Изменчивость в культуре картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro и возможности ее использования в селекции и семеноводстве

Леонова, Нина Семеновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменчивость в культуре картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro и возможности ее использования в селекции и семеноводстве
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Изменчивость в культуре картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro и возможности ее использования в селекции и семеноводстве"

На правах рукописи

ЛЕОНОВА Нина Семеновна

ИЗМЕНЧИВОСТЬ В КУЛЬТУРЕ КАРТОФЕЛЯ (Solanum tuberosum L.) IN VITRO И ВОЗМОЖНОСТИ ЕЁ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВЕ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Улан-Удэ-2010

00469504

004605042

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Апцупова Татьяна Петровна

доктор биологических наук Рожанская Ольга Александровна

доктор сельскохозяйственных наук Кушнарё'в Анатолий Григорьевич

Ведущая организация Учреждение Российской Академии наук

«Сибирский институт физиологии и биохимии растений» СО РАН, (г. Иркутск)

Защита диссертации состоится июня 2010 года па заседании объединённого диссертационного совета ДМ 212.039.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Восточно-Сибирский государственный технологический университет» (ГОУ ВПО ВСГТУ) по адресу: 670013 Республика Бурятия г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40 В.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ВСГТУ. Автореферат разослан _ _2010 г.

Ученый секретарь

объединённого диссертационного совета, ¿Р -

доктор технических наук, профессора ЛуА&Л^е&к— Н.И. Хамнаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы определена значением картофеля в качестве продовольственной культуры потребляемой более 3-х млрд человек населения планеты. Его выращивают в 150 странах мира. Ареал возделывания картофеля простирается от приполярной Финляндии до высокогорий Эквадора и Кении. По прогнозу рост мирового производства данной культуры к 2020 году составит 40 %. В России выращивают более 10 % общемирового валового сбора картофеля. Являясь одним из лидеров по количеству производимой продукции, наша страна остаётся на одном из последних мест по урожайности. Одна из проблем производства картофеля состоит в том, что он в значительной степени поражается вирусными, бактериальными и грибными заболеваниями и вредителями. Восприимчивость картофеля к болезням и вредителям сделала его культурой номер два в мире по использованию пестицидов. Экономическая ситуация в России требует создания новых сортов картофеля, отличающихся от сортов «интенсивного типа», выведение которых было главной задачей селекции в период 90-х годов прошлого века. Современные сорта должны обладать комплексной устойчивостью к вирусным заболеваниям, фитофторозу, колорадскому жуку и к цистообразующим нематодам. Кроме того, в каждой конкретной зоне возделывания картофеля существуют патогены локального значения. В Сибири, где длинная холодная весна и жаркое сухое лето, возделываемые сорта должны обладать устойчивостью к ризокгониозу. Использование методов биотехнологии и генетической инженерии открывает новые перспективы получения таких растений. Нельзя утверждать, что с помощью одной лишь сельскохозяйственной биотехнологии можно решить все имеющиеся в мире проблемы, связанные с нехваткой продовольствия, но также и нельзя настаивать на том, что необеспеченность продовольствием можно устранить без применения биотехнологии. Необходимость внедрения в сельское хозяйство нетрадиционных технологий, которые позволили бы поднять на новый уровень производство продуктов питания, в последние годы ощущается все с большей остротой. Для селекционного процесса аспекты клеточной биотехнологии растений имеют огромные перспективы. Одно из важнейших направлений в биотехнологии растений занимает клеточная селекция, а также методы оздоровления от вирусных и других инфекций вегетативно размножаемых культур.

Наряду с прикладными биотехнологическими аспектами применения новых подходов селекции неоценимо значение этих работ для развития фундаментальных вопросов генетики и эпигенетики, а также молекулярной биологии и физиологии растений.

Настоящее исследование имеет теоретико-прикладной характер и представляет определенный интерес: как в биологическом, так и в генетико-селекционном плане.

Цель и задачи исследования

Цель заключалась в оценке фенотипической и генотипической изменчивости в культуре картофеля in vitro под воздействием экзогенных факторов и выявлении возможности использования данной изменчивости в создании новых методов селекции.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Проанализировать фенотипы спонтанных сомаклональных вариантов, возникающих при регенерации в культуре картофеля in vitro, и почковых вариаций.

2. Выявить возможность использования культурального фильтрата Rhizoctonia solani в качестве селективного фактора для получения форм картофеля, устойчивых к данному патогену

3. Изучить влияние фитогормонального состава сред и других экзогенных факторов культивирования in vitro на экспрессию генов, контролирующих синтез белка и аминокислотный состав растворимых белков картофеля, на разных стадиях дифференциации.

4. Проследить влияние фитогормонального состава сред культивирования и стадии дифференциации на экспрессию генов, контролирующих изоферментны.

5. Оценить возможность использования бактериальной эндонуклеазы, продуцируемой Serratia marcescens, в качестве противовирусного препарата при оздоровлении картофеля от вирусной инфекции методом апикальной меристемы, при микроклональном размножении.

6. Создать коллекцию генофонда картофеля, оздоровленного методом апикальной меристемы от вирусной и грибной инфекции, и показать преимущество использования оздоровленного картофеля в оригинальном семеноводстве ЗападноСибирского региона для получения высоких урожаев экологически безопасного товарного картофеля.

Научная иовизиа работы

Установлено, что экспрессия генов, контролирующих синтез растворимых белков и изоферментов, изменяется в зависимости от стадии дифференциации. Электрофоретический спектр белков у интактных растений представлен значительно большим числом фракций, чем спектр каллусной культуры. Различается также состав аминокислот у интактных растений и каллусной культуры, имеющей на одну аминокислоту больше, чем интактные растения.

Кроме того, установлено, что наблюдаемая в культуре in vitro изменчивость экспрессии генов, кодирующих синтез растворимых белков и изоферментов, носит обратимый характер, что свидетельствует о смене активного и неактивного состояния генов в ходе онтогенеза и указывает на эпигенетический характер данного процесса.

Показано, что изменения в культуре in vitro могут происходить не только на стадии клеточной культуры, но и в интактных растениях в виде почковых вариаций, которые наследуются в ряду вегетативных репродукций.

Разработан метод селекции на устойчивость к патогенному грибу Rhizoctonia solani на основе использования культурального фильтрата данного гриба в качестве селективного фактора. Показано, что можно получать направленные сомаклональные изменения, проводя отбор с помощью селективных факторов не только на клеточном уровне, но и на уровне интактных растении, что позволяет вести селекцию, минуя стадию регенерации, являющуюся самым «узким» местом в процессе получения направленных изменений.

Разработан метод оздоровления картофеля от вирусной инфекции путем воздействия бактериальной эндонуклеазы Serratia marcescens на культивируемую апикальную меристему, и получены генетически модифицированные растения картофеля, экспрессирующие ген секреторной нуклеазы Serratia marcescens на сорте Белоярский ранний.

Практическая значимость работы

Установленный эпигенетический характер изменчивости в культуре in vitro, позволяет получать направленные изменения. Именно на этом теоретическом

положении основан разработанный метод селекции на устойчивость к патогенам и другим стрессовым факторам.

На основе использования в качестве селективного фактора культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani получены формы картофеля, устойчивые к ризоктониозу.

Разработанный метод оздоровления картофеля от вирусной, бактериальной и грибной инфекций путем применения в качестве хемиотерапевтического препарата бактериальной эндонуклеазы, продуцируемой Serratia marcescens, позволяет не только существенно повысить выживаемость вычленяемой меристемы, но и увеличить выход здоровых растений из регенерировавших меристем. Это существенно облегчает и удешевляет биотехнологические стадии в семеноводстве как самые трудозатратные при оздоровлении картофеля и является стимулирующим фактором при микроклоналыюм размножении.

На основе разработанного метода создана коллекция генофонда оздоровленного картофеля, которая служит базовым фондом для оригинального семеноводства в Западно-Сибирском регионе.

Результаты исследований использованы н внедрены:

- в оригинальном семеноводстве Западной Сибири используется созданная коллекция генофонда картофеля с использованием разработанного метода применения бактериальной эндонуклеазы в освобождении от вирусной инфекции.

- акты внедрения приложены в диссертации.

Апробация работы

Основные результаты были представлены на: 4-ом Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987); 5-м Съезде ВОГиС (Москва, 1987); Всесоюзном симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1987); Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988); Межреспубликанском совещании "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" (Рига, 1989); Международной конференции «Частная генетика растений» (Киев, 1989); Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений" (Алма-Ата, 1993); Международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений" (Киев, 1994); б-ом Съезде ВОГИС (Саратов, 1994); 3-ем Российском семинаре "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1995); Международной конференции "Биология клеток растений, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997); "Third International symposium in Rhizoctonia" [1SR-2001] National Chung Hsing University Taichung (Taiwan, 2001); Генетико-селекционных школах (Новосибирск, 1994, 1999, 2004); Международной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001); IV Международной конференции «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений» (Ульяновск, 2002,); Международных конференциях Института картофелеводства HAH Беларуси (Минск, 2003, 2007, 2008); 2-ой Конференции Московского общества генетиков и селекционеров имени Н.И.Вавилова (Москва, 2003); Международной научно-практической конференции «Современные технологии производства сельскохозяйственных культур в Сибири» (Новосибирск, 2005); Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение картофелеводства Сибири и Дальнего Востока: состояние, проблемы и перспективные направления» (Кемерово, 2006); Международной конференции

«Научное наследие Н.И.Вавилова — фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007).

В 1991г. работа была награждена серебряной медалью ВДНХ СССР «За научные разработки по применению бактериальной эндонуклеазы в борьбе с вирусным вырождением картофеля». В 2000 г. на Сибирской ярмарке на выставке «Наука 2000 городу и области» за создание коллекции генофонда оздоровленного картофеля работа была награждена малой золотой медалью выставки.

Публикация

По теме исследования опубликовано 34 работы, в том числе 11 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

Издан каталог «Распространенные и перспективные сорта картофеля коллекции ИЦиГ СО РАН».

Кроме того, получено авторское свидетельство «Способ выращивания картофеля» от 15.04.1990г. № 1585328 и патент «Способ селекции картофеля на устойчивость к ризоктониозу» № 2217906 от 10.12.2003 г., Москва.

Объём и структура

Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста, состоит из следующих глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение исследования, Использование в семеноводстве, Выводы и Литература. Библиографический указатель включает 274 источника, из них 92 публикации в отечественной литературе, 182 в зарубежной печати. Диссертация иллюстрирована 30 рисунками и содержит 26 таблиц.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изменения в культуре in vitro можно вызвать как на клеточном уровне, так и на уровне интактных растений, а используя селективные факторы, можно получать направленные изменения. Это показано в селекционном процессе с помощью разработанного метода получения устойчивых к Rhizoctonia solani растений картофеля.

2. Экспрессия генов, контролирующих синтез растворимых белков и изоферментов, а также аминокислотный состав, изменяются в зависимости от стадии дифференциации в культуре in vitro. Возникающие новые состояния экспрессии генов стабильны в период прохождения той или иной стадии дифференциации, но носят обратимый характер: спектры белка и изоферментов при переходе от интактных растений к каллусной культуре изменяются, но у растений-регенерантов вновь восстанавливаются, что указывает на наличие процессов репрессии и дерепрессии генов в зависимости от стадии дифференциации. Стабильность и обратимость выявляемых изменений свидетельствует о том, что данные изменения могут иметь эпигенетическую природу.

3. В культуре in vitro элекгрофоретические спектры растворимых белков и изоферментов изменяются в зависимости от фитогормонального состава сред культивирования.

4. Бактериальная эндонуклеаза, продуцируемая Serratia, marcescens, обладает как противовирусным, так и стимулирующим эффектом при оздоровлении картофеля методом апикальной меристемы и при микроклональном размножении. Стимулирующий эффект от воздействия эндонуклеазы в культуре in vitro сохраняется и после высадки обработанной пробирочной культуры в почву.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Работа посвящена изучению физиолого-биохимических и генетических процессов, происходящих при культивировании картофеля in vitro, а также анализу влияния состава сред культивирования на прохождение стадий дифференциации, дедифференциации и редифференциации, и выявлению возможности направленного влияния на происходящие на данных стадиях изменения для их практического использования.

Глава 1. Обзор литературы

Приведен анализ отечественной, зарубежной и патентной литературы. Проанализированы методы культуры растительных клеток in vitro, широко используемые для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физиологии и генетики растений. Установлено, что многие фенотипические и генотипические изменения, обнаруженные среди растений, прошедших стадию неорганизованного роста, являются следствием культивирования in vitro. Дальнейшие исследования подтвердили, что прохождение клетками стадии неорганизованного роста in vitro способствует их изменению и возникновению новых форм растений - сомаклональных вариантов. Генетическая природа н механизмы возникновения соматических изменений пока мало изучены. Поэтому для управления сомаклональной изменчивостью важно понять её причины и размах. Хотя расшифровка первичной нуклеотидной последовательности ДНК позволила ответить на ряд важнейших вопросов о структурной организации генома, тем не менее, полученных данных пока недостаточно для понимания закономерностей реализации наследственной информации в ходе индивидуального развития и механизмов формирования широкого фенотипического разнообразия организмов.

Обсуждены проблемы изучения механизмов, обеспечивающих специализацию клеток, обладающих одним и тем же геномом. Гены, детерминирующие какой-либо признак, действительно остаются в онтогенезе у каждого организма одинаковыми, но для каждого из признаков существует своя схема регулирования их активности в той или иной клетке. Обратимые изменения активности генов в процессе индивидуального развития организма, не связанные с нарушением нуклеотидной последовательности ДНК, но приводящие к сохранению неактивного или активного состояния генов в ряду клеточных поколений, называют эпигенетическими (Гвоздев, 1999). Элементарным событием дифференцировки может быть процесс репрессии или дерепрессии гена, а элементарным событием морфогенеза предлагается считать наработку белка каким-либо геном, активированным на данной стадии развития (Голубовский, 2000).

Приведены данные, свидетельствующие о том, что изменчивость, обусловленная возможностью существования множественных эпигенетических состояний, в отличие от ненаправленной генной изменчивости может быть связана с состоянием среды. Таким образом, эпигенная изменчивость, как правило, не носит случайный характер и может привести к формированию новых вариантов наследственных программ онтогенеза. Следовательно, основной особенностью эпигена является возможность целенаправленного изменения содержащейся в них наследственной информации без изменения нуклеотидной последовательности генома (Чураев, 1987).

Изменения активности генов, происходящие в культуре in vitro, появление почковых вариаций и возможности их использования в селекционных процессах мы

попытались проследить в своих исследованиях. Немаловажной проблемой является и проблема вирусного вырождения картофеля, решать которую на данном этапе пока можно только, в основном, в культуре in vitro.

Глава 2. Материалы и методы

Все работы выполнены на растениях коллекции генофонда картофеля, оздоровленного методом апикальной меристемы и поддерживаемого в асептических условиях. Растения выращивали при температуре 24-26°С с 16-ти часовым фотопериодом при освещенности в 4000 люкс. При оздоровлении исходного материала дополнительно применялся разработанный нами метод хемиотерапии с использованием эндонуклеазы, продуцируемой Serratia marcescens. Селекция на устойчивость к ризокгониозу проводилась на средах MS (Murashige, Skoog 1962) с добавлением культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani двух штаммов.

Изменение экспрессии генов, контролирующих синтез водорастворимых белков и изоферментов картофеля в культуре in vitro, определяли по электрофоретическим спектрам, выявляемым после электрофореза белков в поли акр иламиднои геле и изоферментов - в крахмальном геле.

Для оценки устойчивости к патогену Rhizoctonia solani растения картофеля высаживали в вазоны с грунтом, искусственно зараженным двумя штаммами R. solani.

При изучении влияния эндонуклеазы на концентрацию вирусов в растениях картофеля, а также на развитие и рост растений использовали стерильный коммерческий препарат бактериальной эндонуклеазы с активностью 10000-20000 ед. на миллиграмм препарата (ME), произведенный НИКТИ Биологически активных веществ. Данный препарат бактериальной эндонуклеазы получен из микроорганизма Serratia marcescens штамм В-10 M-I. Наличие вирусов в растениях определяли электронно-микроскопическим и иммуно-ферментным методами. Использовали методические указания производителей иммуноферментных диагностикумов.

При статистической обработке полученных результатов использовали методики, представленные в руководствах «Статистические методы в применении к исследованиям в сельском хозяйстве и биологии» (1961) и «Прикладная статистика на компьютере» (2004).

Глава 3 Фенотиническая изменчивость у картофеля и возможности

её использования в селекции

Несмотря на то, что использование сомаклональных вариаций в селекции предложено четверть века тому назад, на их основе создано очень мало сортов. Причины лежат в высокой частоте вариаций, «ухудшающих» селекционные качества, и низкой частоте «улучшающих» вариаций. Важным фактором, влияющим на сомаклональную изменчивость, являются условия регенерации растений, среди которых важнейшее место принадлежит среде культивирования. Находящиеся в условиях in vitro недифференцированные каллусные культуры лишены тонкой, сбалансированной регуляции, присущей целостному организму. В связи с этим на стабильность и изменчивость каллусной культуры сильное влияние оказывает длительность ее пребывания в стадии неорганизованного роста. Как правило, при соматическом эмбриогенезе время прохождения цикла дедифферещированная клетка - растение значительно короче, чем при регенерации растений через органогенез и, следовательно, степень изменчивости при соматическом эмбриогенезе ниже, а сходство получаемого материала и исходного родительского генотипа может

быть выше. Различные типы морфогенеза (соматический эмбриогенез или органогенез), регулируемые главным образом геномом, а также содержанием и соотношением экзогенных фитогормонов, могут неодинаково сказываться на геноме и приводить к изменениям, по-разному проявляющимся впоследствии на фенотипе растений. От пути регенерации растений зависит степень их генетической изменчивости. Поэтому все большее значение приобретают работы, целью которых является направленная регуляция генетических процессов. Значительные успехи в индукции различных вариантов и форм растений при использовании методов культуры in vitro достигнуты при работе с вегетативно размножаемыми растениями, новые варианты которых, обладающие важными хозяйственными наследуемыми признаками, могут быстро тиражироваться.

