По итогам всех проведенных опытов был определен наибо ice _>ф-фективный протокол трансформации

Протокол трансформации картофеля Культура донорных растений доиорные растения, свободные от вирусной и вироидной инфекции, кутьтивировать в ас^птичесхих условиях в кучьтуре ш \itro Для этого стебай исходных растений нарезать на черенки длиной 5 мм с одной пазушной почкой и к\ штивировать 4 недели в вегетационных сосудах на VI.sbase-среде при температуре + 19-21 "С и фотопериодичности 16 часов день/8 часов ночь (освещенность 120 цЕ)

Подготовка агробактериального штамма для трансформации Базовый вариант. За день до со-ку !ьтивации засеять ночную кучьтуру агробактериальною штамма, (50 мл LB, 25 28СС, 120—140 об/мин) В первый день трансформации осадить ночную к\ чь-туру афобактериального штамма (5 мин 3,5 тыс об/мин ), развести полученный осадок в 5 мт среды MSbase

Оптимизированный вариант. Засеять агробактериальный штамм штрихом (LB, 3 суток в темноте, 25°С) За два дня до п шнируемой

— ю—

трансформации засеять смесью колоний ночную культуру I агробакте-риального штамма, (2 мл LB, 25-*-28°С, 120 об/мин). За день до инокуляции засеять ночную культуру И, внося в среду 60 мкл ночной культуры I (6 мл LB, 25°С, 120 об/мин). В первый день трансформации развести ночную культуру II жидкой СМ-средой в соотношении 1:10.

Первый день трансформации

1. Нарезать стебель на сегменты без пазушных почек длиной 5 мм.

2. Со-культивация:

Способ 1. В чашки Петри поместить стерильные бумажные фильтры, равномерно смочить их небольшим количеством разведенной бактериальной суспензии (3 мл). В контрольных вариантах использовать такое же количество жидкой среды СМ.

Способ 2. Залить чашки Петри небольшим количеством агаризо-ванной (5 мл) среды СМ, нанести разведенную бактериальную суспензию равномерно по поверхности агара, сверху накрыть бумажным фильтром.

Поместить экспланты поверх фильтров, в соответствии со способом 1 или 2.

Луговской Невский Голубизна Чародей

Способ 1 Способ 2 Способ 1 или Способ 2 Способ 1

Чашки Петри с эксплантами оставить на 48 часов в климатической камере (19°-ь21°С, 16 часов день/8 часов ночь,освещенность! 20 цЕ).

Третий день

Перенести экспланты на чашки со средой СІМ, содержащей цито-кинины в следующей концентрации в зависимости от сорта (табл. 7) и антибиотики, подавляющие развитие агробактерии (карбенициллин и/или цефотаксим).

Табл. 7.Концентрация цитокининов в среде СІМ

Луговской Невский Голубизна Чародей

0,5 мг/л БАП 0,5м г/л зеа-тин 0,0 мг/л БАП 0,5—1,0 мг/л зеа-тин 5,0 мг/л БАП 0,0 мг/л зеа-тин 1,0 мг/л БАП 1,0 мг/л зеа-тин

Восьмой день

Перенести экспланты на чашки со средой ИМ для регенерации с добавлением селективного агента 100 мг/л антибиотика канамицина или 5 мг/л гербицида фосфинотрицина, в зависимости от используемой генетической конструкции. Для контроля регенерации использовать среду ЯМ, без добавления селективного агента.

—и —

Через каждые 14 дней Перенести зкспланчы на свежие чашки ГГетри со средой гого же состава

При появлении регснерантов

Срезать регенеранты и перенести их в пробирки содержащие среду RIM для у коренения

Первичные регенеранты, укоренившиеся на селективной среде, считаются прошедшими первичный отбор и подлежат дальнейшему анализу на наличие це швои вставки

В результате продетанных опытов по созданию эффективных протоколов трансформации для четырех сортов картофеля отечественной селекции было получено следующее количество регенсраитов и трансформантов (и т с ) (табт 8)

Далее по оптимизированным протоколам бьпа проведена разовая трансформация растений картофеля сортов Луговской, Невский, Готу-бизна и Чародей Полученные данные представлены в таб шце ч

2.7. Трансгенные растения сортов Лугонскои, Невский и Голубизна, жспрессирующие ген Ваг, обеспечивающий устойчивость к ¿иофосинапгу натрия

2 7 1 Выявление наличия ± ьна bar в ^еноме растений ка^тофьля при помощи ПЦР-анализа

Бьп проведен ПНР анализ трансформантов, проледших первичный отбор на среде с фосфинотрицином Типичным пример такого рода анализа приведен на рисунке 1

На основе проведенною ПЦР - анализа i сна bar бьпи отобраны 169 транс:енныч линий (и т с ), в том чис ie 48 линий (и т с ) сорта Луговской, 75 чиний (и тс ) сорта Невский и 46 линий (итс ) сорта Гочу-бизна

2 72 Ограниченные птьвые испытания в кимях открытом гр\нта 2000 гог)

В период с 10 июня 2000 по 20 сентября 2000 года на сертифицированном V1BK ГИД участке ВНИИ Фитопагоио! ш' РАСХН, пос Б Вяземы, Московская обт, были проведены ограниченные почевые испытания полученных трансгенных тиний картофеля сортов Невский, Луговской и Гочубизна, экспрессирующих ген bar

Испытания проводи чи с цечыо подтвердись проявление внесенного признака в почевыч усчовиях и отобрать жизнеспособные, фенотиниче-Сли нормальные растении По *авершению отбора mai ировалось но чу-чение первичного семенного материала выбранных тиний

Табл. 8.Количество регенерантов и трансформантов, полученных при сравнении различных вариантов постановки экспериментов

і -.. і

і Лугов-

'СКОЙ

Сорт

Опыт по выбору типа экспланта

I Опыт С ци-

сте б левые сегменты

Листовые высечки

і 'Опы I токи-' „ 1 тс

1нина-1 г„ .

I ми* ' ГКз

і

'Опыты! по со-куль-I тива-! ции* -

Регене-оанты

22

520 92 167 ! 808 і

Транс- і форманты

16

16

Регене- I

Невский і—_ Транс- і

1 форманты і

; Регене- ^

Голу- '_ранты

бизна Транс- {

_______| форманты^

Регене- ;

ранты 1

Транс- Г

1 форманты

31

----,-„---

637 122 і 114 909

11

51

37

Т

- I.