В задачу исследований входил анализ спонташюй сомаклональной изменчивости растений разных сортов картофеля по маркерным признакам: форма и высота куста, форма и окраска клубня, окраска цветка и цвет мякоти. Данные морфологического анализа представлены в таблице 1.

Таблица 1. Сомаклональная изменчивость растений-регенерантов картофеля

Сорт Общее Количество регенерантов с измененной

количество морфологией

регенерантов форма и высота куста окраска цветка форма клубня окраска клубня цвет мякоти

Мутант-987 186 16 4

Приекульский 25 2 1

Темп 40

Лорх 57

Хеша 208 89 36 44

Не по всем выбранным маркерным признакам выявлена изменчивость: стабильными оказались окраска цветка и цвет мякоти. Неизменность окраски цветка очень хорошо согласуется с тем, что цветок относится к консервативным органам, характеризующимся очень слабой изменчивостью. Менее изученным является признак окраски мякоти. Все исследованные сорта имели белую окраску мякоти, и только сорт Хеша имел желтую окраску мякоти. Все типы окраски мякоти сохранились и в регенерантах.

Сорт Хеша который обладал наибольшей изменчивостью по окраске и форме клубня. Исходный сорт имеет округлую форму клубня с глубокими глазками, с красно-фиолетовой окраской кожуры и желтой мякотью. У сомаклонов отмечены все переходы в окраске клубня от красно-фиолетовой до желтой, включая пестроокрашенные.

Известны три независимых фактора окраски клубней: Я — для красного окрашивания, Р - синею и £> - фактор проявления окраски. Растения с генами Ли Р, но без гена О имеют белые клубни, генотипы Рй - синие и ЯЛ - красные.

Из исследуемых 5 сортов мутант-987 имел светло-розовую окраску клубней, а Приекульский, Темп и Лорх - белую, сорт Хета - красно- фиолетовую. Наличие красно-фиолетовой окраски клубней свидетельствует о том, что сорт Хета имел экспрессивный ген проявления Л. Наличие полиморфизма и мозаицизма среди полученных регенератов свидетельствует о репрессии фактора проявления окраски й не только в части потомства, но и в отдельных частях клубня. Известно, что мозаицизм является характерным признаком эпигенетической изменчивости.

Форма клубня варьировала от округлой до продолговатой. Каждый измененный клубень стал родоначальником клона, и эти клоны изучались в полевых условиях. Измененная окраска и форма клубня сохранялись в течение 10 репродукций. Высокая частота обнаруженных изменений, на много порядков превышающая частоту мутационных событий, а также сохранение этих изменений в ряду поколений клонов свидетельствуют о том, что данные изменения можно классифицировать как эпигенетические и вегетативно-наследуемые.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что сомаклональная изменчивость зависит от генотипа исходного растения, и она может быть источником генетической изменчивости по целому ряду признаков.

Мощным стимулом для изучения сомаклональной изменчивости явилась возможность практического применения спонтанной вариабельности in vitro. В то же время метод получения генетически измененных форм растений через культуру in vitro имеет существенные недостатки. Один из главных недостатков — отсутствие методов направленной селекции нужных вариантов. В ряде случаев процесс получения спонтанных сомаклональных вариантов, их идентификация и оценка в полевых опытах заканчивались отрицательными результатами.

Важное значение приобретает исследование возможности индукции определенных признаков. Поэтому индуцированный мутагенез часто используется для получения широкого спектра мутантов, позволяющего перейти от изучения классической системы ген - признак к уровню ген - фермент, т.е. к уровню цепей реакций биосинтеза.

В связи с тем, что картофель является тетраплоидом с перекрестным типом размножения, уровень гетерозиготности его сортов достаточно высок. Поэтому для сохранения сортоспецифической гетерозиготности картофеля, как вегетативно размножаемой культуры, метод обработки мутагеном семян неприемлем, так как при такой обработке сортовые признаки расщепляются в потомстве. В данной ситуации при использовании картофеля в селекции in vitro эффективным оказался метод обработки мутагеном черенков и интактных растений.

Классическим примером может служить модельная система хлорофиллдефектных мутантов, где хлорофиллдефектность является маркером при проведении отборов. Анализ мутаций хлорофиллдефектности широко используется в работах по мутационной активности мутагенов, для определения частоты мутаций и оптимальных мутагенных доз.

Для получения хлорофиллдефекгных форм использовали уже не метод клеточной селекции, где на клеточном уровне ведутся обработки, а затем из измененной клеточной кулмуры получают регенераты, а метод почковых вариаций. С этой целью использовали побеги с пазушными почками растущих in vitro растений картофеля. Этот метод позволяет избегать стадию регенерации при получении мутантных форм. В экспериментах зеленые интактные пробирочные растения были обработаны химическим мутагеном ЭМС (этилметансульфонатом) и расчеренкованны. В полученных микроклонах из пазух данных черенков выделялись химерные по хлорофиллдефектности растения (рис.1).

Абсолютная частота появления пестролистных химер, определяемая как отношение количества пестролистных растений к общему числу высаженных после обработки мутагеном черенков, для сорта Лошицкий равнялось 17,8%, для Дезире — 26,4%, для сорта Темп — 38,6%. При дальнейшем микроклональном размножении и отборе на хлорофиллдефектность были отобраны почти полностью хлорофиллдефектные растения. Зеленая часть листа у таких растений была только вдоль основных жилок, или оставалась лишь небольшим сегментом у основания.

Такие растения при микроклональном размножении поддерживались в течение 3-х лет, т.е. не менее 30 вегетативных репродукций в пробирочной культуре.

Образовавшиеся пестролистные

формы снова пропускали через этап микроклонального размножения. Данную процедуру повторяли несколько раз. Но уже во втором после обработки мутагеном вегетативном потомстве из почки, расположенной в пазухе химерного листа, наблюдалось выщепление однородных хлорофиллдефектных побегов. В некоторых случаях растения характеризовались

различными морфологическими аномалиями и угнетенным ростом.

Рис.1. Химерное хлорофиллдефектное растение сорта Deziree.

Результаты проведенного модельного эксперимента по получению хлорофиллдефектных растений показали, что можно получать почковые вариации, и данные изменения будут сохраняться в последующих репродукциях у вегетативно размножаемых культур. Но используемые в качестве индуктора почковых вариаций химические мутагены дают большой процент хлорофиллдефектности, что крайне нежелательно при получении хозяйственно-ценных продуктивных форм.

Стабильность проявления измененных признаков свидетельствует о возможности и необходимости более эффективного внедрения различных приемов сомаклональной изменчивости в практику селекционной работы. Наиболее реальным является применение сомаклональной изменчивости для улучшения или «доработки» уже существующих сортов или линий но отдельным признакам.

Поэтому остается актуальным дальнейшее изучение регуляции изменчивости, и определение условий увеличения спектра сомаклональной изменчивости. В каждом конкретном случае необходимо детальное изучение природы сомаклональной изменчивости, анализ наследования новых признаков и наличие селективных факторов для отбора нужных сомаклональных вариантов.

При использовании методов биотехнологии в селекционном процессе решающую роль играет наличие селективных сред и надежных маркерных признаков. Так, с использованием селективных сред можно вести отбор растений на устойчивость к ряду болезней. Проведение данных экспериментов позволило нам разработать метод получения направленных изменений с использованием селективных факторов.

В связи с развитием методов биотехнологии проводится поиск новой стратегии в селекции картофеля. Это связано с тем, что картофель, будучи вегетативно размножаемой культурой, стал частично стерильным. Стерильность сортов картофеля проявляется в том, что часть сортов просто не цветет, другие сорта цветут, но не дают ягод, а третьи образуют ягоды, в которых отсутствуют семена. Поэтому селекционеры сталкиваются со значительными трудностями при подборе комбинационных пар для скрещивания и получения гибридов. Все это делает актуальным создание новых методов индукции in vitro , выявления сомаклональных изменений и их селективного отбора.

Цель исследований состояла в разработке метода селективного отбора устойчивых к ризоктониозу форм картофеля с использованием биотехнологических методов. Схема эксперимента состояла в индукции изменчивости с помощью

облучения и последующего отбора на средах с культуральным фильтратом гриба Rhizoctonia solani, который использовался в качестве селективного фактора.

Для индукции изменений обработку исходного материала химическими мутагенами считали нецелесообразной, потому что она дает, как правило, большой процент хлорофиллдефектных вариаций, что снизит продуктивность полученных форм. Поэтому использовали обработку гамма лучами, для чего исходные интактные растения картофеля, выращенные in vitro, облучали гамма лучами в дозе 1500-4000 рентген. Наиболее удачной оказалась доза в 3000 рентген. Облученные растения разрезали на черенки, каждый из которых имел по нескольку пазушных почек. Черенки высаживали на селективную среду, состоящую из среды MS и культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani, представленного двумя штаммами Rhizoctonia solani AG-3, отличающимися по фитотоксичности. Исследовалось в общей сложности более 100 различных вариантов, чтобы подобрать для каждого сорта сублетальную концентрацию культурального фильтрата (Рис. 2). Контроль выращивали только на среде MS. В дальнейшей работе использовали те концентрации, на которых выжили единичные растения. На рис. 2 такая концентрация была в пробе 3.

Сначала черенки помещали на среду, содержащую менее токсичный штамм 1. Выжившие побеги микроклонально размножали на среде MS и высаживали на новую селективную среду, содержащую более фитотоксичный штамм 2. Для более жесткого отбора на среде со штаммом 2 преимущественно использовали концентрацию культурального фильтрата выше 75%.

Добавление культурального фильтрата ведет к ингибированию роста побегов из пазушных почек и корней, которое усиливается по мере увеличения концентрации культурального фильтрата, как первого, так и второго штаммов. Состояние черенков ухудшалось с увеличением концентрации фильтрата и, соответственно, токсинов. Наблюдалось пожелтение, а затем потемнение ткани, в дальнейшем растения погибали. Однако единичные побеги выживали (рис. 2, комбинация 3). Процент выживаемости варьировал в зависимости от сорта картофеля и концентрации культурального фильтрата. Эти выжившие единичные побеги отсаживали на обычную микроклональную среду, а выросшие из них растения подвергали вторичному отбору.

К 12 3 4

Рис. 2. Отбор на разных концентрациях культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani (штамм №1). К - контроль. Растения растут на среде MS; 1-1 часть культурального фильтрата + 3 части среды MS; 2-2 части культурального фильтрата + 2 части среды MS; 3 — 3 части культурального фильтрата + 1 часть среды MS; 4 - 100% культурального фильтрата.

Выжившие на второй селективной среде почки снова микроклонально размножали, и растения высаживали в вазоны с грунтом, искусственно зараженным

одновременно двумя штаммами Л solani. Через 3 месяца вегетации проводили учет на зараженность и определяли штдекс развития болезни R, который определяли по формуле:

R = V (а • «) ■ 100% / NK , где: а - количество пораженных стеблей; в -соответствующий балл поражения; N - количество учтенных растений; К - высший балл шкалы.

Растения, имеющие при выращивании в вазонах с зараженным грунтом нулевой индекс развития болезни, считали устойчивыми. Такие растения картофеля отбирали и были переданы в селекционные учреждения для дальнейшего изучения и использования в селекционных схемах в качестве исходного материала, устойчивого к ризоктониозу (таблица 2).

Проведенный двукратный отбор при очень жестких условиях второго отбора на 100% культуралыюм фильтрате штамма № 2 дает возможность отобрать растения с нулевым индексом развития болезни, т.е. устойчивые формы. Растения сорта Сайте при однократном отборе на первой селективной среде с 40% концентрацией культурального фильтрата имели индекс развития болезни 20%, а прошедшие двукратный отбор имели 1гулевой индекс развития болезни. Растения сорта Адретта менее устойчивы к ризоктониозу. В контроле растения сорта Санте имели 40% индекс развития болезни, а Адретты 80% и растения после однократного отбора имели индекс 60%. Но после двукратного отбора некоторые растения имели нулевой индекс.

Таблица 2. Влияние отбора на культуральном фильтрате R. solani на устойчивость картофеля к ризоктониозу___

Сорт Обработка Концентрация культурального фильтрата A solani (%) Индекс Развития болезни в %

первый отбор второй отбор

Санте Контроль (необлученные) 0 0 40

3000 рентген 40 0 20

3000 рентген 20 100 0

3000 рентген 50 100 0

Адретта Контроль (необлученные) 0 0 80

3000 рентген 40 0 60

3000 рентген 20 100 0

3000 рентген 50 100 0

О том, что сорта имеют разную устойчивость к ризоктониозу говорят и данные приведенные в таблице 3.

Таблица 3. Влияние генотипа сорта картофеля на результаты отбора на культуральном фильтрате Я. $о1ат к заболеванию ризоктониозом_

Обработка Сорт Концентрация фильтрата, % Индекс развития болезни в %

Контроль (облученные) Русте 0 40

Контроль (необлученные) Русте 0 40

3000 рентген Русте 50 20

Контроль (облученные) Ранний желтый 0 20

Контроль (необлученные) Ранний желтый 0 30

3000 рентген Ранний желтый 50 0

Контроль (необлученные) Роза Сибири 0 30

3000 рентген Роза Сибири 50 0

Контроль (необлученные) Снегирь 0 60

3000 рентген Снегирь 50 20

Контроль (необлученные) Адретта 0 80

3000 рентген Адретта 50 30

В связи с тем, что в данном эксперименте использовали сразу два воздействия на растения (облучение и культуральный фильтрат), предварительно использовали два контроля па сортах Русте и Ранний желтый. Эти контроли характеризовались тем, что в них использовались либо облученные, либо необлученные растения, но в обоих случаях не было культурального фильтрата в средах выращивания. Контрольные исследования показали, что облучение либо не влияет на развитие болезни (у сорта Русте), либо только слегка снижает индекс развития болезни (у сорта Ранний желтый). Эти контрольные эксперименты позволили далее оценивать роль генотипа сорта в ответе на воздействие культурального фильтрата гриба.

Так, сорта Роза Сибири, Ранний желтый и Русте более устойчивы, чем Снегирь и Адретта. У сортов Роза Сибири и Ранний желтый были получены растения с нулевым индексом развития болезни сразу после первого отбора, а у неустойчивых сортов получены у сорта Снегирь растения с 20% индексом по сравнению с 60% в контроле, а у Адретты с 30% по сравнению с 80% индексом в контроле.

На основе этих экспериментов быя разработан метод селекции на устойчивость к ризоктониозу, с использованием биотехнологических методов почковых вариаций. Предложеный метод позволяет уменьшить объемы исследуемого материала, заменив трудоемкие полевые работы при традиционной селекции на биотехнологические методы. Кроме того, данный метод, основанный на использовании почковых вариаций, позволяет исключить стадию каллусной культуры и, соответственно, стадию регенерации, являющуюся узким местом в биотехнологических методах при их использовании на всех культурах и особенно на картофеле.

Необходимость замены клеточной селекции на метод почковых вариаций обусловлена тем, что у картофеля практически нельзя получить регенераты из суспензионной культуры, и у картофеля отсутствует соматический эмбриогенез. При регенерации из каллусной культуры через органогенез трудно избежать сомаклональной изменчивости, возникающей при неорганизованном росте каллуса. Но картофель хорошо переносит микроклональное размножение, что и было использовано.

Наличие же селективных факторов при отборе в селекционном процессе с использованием методов биотехнологии играет решающую роль. Так с

использованием селективных сред можно вести отбор растений на устойчивость к ряду болезней и других стрессовых факторов.

Предложенный способ отбора форм, устойчивых к ризоктониозу, имеет существенные преимущества по сравнению с другими биотехнологическими методами селекции. Во-первых, не возникает сложностей с регенерацией, особенно мутантных форм. Во-вторых, данный метод приобретает особое значение для селекции вегетативно размножаемых растений, так как позволяет выделять формы с характерной сортовой гетерогенностью и избегать сомаклональную изменчивость, возникающую при неорганизованном росте каллусной ткани. В третьих, применение этого метода in vitro по сравнению с классическим методом значительно сокращает время на получение новых форм и, соответственно, затрат труда, так как уменьшает физические объемы экспериментального материала.

На разработанный метод получен патент.

3.1. Экспрессия генов, контролирующих общие белки н изофермеиты,

в культуре in vitro

Селекция картофеля традиционно ведётся по фенотипическим признакам, даже несмотря на бурное развитие молекулярпо-генетических маркеров, хотя использование молекулярных маркеров в культуре in vitro, где мало феиотипических маркерных признаков, могло бы дать возможность более глубокого понимания происходящих биотехнологических процессов. В наших исследованиях мы попытались использовать в качестве маркеров в происходящих биохимических процессах в культуре in vitro электрофоретические спектры общих белков и изоферментов.

Полиморфизм растворимых белков является мощным инструментом при изучении генетической изменчивости. При селекционных процессах очень важно знать, как ведут себя эти маркерные признаки на разных стадиях дифференциации организма в культуре in vitro. Именно на этот вопрос была сделана попытка ответить путем исследования полиморфизма растворимых белков картофеля в культуре in vitro. Целью наших исследований было изучение динамики экспрессии белков в культуре in vitro в процессах дифференциации, дедифференциации и редифференциации.

В проведенных исследованиях было установлено, что электрофоретический спектр водорастворимых белков интактных растений картофеля, выращенных в культуре in vitro, состоит из 42-45 компонентов, а у каллусов - только из 22-25. Для удобства рассмотрения электрофоретический спектр условно разделили их на 3 зоны (схема 1). А - быстро подвижные компоненты (БК), В - средне подвижные компоненты (СК), С - медленно подвижные компоненты (МК).

В белках каллусов, как было сказано, содержится 20-25 компонентов, причем полностью отсутствуют белки зоны А (быстроподвижные компоненты) и всего 3 компонента в зоне В - среднеподвижных. У регенерантов, полученных из этих каллусов, белковый спектр полностью восстанавливается и содержит компоненты всех трех зон. Двенадцать компонентов в зонах В и С являются общими для белков исходных растений, регенерантов и каллуса (схема 1). Компонентные составы белка из каллуса Мутанта - 987 и сорта Xenia сходны и отличаются только по двум медленноподвижным компонентам (40 и 41), присутствующим у сорта Xenia (схема 1). Сортоспецифичность компонентного состава белков, выявленная в интактных растениях, сохраняется и в каллусе. Различия между сортами чаще всего выявляются на уровне интенсивности отдельных компонентов белкового спектра. Однако некоторые сорта имеют фракции белка, характерные только для этого сорта. При

сравнении электрофоретических компонентов белка у каллусов, выращенных на средах с разным фитогормональным составом, установлено влияние последнего на количественный и качественный состав белка (рис. 3).

« Ксения » я м - аю *

: г л

i-иаюдное ¡.юсхецце t укткувт: каллус

Схема 1. Электрофоретические спектры белка картофеля

1 2 3 4 6 7 8 9 И 12 13 14 (5 16 17 18

Рис 3. Электрофоретические спектры белка исходных форм и каллусов, выращенных на разных средах. 1-4 - сорт Приекульский ранний; 6-9 - сорт Берлихенген; 11-14 - сорт Xenia; 15-18 - Мутант 987; 1,6,11,15 - исходное растение; 2,7,12,16 - каллус на каллусной среде; 3,8,13,17 - каллус на регенерационной среде; 4,9,14,18 - каллус на среде без гормонов.

В экспериментах по изучению влияния ауксинов на компонентный состав белка подтвердилась основная особенность каллусной культуры: в электрофоретических спектрах белка отсутствуют компоненты быстромигрирующей зоны А и существенно меньше компонентов в зоне среднеподвижных компонентов (зона В). Сортоспецифичные компоненты проявляются на всех средах выращивания (рис.4).

к и 14 15

Рис. 4. Электрофоретический спектр белка каллусов картофеля, выращенных на средах с разными ауксинами. 1-4 - на среде с 2,4Д 2 мг/л; 5-8 - на среде с ИУК 0,5мг/л; 9-12 - на среде с НУК 10 мг/л; 13-16 - на среде с НУК 8 мг/л + кинетин 2 мг/л; 1,5,9,13 - сорт Хеша; 2,6,10,14-сорт Приекульский; 3,7,11,15 - Мутант-987; 4,8,12,16 - сорт Седов.

В исследованиях было установлено также, что это сокращение электрофоретического спектра белка в каллусной культуре зависит от стадии дифференциации. Зависимость от фитогормонального состава сред, на которых выращивается данная каллусная культура, в основном выявляется в степени интенсивности проявления отдельных компонентов белка. При анализе электрофоретических спектров белков регенерантов, полученных из этих каллусных культур, установлено, что их компонентный состав восстанавливается и чаще всего соответствует сортовому спектру исходного растения, хотя иногда могут выявляться изменения в одном или нескольких компонентах или в интенсивности их проявления.

Полученные данные указывают на то, что отмеченные выше различия в спектрах белков каллуса картофеля обусловлены репрессией и дерепрессией генов, что можно рассматривать как эпигенетические изменения экспрессии генов, контролирующих синтез белков. Замолкание в каллусах большого числа генов сменяется их активацией и полным восстановлением спектра белков у регенерантов. При восстановлении белкового спектра у регенерантов сортоспецифичность в экспрессии генов, контролирующих синтез белка, сохраняется.

При селекции картофеля на клеточном уровне для более полного использования генетического потенциала необходимо изучить как можно больше физиологических и биохимических процессов, которые проходят и на стадии каллусной культуры, и в период морфогенеза. Это необходимо, прежде всего, для того, чтобы знать, на каких этапах можно влиять на генотип картофеля с целью его изменения, и как с помощью молекулярно-генетических маркеров контролировать

сохранность его сортотипичности при меристемном оздоровлении от вирусной инфекции и при дальнейшем микроклональном размножении. Такими биохимическими маркерами могли бы быть не только электрофоретические спектры белков, но и аминокислотный состав суммарного белка растений, т.к. свойства белка могут сильно изменяться даже при замене одной аминокислоты на другую, т.к. изменяется конфигурация пептидных цепей и пространственная структура, которая, в конечном счете, определяет его функции в организме.

Обнаружено, что аминокислотный состав общего белка исходных форм, выращенных в асептических условиях, каллусов и регенерантов в основном сходен (рис. 5, 6). Но имеются некоторые отличия, характерные только для каллусной культуры. В каллусной культуре есть тирозин (от 2 до 5%), а в интактных растениях исходной формы и у растений регенерантов он отсутствует или наблюдается только его следовое количество. Это установлено на каллусных культурах четырех изученных сортов (рис. 7). В интактных растениях исходных форм сорта Xenia и мутантной формы - М-987 и у их регенерантов отсутствует 3 аминокислоты: цистеин, метионин и тирозин из числа исследованных аминокислот (рис. 5, 6, 8), а в каллусной культуре отсутствуют только две: цистеин и метионин, а тирозин присутствует. Но известно, что тирозин получается из фенилаланина, которого в интактных растениях как в исходных формах, так и у регенерантов, больше, чем в каллусной культуре почти в 2 раза. Профили кривых соотношения аминокислот исходных растений, выращенных в резко отличающихся условиях (теплица и культура in vitro), оказались близкими (рис. 9), но в условиях теплицы в листьях растений наблюдалось повышенное содержание аспарагина, глутамина и аргинина по сравнению с растениями, выращенными в пробирочной культуре.

В исходных формах, вне зависимости от условий выращивания, также отсутствуют 3 аминокислоты из исследованных. Хотя электрофоретические спектры белков исходных растений и их каллусов резко отличаются, содержание аминокислот в белках этих форм существенно не различается. Несмотря на то, что компонентный состав белков каллуса гораздо беднее, чем у исходной формы и регенерантов,

Рис. 5. Аминокислотный состав общего белка формы Мутант-987.

аминокислотный состав растворимого белка каллусов даже на 1 аминокислоту (тирозин) больше.

Вероятно, специфика экспрессивности белков у каллусной культуры, имеющей только половинный состав компонентов белка исходных растений и регенерантов, обусловлена не отсутствием соответствующих аминокислот для синтеза белка, а отсутствием экспрессии генов, контролирующих синтез данных форм белка в каллусной культуре, или из-за отсутствия их функции на данной стадии онтогенеза.

Итак, на стадии растений-регенерантов функции данных белков восстанавливаются, и восстанавливается компонентный состав белков, характерный для данного вида и сорта, хотя иногда это восстановление происходит с некоторыми отличиями. У регенерантов восстанавливается и аминокислотный состав, т.е. вместо тирозина выявляется повышенное количество фенилаланина.

Рис.7. Аминокислотный состав общего белка каллусов трех сортов и одной формы

картофеля.

Рис. 8. Аминокислотный состав общего белка листьев регенерантов сорта картофеля Хеша и

формы Мутант-987.

Рис. 9. Аминокислотный состав общего белка листьев исходных растений, выращенных в

условиях теплицы и in vitro. }

Можно сделать вывод, что аминокислотный состав растворимого белка i

картофеля запрограммирован генетически на всех уровнях дифференциации в культуре in vitro и мало поддается изменениям в зависимости от условий выращивания. Обратимость аминокислотного состава при переходе от исходного растения к каллусной культуре и затем к регенерату, т.е. репрессия и дерепрессия генов, контролирующих синтез аминокислот, вероятно, также носит эпигенетический характер.

Изоферменты представляют собой простые, наиболее доступные и удобные маркеры для характеристики активности контролирующих их структурных генов. Это находит широкое применение в решении многих вопросов в самых разных областях генетики. Изоферменты позволяют маркировать не только контролирующие их локусы, но и сцепленные с ними блоки генов, что имеет большое значение для проведения популяционно-генетических и селекционных экспериментов на животных и растениях. Поэтому при использовании данного метода ставилась цель проследить изменения экспрессии изоферментов на разных стадиях онтогенеза в культуре картофеля in vitro и при разном фитогормональном составе сред культивирования.

На электрофореграмме, полученной из каллуса картофеля (рис. 10), выращенного на среде с 2,4Д, АДГ выявляется в виде одного анодного изофермента. АДГ не выявляется в интактных зеленых растениях и каллусах, выращенных на среде с ауксином НУК. На среде с ауксинами 2,4Д + НУК активность АДГ ниже, чем на среде, содержащей только 2,4Д.

123 4 56789 10 11

Рис. 10. Изоферментный спектр алкогольдегидрогеназы в интактных растениях и каллусах картофеля. 1, 2, 3 - спектр каллусов сорта Приекульский, выращенных на среде с добавлением ауксина 2,4Д; 4, 5, 6 - спектр каллусов сорта Приекульский, выращенных на среде с добавлением ауксина НУК (не экспрессируется); 7, 8 - спектр интактных асептических растений сорта Приекульский (не экспрессируется); 9 - Спектр каллуса сорта Невский, выращенного на среде с добавлением ауксина 2,4Д; 10 - спектр каллуса сорта Невский, выращенного на среде с добавлением ауксина НУК (не экспрессируется); 11 -Спектр интактного асептического растения сорта Невский (не экспрессируется).

Такой простой тип спектра, содержащий один изофермент, характерен для ферментов, находящихся под контролем одного гена. Однако следует заметить, что среди изученных ферментов растений почти нет таких, которые контролировались бы одним геном. Можно выявить лишь определенные стадии онтогенеза, в которых активен лишь один локус. Если растение гомозиготно по такому локусу, то на электрофореграмме выявляется в основном один изофермент. Такой стадией в культуре in vitro, вероятно, и является каллусная культура, растущая на среде с 2,4Д. Следует отметить, что АДГ является ферментом, активным в тканях, которые не используют атмосферный кислород. Экспрессия АДГ у каллусной культуры, выращенной на средах, содержащих ауксин 2,4Д, свидетельствует о низкой эффективности потребления глюкозы в клетках этой культуры, находящейся в данных условиях. У каллусов, выращенных на средах с другими ауксинами, на морфогенных средах, т.е. средах с добавлением цитокининов, и у интактных растений алкогольдегидрогеназа не экспрессируется, что говорит о более высокой эффективности использования глюкозы в обменных процессах.

Представляет интерес сравнение активности АДГ в каллусах с интенсивностью их роста, который не может не зависеть от эффективности обменных процессов. Каллусы на среде с 2,4Д растут значительно медленнее, чем на среде с ауксином НУК (Рис. 11). Это является хорошим доказательством более высокой эффективности обменных процессов в каллусах, растущих на средах, не содержащих 2,4Д.

12 3 4

Рис. 11. Влияние ауксинов на рост каллусной культуры. 1- Каллусная культура сорта Приекульский на среде с НУК 10 мг/л; 2 - Каллусная культура сорта Приекульский на среде с 2,4Д 2 мг/л; 3 - Каллусная культура М-987 на среде с НУК 10 мг/л; 4 - Каллусная культура М-987 «а среде с 2.4Д2мг/л.

Характерно, что на средах с добавлением ауксина НУК и ИУК в каллусах синтезируется белка меньше, чем на средах с 2.4Д, но каллусная культура растет на этих средах быстрее и каллус более рыхлой консистенции. Хотя морфогенных зон больше на каллусах, выращенных на средах с 2.4Д .

Глутаматдегидрогеназа (ГДГ) разных видов растений контролируется разным числом локусов, отличающихся своей экспрессией. ГДГ по своей четвертичной

Рис.12. Изоферментные спектры

глутаматдегидрогеназы в интактных растениях и каллусах картофеля. 1 -4 - каллус сорта Темп на средах с 2,4Д; 5 и 7 -интактное растение сорта Темп; 8-11 — каллус сорта Вигри на среде с 2,4Д; 12 и 13 -интактное растение сорта Вигри;

структуре - гексамер.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

14,16-19 - каллус сорта Адретта на среде с НУК; 20 — каллус сорта Адретта на среде 2,4Д+НУК; 6 и 15 — семена сахарной свеклы, взятые в качестве стандарта.

Глутаматдегидрогенеза картофеля представлена на электрофореграмме двумя анодными зонами: быстромигрирующей и медленномигрирующей. В растениях чаще всего выявляются обе зоны, а в каллусах - только медленно мигрирующая. Интактные растения картофеля различаются по характеру проявления ГДГ быстрой зоны. Так, например, у сорта Берлихенген ГДГ в быстрой зоне не выявляется, тогда как у трех других сортов ГДГ в этой зоне активна. Присутствие в среде НУК снижает активность ГДГ в каллусах. Так, при наличии в среде 2ДД+НУК активность ГДГ всех зон снижена по сравнению с той, которая наблюдается в каллусах, выращенных на среде, содержащей 2,4Д. Если же в среде нет 2,4Д, а присутствует НУК, то активность ГДГ следовая (рис. 10)

Малатдегидрогеназа (МДГ) исследована у многих видов растений. У многих видов растений изоферментный спектр состоит не менее, чем из двух зон, что соответствует наличию множественных форм фермента, имеющих различную субклеточную локализацию (цитоплазматическую, митохондриальную и микросомальную). Известно, что по первичной структуре цитоплазматические и митохондриальные формы различаются между собой гораздо сильнее, чем митохондриальные формы МДГ разных родов. Изоферментные спектры МДГ картофеля представлены тремя зонами, из которых одна наиболее быстрая четко отделена от второй (средней) и третьей (медленной) зон. Вторая и третья зоны расположены близко друг к другу. Изоферментные спектры в этих зонах независимы; это позволяет предположить, что данные зоны контролируются неаллельными генами. Обнаружены также ярко выраженные различия между каллусами и интактными растениями в относительной активности и числе изоферментов, что свидетельствуют о различии в экспрессии генов, контролирующих МДГ. Выявляемая на электрофореграммах активность МДГ в каллусах, выращенных на среде с 2,4Д, намного выше, чем в каллусах, выращенных на среде с НУК.

Таким образом, влияние ауксина 2,4Д на экспрессию МДГ в культуре in vitro аналогично тому, которое наблюдалась и у АДГ.

В каллусах, выращенных на средах с ауксинами и перепассированных на среды для морфогенеза, содержащие цитокинин зеатин и уменьшенное содержание ауксинов, после месячного культивирования изоферменты ГДГ, МДГ и АДГ не экспрессируются.

У регенерантов электрофоретический спектр белка и изоферментов, восстанавливается и в основном идентичен спектрам исходных растений данного сорта, иногда с изменениями в интенсивности того или другого компонента.

Электрофоретический спектр общего белка и изоферментов, несмотря на изменения в период дифференциации, дедифференциации и редифференциации в культуре in vitro возвращаются у регенерантов к исходной форме. Следовательно, можно считать, что данные процессы контролируются эпигенетически.

Основное понятие эпигенетики — эпиген - означает, что ген может находиться в двух состояниях: активном или неактивном, и переход гена из одного состояния в другое не обусловлен изменениями в его первичной структуре. Переходы генов из активного состояния в неактивное и наоборот происходят под действием целого комплекса процессов, включая в первую очередь энзиматическое метилирование ДНК, ацетилирование гистонов (гистоновый код), и множество регуляторных белков, инактивирующих или активирующих гены в ответ на факторы внешней среды. Важным моментом является то, что измененные под действием внешних факторов (сигналов) эпигенетические изменения могут наследоваться как в клеточных, так и в половых поколениях. По-видимому, именно таков механизм появления сомаклональных вариантов в культуре in vitro.

Совершенно очевидно, что клетки организма, обладающие одинаковым генотипом, могут иметь бесконечное множество эпигенотипов, а реализация генотипа в фенотип осуществляется сквозь призму эпигенотипа. Эти процессы, по-видимому, присущи процессам, происходящим при выращивании растений в культуре in vitro. К эпигенетической изменчивости следует отнести также изменчивость, выявляемую в потомствах, полученных путем вегетативного размножения. Эту изменчивость Дарвин назвал почковой вариацией.

3.2. Применение бактериальной эндонуклеазы, продуцируемой Serrada marcescens, для оздоровления картофеля от вирусов и её стимулирующее действие

Вирусное вырождение картофеля приносит самый большой вред производству картофеля. Именно это послужило причиной для изучения возможности использования способности нуклеаз подавлять размножение вирусов и применить эндонуклеазу для оздоровления растений картофеля с помощью биотехнологических методов.