11

11 ї 961 179 293 1495

46

46

-1--

491 ! 127 ! 148 ' 808

1Чародей

_ і

20

20

* — В качестве эксплантов использовались стеблевые сегменты --—Суммарное количество регенерантов и трансформантов с использованием в качестве зксплантов листовых высечек и стеблевых сегментов Табл. Э.Результаты, полученные при проведении трансформации по оптимизированному протоколу

Сорт

Количество полученных трансформан-

г

Эффективность, %

регенерации і трансформации і

Всего было высажено 880 растений 169 трансгенных и 3 контрольных линии, в том числе 75 линий (и.т.с.) на основе сорта Невский, 48 линий (и.т.с.) на основе сорта Луговской и 46 линий (и.т.с.) на основе сорта Голубизна.

После обработки в два срока суммарной дозой гербицида фосфи-нотрицина 6 л/га (3+3) трансгенные растения не проявляли признаков фитотоксического угнетения. Обработанные гербицидом контрольные (нетрансформированные) растения погибли полностью.

По результатам морфологического отбора были отобраны 122 линии (и.т.с.) картофеля, устойчивых к глюфосинату натрия, в том числе 75 линий (и.т.с.) сорта Невский, 23 линии (и.т.с.) сорта Луговской и 20 линий (и.т.с.) сорта Голубизна.

Рис. 1. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 1,5% агарозном геле

1 - маркер молекулярной массы XPstI; 2- контроль; продукт ПЦР на плазмидной ДНК pBAR

4,7,9,11,13,14,15,19 - ПЦР на препаратах ДНК из не экспрессирующих bar линий сорта Луговской 677115, 677146, 677192, сорта Невский 143102,143111, сорта Голубизна 135101,135113,135117, соответственно; 5,6,8,10,12,16,17,18,20 -ПЦР на препаратах ДНК из экспрессирующих bar линий сорта Луговской 677154, 677162, сорта Невский 143101, 143109, 143147, сорта Голубизна 135120,135137, соответственно;

3 - ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы (.контроль качества реакционной смеси).

В конце вегетационного сезона был получен первичный семенной материал.

Апатии отобранных линий по урожайности не выявил существенных различий между модифицированными и контрочьнычш линиями, вероятность существенности различий составила 62% для линий сорта Невскии, 44° о дгя линий сорта Луговской и 54% дчя линий сорта Голубизна

Табл. 10. Трансгенные линии картофеля, отобранные для дальнейшей работы после первого года полевых испытаний

Невский Луговской Голубизна

143109 677145 135120 |

143147 677152 135137

143165 677154 135168

143166 677162 135193 i

143100* 677100* 135100*

* — контрольная нетрансформированная линия

В резучьтате анализа морфоюгических признаков (основные признаки куста, стебля, чиста и цветка, форма клубней, окраска и гип кожуры, пубина глазков) ;пя дальнейшей работы были отобраны следующие ишии (и т с ) (табл 10)

27 3 Ограниченные поъевые испытания в усювиях открытого грунта 2(Ш! год

В период с 15 мая 2001 по 15 сентября 2001 года на том -ке сертифицированном V1BK ГИД участке ВНИИ Фитопаточогии РАСХН были проведены ограниченные i очевые испытания отобранных в первый год грансгенных линий (и т с ) картофеля Задачей испытаний второго года была проверка стабичьности наследования введенного признака при вегетативном размножении и определение возможного спонтанного вы-щептения признака

Ьыло проведено опрыскивание гербицидом фосфинотрициком в два срока в суммарной дозе 6 шга Вышепления признака не обнаружено, все испытываемые трчнсгенные чинии (иге) проявили устойчивость к действию гербицида Все обработанные гербицидом контрольные растения погиб'!и В конце вегетационного периода были получены кчубни всех отобранных трансгенных линий, данные но урожайности представлены в тлбчицах 11-12

В результате проведения двухлетних полевых испытаний, были отобраны 12 транстенных линий (итс ), устойчивых ,< гербициду фос-финотрицину Показано, что отобранные трансгенные чинии (и т с ) сохраняют введенный признак при вегетативном размножении и не отличаются по морфологическим признакам от контрольных нетрансформи-рованных растений исходного сорта В дальнейшем планируется проведение испытаний отобранных чиний на биобезопасность и их полная

—15 —

молекулярно-биологическая характеристика, что необходимо для регистрации этих линий в комиссии по сортоиспытаниям в качестве новых сортов.

2.8. Трансгенные растения сортов Луговской, Голубизна и Чародей, экспрессирующие ген белка тауматин II

2.8.1. Выявление наличия гена taull в геноме растений картофеля при помощи ПЦР-анализа Перед передачей на полевые испытания был проведен ПЦР-анализ растений на присутствие трансгенной вставки, соответствующей гену Tau II. Типичный пример такого рода анализа для каждого сорта приведен на рисунках 3-4.

Для этого была сконструирована пара праймеров, охватывающая как кодирующую тауматин последовательность трансгенной вставки, так и область промотора E35S. Указанная пара должна давать в результате проведения ПЦР продукт длиной 907 нуклеотидов.

Из анализа данных следует, что линии растений содержат кодирующую область трансгенной вставки в полном объеме. Контрольный картофель не дает сигнала, соответствующего трансгеиу, что показывает высокую специфичность выбранной праймерной системы, которую в дальнейшем можно рекомендовать в качестве основы для создания тест-диагностикума на трансгенный картофель, несущий ген Tau II. Табл. 11. Полевые испытания второго года трансгенных линий картофеля сорта Невский

Линия Г/ куст Средняя масса клубня, г Среднее кол-во клубней на куст, шт. % товарных клубней

143109 600 38,5 15,6 27,2

143147 671 46,7 14,4 35,4

143165 863 49,6 17,4 45,8

143166 684 47,6 14,4 35,7

143100 (контроль) 287 54,2 5,3 55,7

Стандартное отклонение 112 1,3 0,8 1,3

Вероятность, % >95 <95 <95 <95

—а—

Iі!I2{ l3li4l lsl I6 il7llsl I9! f10! MMM

3000«

»00-

500-

»07

um/

iLi ¿¿ä il^. , ШМ Üb фт щщ- -WS* ЩЩ. ЩЩ ЩШ -

J? Ш

' I' J

V" iK

Рис. 2. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР на препаратах ДНК модифицированных линий (и.т.с.) сорта Голубизна

1,13 -маркер молекулярной массы GeneRu/er Fermentas, #SM0321,

2- 1353С0- ПЦР на препаратах ДНК из ^трансформированных растений сорта

Голубизна;

6,9,10,11,12 - ПЦР на препаратах ДНК из не зксгрессирующих tau II линий, 135314, 135324; 135326, 135327; соответственно;

3, 4, 5, 7,8 - ПЦР на препаратах ДНК из зксгрессирующих tau II линий 135311;135312;135313,135315,135322, соответственно; 12 - ГЦР в отсутствие ДНК-матрицы (контроль реакционной смеси) Табл. 12. Полевые испытания второго года трансгенных линий картофеля сорта Голубизна

Среднее ^ «

Линия I масса ных

клубней

, клубней на | куст, шт.