Ранее, в ряде работ, проведенных в Институте цитологии и генетики СО РАН, была показана способность панкреатической дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы) подавлять синтез вирусной ДНК и размножение ДНК-содержащих вирусов. Также была показана способность рибонуклеазы (РНК-азы) подавлять синтез вирусной РНК и репродукцию различных РНК-содержащих вирусов

Результаты этих исследований послужили стимулом для испытания способности нуклеаз препятствовать переносу и репликации генетического материала вирусов растений. Так было показано, что применение панкреатической РНК-азы в процессе получения безвирусного картофеля методом апикальной меристемы увеличивает выход здоровых регенерантов и стимулирует морфогенез. Под действием РНК-азы увеличивается устойчивость картофеля к вирусам.

Существует по меньшей мере два различных механизма формирования иммунитета у растений: перекрестная защита (cross-protection) и системная приобретенная устойчивость (systemic acquired resistance, SAR). Одним из компонентов формирования SAR является индукция синтеза так называемых PR-белков (patogénesis related proteins). Некоторые PR белки имеют рибонуклеазную (РНКазную) активность. Ряд идентифицированных в последнее время белков имеют высокую гомологию с классом PR-10, и, как было показано, являются рибонуклеазами, что может стимулировать противовирусный иммунитет.

В настоящей работе исследовалось влияние бактериальной эндонуклеазы на развитие апикальных меристем, на выход безвирусных регенератов и освобождение от вирусов при микроклональном размножении, а также на рост, развитие и продуктивность растений картофеля при дальнейшем выращивании вне пробирочной культуры.

Поскольку применение дорогостоящей панкреатической РНК-азы для этих целей неэкономично, представлялось существенным исследовать на растениях противовирусное действие доступной и экономичной бактериальной эндонуклеазы, продуцируемой Serrada marcescens штамм В-10 М-1.

При выращивании вычлененных меристем с целью освобождения растений картофеля от вирусной инфекции на двух сортах картофеля (Полет и Кемеровский ранний) было установлено что, бактериальная эндонуклеаза оказывает стимулирующее действие на морфогенез и регенерацию (Таблица 4). Так, количество регенератов сорта Полет повышается в два раза: с 14,9% растений в контроле до 30,4% в опыте.

Повышается при этом и число здоровых растений среди регенерантов. При применении эндонуклеазы число свободных от вирусов растений среди регенератов составляло 41%, а в контроле только 20%. Сходные результаты получены и па сорте Кемеровский ранний, у которого при применении эндонуклеазы процент регенератов был 27,8% и только 10,8% в контроле. Соответственно почти в 2 раза увеличился и выход здоровых растений с 25% в контроле до 46% в опытном варианте с применением эндонуклеазы (таблица 4).

Таблица 4. Влияние эндонуклеазы на регенерацию растений картофеля из меристемы и на количество безвирусных растений

Сорт Условия опыта Вычленено Регенерировало Количество

меристем растении безвирусных

растений

пгг % шт %

Полет Контроль 35 5 14,9 1 20

Эндонуклеаза 56 17 30,4 7 41

Кемеровский ранний Контроль 37 4 10,8 1 25

Эндонуклеаза 47 13 27,8 6 46

Кроме контроля иммуноферментным анализом, содержание вирусов проверяли еще электронно-микроскопическим методом, где было также показано, что эндонуклеаза обладает противовирусным действием (табл. 5).

Таблица 5. Влияние эндонуклеазы на число вирусных частиц у картофеля по данным электронной микроскопии

Вирусы картофеля Среднее число вирусных частиц на 10 полях зрения

контроль эндонуклеаза

Х + М 12.7 1.9

М 12.9 1.5

X 5.6 1.9

Выявлено, что разные виды вирусов по разному реагируют на обработку эндонуклеазой. Если концентрация вируса X снизилась в 3 раза, то концентрация вируса М почти в 10 раз. Также сильно снизилась и концентрация смеси двух вирусов.

Данные этих экспериментов показали, что титр вирусности в растениях, выращенных на среде с эндонуклеазой, снижается. У растений сорта М-987, где степень заражения была небольшой, даже появились единичные растения свободные от вируса. Суммарные данные по влиянию эндонуклеазы на содержшгае вирусных частиц в растениях картофеля четырех исследованных сортов даны в таблице 6.

Впервые исследована возможность стимулирующего действия эндонуклеазы Serratia marcescens на рост стеблей и корней при микроклональном размножении картофеля. Для этого исследования были использованы оздоровленные пробирочные растения как для контроля, так и для опыта.

Из полученных данных (таблица 7) видно, что введение бактериальной эндонуклеазы в питательные среды при микроклональном размножении картофеля вызывают стимуляцию роста стебля. Оптимальной концентрацией является 200 МЕ на мл среды. Эта концентрация увеличивает рост стебля в 1,5 раза по сравнению с контролем.

Таблица 6. Снижение концентрации вируса под действием бактериальной эндонуклеазы. (Данные иммуноферментного анализа).

Сорт Условия Опыта Количество растений Вирусы

L X М S Y

Оптических единиц % Оптических единиц % Оптических единиц % Оптических единиц % Оптических единиц %

Седов Эндонуклеаза 6 0,034 19,1 0,125 19,9 0.523 9,1 0,202 17,6 0,091 10,8

Контроль 6 0,042 0.156 0,575 0.245 0,102

Приекульский Эндонуклеаза 4 0,084 29,5 1,005 9 0,476 10,7 0.243 24.8 0,104 21,9

Контроль 4 0,119 1,104 0,533 0,311 0,133

Мутант-987 Эндонуклеаза 6 0,058 6,5 0,100 13,1 0,059 9,3 0,051 17,8 0,0884 18,5

Контроль 6 0,062 0,115 0,065 0,062 0,103

Xenia Эндонуклеаза 6 0,052 28,8 0,049 37,2 0,469 24,4 0,101 27,4 0,088 24,8

Контроль 6 0,073 0,078 0,620 0,139 0,117

Растения, выращенные на средах, с добавлением эндонуклеазы, были пересажены в вазоны с грунтом и выращивались в тепличном боксе, где был проведен учет приживаемости растений, дата появления нового листа, начала ветвления, массового цветения, а также был проведен учет продуктивности (табл. 8).

Приживаемость растений, выращенных на средах с добавлением эндонуклеазы, в концентрациях 100, 200 и 350 МЕ в миллилитре среды, достоверно выше и на шесть-семь дней раньше завершился процесс приживаемости, о чем говорят сроки появления нового листа и начало ветвления. На два-шесть дней раньше наступило и цветение у этих растений (24 декабря и 18-22 декабря в опыте). В два раза была выше и биологическая урожайность (как на грамм с куста, так и в числе клубней) у растений, выращенных на среде с эндонуклеазой в концентрации 200 МЕ на мл среды. Также достоверно выше, чем в контроле урожайность и количество клубней у растений, выращенных на среде с эндонуклеазой в концентрации 100 и 350 МЕ на мл среды.

Суммируя полученные данные, можно констатировать следующее.

Обработка эндонуклеазой способствует освобождению от патогена, и кроме того - более быстрому росту стебля и корня в пробирках, увеличению процента приживаемости при пересадке в грунт.

При дальнейшем выращивании в грунте наблюдается ускорение развития обработанных эндонуклеазой растений, увеличение стебля и площади листьев, а также продуктивности.

Таблица 7. Влияние бактериальной эндонуклеазы на рост стебля при микроклоналыюм размножении__

Сорт Варианты опыта (ед. актив, эндонуклеазы на мл среды) Средняя высота стебля (в мм)

на 14 день на 21 день на 28 день

Xenia 10 41,25±2,45 4б,12±3,25 65,01±2,97

100 43,12±2,40 60,12±2,25* 77,53±0,4*

200 56,37±3,0* 68,28±4,03* 98,04±0,51*

350 43,20±2,02 63,0±3,97* 7б,63±0,34*

1000 40,83±3,06 45,17=4=3,06 62,04±5,34

контроль 41,8±2,54 48,0±2,89 64,66±3,17

Приекульский 10 53,46±1,62 62,04*2,07 72,75±2,15

100 54,88±4,81 73,0*3,28 94,28±3,75*

200 58,42±4,14» 82,00±3,28* 105,00±4,44*

350 63,0±2,29» 86,00±4,02» 102,80±3,95*

1000 52,17±2,07 60,4±2,54 71,17±3,52

контроль 55,3±3,09 64,07±3,55 73,75±3,74

* достоверное превышение

Таблица 8. Рост, развитие и продуктивность растений картофеля сорта Приекульский ранний после микроклонального размножения на среде с эндонуклеазой_

Варианты опыта (ед.активнос ти эндо-нуклеазы на мл среды) Даты Урожай

% приживаемости посадки в сосуды появл. нового листа начало ветвления массовое цветение уборка г/куста кол-во клубней

10 40 27.09 11.10 20.10 22.12 4.11 16,00 ±0,71 2,4 ±0,62

100 50 27.09 06.10 14.10 19.12 4.11 20,7 ±1,2* 3,6 ±0,50*

200 68 27.09 05.10 12.10 18.12 4.11 37,4 ±0,97* 4,8 ±0,70*

350 54 27.09 06.10 15.10 18.12 4.11 22,8 ±0,84* 3,9 ±0,47*

1000 42 27.09 10.10 18.10 20.12 4.11 17,6 ±1,37 2,7 ±0,36*

Контроль 34 27.09 12.10 22.10 24.12 4.11 14,5 ±0,48 2,0 ±0,9

* достоверное превышение

Использование в семеноводстве

Отсутствие высококачественного посадочного материала является основной причиной того, что средняя урожайность картофеля по России составляет 90-95 ц\га при очень низкой сохранности. Согласно принятого в России закона «О семеноводстве картофеля» элитный материал получают на 5-6 год полевой репродукции. Но установлено, что на 7-8 год полевой репродукции после оздоровления меристемной культурой, продуктивность картофеля резко падает. Даже при условии, что элита получена на основе оздоровленного материала, такой посадочный материал уже растерял свои преимущества, которые дает оздоровление меристемной культурой. Частным производителям необходимо продавать семенной материал 2-3 года репродукции после пробирочной культуры.

На основе созданной коллекции генофонда оздоровленных сортов картофеля и предложенной технологии получена возможность быстро размножать предбазисный материал и использовать полностью преимущества оздоровленного материала для получения высоких урожаев производителями товарной продукции. Так в ЗАО «Приобское» урожайность поднялась в 3 раза только за счет применения оздоровленного посадочного материала с 3 по 5 год репродукции после миниклубней, при этом сохранность его в течение зимнего периода составляла практически 100%. Это хозяйство за 9 лет совместной работы не только обеспечивало себя качественным посадочным материалом, но и имело возможность его реализации другим крестьянским хозяйствам и многочисленным огородникам.

Кроме того, коллекцию оздоровленного материала и разработанные технологии использовали для семеноводства крестьянские хозяйства, а также многочисленные огородники Алтайского края и Республики Алтай.

выводы

1. Изменения, возникающие в процессе культивирования в культуре in vitro, реализуются у растений регенерантов на фенотипическом уровне в виде изменений окраски клубня, появления устойчивости к болезням. Эти возникающие с высокой частотой изменения наследуются в последующих поколениях вегетативного размножения в течение многих лет, что позволяет рассматривать их как эпигенетические. Этот феномен может с успехом использоваться в селекционных программах.

2. Возникающие в культуре in vitro под влиянием селективных факторов изменения дают возможность для отбора перспективных селекционных форм. Так, был использован в качестве селективного фактора культуральный фильтрат гриба Rhizoctonia solani и разработан метод, с помощью которого были впервые получены устойчивые к Rhizoctonia Solani формы. Показано, что отборы можно вести на ннтактных растениях, а не только на клеточной культуре, что позволяет избегать стадию регенерации и связанные с ней трудности.

3. Экспрессия генов, контролирующих синтез общего белка, а также аминокислотный состав при культивировании картофеля in vitro, зависит от стадии дифференциации. Она меняется в период прохождения отдельных стадий онтогенеза каллусной культуры. Установлено, что изменения экспрессии генов, контролирующих синтез общего белка и аминокислотного состава в период дедифференциации и дифференциации, имеют обратимый характер и, предположительно, имеют эпигенетическую природу.

4. На стадии каллусной культуры происходит репрессия значительной части генов, контролирующих синтез белка, но экспрессия инактивированных генов восстанавливается у регенерантов, полученных из этих каллусов. Чаще всего экспрессивность генов у регенерантов соответствует экспрессии генов исходных растений.

5. Аминокислотный состав белков картофеля генетически детерминирован и варьирует в зависимости от генотипа сорта и условий выращивания. Установлено, что в каллусной культуре проявляется тирозин, а у интактных растений исходных форм и регенерантов эта аминокислота отсутствует, но у них выявляется высокое содержание фенилаланина, предшественника тирозина. Этот процесс обратимой смены фенилаланина, на тирозин в онтогенезе каллусной культуры также свидетельствует об эпигенетическом характере данных изменений,

6. Изоферментные спектры МДГ, ГДГ и АДГ, также как и белковый спектр, изменяются в зависимости от уровня дифференциации. Исходные интактные растения и регенераты имеют одинаковый спектр изоферментов. В онтогенезе каллусной культуры спектр может изменяться в зависимости от фитошрмонального состава сред культивирования; также может меняться относительная активность отдельных изоферментов в спектре. При выращивании на морфогешшх средах, т.е. в присутствии цитокининов, все три исследованных фермента не экспрессируются.

7. Установлена возможность применения бактериальной эндонуклеазы, продуциремой Serratia marcescens, для оздоровления растений от вирусной инфекции и показана ее стимулирующая роль при выращивании растений картофеля в культуре in vitro. Стимулирующий эффект бактериальной эндонуклеазы сохраняется и после высадки пробирочной культуры в почву в открытый грунт.

8. Создана коллекция генофонда картофеля, оздоровленного методом апикальной меристемы с использованием бактериальной эндонуклеазы, от вирусной, грибной и бактериальной инфекции. Показано, что использование созданной коллекции генофонда в оригинальном семеноводстве картофеля повышает

урожайность в три-четыре раза при практически 100 % сохранности картофеля в период хранения

Список сокращений

MS - среда Мурасиге и Скуга

2.4 Д - дихлорфеноксиуксусная кислота

НУК - нафтилуксусная кислота

ИУК - индолилуксусная кислота

АДГ - алкогольдегидрогеназа

МДГ - малатдегидрогеназа

ГДГ - глутаматдегидрогеназа

БЭ — бактериальная эндонуклеаза

ИМ - индолилмасляная кислота

Fer — ферруловая кислота

ЭМС - этилметансульфонат

ЭСБ - электрофоретический спектр белка

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи изданные в журналах, рекомендованных ВАК

1. Леонова Н.С. Использование метода культуры ткани в селекции картофеля. Леонова Н.С. // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 1986, № 3, с.6-10.

2. Леонова Н.С. Влияние фитогормонов на индукцию каллусогенеза у картофеля. Леонова Н.С., Омельянчук H.A., Привалов Г.Ф. // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 1985, № 4, с. 24-25.

3. Леонова Н.С. Влияние фитогормонов на экспрессию генов, контролирующих синтез белков в культуре каллуса картофеля. Леонова Н.С., Солоненко Л.П., Контарева Н.И., Симонова О.Г. «Известия Сибирского отделения АН СССР», серия биологическая, 1989, выпуск 1, с. 32-35.

4. Леонова Н.С. Стимулирующий эффект бактериальной эндонуклеазы при микроклональном размножении картофеля. Леонова Н.С., Салганик Р.И., Симонова О.Г. // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 1991, № 4, с. 38-42.

5. Леонова Н.С. Применение бактериальной эндонуклеазы для оздоровления картофеля от вирусов. Леонова Н.С., Салганик Р.И. И Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 1991, № 5, с. 25-28.

6. Леонова Н.С. Получение растений картофеля, несущих ген бетаинтерферона человека. Леонова Н.С. // Генетика, Приложение, 1994, с. 84.

7. Леонова Н.С. Влияние тяжелых металлов на рост и развитие растений картофеля. Леонова Н.С. Сельскохозяйственная биология, 1999, №3, с. 107-109.

8. Леонова Н.С. Трансгенные растения картофеля Solanum tuberosum L. экспрессирукяцие ген секреторной нуклеазы Serracia marcescens. Трифонова Е.А., Комарова М.Л., Леонова Н.С., Щербань А.Б., Кочетов A.B., Малиновский В.И., Шумный В.К. // Доклады Академии наук, 2004, т. 394, № 3, с. 411-413.

9. Леонова Н.С. Динамика аминокислотного состава общего белка картофеля в культуре in vitro Леонова Н.С. // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», 2008, № 12, с. 25-30.

10. Леонова Н.С. Создание, сохранение и использование генофонда кормовых и лекарственных растений в ИЦиГ СО РАН. Железное В.А., Железнова

Н.Б., Бурмакина Н.В., Леонова Н.С., Юдина Р.С. // Информационный вестник ВОГиС, 2008, т. 12, № 4, с. 580.

11. Леонова Н.С. Селекция картофеля на устойчивость к Rhizoctonia solani в культуре in vitro. Леонова Н.С., Железиов А.В. // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки 2009, № 4, с. 9-16.