і __135120__j_548_ 65,3 , 8,4 f

I__ 135137_,__580__~ _49j2 11,8 I 46,6" 1

і__135168_______;__375 , 46,7 |__8,0_________38,2__\

135193 __І__569_.__65,3 і 8,7_| 73,0

____135100___

j Стандартное оті клонение

Вероятность, % . <95 | <95 j <95_<95

Рис. 3. Электрофоретический анализ продуктов Г1ЦР на препаратах ДНК модифицированных линий (и.т.с.) сорта Луговской

1 - маркер молекулярной массы GeneRu/er Fermentas, #SM0321, 2- 677300 - ПЦРна препаратах ДНК из нетрансформированных растений сорта Луговской;

3,11,12,13,15- ПЦР на препаратах ДНК из не экспрессирующих tau II линий 6773306,677310; 677318, 6773346,677359, соответственно 4,5,6,7,8,9,10,14 - ПЦР на препаратах ДНК из экспрессирующих tau II линий 677308, 677311, 677312, 677314, 677320, 677349, 677350, 677369, соответственно;

16 - ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы (контроль качества реакционной смеси). 2.8.2. Полевые испытания в условиях закрытого грунта.

С целью отбора жизнеспособных и фенотипически нормальных трансгенных линий (и.т.с.) были проведены полевые испытания в закрытом грунте. Были высажены 118 трансгенных линий (и.т.с.) (555 растений) и 3 контрольных нетрансформированных линии (30 растений). Растения оценивали по фенотипическим характеристикам в сравнении с контролем (нетрансформированные растения). В результате проведения полевых испытаний в закрытом грунте были отобраны жизнеспособные и фенотипически не отличающиеся от контрольных трансгенные линии (и.т.с.) картофеля сортов Голубизна (25 шт.), Луговской (22 шт.) и Чародей (11 шт.). Методом иммуноблоттинга был определен уровень экспрессии белка тауматин II. В восьми линиях сорта Голубизна, семнадцати линиях сорта Луговской и трех линиях сорта Чародей обнаружен белок тауматин в различных концентрациях (табл. 14).

ІМШММММІ'ІММММММІ"

>7

- г-*, ш Wß wf

Ы ШШ ЇЙ.&

Рис. 4. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР на препаратах ДНК модифицированных линий (и.т.с.) сорта Чародей

1,16 - маркер молекулярной массы GensRuier Fermentas, ¿SM0321, 2-ПЦР на препаратах ДНК из нетрансформированных растений сорта Чародей;

3, 5, 7, 8, о, 12, 13 - ПЦР на препаратах ДНК из не жсгрессирующих tau II линий 103301,103303;103305, 103307,103308,103314,103315 соответственно; 4 - ПЦР на препарате ДНК из неэлсгресс;ірую^ией tau II линии, имеющей трансгенную вставку; 103302

б, 10, 11 - ПЦР на препаратах ДНК из экспрессирующих tau II линий соответственно; 103304, 103310, 103311 соответственно,

14 - ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы (контроль качества реакционной смеси),

15 — rtpoúwm ПЦР на плазчидной ДНК (О, I нг.реакцию) испо лзованной

дія трансформации растений

2 8 3 Лоаптация растений ь\ іьтхрьі in \,itro к почвенным условиям с использованием гиоропоннои остановки сМшшвит-2» Перед проведением полевых испытаний в открытом фунте транс-генныь линии (и тс ), отобранные посіє иммлнодетекции Сетка таума-тин, были размножены в культ\ре ш vitro Затем с использованием гидропонной установки для производства посадочного материала картофеля «Минивит-2» растения с 20 мая по 15 июня 2000г прошли адаптацию к почвенным \словиям

Табл. 13. Полевые испытания второго года трансгенных линий картофеля сорта Луговской

Линия Г/куст Средняя масса клубня, г Среднее кол-во клубней на куст, шт. % товарных клубней

677145 459 45,8 10,0 40,2

677152 474 49,4 9,6 34,7

677154 575 53,3 10,8 46,7

677162 456 40,0 11,4 37,9

677100 414 58,9 7,0 45,7

Стандартное отклонение 57 5,7 0,8 5/1

Вероятность, % <95 <95 >95 <95

Табл. 14. Уровень экспрессии белка тауматин II в клетках трансгенных растений картофеля

Линия Концентрация, мкг/мг Линия Концентрация, 1 мкг/мг

Голубизна Луговской

135302 0,25 677302 0,5-1,0

135304 1,0-2,0 677303 0,5-1,0

135311 2,0-3,0 677305 0,5-1,0

135312 2,0-3,0 677307 1,0-2,0

135313 2,0-3,0 677308 0,5-1,0

135315 0,5-1,0 677311 1,0-2,0

135317 0,5-1,0 677312 0,5-1,0

135322 0,5-1,0 677314 0,5-1,0

Чародей 677315 1,0-2,0

103304 0,5-1,0 677320 1,0-2,0

103311 0,5-1,0 677321 0,5-1,0

103313 0,5-1,0 677330 0,25

677331 0,5-1,0

677349 1,0-2,0

677350 1,0-2,0

677354 1,0-2,0

677369 0,5-1,0

2.8.4. Ограниченные полевые испытания в условиях открытого грунта

В период с 15 июня 2001 по 20 сентября 2001 года на сертифицированном МВК ГИД участке ВНИИФ, пос. Б. Вяземы, Московская обл. были проведены ограниченные полевые испытания отобранных трансгенных линий картофеля сортов Голубизна, Луговской и Чародей, экс-прессирующих ген белка тауматин И.

В конце вегетационного периода были получены клубни всех трансгенных линий.

Урожайность трансгенных линий (и.т.с.) оценивали по следующим показателям: средняя масса клубней, г/куст и среднее количество клубней на куст. Математический анализ урожайности контрольных и трансгенных линий (и.т.с.) картофеля показал, что между трансгенными и контрольными растениями нет существенных различий по показателям урожайности.

В результате проведения двухлетних полевых испытаний были отобраны следующие трансгенные линии (и.т.с.): 8 трансгенных линий (и.т.с.) сорта Голубизна, 17 трансгенных линий (и.т.с.) сорта Луговской и 3 трансгенных линии (и.т.с.) сорта Чародей, экспрессирующие ген белка тауматин II. Отобранные линии жизнеспособны и фенотипически не отличаются от контрольных ^трансформированных растений исходного сорта.

В дальнейшем будет проведена оценка устойчивости отобранных линий к грибным и бактериальным фитопатогенам и полная молекуляр-но-биологическая характеристика. 3. Выводы

1. Показано, что эффективность регенерации и трансформации картофеля зависит от трансформируемого генотипа и определяется следующими параметрами: тип экспланта, гормональный состав питательной среды, способ подготовки агробактериального штамма, тип со-культивации, время начала селекции и концентрация селективного агента.

2. Разработаны эффективные протоколы трансформации картофеля применительно к сортам российской селекции Невский, Голубизна, Луговской и Чародей:

- показано, что для сорта Луговской трансформационные параметры должны быть следующими: стеблевой сегмент; 0,5 мг/л БАП и 0,5 мг/л зеатина в среде для регенерации, способ со-культивации с использованием бумажного фильтра и жидкой питательной среды, начало селекции с 14 дня трансформации, концентрация канамицина 50 мг/л, концентрация фосфинотрицина 5 мг/л. При соблюдении этих параметров достигается эффективность регенерации 78% и трансформации 24%; — 21—

— показано, что для сорта Невский трансформационные параметры должны быть следующими: стеблевой сегмент; 0,5 мг/л - 1,0 мг/л БАП в среде для регенерации, способ со-культивашш с использованием бумажного фильтра и агаризованной питательной среды, начало селекции с 14 дня трансформации, концентрация канамицина 50 мг/л, концентрация фосфинотрицина 5 мг/л. При соблюдении этих параметров достигается эффективность регенерации 64% и трансформации 16%;

— показано, что для сорта Голубизна трансформационные параметры должны быть следующими: стеблевой сегмент; 5,0 мг/л БАП в среде для регенерации, способ со-культивации с использованием бумажного фильтра и либо жидкой, либо агаризованной питательной среды, начало селекции с 14 дня трансформации, концентрация канамицина 50 мг/л, концентрация фосфинотрицина 10-15 мг/л. При соблюдении этих параметров достигается эффективность регенерации 96% и трансформации 21%;

— показано, что для сорта Чародей трансформационные параметры должны быть следующими: стеблевой сегмент; 1,0 мг/л БАП и 1,0 мг/л зеатина в среде для регенерации, способ со-культивации с использованием бумажного фильтра и жидкой агаризованной питательной среды, начало селекции с 14 дня трансформации, концентрация канамицина 50 мг/л, концентрация фосфинотрицина 5 мг/л. При соблюдении этих параметров достигается эффективность регенерации 64% и трансформации 20%.

3. На основе разработанных эффективных протоколов трансформации получено 169 трансгенных линии (и.т.с.), экспрессирующие ген Ваг, в том числе 48 линий сорта Луговской, 75 линий сорта Невский и 46 линий сорта Голубизна.

4. В результате проведения двухлетних полевых испытаний отобраны 4 трансгенных линии (и.т.с.) сорта Луговской, 4 трансгенных линии (и.т.с.) сорта Невский и 4трансгеиных линии (и.т.с.) сорта Голубизна, устойчивых к гербициду фосфинотрицину. Показано, что отобранные трансгенные линии (и.т.с.) сохраняют введенный признак при вегетативном размножении и не отличаются по морфологическим признакам от контрольных нетрансформированных растений исходного сорта. Выщепления признака не обнаружено, все испытываемые трансгенные линии (и.т.с.) проявили устойчивость к действию гербицида. Проведен ПЦР анализ растений на присутствие и структурную целостность трансгенной вставки, соответствующей гену Ваг.

5. На основе разработанных эффективных протоколов трансформации получено 118 трансгенных линии (и.т.с.), экспрессирующие ген

Tau //, в том числе 35 тиний сорта Луговсчо", s5 шний сорта Чародей и 28 шний сорта I олубизна

6 В результате проведения двухтетних поаевых испытаний отобраны S грансгенных -шний (и тс ) сорта Гоаубизна, 17 трансгенных линий (и т с ) сорта Луговской и 3 трансгенных линии (и т с ) сорта Чародей, экспрессирующие ген белка гаучатин II Отобранные чинш жизнеспособны и Ленотипически не отличаются от контрольных ^трансформированных растений исходного сорта Проведен ПЦР анализ растений на присутствие и структурную целостность грансгенной вставки, соответствующей гену Таи И Проверен уровень экспрессии белка гауматин II методом иммунобюттинга

Автор выражает пубокую бтагодарность своему научному руководителю директору Центра «Биоинженерия» РАН академику РАСХН К Г. Скрябину за предоставленную возможность проведения интересной научно-исследовательской работы, руководителю группы генетической инженерии растений к х н OA Шучьге за обучение методам ¡еннои инженерии, руководителю группы молекулярно-биологической идентификации Б Б Кузнецову за неоценимую помощь в работе, моему постоянному соавтору M Ь Бедоусовой за совместную творческую работу, а также всему кочлективу лаборатории генетической инженерии Центра «Биоинженерия» РАН за моральную поддержку и доброжелательное отношение

4. Список р \бот, опубликованных по материалам диссерт\ции

1 Конов АЛ., Стародубцева A.M., Шульга O.A., Скрябин К.Г. Генетическая инженерия картофеля от лаборатории до поля Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к коюрадскому ,к\ку М. Наука, 2000 Т 1, 110-1 Iе»

2 Супрунова Т.П., Стародубцева A.M., Дорохов Д.Б., Скрябин К.Г. Мотеку тярная идентификация сортового материала картофетя Современные системы ищиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому ж> ку M Наука, 2000 Т 1, 107-110

3 Стародубцева A.M., Белоусова М.Б., Щепниковл A.B., Конов А.Л., Шульга O.A., Скрябин К.Г. Потучение трансгснных растений картофеля, \стойчивых к гербициду биалофосу материалы II Международной научной конференции «Ьиотехночогия в расениеводстве, животноводстве и ветеринарии», M 2000, 158

4 Стародубцева A.M., Белоусова М.Б., Шульга O.A., Скрябин К.Г. Оптимизация условий трансформации российских сортов картофе-ш - материалы школы-конференции «Горизонты физико-химической биологии», Пушино, 2000, Т 1, 129