Прочие основные публикации

12. Леонова 1I.C. Биохимические различия у картофеля на разных уровнях дифференциации в культуре тканей. Леонова Н.С., Солоненко Л.П. // Сб. Использование клеточных технологий в селекции картофеля. Москва, 1987, с. 89-94.

13. Леонова Н.С. Применение эндонуклеазы S. marcescens (ридезита) для освобождения растений от вирусов и стимуляции их развития. Салганик Р31., Леонова Н.С. // Сб. «Генетика народному хозяйству», 1990, СО РАН ИЦиГ, с. 69-72.

14. Леонова Н.С. Способ выращивания картофеля. Леонова Н.С., Панфилова З.И., Салганик Р.И., и др. Авторское свидетельство 15.84.1990. № 1585328.

15. Леонова Н.С. Препарат «Ризоплан» - эффективное биологическое средство защиты растений. Леонова Н.С., Гребешок А.Н., Солоненко Л.П. // Сб. «Генетика хозяйственно-ценных признаков высших растений». Новосибирск, 1990.

16. Леонова Н.С. Сомаклональная вариабельность, как источник генетической изменчивости у картофеля. Леонова Н.С., Солоненко Л.П., Симонова О.Г., Набиева А.Ю. // Материалы Всесоюзной конференции. Сельскохозяйственная биотехнология. Целиноград 25-28 июня 1991.

17. Леонова Н.С. Распространенные и перспективные сорта картофеля коллекции ИЦиГ СО РАН. Леонова Н.С. Новосибирск, 2001, 92 с.

18. Леонова Н.С, Противовирусный и стимулирующий эффекты эндонуклеазы бактериальной у картофеля. Леонова Н.С., Аликин.Ю.С, Сенженко Л.П. // Сб. «Ферменты микроорганизмов». - Казань, 2001, с. 37-38.

19. Леоиова Н.С. Использование биотехнологических методов в создание форм картофеля, устойчивых к резоктониозу. Леонова Н.С., Шалдяева Е.М. // Материалы 14-ой международной научно-практической конференции. «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений». Ульяновск, 2002, т. 2, с. 171-173.

20. Леонова Н.С. Современные методы селекции и семеноводства картофеля. Леонова Н.С. // Сб. «Повышение эффективности селекции и семеноводства сельскохозяйственных растений. Новосибирск, 2002, с. 35-42.

21. Леонова Н.С. Создание форм картофеля, устойчивых к ризоктониозу. Леонова Н.С., Шалдяева Е.М., Кукоева Т.В. // Материалы 2-ой конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Вавилова Н.И., Москва, 2003, т. 1, с. 135-136.

22. Леонова Н.С. Трансформация картофеля Solanum tuberosum L. и получение трансгенных растений экспрессирующих нуклеазу Serratia marcescens. Комарова М.Л., Трифонова Е.А., Кочетов А.В., Колодяжная Я.С., Титов С.Е., Леонова Н.С., Шумный В.К. // Материалы международной научно-практической конференции Института картофелеводства НАН Беларуси, Минск, 2003, т. 1, с. 333366.

23. Леонова Н.С. Трансгенные растеши табака и картофеля, экспрессирующие нуклеазу Serratia marcescens. Трифонова Е.А., Комарова М.Л., Кочетов А.В., Леонова Н.С., Колодяжная Я.С., Титов С.Е., Смоленская С.Э., Шумный В.К. // Конференция МОГИ С. - Москва, 20-21 февраля 2003, т. 2, с. 184185.

24. Леонова Н.С. Влияние препарата БИНОРАМ на картофель // Материалы 6-го международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и

перспективы их использования». Леонова U.C., Дашкевич B.C. Москва, 2005, т. 1, с. 297-299.

25. Леонова Н.С. Проблемы семеноводства и селекции картофеля. Леонова Н.С., Беккер В.П. // Доклады и сообщения IX-ой генетико-селекционной школы «Актуальные задачи селекции и семеноводства сельскохозяйственных растений на современном этапе». Новосибирск, 2005, с. 122-128.

26. Леонова Н.С. Результаты и перспективы использования биопрепарата БИНОРАМ в системе биоземледелия для получения экологически чистой и высококачественной продукции. Дашкевич B.C., Дашкевич Н.Ю., Леонова Н.С. II Материалы 6-го международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования, Москва, 2005, т. 1, с. 237-248.

27. Леонова Н.С. Результаты и перспективы применения биопрепаратов на основе ризосферных бактерий для получения высококачественной сельскохозяйственной продукции. Дашкевич B.C., Дашкевич Н.Ю., Гребенников В.В., Бычкова М.А., Леонова Н.С., Крючихина A.A., Ашмарина Л.Ф., Галузина Р.И., Холодарь А.Ф., Киров Е.И., Цибулько В.А. // Материалы третьей Всероссийской научно-практической конференции, Краснодар, 14-18 июня 2005, с. 171 -173.

28. Леонова Н.С. О концепции развития семеноводства картофеля в России. Леонова Н.С., Беккер В.П., Скорик A.B. // Материалы международной научно-практической конференции «Научное обеспечение картофелеводства Сибири и Дальнего востока: состояние проблемы и перспективы». - Кемерово, 2006, с. 144155.

29. Леопова Н.С. Создание, сохранение и использование коллекции генофонда картофеля в селекции и продовольственной безопасности Леонова Н.С. // Материалы международной конференции «Научное наследие Н.И.Вавилова -фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства», Москва, 2007, с. 191-199.

30. Леонова Н.С. Использование биотехнологии в селекции и семеноводстве картофеля Леонова Н.С. // В кн. Реализация идей Вавилова на современном этапе развития генетики, селекции и семеноводства сельскохозяйственных культур. Новосибирск, 2007, с. 191-198.

31. Леонова Н.С. Использование культурального фильтрата Rhizoctonia solani в селекции картофеля in vitro // Сб. «Картофелеводство». Минск, Беларусь,

2007, т. 12, с. 6-14.

32. Леонова Н.С. Динамика аминокислотного состава общего белка картофеля в культуре in vitro Леонова Н.С. // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 2008, № 12, с. 25-30.

33. Леонова Н.С. Полиморфизм белков картофеля на разных уровнях дифференциации в культуре in vitro Леонова Н.С. // Сб. «Картофелеводство», Минск.

2008, т. 14, с. 86-93.

34. Леонова Н.С. Аминокислотный состав общего белка картофеля в культуре in vitro Леонова Н.С. // Сб. «Картофелеводство». Минск. 2008, т. 14, с. 8186.

35. Авторское свидетельство «Способ выращивания картофеля» от 15.04.1990г. № 1585328

36. Патент «Способ селекции картофеля на устойчивость к ризокгониозу» № 2217906 от 10.12.2003 г., Москва.

Автореферат:

Формат 60*84 1/16,1,85 п. л. Тираж 110 экз. Заказ № 240.05.052.2010

Отпечатано ЗАО РИЦ «Прайс-курьер» ул. Кутателадзе, 4г, т. 330-7202

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Леонова, Нина Семеновна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Сомаклональная изменчивость.

1.2. Эпигенетическая изменчивость.

1.3. Влияние условий культивирования in vitro на генетическое разнообразие.

1.4. Спектр изменчивости среди растений-регенерантов.

1.5. Практическое использование и перспективы применения сома-клональной изменчивости.

1.6. Мутагенез в селекции in vitro.

1.7. Хлорофиллдефектные мутанты.

1.8. Устойчивость к болезням.

1.9. Селекция на устойчивость к патотоксинам.

1.10. Применение культуральных фильтратов в селекции.

1.11. Использование методов биотехнологии для создания растений картофеля, устойчивых к вирусам.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Фенотипическая изменчивость в культуре in vitro картофеля и возможности её использования.

3.1.1. Фенотипическая изменчивость в культуре in vitro

3.1.2. Получение хлорофиллдефектных сомаклональных вариаций . 78 3.1.3 Использование культурального фильтра Rhizoctonia Solani в селекции картофеля in vitro.

3.2. Экспрессия генов, контролирующих общие белки и изоферменты в культуре in vitro.

3.2.1. Изменение экспрессии генов, контролирующих общие белки, в культуре in vitro под действием фитогормонов.

3.2.2 Динамика аминокислотного состава растворимого белка картофеля в культуре in vitro.

3.2.3. Спектры изоферментов в каллусах и исходных интактных растениях картофеля.

3.3. Применение бактериальной эндонуклеазы.

3.3.1. Применение бактериальной эндонуклеазы продуцируемой Serratia marcescens, для оздоровления картофеля от вирусов и стимуляции регенерации и роста растений.

3.3.2. Получение растений картофеля с повышенным уровнем нуклеазной активности методом трансгенеза.

3.4. Биотехнология в семеноводстве картофеля в Новосибирской области.

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменчивость в культуре картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro и возможности ее использования в селекции и семеноводстве"

Картофель в качестве продовольствия потребляет более 3 млрд населения планеты, его выращивают в 150 странах мира. Ареал его возделывания простирается от приполярной Финляндии до высокогорий Эквадора и Кении. По прогнозу рост мирового производства данной культуры к 2020 г. составит 40 %. Особенно быстрыми темпами с 1990 г. по 1999 г. увеличилось его производство в Индии, Китае и развивающихся странах Азии и Африки, где сегодня получают около 30 % общемирового урожая (Анисимов, 2001).

В Росс ии выращивают более 10 % общемирового валового сбора картофеля. Являясь одним из лидеров по количеству производимой продукции, наша страна остается на одном из последних мест по урожайности - в среднем 100 ц/га (Анисимов, 2001). Низкая эффективность картофельного производства объясняется произошедшими после 90-х годов изменениями в структуре посевных площадей и сосредоточением производства в индивидуальных хозяйствах, дающих сегодня 92 % продукции.

В Новосибирской области в 2007 г. доля индивидуальных хозяйств достигла 97 %, а урожайность составила 50-90 ц/га в зависимости от района. Кроме того, свирепствует колорадский жук и в 2008 г. в 13 районах области объявлен карантин по цистообразующей золотистой нематоде.

Защита сельскохозяйственных культур от вредителей и болезней имеет большое экономическое значение. В настоящее время происходит смена парадигм в защите растений. Согласно существующей парадигме культурные растения окружены множеством вредителей и возбудителей болезней, которых необходимо уничтожать. С этой целью используют агротехнические, биологические и химические средства защиты растений.

Последние наиболее опасны как для окружающей среды, так и для сельскохозяйственной продукции и, в конечном счете, для человека. В соответствии с новой парадигмой необходимо сделать культурное растение способным к самозащите, т. е. устойчивым к вредным организмам и болезням. Сделать так, чтобы сельскохозяйственная культура перестала быть растением-хозяином, а значит и не поражаться теми или иными вредителями и возбудителями болезней. В этом случае отпадает необходимость применения химических средств защиты растений (Мазин и др., 2007). Использование методов биотехнологии и генной инженерии открывает новые перспективы получения таких растений.

Нельзя утверждать, что с помощью одной лишь сельскохозяйственной биотехнологии можно решить все имеющиеся в мире проблемы, связанные с нехваткой продовольствия, но также нельзя настаивать на том, что необеспеченность продовольствием можно устранить без применения биотехнологии.

Картофель в значительной степени поражается вирусными, грибными, бактериальными заболеваниями и вредителями.

Восприимчивость картофеля к болезням и вредителям сделала его «культурой номер два» в мире после хлопка по использованию пестицидов. Например, в развитых странах против фитофтороза в настоящее время применяют от 7-8 до 10-12 химических обработок за вегетационный период (Wiik, 2002; Preston, 1998).

Экономическая ситуация в России требует создания новых сортов картофеля, отличающихся от сортов «интенсивного типа», которые были главной задачей селекции в период до 90-х годов прошлого века.

Современные сорта должны обладать комплексной устойчивостью к вирусным заболеваниям и фитофторозу, колорадскому жуку и цистообразующим нематодам. Кроме того, в каждой конкретной зоне возделывания картофеля существуют патогены локального значения. В Сибири, где длительная холодная весна и жаркое сухое лето, возделываемые сорта должны обладать устойчивостью к ризоктониозу.

Необходимость внедрения в сельское хозяйство нетрадиционных технологий, которые позволили бы поднять на новый уровень производство продуктов питания, в последние годы ощущается все с большей остротой. Для селекционного процесса технологии клеточной и генной инженерии растений имеют огромные перспективы. Одно из важных направлений в биотехнологии растений занимает клеточная селекция, при которой отбор клеточных линий и растений с новыми наследственными признаками производится на уровне культивируемых in vitro клеток. Получение растений из отобранных в селективных условиях мутантных клеток возможно благодаря уникальному свойству растительной клетки - ее тотипотентности. Под тотипотентностью понимается уникальная способность клетки конвертироваться в дифференцированные клетки любых типов. У растений, в отличии от животных, клетки остаются тотипотентными в течение всей жизни растения, обеспечивая вегетативное размножение, а в культуре in vitro способность регенерировать новое растение из соматической клетки. Приемы культивирования растительных клеток и регенерации из них растений, разработанные для многих важных сельскохозяйственных культур, уже сейчас позволяют экспериментально реализовать возможности клеточной селекции, т. е. применять ее для создания новых сортов растений. Перечень мутантов с важными сельскохозяйственными признаками, селекция которых осуществима на клеточном уровне, довольно большой. К ним относятся мутанты устойчивости к стрессовым факторам, гербицидам, различным заболеваниям, сверхпродуценты незаменимых аминокислот. Мощным источником генетического разнообразия растений является сомаклональная изменчивость, возникающая при прохождении растениями стадии неорганизованного роста (каллусогенеза), которая позволяет вести ненаправленную селекцию in vitro. Вместе с тем в селекции растений следует реально учитывать и ограничения клеточной технологии. Несмотря на огромные перспективы целенаправленного улучшения ряда признаков растений in vitro, технология клеточной селекции все же остается хотя и важным, но лишь дополнением к традиционным методам селекции.

Прикладные направления исследований, которые решаются с помощью клеточной селекции, не ограничиваются созданием ценного исходного материала. Методы клеточной селекции лежат в основе ряда технологий промышленного выращивания клеточных культур, продуцентов экономически значимых веществ, оздоровления вегетативно размножаемых культур от вирусных и других инфекций. Они также являются важными элементами экспериментов по соматической гибридизации и трансформации растений.

Благодаря новой технологии селекции получены многочисленные генетически маркированные клеточные линии и растения, которые широко используются в качестве исходного материала для различных прикладных и в первую очередь теоретических исследований. С их применением были выделены мутанты, ранее не известные у растений. Используя простые приемы селекции на уровне каллусных тканей, уже в середине 70-х годов XX столетия получены первые мутанты, устойчивые к антибиотикам. Это способствовало дальнейшему развитию генетики и эпигенетики растений. Значительный прогресс в области клеточной селекции достигнут благодаря разработке техники культивирования «голых» растительных клеток - изолированных протопластов. Методы выделения и культивирования in vitro больших количеств индивидуальных растительных клеток позволили использовать в отношении растений эффективные микробиологические приемы селекции мутантов. В результате их применения у высших растений было идентифицировано большое разнообразие ауксотрофных и других редких мутантов.

Большинство работ в данной области исследований проведено в 80-х годах прошлого столетия. Арсенал новых методов селекции становится все более мощным, и спектр различных мутантов, получаемых in vitro, с каждым годом расширяется. Несмотря на довольно совершенную методологию клеточной селекции и актуальность вопросов, решаемых при помощи новых технологий, это направление исследований все же не находит должного использования в селекции растений.

Наряду с биотехнологическими аспектами применения новых подходов селекции неоценимо значение этих работ для развития фундаментальных вопросов генетики и эпигенетики, а также молекулярной биологии и физиологии растений.

Изучение механизмов регуляции индивидуального развития организма, наряду с установлением молекулярно-биологических основ различных этапов онтогенеза, являются приоритетными направлениями исследований в области генетики развития (Рефф, Кофмен, 1986; Корочкин, 2002).

Для нормального индивидуального развития и реализации генетической программы онтогенеза существенное значение имеет эпигенетическая регуляция генома, обеспечивающая установление и поддержание дифференциальной экспрессии генов. Согласно классическому определению, эпигенетика может быть обозначена как исследование причинных взаимодействий между генами и их продуктами, приводящих к формированию фенотипа (Waddington, 1942).

Элементарным событием дифференцировки может быть процесс репрессии или дерепрессии гена. А элементарным событием морфогенеза предлагается считать наработку белка каким-либо геном, активированном на данной стадии развития (Голубовский, 2000). Однако в дальнейшем в понятие «эпигенетика» стали вкладывать иной смысл. Основное понятие эпигенетики - эпиген «эпиаллель» — означает, что ген «аллель» может находиться в двух состояниях: активном и неактивном, и переход из одного состояния в другое не обусловлен изменениями его первичной структуры (Голубовский,1996; Малецкий и др., 2004).

Гены, детерминирующие какой-либо признак, действительно остаются в ходе онтогенеза у каждого организма одинаковыми, но для каждого из них существует своя схема регулирования их активности в той или иной клетке. Обратимые изменения активности генов в процессе индивидуального развития организма, не связанные с нарушением нуклеотидной последовательности ДНК, но приводящие к сохранению неактивного или активного состояния генов в ряду клеточных поколений, называют эпигенетическими (Гвоздев, 1999).

В настоящее время эпигенетические изменения, носящие направленный и обратимый характер, стали называться эпимутациями и очень активно изучаются (Голубовский, 2001).