5. Стародубцева А.М., Белоусова М.Б., Щенннкова A.B., Конов АЛ., Шульга O.A., Скрябин К.Г. Генноинженерная модификация российских сортов картофеля. Arpo XXI, 2001, №5, стр.16

6. Стародубцева А.М., Белоусова М.Б., Скрябин К.Г. Оптимизация протокола трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens основных российских сортов картофеля. Отработка лабораторного регламента протокола. Методика награждена медалью «Лауреат ВВЦ» во время проведения выставки ВВЦ «Картофель-2001» с 21.02.2001 по 25.02.2001. Постановление № 13 от 23.02.2001

7. Стародубцева A.M., Помякшева Л.Б., Колонтаевская ОЛ., Белоусова М.Б., Скрябин К.Г. Получение трансгенных растений картофеля, устойчивых к грибным и бактериальным болезням. — материалы конференции «Биотехнология -2001», Пущино, 2001, стр.78 129

8. Заявка на изобретение № 2002110969 «Способ получения генетически модифицированных растений картофеля сорта Луговской с помощью Agrobacterium tumefaciens» дата приоритета ¿fy.PV. 2002 г. Стародубцева A.M., Белоусова М.Б., Шульга O.A., Конов А.Л., Скрябин К.Г.

9. Заявка на изобретение № 2002110968 «Способ получения генетически модифицированных растений картофеля сорта Невский с помощью Agrobacterium tumefaciens» дата приоритета f£^££^_2002 г. Стародубцева A.M., Белоусова М.Б., Скрябин К.Г.

Ю.Заявка на изобретение № 2002110970 «Способ получения генетически модифицированных растений картофеля сорта Голубизна с помощью Agrobacterium tumefaciens» дата приоритета eS^.P^ 2002 г. Стародубцева A.M., Белоусова М.Б., Конов АЛ., Скрябин К.Г.

11.Заявка на изобретение № 2002110967 «Способ получения генетически модифицированных растений картофеля сорта Чародей с помощью Agrobacterium tumefaciens» дата приоритета^^ (SP20Q2 г. Стародубцева A.M., Скрябин К.Г.

О "гечатачо с noej о і pu иная

Объем ! , S /? Зак _Тираж tOO

AHO <Изчатеіьогво MLXA» 127550 Москва, vi Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Стародубцева, Анастасия Михайловна

Список иллюстраций.

Список сокращений.

1. Актуальность проблемы.

2. Цели и задачи работы.

3. Научная новизна.И

4. Обзор литературы.

4.1. Трансформация растений сегодня.

4.2. Регенерация. Культивирование тканей.

4.3. Системы трансформации.

4.3.1. Трансформация протопластов.

4.3.2. Баллистическая трансформация.

4.3.3. Агробактериальная трансформация.

4.3.4. Альтернативные методы.

4.4. Селекция и маркеры.

4.5. Внедрение трансгенов и улучшение экспрессии.

4.6. Перспективы.

4.7. Взаимодействие между растением и агробактерией.

4.7.1. Введение.

4.7.2. Взаимодействие «клетка-клетка». Распознавание на клеточном уровне.

4.7.3. Сигналы трансдукции и активация транскрипции ун--генов.

4.7.4. Элементы Т-ДНК.

4.7.5. Переносимая Т-цепь. Процессинг Т-ДНК.

4.7.6. Структурная модель транспорта Т-ДНК. Т-комплекс.

4.7.7. Межклеточный транспорт.

4.7.8. Ядерный импорт .;.

4.8. Картофель как объект генно-инженерных манипуляций.

4.8.1. Эффективность трансформации и фенотипическая вариабельность трансгенных растений.

4.8.2. Создание картофеля, устойчивого к вредителям и болезням.

4.8.3. Картофель, устойчивый к абиотическим стрессам.

4.8.4. Процессы развития.

4.8.5. Применение молекулярных подходов в сельском хозяйстве.

4.9. Факторы, влияющие на эффективность трансформации.

4.9.1. Бактериальный штамм и генотип растения.

4.9.2. Тип экспланта.

4.9.3. Оптимальные условия со-культивирования.

4.9.4. Селекция.

4.9.5. Регенерация и реакция на стрессовое воздействие.

4.10. Компоненты питательных сред как факторы, влияющие на эффективность трансформации.

4.10.1. Микро- и макроэлементы.

4.10.2. Витамины.

4.10.3. Антибиотики.

4.10.4. Гормоны.

4.10.5. Ауксины.

4.10.6. Цитокинины.

4.10.7. Ауксин-цитокининовое взаимодействие.

4.10.8. Гиббереллины.

4.10.9. Абсцизовая кислота.

4.10.10. Этилен.

4.10.11. Сроки и продолжительность применения

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Стародубцева, Анастасия Михайловна

Выводы — 140 —

5 мг/л. При соблюдении этих параметров достигается эффективность регенерации 96% и трансформации 21%; - показано, что для сорта Чародей трансформационные параметры должны быть следующими: стеблевой сегмент; 1,0 мг/л БАП и 1,0 мг/л зеатина в среде для регенерации, способ со-культивации с использованием бумажного фильтра и жидкой агаризованной питательной среды, начало селекции с 14 дня трансформации, концентрация канамицина 50 мг/л, концентрация фосфинотри-цина 5 мг/л. При соблюдении этих параметров достигается эффективность регенерации 64% и трансформации 20%.

3. На основе разработанных эффективных протоколов трансформации получено 169 трансгенных линии (и.т.с.), экспрессирующие ген Ваг, в том числе 48 линий сорта Луговской, 75 линий сорта Невский и 46 линий сорта Голубизна.

4. В результате проведения двухлетних полевых испытаний отобраны 4 трансгенных линии (и.т.с.) сорта Луговской, 4 трансгенных линии (и.т.с.) сорта Невский и 4 трансгенных линии (и.т.с.) сорта Голубизна, устойчивых к гербициду фосфинотрицину. Показано, что отобранные трансгенные линии (и.т.с.) сохраняют введенный признак при вегетативном размножении и не отличаются по морфологическим признакам от контрольных нетрансформированных растений исходного сорта. Выщепления признака не обнаружено, все испытываемые трансгенные линии (и.т.с.) проявили устойчивость к действию гербицида. Проведен ПЦР анализ растений на присутствие и структурную целостность трансгенной вставки, соответствующей гену Ваг.