Обнаружено, что живые системы обладают «оперативной памятью», которая находится в непрерывном контакте со средой и использует средства природной эмбриогенетической инженерии для быстрого наследуемого перехода из одного режима функционирования в другой (Голубовский, 2001).

Одно из важных открытий в области биологии клетки состоит в том, что клетка непрерывно собирает и анализирует информацию о своем внутреннем состоянии и внешней среде, принимая решение о росте, движении и дифференциации (Голубовский, 2001). По-видимому, клетки дают разные геномные ответы на стрессовые воздействия разных типов и в определенных стрессовых условиях активизируют специализированные мутационные системы (McClintock, 1984; Wills, 1991; Jablonka, Lamb, 1995, 1998).

Условия культивирования и, прежде всего, фитогормональный состав питательных сред играют решающую роль в прохождении онтогенеза и, в частности, морфогенеза в культуре in vitro.

Культура in vitro располагает очень малым количеством морфологических признаков, позволяющих контролировать процессы морфогенеза, поэтому наличие биохимических маркеров систем дает дополнительную возможность понимания и контроля процессов, происходящих в онтогенезе культивируемых форм.

Цель настоящего исследования заключалась в оценке фенотипической и генотипической изменчивости в культуре картофеля ш vitro под воздействием экзогенных факторов и выявлении возможности использования данной изменчивости в создании новых методов селекции.

Задачи исследования

1. Проанализировать фенотипы сомаклональных вариантов и почковых мутаций, возникающих в культуре картофеля in vitro.

2. Изучить влияние фитогормонального состава сред и других экзогенных факторов культивирования in vitro на экспрессию генов, контролирующих синтез белка, на разных стадиях каллусогенеза и на аминокислотный состав растворимых белков картофеля.

3. Проследить влияние фитогормонального состава сред культивирования на экспрессию генов, контролирующих изоферменты.

4. Изучить возможность использования культурального фильтрата Rhizoctonia solani в качестве селективного фактора для получения форм картофеля, устойчивых к данному патогену.

5. Оценить возможность использования препарата бактериальной эндонуклеазы, продуцируемой Serratia marcescens, в качестве хемиотерапевтического агента при оздоровлении картофеля от вирусной инфекции методом апикальной меристемы и микроклональном размножении.

6. Создать коллекцию генофонда картофеля, оздоровленного методом апикальной меристемы от вирусной и грибной инфекции, и показать преимущество использования оздоровленного картофеля в оригинальном семеноводстве Западно-Сибирского региона для получения высоких урожаев экологически безопасного товарного картофеля.

Научная новизна

Показано, что изменение в культуре in vitro могут происходить не только на стадии клеточной культуры, но и в интактных растениях в виде почковых вариаций, которые наследуются в ряду вегетативных репродукций.

Разработан метод селекции на устойчивость к патогенному грибу Rhizoctonia solani, на основе использования почковых вариаций, и культурального фильтрата данного гриба в качестве селективного фактора.

Показано, что можно получать направленные сомаклональные изменения, проводя отбор с помощью селективных факторов не только на клеточном уровне, но и на уровне интактных растений, что позволяет вести селекцию, минуя стадию регенерации, являющуюся самым «узким» местом в процессе получения направленных изменений.

Разработан метод оздоровления картофеля от вирусной инфекции путем воздействия бактериальной эндонуклеазы Serratia marcescens на культивируемую апикальную меристему.

Практическая значимость

Разработанный метод оздоровления картофеля от вирусной, бактериальной и грибной инфекций путем применения в качестве хемиотерапевтического препарата бактериальной эндонуклеазы Serratia marcescens помогает не только существенно повысить выживаемость вычленяемой меристемы, но и увеличить выход здоровых растений из регенерировавших меристем. Это существенно облегчает и удешевляет биотехнологические стадии в семеноводстве как самые трудозатратные в процессе оздоровления картофеля, а также служит стимулирующим фактором при микроклональном размножении.

На основе использования в качестве селективного фактора культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani разработан метод селекции и получены формы картофеля, устойчивые к ризоктониозу.

Положения, выносимые на защиту

1. Изменения в культуре in vitro можно вызвать как на клеточном уровне, так и у интактных растений а, используя селективные факторы, можно получать направленные изменения. Это показано в селекционном процессе с помощью разработанного метода получения устойчивых к Rhizoctonia solani растений картофеля.

2. Экспрессия генов, контролирующих синтез растворимых белков и изоферментов, а также аминокислотный состав изменяются в зависимости от стадии дифференциации в культуре in vitro. Возникающие новые состояния экспрессии генов стабильны в период прохождения той или иной стадии дифференциации, но носят обратимый характер: спектры белка и изоферментов при переходе от интактных растений к каллусной культуре изменяются, а у растений-регенерантов вновь восстанавливаются, что указывает на наличие процессов репрессии и дерепрессии генов в зависимости от стадии дифференциации. Стабильность и обратимость выявляемых изменений свидетельствует о том, что данные изменения могут иметь эпигенетическую природу.

3. В культуре in vitro изоферментные спектры и электрофоретические спектры растворимых белков изменяются в зависимости от фитогормонального состава культуральных сред.

4. Бактериальная эндонуклеаза, продуцируемая Serratia marcescens, обладает как противовирусным, так и стимулирующим эффектом при оздоровлении картофеля методом апикальной меристемы и микроклональном размножении. Стимулирующие эффекты от воздействия эндонуклеазы в культуре in vitro сохраняются и после высадки обработанной пробирочной культуры в почву.

Публикации, авторские свидетельства, патенты

По теме исследования опубликовано 34 печатных работы в рецензируемых изданиях, в том числе 11 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

Издан каталог «Распространенные и перспективные сорта картофеля коллекции ИциГ СО РАН».

Структура диссертации

Диссертация изложена на 194 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения исследований, выводов, рекомендаций для использования в производстве и списка цитируемой литературы. Библиографический указатель включает 274 источников, из них 92 публикаций в отечественной литературе, 182 в зарубежной печати. Диссертация иллюстрирована 30 рисунками и содержит 26 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Леонова, Нина Семеновна

ВЫВОДЫ

1. Изменения, возникающие в процессе культивирования в культуре in vitro, реализуются у растений регенерантов на фенотипическом уровне в виде изменений окраски клубня, появления устойчивости к болезням. Эти возникающие с высокой частотой изменения наследуются в последующих поколениях вегетативного размножения в течение многих лет, что позволяет рассматривать йх как эпигенетические. Этот феномен может с успехом использоваться в селекционных программах.

2. Возникающие в культуре in vitro под влиянием селективных факторов изменения дают возможность для отбора перспективных селекционных форм. Так, был использован в качестве селективного фактора культуральный фильтрат гриба Rhizoctonia solani и разработан метод, с помощью которого были впервые получены устойчивые к Rhizoctonia Solani формы. Показано, что отборы можно вести на интактных растениях, а не только на клеточной культуре, что позволяет избегать стадию регенерации и связанные с ней трудности.

4. На стадии . каллусной культуры происходит репрессия значительной части генов, контролирующих синтез белка, но экспрессия инактивированных генов восстанавливается у регенерантов, полученных из этих каллусов. Чаще всего экспрессивность генов у регенерантов соответствует экспрессии генов исходных растений.

5. Аминокислотный состав белков картофеля генетически детерминирован и варьирует в зависимости от генотипа сорта и условий выращивания. Установлено, что в каллусной культуре проявляется тирозин, а у интактных растений исходных форм и регенерантов эта аминокислота отсутствует, но у них выявляется высокое содержание фенилаланина, предшественника тирозина. Этот процесс обратимой смены фенилаланина, предшественника тирозина, на тирозин в онтогенезе каллусной культуры также свидетельствует об эпигенетическом характере данных изменений.

6. Изоферментные спектры МДГ, ГДГ и АДГ, также как и белковый спектр, изменяются в зависимости от уровня дифференциации. Исходные интактные растения и регенеранты имеют одинаковый спектр изоферментов. В онтогенезе каллусной культуры спектр может изменяться в зависимости от фитогормонального состава сред культивирования; также может меняться относительная активность отдельных изоферментов в спектре. При выращивании на морфогенных средах, т. е. в присутствии цитокининов, все три исследованных фермента не экспрессируются.

7. Продемонстрирована возможность применения бактериальной эндонуклеазы, продуциремой Serratia marcescens, для оздоровления растений от вирусной инфекции и показана ее стимулирующая роль при выращивании растений картофеля в культуре in vitro. Стимулирующий эффект бактериальной эндонуклеазы сохраняется и после высадки пробирочной культуры в почву в открытый грунт.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Леонова, Нина Семеновна, Улан-Удэ

1. Анисимов Б.В. Сортовые ресурсы и передовой опыт семеноводства картофеля. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2001. 472 с.

2. Асеева Т.В. Вегетативные мутации картофеля // Генетика. 1968. Т. 4. № 3. С. 145-164.

3. Асеева Т.В. Генетика картофеля // Картофель. М., 1937. С. 139-165.

4. Асеева Т.В., Николаева Н.В. Генетическая природа окраски клубней, ростков и цветков у картофеля // Тр. НИИ картофеля. 1935. Вып. 9. С. 107.

5. Ашмарин И.П., Ключарев JLA. Ингибиторы синтеза белка. М.: Медицина, 1975. 208 с.

6. Баранов B.C. Хромосомный импринтинг и межхромосомные взаимодействия в раннем развитии млекопитающих // Усп. соврем, биологии. 1988. Т. 105. Вып. 3. С. 26-35.

7. Биотехнологические методы получения и оценки оздоровления картофеля: Рекомендации. М.: Агропромиздат, 1988. 15 с.

8. Блоцкая Ж.В. Методы селекции картофеля на устойчивость к вирусным болезням. Минск, 1984. 94 с.

9. Бреславец Л.П. Полиплоидия в природе и опыте. М.: Изд-во: АН СССР, 1963. 364 с.

10. Будин К.З., Гавриленко Т.А. Генетические основы отдаленной гибридизации картофеля // Генетика. 1994. Т. 30. № 10. С. 1413-1422.

11. Бутенко Р.Г., Хромова Л.М., Седнина Г.В. Методические указания по получению вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля. М. : ВАСХНИЛ, 1984. 28 с.

12. Бутенко Р.Г., Шамина З.Б., Фролова Л.В. Индуцированный органогенез и характеристика растений, полученных в культуре тканей табака // Генетика. 1967. Т. 3. № 3. С. 23-39.

13. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика // Генетика. 2006. Т. 42. №9. С. 1186-1199.

14. Ванюшин Б.Ф. Энзиматическое метилирование ДНК-эпигенетический контроль за генетическими функциями клеток // Биохимия. 2005. Т. 70. №5. С. 598-611.

15. Гавриленко Т.А. Межродовая, межвидовая, внутривидовая гибридизация пасленовых: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. ВИР, 2000. 40 с.

16. Гавриленко Т.А., Антонова О.Ю., Костина Л.И. Изучение генетического разнообразия сортов картофеля с использованием ПЦР-анализа ДНЕС-органелл//Генетика. 2007. Т. 43. № 11. С. 1550-1555.

17. Гапоненко А.К., Маликова Н.И., Охрименко Г.Н., Созинов A.A. Получение сомаклональных линий у злаков (Triticum aestivum L. и Hordeum vulgaris L.) // Докл. АН СССР. 1985. Т. 283. № 5. С. 14711475.

18. Гапоненко А.К., Мунтян М.А., Маликова Н.И., Созинов A.A. Регенерация растений различных генотипов пшеницы Triticum aestivum L. in vitro //Докл. АН СССР. 1984. Т. 278. № 5. С. 1231-1235.

19. Гвоздев В.А. Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метилированием) ДНК // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 10. С. 11-17.

20. Гейл Э.Ф., Кандлифф Э., Рейнолдс П.Е. и др. Молекулярные основы действия антибиотиков. М.: Мир, 1975. 500 с.

21. Гершензон С.М. Основы современной генетики. Киев: Наук. Думка, 1983. С. 241-259.

22. Глагоцкая Т.П., Щербатенко И.С. и др. Трансгенные растения картофеля, обладающие устойчивостью к вирусной инфекции // Докл. АН УССР. 1990. Сер. 13. № 10. С. 57-59.

23. Глеба Д.М., Глеба Ю.Ю. Мутации и эпигенетические изменения в культуре клеток и протопластов высших растений // Цитология и генетика. 1978. Т. 12. № 5. С. 458-469.

24. Глеба Ю.Ю., Бутенко Р.Г., Сытник K.M. Слиятние протопластов и парасексуальная гибридизация Nicotiana tabacum L. // Докл. АН СССР. 1975. Т. 22. С. 1196-1198.

25. Голубовский М. Д. Концепция эпигена 20 лет спустя // Биополимеры и клетка. 1996. Т. 12. № 4.С. 5-24.

26. Голубовский М. Д. Неканонические наследственные изменения // Природа. 2001. № 8. С. 3-9.

27. Голубовский М.Д. Век генетики: эволюция идей и понятий. СПб.: Борей Арт, 2000. 262 с.

28. Граскова И.А., Юпова К.Ю., Войников В.К. и др. Роль слабо . связанных с клеточной стенкой пероксидаз в устойчивости картофеляпри инфицировании кольцевой гнилью // Докл. РАН. 2008. Т. 428. №3. С. 414-416.

29. Гринева Г.М. Регуляция метаболизма у растений при недостатке кислорода. М.: Наука, 1975. 279 с.

30. Губарь Е.К., Кунах В.А. Кариотипическая изменчивость культивируемых клеток скерды {Crépis capilaris L). // Генетика. 1992. T. 28. №6. С. 51-61.

31. Гуторов А.Н., Лесников Р.И., Салганик Р.И., Кривошеев Б.Н. Дезоксирибонуклеаза в терапии простого рецидивирующего герпеса // Вестник дерматалогии и веперологии. 1976. С. 75-78.

32. Давоян Э.И. Мутагенез в культуре ткани риса и получение на его основе нового исходного материала // Генетика. 1983. Т. 19. № 10. С. 1714-1719.

33. Дементьева З.А. Полиморфизм белков клубней картофеля и возможности его использования в селекции и семеноводстве // Картофелеводство. 2008. Т. 15. С. 143-152.

34. Дерфкер В. О биологическом значении метилирования ДНК // Биохимия. 2005. Т. 70. С. 618-640.

35. Долгих Ю.И. Сомаклональная изменчивость растений и возможности ее практического использования (на примере кукурузы): Дис. докт. биол. наук. М.: Ин-т физиологии растений им. К.А. Тимирязева, 2005. 385 с.

36. Епифанова О.И. Гормоны и размножение клеток. М.: Наука, 1965. 242с.

37. Зеленева И.В., Поликарпочкина Р.Г., Реймерс Ф.Э. Ферментные системы каллусной и суспензиоуной культуры кукурузы в сравнении с исходным материалом междоузлиями интактного растения // Докл. АН. 1979. Т. 248. № 2. С. 509-512.

38. Кирикович С.С., Левитес Е.В. Факторы, влияющие на эпигенетическую изменчивость у растений // Эпигенетика растений (сб. науч. тр.). Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 2005. С. 144-161.

39. Киселева Г.Н. Изучение влияния ß-индолил уксусной кислоты на синтез ДНК в проростках ячменя методом авторадиографии и цитофотометрии // Тез. докл. всесоюзн. симпозиума «Половой процесс и эмбриогенез растений». М., 1973. С. 103.

40. Комарова MJL, Трифонова Е.А., Кочетов A.B. и др. Трансформация картофеля Solanum tuberosum L. и получение трансгенных растений, экспрессируюших нуклеазу Serratia marcescens II Картофелеводство. Минск, 2003. Т. 1. С. 333-366.

41. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры. М.: Колос,1983. 320 с.

42. Корочкин Л.И. Биология индивидуального развития. М.: Изд-во МГУ, 2002. 264 с.

43. Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений и факторы, регулирующие этот процесс // Цитология и генетика. 1980. Т. 14. № 1.С. 73-81.

44. Кунах В.А. Особенности структур мутагенеза в популяциях культивируемых клеток растений // Усп. совр. генетики. М.: Наука,1984. Т. 12. С. 30-68.

45. Кунах В.А., Алпатова Л.К. Роль фитогормонов в изменчивости числа хромосом в культуре тканей Haplopoppus gracilis II Докл. АН СССР. 1979. Т. 245. № 4. С. 967-970.

46. Лавров С.А., Мавродиев Е.В. Эпигенетическое наследование признаков и его возможная роль в микроэволюции растений // Журн. общ. биологии. 2003. Т. 64. № 5. С. 403-420.

47. Левитес Е.В. Генетика изоферментов растений. Новосибирск: Наука, 1986. 144 с.

48. Левитес Е.В., Горенштейн Н.М., Денисова Ф.Ш., Тарасова P.C. Изоферменты как маркеры нестабильности генома у сахарной свеклы //Генетика. 1991. Т. 27. № 11. С. 1937-1954.

49. Левитес Е.В., Малецкий С.И., Монастырева Л.Е. и др. Генотипическая и фенотипическая изменчивость алкогольдегидрогеназы у кукурузы {Zea mays L.) // Докл. АН СССР. 1974. Т. 218. № 2. С. 466-468.

50. Мазин В.В., Попова Т.А., Хадеева Н.В. и др. Получение регенератов ярового рапса на селективных средах, содержащих нистатин, и оценка их устойчивости к вредным насекомым // С.-х. биология. 2007. № 1. С. 86-90.

51. Мазин В.В., Хитрова Л.М. Самозащита растений, или смена парадигм // С.-х. биология. 2001. № 3. С. 37-42.

52. Малецкий С.И. Слитное наследование (новая парадигма) // Эпигенетика растений. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 2005. С. 113144.

53. Малецкий С.И., Колодяжная Я.С. Генетическая изменчивость в популяциях соматических клеток и её влияние на репродуктивные признаки у покрытосеменных растений // Эпигенетика растений. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 2005. С. 87-113.

54. Малецкий С.И., Левитес Е.В., Батурин С.О., Юданова С.С. Репродуктивная биология покрытосеменных растений. Генетический словарь. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 2004. 106 с.

55. Молявко А.А., Свист В.Н., Старко Л.И. Заражение вирусной инфекцией и продуктивность картофеля в зависимости от происхождения элиты // Картофелеводство. 2007. Т. 13. С. 84—93.

56. Мусин С.М. Полиморфизм белков картофеля и возможности его использования в селекции и семеноводстве // Использование клеточных технологий в селекции картофеля (сб. науч. тр.). М., 1987. С. 77-87.

57. Оленов Ю.М. Эпигеномная изменчивость // Онтогенез. 1970. Т. 1. № 1.С. 11-16.

58. Паназян Н.Д. Эффективный путь получения регенерантов пшеницы и ячменя в культуре соматических клеток на основе органогенных штаммов // Тез. докл. IV съезда ВОГиС, Кишенев, 1-5февраля, 1982 г. Кишенев: Штиинца, 1982. Т. 1. С. 186.

59. Панфилова З.И., Салганик Р.И. Полумутантный штамм бактерий -суперпродуцент эндонуклеазы с противовирусными свойствами // Генетика народному хозяйству. Новосибирск, 1990. С. 64-65.

60. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии. М.: Наука, 1988. 303 с.

61. Рейфман В.Г. Десять лет фитовирусологических исследований на Дальнем Востоке // Тр. биол. почвен. ин-та. 1976. Т. 25. С. 9.

62. Рефф Р., Кофмен Т. Эмбрионы, гены, эволюция. М.: Мир, 1986. 402 с.

63. Салганик Р.И. Ферменты побеждают вирусы // Наука в СССР. 1985. №4. С. 98-103.

64. Салганик Р.И., Баталина Т.А., Бердичевская JI.C., Мосолов А.Н. Торможение синтеза РНК и размножение вируса клещевого энцефалита под действием рибонуклеазы //Докл. АН СССР. 1968. Т. 180. №6. С. 1473-1475.

65. Салганик Р.И., Баталина Т.А., Ногина В.Т. и др. Действие рибонуклеазы на вирус ящура. Изучение механизма инактивирующего действия // Изв. СО АН СССР. 1969. Сер. мед. биол. № 10. С. 74-78.

66. Салганик Р.И., Загребельный С.Н., Грачева С.Ф. и др. Эндонуклеаза бактериальная — средство профилактики вирусного паралича пчел // Ветеринария. 1985. № 5. С. 42-44.

67. Салганик Р.И., Талпалацкий П.Л. Влияние эндонуклеазы из Serratia marcescens на инфекционный процесс при вирусном параличе пчел // Сиб. вестник с.-х. науки. 1976. С. 124-126.

68. Салганик Р.И., Трухачев A.A., Баталина Т.А. Противовирусное действие дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы // Ингибиторы вирусной активности. Рига: Знание, 1972. С. 147-152.

69. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев: Наук, думка, 1990. 280 с.

70. Сидоров В.А., Зубко М.К., Коломиец М.П., Комарницкий И.К. Анализ мутаций хлорофиллдефектности у растений при помощи слияния протопластов // Генетика. 1987. Т. 23. № 2. С. 311-316.

71. Сидоров В.А., Зубко М.К., Кучко A.A. Получение мутантов картофеля in vitro и их использование в клеточной инженерии // Генетика и селекция. 1986. Т. 19. № 5. С. 470-474.

72. Сидоров В.А., Лысенко Е.Г., Кучко A.A. Культура изолированных протопластов для получения новых форм картофеля // Исследования по клеточной селекции картофеля. Мин-во с.-х. РСФСР, Укр. НИИ картоф. хоз-ва, 1984. С. 108-114.

73. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю. и др. Соматическая гибридизация пасленовых. Киев: Наук, думка, 1985. 130 с.

74. Созинов A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. М.: Наука, 1985. 272 с.

75. Солоненко Л.П., Леонова Н.С., Контарева Н.И. Изменение белков картофеля в зависимости от уровня дифференциации в культуре ткани // Матер. VI Всесоюзн. симпозиума «Молекулярные механизмы генетических процессов». М., 1987, С. 143.

76. Суханов В.М., Паназян Н.Д. Условия получения каллуса и регенерантов в культуре зрелых зародышей пшеницы // Апомиксис и цитоэмбриология растений. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1983. Вып.5. С. 124-130.

77. Тимирязев К.А. Исторические методы в биологии. Т. 6. М.: Сельхозгиз, 1939. 238 с.

78. Трифонова Е.А., Комарова M.JL, Сырник O.A. и др. Трансгенные растения табака Nicotiana tabacum SRI, экспрессирующие ген, кодирующий нуклеазу Serratia marcescens II Генетика. 2002. Т. 38. № 2. С. 274-277.

79. Трухачёв A.A., Салганик Р.И. Действие дезоксирибонуклеазы на включение тимидина Н в клетки, зараженные вирусом осповакцины // Вопросы вирусологии. 1967. Вып. 3. С. 117-124.

80. Уоддингтон К.Х. Основные биологические концепции // На пути теоретической биологии. М.: Мир, 1970. С. 11-38.

81. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. М.: Мир, 1984. 472 с.

82. Холлидей Р. Эпигенетическая наследственность // В мире науки. 1989. № 8. С. 30-38.

83. Хромова JI.M., Седнина Г.В., Бутенко Р.Г. и др. Возможности методов культуры тканей для выявления вариабельности генотипов картофеля //Докл. ВАСХНИЛ. 1983. № 10. С. 21-23.

84. Чураев Р.Н. Генные и эпигенные сети: два уровня организации наследственной системы // Информ. вестник ВОГиС. 2005. Т. 9. С. 199-208.

85. Чураев Р.Н. Моделирование молекулярно-генетических систем управления: Дис. . д-ра биол. наук. Уфа: БФАН СССР, ИциГ, 1987. 414 с.

86. Чураев Р.Н. Прикладные аспекты концепции эпигенов // Журн. общ. биологии. 1982. Т. 43. № 1. С. 79-87.

87. Чураев Р.Н. Эпигенетика: генные и эпигенные сети в онто и филогенезе // Генетика. 2006. Т. 42. № 9. С. 1276-1296.

88. Чуриков H.A. Молекулярные механизмы эпигенетики // Биохимия. 2005. Т. 70. № 4. С. 493-513.

89. Шевченко В.В., Гриних Л.И. Химерность у растений. М.: Наука, 1981. 212 с.

90. Шмальгаузен И.И. Пути и закономерности эволюционного процесса. М.; Л.: АН СССР, 1939. 128 с.

91. Adams W.T., Joly R.J. Genetics of allozyme variants in loblolly pine // J. Heredity. 1980. V. 71. P. 33-40.

92. Adams S., VinKenoog, Spielman M. et al. Parent of origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana require DNA methylation // Development. 2000. V. 127. P. 2493-2502.

93. Alleman M., Doctor J. Genetic imprinting in plants: observations and evolutionary implication // Plant. Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 147-161.

94. Ammirato P.V. Embryogenesis. Handbook of plant cell culture. N.Y., London: Macmillian, 1983. V. 1. P. 82-123.

95. Ashmore S.E., Shapcott A.S. Cytogenetic studies of Haplopappus gracilis in both callus and suspension cell cultures // Theor Appl Genet. 1989. V. 78. P. 249-259.

96. Aviv D., Galum E. Isolation of tobacco protoplasts in the presence of isopropyl-N-phenylcarbamate and their culture and regeneration into plants // Z. Pflanzenphysiol. 1977. V. 83. P. 267-273.

97. Barta J., Cum V., Divis J. Study of biochemical variability of potato cultivars by solyble protein, isoesterase, and isoperoxidase electrophoretic patterns // Plant soil. Environ. 2003. V. 49. № 5. P. 230-236.

98. Beaudet A.L. Is medical genetic neglecting epigenetics? // Genetics in Medicine. 2002. V. 4. P. 399-402.

99. Behnke M. General resistance to late blight of Solanum tu berosum plants regenerated from callus Resistant to culture filtrates of Phytophtora infestans // Ibid. 1980. V. 56. P. 151-152.

100. Behnke M. Selection of potato callus for resistance to culture filtrates of phytophtora infestans an Regeneration of resistant plant // Theor. Appl. Genet. 1979. V. 55. P. 69-71.

101. Binding H., Nehls R., Schieder O. et al. Regeneration of mesophyll protoplasts isolated from dihaploid clones of Solanum tuberosum II Physiol. Plant. 1978. V. 43. P. 52-54.

102. Binns A., Meins F.J. Evidence that habituation of tobacco pith cell division promoting factors is heritable and potentially reversible // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1973. V. 70. P. 2660-2662.

103. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory // Genes and Development. 2002. V. 16. P. 6-21.

104. Bordnman C.H., Bordnman J.F. Plant protoplast viability // The Physiological Properties of Plant Protoplasts B. Heidelberg: Springer, 1985. P. 29-37.

105. Bourgin J.P., Goujaud J., Missonier C. et al. Valine resistance, a potential marker in plant cell genetics. 1. Distinction of two types of valine-resistant tobacco mutants isolated from protoplast-derived cells // Genetics. 1985. V. 109. P. 393-407.

106. Breiman A., Barash I. Partial characterization of phytotoxic compounds in culture filtrates of Phytophthora citrophthora II Phytopathol. Z. 1981. V. 102. P. 1-9.

107. Breiman A., Galun E. Plant protoplast as tools in quantitative assays of phytotoxsis compounds from culture filtrates of Phytophthora citrophthora //Physiol. Plant Pathol. 1981. V. 19. P. 181-191.

108. Brettell R.I.S., Pallotta M.A., Gustafson J.P. et al. Variation at the Nor loci in triticale derived from tissue culture // Theor. and Appl. Genet. 1986. V. 71. №4. P. 637-643.

109. BrinkR.A. Paramutation// Annu. Rev. Genet. 1973. V. 7. P. 129-152.

110. Brink R.A. Paramutation and chromosome organization // Q. Rev. Biol. 1960. V. 35. P. 120-137.

111. Brink R:A. A genetic change associated with the R locus in maize, wich is directed and potentially reversible II Genetics. 1956. V. 41. P. 872-889.

112. Buiatti M., Scala A., Bettini P. et al. Correlations between in vivo resistance to Fusarium and in vitro response to fungal elicitors and toxic substances in carnation // Theor. and Appl. Genet. 1985. V. 70. № 1. P. 42-47.

113. Buvat R. Recherches sur la dedifferenciation des cellules vegetales // Ann. Sei. Nat. Bot. 1944. B. 5. P. 1-130.

114. Carlson P.S. Methienine sulfoximine-resistant mutants of tobacco // Jbid. 1973. V. 180. P. 1366-1368.

115. Chaleff R.S., Parsons M.F. Isolation of a glycerol-utilizing mutant of Nicotiata tabacum II Genetics. 1978. V. 89. P. 723-729.

116. Chin J.C., Scott K.J. Studies on the formation of roots and shoots in wheat culture //Ann. Bot. 1977. V. 41. № 173. P. 473-481.

117. Coe E.H.Jr. The properties origin and mechanism of conversion type inheritance at the B locus in maize // Genetics. 1966. V. 53. P. 1035-1063.

118. Colijn C.M., Kool A.J., Nijkamp H.J.J. An effective chemical mutagenesis procedure for Petunia Hybrida cell suspension cultures // Theor. Appl. Genet. 1979. V. 55. № 3/4. P. 101-116.

119. Collinge D.B., Slusarenko A.J. Plant gene expression in response to pathogens //Plant Mol. Biol. 1987. V. 9. P. 389-410.

120. Cooper D.B., Sears R.G., Lookhart G.L., Jones B.L. Heritable samaclonal variation in gliadin proteins of wheat plants derived from immature embryo callus culture II Ibid. 1986. V. 71. № 6. P. 784-790.

121. Cooper J.I., Jones A.T. Responses of plants to virus, proposals for the use of terms //Phytopath. 1983. V. 73. P. 127-128.

122. Correns C. Vererbungsversuche mit blass (gelb) grünen und buntblattrigen Spippen bei Mirabilis jalapa, Urtica pilulifera und Lunaria annua // Z. indukt. Abstamm. u. VererbLehre. 1909. V. 1. P. 291-329.

123. Culver J.N. Viral avirulence genes II Plant-Microbe Interact. N.Y., 1997. V. l.P. 196-219.

124. D'Amato F. Chromosome number variation in cultured cells and regenerated plants // Frontiers of plant tissue culture 1978. Proc. 4th Intl Cong Plant Tissue and Cell Culture. Calgary: IAPTC, 1978. P. 287-295.

125. D'Amato F. Nuclear cytology of tissue cultures // Plant tissue and cell culture application to crop improvement: Proc. Int. Symp. Olomouc, Czechoslovakia. Sept. 24-29, 1984. P. 295-303.

126. Deaton W.R., Keyes G.J., Collins G.B. Expressed resistance to black shank among tobacco callus cultures // Theor. and Appl. Genet. 1982. V. 63. № 1. P. 65-70.

127. Diener T.O. Potato spindle tuber viroid. 8. Correlation of infectivity with a UV-absorbing component and thermal denaturation properties of RNA // Virology. 1976. V. 50. P. 606-609.

128. Diener T.O. Viroids and viroid diseases. Wiley and Sons, New York, 1979. 252 p.

129. Dix P.J. Cross- resistance in cell lines Nicotiana sylvestris selected for resistance to individual antibiotics // Ibid. 1981b. V. 148. P. 321-325.

130. Dix P.J. Inheritance of chloramphenicol resistance, a trait selected in cell cultures of Nicotiana Sylvestris Speg. and Comes // Ann Bot. (Gr Brit). 1981a. V. 48. P. 315-319.

131. Dix P.J., Joo F., Maliga P.A. Cell line of Nicotiana sylwestris with resistance to kanamicin and streptomycin // Mol. and Gen. Genet. 1977. V. 157. P. 285-290.

132. Dix P.J., Street H.E. Sodiym chrorida-resistant cultured cell lines from Nicotiana sylvestris and Capsicum // Ibid. 1975. V. 5. P. 231-237.

133. Durbin R.D. Toxins in plant disease. N.Y.: Acad, press, 1981. 515 p.

134. Edallo S., Zucchinali C., Perenzin M., Salamini F. Chromosomal variation and frequency of spontaneous mutation associated with in vitro culture and plant regeneration in maize // Maydica. 1981. V. 26. P. 39-56.

135. Endo T., Morishima H. Rice. In: Isozymes in plant genetics and breeding. PartB. Amsterdam: Elsvier, 1983. P. 129-146.

136. Flack I., Collin H.A., Putwain P.D. Selection of resistance to asulam in oil seed rape // Abstr. 4th Int. cong. of plant tissue and cell culture. Calgary (Canada), 1978. P. 171.

137. Flashman S.M. Use of a non-volatile thiocarbamate to select for herbicide-tolerant tobacco Nicotiana-Tabacum cell lines // Plant Science. 1985. V. 38. P. 149-54.

138. Flor H.H. Genetics of pathogenicity in Melampsora line I I J. Agric. Res. 1946. V. 73. P. 335-357.

139. Fluhr R., Aviv D., Galun E., Edelman M. Efficient induction and selection of chloroplast-encoded antibiotic-resistant mutants in Nicotiana // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 1485-1489.

140. Fromm H., Edelman M., Aviv D., Galun E. The molecular basis for rRNA-dependent spectinomycin resistance in Nicotiana chloroplasts // EMBO J. 1987. V. 6. № 11. P. 3233-3237.

141. Furusawa I., Tanaka K., Thanutong P. et al. Paraquat resistant tobacco calluses with enhanced Superoxide dismutase activity // Plant and Cell Physiol. 1984. V. 25. № 7. P. 1247-1254.

142. Gengenbach B.G., Green C.E. Selection of T-cytoplasm maize callus cultures resistant to Helminthosporium maydis race T-pathotoxine // Crop Sci. 1975. V. 15. P. 645-649.

143. GillhamN.W., Boynton J.E., Burkholder B. Mutations altering chloroplasts ribosome phenotype in Chlamydomonas. 1. Non-Mendelian mutations // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1970.V. 67. № 2. P. 1026-1033.

144. Goodman M.M., Stuber C.W. Maize. In: Isozymes in plant genetics and breeding. PartB. Amsterdam: Elsvier, 1983. P. 1-33.

145. Gosch-Wackerle G., Avivi L., Galun E. Induction, culture and differentation of callus from immature rachises, seeds and embryos of Triticum // Z. Pflanzenphysiol. 1979. V. 91. № 3. P. 267-278.

146. Grobstein C. The problem of the chemical nature of embryonic inducers // Ciba foundation symposium on cell differentiation. London: Churchill, 1967. P. 131-136.

147. Haberlach G.T., Budde A.D., Sequeira L., Helgeson J.P. Modification of disease resistance of tobacco callus tissues by cytokinins // Plant. Physiol. 1978. V. 62. № 4. P. 522-525.