5. На основе разработанных эффективных протоколов трансформации получено 118 трансгенных линии (и.т.с.), экспрессирующие ген Tau II, в том числе 35 линий сорта Луговской, 55 линий сорта Чародей и 28 линий сорта Голубизна.

6. В результате проведения двухлетних полевых испытаний отобраны 8 трансгенных линий (и.т.с.) сорта Голубизна, 17 трансгенных линий (и.т.с.) сорта Луговской и 3 трансгенных линии (и.т.с.) сорта Чародей, экспрессирующие ген белка тауматин II. Отобранные линии жизнеспо

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стародубцева, Анастасия Михайловна, Москва

1. Список ЛИТЕРАТУРЫ

2. An G., Watson B.D., Chiang C.C. Transformation of tobacco, tomato, potato and Arabidopsis thaliana using a binary Ti vector system//Plant Physiology. 1986. v. 81. p. 301-305

3. Bechtold N., Ellis J., Pelletier G. In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants// Life Science. 1993.v. 316.p. 1194-1199

4. Belknap W.R., Corsini D., Pavek J.J., Snyder G.W., Rockhold D.R., Vayda M.E. Field performance of transgenic Russet Burbank and Lemhi Russet potatos// American Potato Journal. 1994 .71. p. 117-124

5. Braun A.C. A physiological basic for autonomous growth of the crown-gall tumor cell //Proceeding of the National Academy of Science USA. 1958 v.44. p. 344-349

6. Chakraborty S., Chakraborty N.f Datta A. Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a nonallergenic seed albumin gene from Amaranthus hypochondriacus //PNAS Early Edition. 2000 p. 1-6

7. Citovsky V., Zupan J., Warnick D., Zambryski P. Nuclear localization of Agrobacterium VirE2 protein in plant cells //Science. 1992. v. 256. p. 1803-1805

8. Clough S.J., Bent A. Floral dips: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana//~Pla.nt Journal. 1998. v. 16.p. 735-743

9. CricmoreN., Ziegler D., Feitelson J., Schnept E., Van Rie J., Lereclue R., Baum J., Dean D. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins //Molec. Biol.Rev. 1998 v.62 p.807-813

10. Dale J.P., Hampson K.K. An assessment of morphogenic and transformation efficiency in a range of varieties of potato (Solanum tuberosum L.)//Euphytica. 1995. v.85.p.101-108

11. Davies H.V. Recent developments in our knowledge of potato transgenic biology //Potato research. 1996 v.39. p. 411-427

12. Davies P.J. Plant propagation by tissue culture/«Plant Hormones, Physiology, Biochemistry and Molecular Biology». Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. Boston. London. 1995

13. De Block M. Genotype-independent leaf disk transformation of potato Solanum tuberosum using Agrobacterium tumefaciens //Theor. Appl. Genetic. 1988 v.76. p.767-774

14. Destefano-Beltran L., Nagpala P.G., Cetiner M.S., Dodds J.H., Janes J.M.

15. Enhancing bacterial and fungal disease resistance in plants: application to potato //Biotechnology in Plant Disease Control. 1993 p. 175-189

16. D'Hallium K. Transformation of sugar beet (Beta vulgaris L.) and evaluation of herbicide resistance in transgenic plants//Biotechnology. 1992 v.10. p309-3141992

17. DiMaio J.J., Shillito R.D. Cryopreservation technology for plant cell cultures //Journal of tissue culture menhods. 1989. v. 12. p. 163-169

18. During K., Porsch P., Fladung M., Lorz H. Transgenic potato plants resistant to the phytopathogenic bacterium Erwinia carotovora//Plant Joyrnal. 1993 v.3. p.587-598

19. Evers D., Overney S., Simon P., Greppin H., Hausman JF. Salt tolerance of Solanum tuberosum L-overexpressing an heterologous osmotin-like protein //Biologia Plantarum. 1999 v. 42(1). p. 105-1121. Список литературы — 144

20. Escudero J., Hohn B. Transfer and integration of T-DNA without cell injury in the host plant //Plant Cell Reports. 1997. v. 9. p. 2135-2142

21. Filho E.S.F., Figueiredo L.F.A., Monte-Neshich D.C. Transformation of potato (Solarium tuberosum) cv. Mantiqueira using Agrobacterium tumefaciens and evaluation of herbicide resistance //Plant Cell Reports. 1994. v. 13. p. 666-670

22. Gaffney T., Friedrich L., Vernooij B., Negrotto D., Nye G., Uknes S., Ward E., Ryals J. Requirement for salicylic acid for the induction of systemic acquired disease resistance //Science. 1993 v.261. p.745-756

23. Gelvin S.B. The introduction and expression of transgenes in plants //Current Opinion of Plant Biology. 1998. v.9. p. 227-232

24. George E.F. Plant Propagation by Tissue Culture Part I. The Technology; Part II. In Practice./ Exegetics Ltd. Edington. 1993.1995.

25. Goodwin I, Todd G, Ford-Lloyd B, Newbury HJ: The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species //Plant Cell Rep 1991 v. 9 p.671-675.

26. Grayburn W.S., Visk B.A. Transformation of sunflower (Helianthus annus L.) following wounding with glass beads //Plant Cell Reports. 1995. v. 14. P. 285-289

27. Guralnick B., Thomsen G., Citovsky V. Transport of DNA into the nuclei of Xenopus oocytes by a modified VirE2 protein of Agrobacterium //Plant Cell. 1996. v. 8. p.363-373

28. James C. Global Review of Commercialised Transgenic Crops: 1999 //ISAAA. 1999 Briefs № 12

29. D'Halluin K. Transformation of sugar beet (Beta vulggaris L.) and evaluation of herbicide resistance in transgenic plants //Biotechnology. 1992. v. 10. p.309-314

30. Hansen G., Wright M.S. Recent advances in the transformation of plants //Trends in plant science. 1999. vol.4 № 6. p.1360-1385

31. Haymes K.M., Davis T.M. Agrobacterium-mcdiated transformation of «alpine' Fragaria vesca, and transmission of transgenes to R1 progeny //Plant Cell Reports. 1998. v. 17. p. 279-283

32. Herbers K., Sonnewald U. Production of new modified proteins in transgenic plants //Current Opinion in Biotechnology. 1999 v. 10. p. 163-168

33. Holmberg N., Bulow L. Improving stress tolerance in plants by gene transfer. Trends in plants science. 1998 v.3. p. 1360-1385

34. Hoffman F. Laser microbeams for the manipulation of plant cells and subcellular structures //Plant Science. 1996.V. 113. p. 1-11

35. Ishida B.K., Snyder G.W., Belknap W.R. The use of in vitro-grown microtuber discs in Agrobacterium-mediated transformation of Russet Burbank and Lemhi Russet potatoes //Plant Cell Reports. 1989. V. 8. p.325-328

36. Kende H., Zeevaart Jan A.D. The five «classical» plant hormones //The Plant Cell. 1997. v.9. p.1197-12101. Список литературы- 145

37. Koivu K., Valkonen J.P.T., Suomaa S., Tavazza R., Pehu E. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Solanum brevidens and S. tuberosum cv. Pito //Acta Agric. Scand. Sect. B. Soil and Plant Sci. 1995. v.45. p. 78-87

38. Krens F.A., Jamar D. The role of explant source and culture conditions on callus induction and shoot regeneration in sugar beet (Beta vulgaris L.) //Plant Physiology. 1989. v.134. p. 651-655

39. Kohm B.A., Goulden M.G., Gilbert J.E., Kavanagh T.A., Baulcombe D.C. A potato virus X resistance gene mediates an induced, non-specific resistance in protoplasts //The Plant Cell. 1993 v.5. p.913-920

40. Komari T. Transformation of callus cultures of nine species mediated by Agrobacterium //Plant Science. 1989 v.60. p.223-229

41. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970 v,15;227(259):680-5

42. Leitch I.J., Bennett M.D. Polyploidy in angiosperms //Trends Plant Science. 1997. v. 2. p. 470-476

43. Lessl M., Lanka E. Common mechanisms in bacterial conjugation and Ti-mediated transfer to plant cells //Cell. 1994. v. 77. p. 321-324

44. Lin J.J., Assad-Garcia N., Kuo J. Plant hormone effect of antibiotics on the transformation efficiency of plant tissues by Agrobacterium tumefaciens cells //Plant Sciens. 1995. v.109. p.171-177

45. Lodge J.K., Kaniewski W.K., Turner N.E. Broad- spectrum virus resistance in transgenic plants expressing pokeweed antiviral protein //Proceeding of the National Academy of Science USA. 1993 v.90. 9.7089-7093

46. Lurquin P.F. Gene transfer by electroporation //Mol. Biotechnology. 1997. v. 7. p. 5-35

47. Matzke A.J., Matzke M.A. Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes //Current Opinion of Plant Biology. 1998. v. 1. p. 142-148

48. Matthysse A.G. Initial interactions of Agrobacterium tumefaciens with plant host cells //Crit. Review of Microbiology. 1986. v. 13. p. 281-307

49. Melchers L.S., Stuiver M.H. Novel genes for disease-resistance breeding //Current Opinion in Plant Biology. 2000 v.3. p. 147-152

50. Montanelli C., Stefanini F.M., Chiari A., Chiari T, Nascari G. Variability in the response to Pseudomonas solanacearum of trancgenic lines of potato carrying a cecropin gene analogue //Potato Research. 1995 v.38. p.371-378

51. Mourgues F., Brisset M-N., Chevreau E. Strategies to improve plant resistance to bacterial diseases through genetic engineering //Tibtech. 1998 v.16. p.203-210

52. Nakano N., Mii M. Antibiotics stimulate somatic embryogenesis without plant growth regulators in several Dianthus cultivars //Plant Physiology. 1993 v. 141. p. 721-725

53. Nauerby B., Billing K., Wyndaele R. Influence of the antibiotic timetin on plan regeneration compared to carbenicillin and cefotaxime in concentrations suitable for elimination of Agrobacterium tumefaciens //Plant Science. 1997. v. 123. p.169-177

54. Newell C.A., Rozman R., Hinchee M.A., Lawson E.C., Haley L., Sanders P., Kaniewski W., Turner N.E., Horsch R.B., Fraley R.T. Agrobacterium-mediated transformation of Solanum tuberosum L. cv. «Russet Burbank» // Plant Cell reports. 1991. v. 10. p.30-34

55. Okkels F.T., Pedersen M.G. The toxicity to plant tissue and to Agrobacterium tumefaciens of some antibiotics //Acta Hortic. 1988 v.225. p. 199-207

56. Park Y.D., Ronis D.H., Boe A.A, Cheng Z.M. Plant regeneration from leaf tissues of four North Dacota genotypes of potato (Solanum tuberosum L.) //American Potato Journal. 1995 v.72 (6). p. 329-3381. Список литературы — 146

57. Park, Yoonkyung, Park G., Yang Y., Cheong H. Improved in vitro regeneration of potato (Solanum tuberosum cv. Superior) transformation by Agrobacterium expressing ¡¿-glucuronidase //Journal of Plant Biology. 1996. v.39(2). p. 93-98

58. Patton D.A., Meinke D.W. High-frequency of plant regeneration from cultured cotyledons of Arabidopsis thaliana //Plant Cell Report. 1988 v. 7. p.233-237

59. Pawlowski W.P., Somers D.A. Transgenic DNA integrated into the oat genome is frequently interspersed by host DNA //Proceeding of National Academy of Science USA. 1998. v.95 p.12106-12110

60. Pen J., Sijmons P.C., Ooijen A.J.J., Hoekema A. Protein production in transgenic crops: analysis of plant molecular farming. Trangenic Plants: Fundamentals and Applications //Marcel Dekker Inc. 1993. p.239-251

61. Pollock K., Barfield D.G., Shields R. The toxicity of antibiotics to plant cell cultures //Plant Cell Reports. 1983. v.2. p.36-39

62. Shah D., Lawson C., Kaniewski W. Russet Burbank genetically improved for resistance to leaf roll virus and late blight //Seventh International Symposium on Molecular Plant Microbe Interactions. Edinburg. 1994 Abstract. S48. p.14

63. Shah D.M. Genetic engineering for fungal and bacterial diseases //Current Opinion in Biotechnology. 1997 v.8. p.208-214

64. Sheng J., Citovsky V. Agrobacterium-plant cell DNA transport: have virulence proteins, will trave //The Plant Cell. 1996. v.8. p. 1699-1710

65. Sheerman S., BewanM.W. A rapid transformation method for Solanum tuberosum using binary Agrobacterium tumefaciens vectors. //Plant Cell Reports. 1998. v.7. p.13-16

66. Shillito R.D. Methods of genetic transformations: electroporation and polyethylene glycol treatment //In Molecular Improvement of Cereal Crop (Vasil I., ed), Kluwer. The Nether land. 1999. p.9-20

67. Smirnoff N. Plant resistance to environmental stress //Current Opinion in Biotechnology. 1998 v.9. p. 214-219

68. Smith R.H., Hood E. Agrobacterium tumefaciens transformation of monocotyledons //Crop Science. 1995. v.35. p. 301-309

69. Snyder G.W. & Belknap W.R. A modifaed method for routine Agrobacterium -mediated transformation of in vitro grown potato microtubers //Plant Cell Reports. 1993. v.12. p.324-327

70. Stachel S.E., Timmerman B., Zambryski P. Generation of single-stranded T-DNA molecules during the initial stages of T-DNA transfer for Agrobacterium tumefaciens to plant cells //Nature. 1986. v.322. p. 706-712

71. Stark D.M., Timmerman K.P., Barry G.F., Preiss J., Kishore G.M. Regulation of the amount of starch in plant tissues by ADPglucose pyrpphosphorylase //Sciense. 1992 v.258. p.287-292

72. Stock J.B., Stock A.M., Mottonen J.M. Signal transduction in bacteria //Nature. 1990 v. 344. p. 395-400

73. Strittmatter G., Janssens J., Opsomer C., Botterman J. Inhibition of fungal disease development in plants by engineering controlled cell death //Biotechnology. 1995 v.13. p. 1085-1089

74. Tavazza R., Tavazza M., Ordas R.J., Ancora G., Benvenuto E. Genetic transformation of potato (Solanum tuberosum): an efficient method to obtain transgenic plants //Plant Science. 1988. v. 59. p. 175-1811. Cuucok Jiumepamypu — 147

75. Towbin H, Staehelin T, Gordon J Electrophoretic transfer of proteins from poly-acrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications //Proc Natl Acad Sci USA 1979. v.76(9):4350-4

76. Tu H.M., Godfrey L.W., Sun S.M. Expression of the Brazil nut methionine-rich protein and mutants with increased methionine in transgenic potato //Plant Mol Biology. 1998 v.37. p.829-838

77. Visser R.G.F., Somhorst I., Kuipers G.J., Ruys N.J., Feenstra W.J., Jacobsen E. Inhibition of the expression of the gene for granule-bound starch synthase in potato by antisense constructs //Molecular and General Genetics. 1991 v.225. p.289-296

78. Visser R.G.F. Genetic Modification: long term perspectives for potato breeding/Potato Wolrd-wide. Wageningen Press. 2000 p. 60

79. Wagner V.T., Matthysse A.G. Involvement of vitronectinlike protein in attachment of Agrobacterium tumefaciens to carrot suspension culture cells //Journal of Bacteriology. 1992. v. 174. p.5999-6003

80. Watts J.W., King J.M. The use of antibiotics in the culture of non-sterile plant protoplasts //Planta. 1973 v.113. p. 271-277

81. Wenzler H., Mignery G., May G., Park W. A rapid and efficient transformation method for the production of large numbers of transgenic potato plants //Plant Science. 1989. v. 63. p.79-85

82. Wilmink A., Dons J.J.M. Selective agents and marker gene for use in transformation of monocotyledonous plant //Plant Molecular Biology Reports. 1993. v.ll. p. 165-185

83. Wordragen M.F. & Dons H.J.M. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of recalcitrant crops //Plant Molecular biology reporter. 1992. v. 10(1). p. 12-36

84. Wu G., Shortt B.J., Lawrence E.B., Levine E.B., Fitzsimmons C., Shad D.M.

85. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H202-generating glucose oxidase in transgenic potato plants //The Plant Cell. 1995 v.5. p. 1357- 1368

86. Xu H., Khalilian H., Eweida M., Squire S., Abouhaidar M.G. Genetically engineered resistance to potato virus X in four commercial potato cultivars //Plant Cell Reports. 1995. v. 15. p. 91-96

87. Yang D.S.C., Sax M., Chakrabaartty A., Hew C.L Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications //Nature. 1988 v.333. p.232-237

88. Yao K., De Luca V., Brisson N. Creation of metabolic sink for tryptophan alters the phenylpropanoid pathway and the susceptibility of potato to Phytophthora infestans //The Plant Cell. 1995 v.7. p. 1787-1799

89. Zambryski P. Chronicles from the Agrobacterium- plant cell DNA transfer story //Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1992. v. 43. p. 465-490

90. Zhu В., Chen T.H.H., Li P.H. Analysis of late-blight disease resistance and freezing tolerance in potato plants expressing sense and antisense genes for an osmtin-like protein //Planta. 1996 v. 198. p.70-77

91. Zupan J., Muth T.R., Draper O., Zambryski P. The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights //The Plant Journal. 2000. v.23 (1). p. 11-28

92. Zupan J., Zambryski P. Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the plant cell //Plant physiology. 1995. v. 107. p. 1041-1047

93. Глагоцкая Т.Ц., Щербатенко И.С., Сидоров В.А., Шульга О.А., Захарьев В.М., Скрябин К.Г., Глеба Ю.Ю. Трансгенные растения картофеля, обладающие устойчивостью к вирусным инфекциям //ДАН УССР 10. серия Б. с.57-59. 1990.а

94. Глагоцкая Т.Ц., Шульга О.А., Сидоров В.А., Захарьев В.М., Скрябин К.Г., Глеба Ю.Ю. Трансгенные растения картофеля с чужеродным геном белка оболочки Х-вируса картофеля //ДАН СССР 314. №5. с. 1240-1242. 1990.

95. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений Лабораторное руководство/Москва «Мир». 1991 408 стр.

96. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований)/ М.: Агропромиздат.1985 351 е. ил.

97. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование/Москва «Мир». 1984 480стр.

98. Создание трансгенных растений//Вкладыш журнала «Химия и жизнь-XXI век». Москва 2001

99. Соколова М.А., Пугин М.М., Шульга О.А., Скрябин К.Г. Получение трансгенных растений картофеля, устойчивых к У-вирусу картофеля// Мол.биол. 28. с. 1002-1008. 1994.

100. Падегимас Л., Шульга О.А., Скрябин К.Г. Тестирование трансгенных растений, при помощи полимеразной цепной реакции//Мол.биол.т.27.с.947-951.1993

101. Падегимас Л. Шульга О.А., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum и Solanum tuberosum, устойчивых к гербициду фосфинотрицину//Мо л. био л .т.28с.437-443.1994

102. Пугин М.М., Соколова М.А., Шульга О.А., Скрябин К.Г. Влияние 5'-лидера X-вируса картофеля на экспрессию гена белка оболочки У-вируса картофеля в трансгенных растениях Solanum tuberosum//Мол.биол. 28. с.752-760. 1994.