148. Halverson L.J., Stacey G. Signal exchange in plant-microbe interactions // Microbiol. Rev. 1986. V. 50. № 2. P. 195-225.

149. Harrison B.D., Mayo M.A. The use of protoplasts in plant virus research // Use of tissue culture and protoplasts in plant pathology N.Y.: Acad. Press, 1983. P. 67-137.

150. Hartman C.L., McCoy T.J., Knows T.R. Selection of alfalfa (Medicago sativa) cell lines and regeneration of plants resistant to the toxins, produced by Fusarium oxysporum f. sp. Medicaginis I I Plant Sci. Lett. 1984. V. 34. P. 183-194.

151. Hawkes J.G. Origins of cultivated potatoes and species relationships // Potato Gen. Wallingford, 1994. P. 3-42.

152. Heinz D.J. Sugar-cane improvement through induced mutations using vegetative propagules and cell culture techniques // Induced mutations in vegetatively propagated plants: Proc. of a Panel, Sept. 11-15, 1972. Vienna:IAEA, 1973. P. 53-59.

153. Heinz D.J., Krishnamurthy M., Nickel L.G., Maretzki A. Cell, tissue and organ culture in sugar-cane improvement // Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture. Berlin: Springer, 1977. P. 3— 17.

154. Heinz D.J., Mee G.W.P. Morphologic, cytogenetic and enzymatic variation in Saccharum species hybrid clones derived from callus tissue // Amer. J. Bot. 1971. V. 58. № 3. P. 257-262.

155. Helgeson J.P. Studies of host-pathogen in teractions in vitro II Use of tissue culture and protoplasts in plant pathology, N.Y.: Acad. Press, 1983. P. 9-38.

156. Helgeson J.P., Haberlach G.T., Upper C.D. A dominant gene conferring disease resistance to tobacco plants is expressed in tissue cultures // Phytopathology. 1976. V. 66. P. 91-96.

157. Hemenway C., Fang R.-X., Kaniewski W et al. Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X coat protein or its antisense RNAIIEMBO J. 1988. V. 7. P. 1273-1280.

158. Heslop-Harrison J.S., Bennett M.D. Cromosome order possible implication for development // J. Embriol. Exp. Morph. 1984. V. 83. P. 51-73.

159. Hoekema A., Huisman M.J., Molendijk L. et al. The genetic engineering of two commercial potato cultivars for resistance to potato virus X // Bio-Technol. 1989. V. 7. P. 273-278.

160. Holliday R., Pugh J. DNA modification mechanisms and gene activity during development// Science. 1975. V. 187. P. 226-232.

161. Hosaka K., Ogawa K. Genetic diversity and North American potato cultivars evaluated by RAPD analysis // Sci. Rep. Fac. Agr. Kobe Univ. 1994. V. 21. P. 39-42.

162. Ingram D.S., Joachim J. The growth of Peronospora farinose f sp. Betae and sugar beet callus tissues in dual culture // J. Gen. Microbial. 1971. P. 211-220.

163. Ingram D.S. Applications in plant patology // Plant tissue and cell culture. Oxford; Blackwell Sci. Pabl., 1977. P. 463-500.

164. Ingram D.S., MacDonald M.V. In vitro selection of mutants I I Nuclear technique and in vitro culture for plant improvement. Intern. Atomie Energy Agency, Vienna, 1986. P. 241-258.

165. Ivanova T., Antonova O., Rogozina E. et al. Transfer of resistance from wild species to potato Solanum tuberosum through somatic hybridization // XI Intern. Mol. Plant-Microbe Interact. 2003. P. 182.

166. Jaaska V.E. Electrophoretic enzyme studies in the genus Secale L. // ENSV TA Toimet. Biol. 1972. V. 21. № 1. P. 61-70.

167. Jablonka E., Lamb MJ. Epigenetic inheritance and evolution // J. Evol. Biol. 1998. V. 11. P. 159-183.

168. Jablonka E., Lamb M.J. Epigenetic inheritance and evolution: the Lamarckian dimension. Oxford U.K.: Oxford Univ. Press, 1995.

169. Jorgensen R. The germinal inheritance of epigenetic information in plants // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 1993. V. 339. P. 173-181.

170. Kawchuk L., Martin R., McPherson J. Sense and antisense RNA-mediated resistance to potato leafroll virus in Russet Burbank potato plants // Ibid. 1991. V. 4. P. 247-253.

171. Keen N.T., Horsch R. Hydroxyphaseollin. production by various soybean tissues: a warning against the use of unnatural host-parasite systems // Phytopathology. 1972. V. 62. P. 439-442.

172. Kemble R.J., Shepard J.F. Cytoplasmic DNA variation in a potato protoclonal population // Theor. and Appl. Genet. 1984. V. 64. № 2. P. 211-216.

173. Kirikovich S.S., Svirshchevskaya A.M., Levites E.V. Variation at isozyme loci in seed offspring of sugar beet gynogenetic lines // Sugar Tech. 2003. V. 5 № 4. P. 289-292.

174. Krishnamurthy M., Tlaskal J. Fiji desease resistant Saccharum officinarum var. Pindar subclones from tissue cultures// Proc. Congr. Int Soc. Sug Cane Technol. 1974. P. 130-137.

175. Landsmann J., Uhrig U. Somaclonal variation in solanum tuberosum, detected at the molecular level // Theor. Appl. Genet. 1985. V. 71. P. 500505.

176. Larkin P.I., Scowcroft W.R. Somaclonal variation a novel source of variability from cell culture for plant improvement // Theor. Appl. Genet. 1981. V. 60. P. 197-214.

177. Larkin P.J., Ryan S.A., Brettell R.I.S. et al. Heritable somaclonal variation in wheat // Theor. and Appl. Genet. 1984. V. 67. № 5. P. 443-455.

178. Lawson C, Kaniewski W., Haley L. et al. Engineering resistance to mixed virus infection in a commercial potato cultivar, resistance to potato virus X and potato virus Y in transgenic Russet Burbank potato // Bio-Technol. 1990. V. 8. P. 127-134.

179. Lodge J.K, Kaniewski W.K, Turner N.E. Broad spectrum resistance in transgenic plants expressing pokeweed antiviral protein // PNAS USA. 1993. V. 90. P. 7089-7093.

180. Lorz H., Brown P.T.H. Variability in tissue culture derived plants-possible origins; advantages and drawbacks. Genetic manipulation in plant breeding. Berlin; N.Y.: Walter de Gruyter Co., 1986. P. 513-534.

181. LoSchiavo F., Pitto L., Giuliano G. et al. DNA methylation of embryonic carrot cell cultures and its variations as caused by mutation, differentiation,hormones and hypomethylating drugs // Theor. Appl. Genet. 1989. V. 77. P. 325-331.

182. Maliga P., Breznovits S.A., Marton L. Streptomycin — resistant plants from callus culture of haploid tobacco //Nature. 1973a. V. 244. P. 28-30.

183. Maliga P., Marton L., Breznovits S.A. 5-Bromodeoxyuridine-resistant cell lines from haploid tobacco // Plant Sci. Let. 1973b.V. 1. P. 375-383.

184. Matern U., Strobel G., Shepard J.F. Reaction to phytotoxins in a potato population derived from mesophyll protoplasts //Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. № 10. P. 4935-4939.

185. Matsubayashi M. Phylogenetic relationships in the potato and its related species // Chromosome engineering in plants: genetics, breeding, evolution. Amsterdam: Elsevier, 1991. P. 93-118.

186. Matthysse A.G., Torrey J.G. Factors limiting the stimulation of polyploid mitosis in intact pea roots and excised root segments // Bot. Gaz. 1969. V. 130. P. 62-69.

187. Matzke M.A., Matzke A.J.M. How and why do plants inactivate homologous (trans)genes? // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 679-685.

188. McClintock B. The control of gene action in maize // Brookhaven Symposia in Biol. 1965. V. 18. P. 162-184.

189. McClintock B. The significance of responses the genome to challenge // Science. 1984. V. 266. P. 792-801.

190. McHughen A.G. Salt tolerance through increased vigor in a flax line (STS-11) selected for salt tolerance in vitro // Theor. and Appl. Genet. 1987. V. 74. № 6. P. 727-732.

191. McHughen A.G., Swartz M. A tissue culture derived salt tolerant line of flax (Lihum usitatissimum) // J. Plant Physiol. 1984. V. 117. P. 109-117.

192. Medgyesy P., Menczel L., Maliga P. The use of cytoplasmic streptomycin resistance: chloroplast transfer from Nicotiana tabacum into Nicotianasylvestris and isolation of their somatic hybrids // Mol. Gen. and Genet. 1980. V. 179. № 3. P. 693-698.

193. Menczel L., Nagy F., Kiss Z.R. et al. Streptomycin resistant and sensitive somatic hybrids of Nicotiana tabacum + Nicotiana knightiana correlation of resistance to N. tabacum plastids // Theor. and Appl. Genet. 1981. V.589. P. 191-195.

194. Mitra J., Mapes M.O., Steward F.C. Growth and organized development of cultured cells. IV. The behavior of the nucleus // Amer. J. Bot. 1960. V. 47. № 5. P. 357-368.

195. Muller A J., Grafe R. Isolation and characterization of cell lines of Nicotiana tabacum lacking nitrate reductase // Ibid. 1978. V. 161. P. 67-76.

196. Murakishi H.H., Carlson P.S. In vitro selection of Nicotiana sylvestris variants with limited resistance to TMV // Plant cell Reports. 1982. V. 1. P. 94-97.

197. Murakishi H.H., Lesney M., Carlson P. Protoplasts and plant viruses // Adv. Cell Cult. 1984. V. 3. P. 1-55.

198. Murashige T., Nakano R. Tissue culture as a potential tool in obtaining polyploid plants // J. Hered. 1966. V. 57. P. 114-118.

199. Nabors M.W., Daniel A., Nadolny L., Brown C. Sodium chloride tolerant lines of tobacco cells // Plant Sci. Let. 1975. V. 4. P. 155-159.

200. Nabors M.W., Gibb S.E., Bernstein S., Meis M.E. NaCl-tolerant tobacco plants from cultured cells // Z. Pflanzenphysiol. 1980. V. 97 P. 13-17.

201. Nabors M.W., Heyser J.N., Dykes T.A. et al. Long-duration, high frequency plant regeneration from cereal tissue culture // Planta. 1983. V. 157. №5. P. 385-391.

202. Nanney D. L. Epigenetic control systems // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1958. V. 44. P. 712-717.

203. Naylor A.W., Sander G., Skoog F. Mitosis and cell enlargement without cell division in excised tobacco tissue // Physiol. Plant. 1954. V. 7. P. 25-29.

204. Newton K.J. Genetics of mitochondrial isozymes // Isozymes in plant genetics and breeding. Part A. Amsterdam: Elsevier, 1982. P. 159-176.

205. Novy R., Nasruddin A., Ragsdale D., Radcliffe E. Genetic resistances to potato leafroll virus, potato virus Y, and green peach aphid in progeny of Solanum tuberosum II Am. J. Potato Res. 2002. V. 79. P. 9-18.

206. Ohyama K. The basis for bromodeoxyuridine-resistance in plant cells // Environ. Exp. Bot. 1976. V. 16. P. 209-216.

207. Okamoto D., Nielsen S.V.S., Albrechtsen M., Borkhardt B. General resistance against potato virus Y introduced into a commercial potato cultivar by genetic transformation with PVYN coat protein gene // Potato Res. 1996. V. 39. P. 271-282.

208. Oono K. In vitro methods applied to rice // Plant tissue culture. Methods and applications in agriculture. N.Y.: acad. Press, 1981. P. 273-298.

209. Palys J.M., Meredith C.P. Dual cultures of grape (Vitis spp.) and the lesion nematode Pratylenchus vulnus for studies of nematode tolerance // Plant Dis. 1984. V. 68. № 2. P. 1058-1060.

210. Prasad B., Satishchandra-Prabhu M., Shanthamma C. Regeneration of downy mildew resistant plants from infected tissues of pearl millet {Pennisetum americanum) cultured in vitro II Curr. Sci. 1984. V. 53. P. 516-517.

211. Preston D.A. Spray coverage of potato plants using various types of applicator methods //Amer. J. of Potato Research. 1998. V. 75. P. 292.

212. Pullman G.S., Rappaport L. Tissue culture-induced variation in celery for Fusarium yellows //Phytopathology. (Abstr.). 1983. V. 73. P. 818.

213. Randolph L.F. Some effect of high temperature on polyploidy and variations in maize //Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1932. V. 18. P. 222.

214. Reed S.M., Rufty R.C. Reaction of calli of bluemold resistance and susceptible Nicotiana genotypes to infection by Peronospora tabacina II Tab. Sci. 1985. V. 29. P. 53-56.

215. Reisch B. Genetic variability in regenerated plants // Handbook of plant ceel culture. N.Y.; London:"Macmillan,l983.V. 1. P. 748-769.

216. Riesner D, Henco K, Rokohl U. et al. Structure and structure formation of viroids // J. Mol. Biol. 1979. V. 133. № l.P. 85-115.

217. Relton J.M., Wallsgrove R.M., Bourgin J.P. et al. Altered feedback sensitivity of acetohydroxyacid synthase from valine-resistant mutants of tobacco (Nicotiana tabacum L.) // Planta. 1986. V. 169. P. 46-50.

218. Ross H. Die vererbung der immunitetgegen das X- virus in tetraploiden Solanum acaule II Proc. of the 9th Intern. Congr. Gen. Bellagio, 1953. P. 1128.

219. Sacristan M.D. Resistance responses to Phoma lingam of plants regenerated from selected cell and embiyogenic cultures of haploid Brassica napus II Theor. and Appl. Genet. 1982. V. 61. P. 193-200.

220. Sacristan M.D., Hoffmann F. Direct infection of embryogenic tissue cultures of haploid Brassica napus with resting spores of Plasmodiophora brassicae II Theor. and Appl. Genet. 1979. V. 54. P. 129-132.

221. Sacristan M.D., Melchers G. The karyological analysis of plants regenerated from tumorous and other callus cultures of tobacco // Mol. Gen. Genet. 1969. V. 105. P. 317-333.

222. Salaman R.N. Male-sterility in potatoes // J. Linn. Soc. London. 1910. P. 177.

223. Salganik R.I. Current trends in life science // Biological Macromolecules. 1984. V. 12. P. 115-123.

224. Scandalios J.G., Felder M.R. Developmental expression of alcohol dehydrogenase in maize // Develop. Biol. 1971. V. 25. № 4. P. 641-654.

225. Schuchmann R. Methode zur relativen conzentration bestimmung for Fusarium toxinen durch messung der respirationstrate // Nachrichtenbl. Detsch. Pflanzenschutzdienst. 1985. V. 37. P. 81-84.

226. Schwartz D. Genetic control of alcohol dehydrogenase a competition model for regulation of gene action // Genetics. 1971. V. 67. № 3. P. 411-425.

227. Secor G.A. The potato protoplast system // Proc. N D. Acad. Sci. 1984. V. 38. P. 801.

228. Secor G.A., Shepard J.F. Variability of protoplast-derived potato clones // Crop Sci. 1981. V. 21. P. 102-105.

229. Shamina Z.B. Cytogenetic study of tissue culture Haplopappus gracilis // Proc Symp the mutational process. Academia, Prague, 1966. P. 377-380.

230. Shahin E.A., Spivey R.A single dominant gene for Fusarium wilt resistance in protoplast-derived tomato plants // Theor. And Appl. Genet. 1986. V. 73. P. 164-169.

231. Shepard J.F. Regeneration of plants from protoplasts of potato virus X infested tobacco leaves //Virology. 1975. V. 66. P. 492-501.

232. Sidorov V., Maliga P. Fusion-complementation analysis of auxotrophic and chlorophyll-deficient lines isolated in haploid Nicotiana plumbaginifolia protoplast cultures // Mol. And Gen. Genet. 1982. V. 186. № 3. P. 328-332.

233. Sidorov V.A., Zubro M.K., Kuchko A.A. et al. Somatic hybridization in potato: use of y-irradiated protoplasts of Solarium pinnatisectum in genetic reconstruction // Theor. and Appl. Genet. 1987. V. 74. P. 364-368.

234. Skene K.G.M., Barlass M. Studies on the fragmented shoot apex of grapevine //J. Exptl. Bot. 1983. V. 34. № 147. P. 1271-1280.

235. Solomom-Blackburn R., Barker H. A review of host major-gene resistance to potato viruses X, Y, A and V in potato: genes, genetics and mapped locations //Heredity. 2001. V. 86. P. 8-16.

236. Solomom-Blackburn R., Barker H. Breeding virus resistant potatoes (Solanum tuberosum): a review of traditional and molecular approaches // Ibid. 2002. P. 17-35.

237. Solter D. Differential imprinting and expressi on of maternal and paternal genomes // Annu. Rev. Genet. 1988. V. 22. P. 127-146.

238. Stegemann H., Schnick D. Index 1985 of European potato varieties. Mitteilungen der Biologische Bundesanstalt Heft, 1985. B. 227. 128 s.

239. Stoller K., Schober B. Wirkung eines toxins von Phytophtora infestans (Mont.) de Bary auf kartoffelgewebe // Potato Res. 1984. V. 27. P. 173-184.

240. Stubbe W. Origin and continuity of plastids // Origin and continuity of cell organelles. Berlin-Heidelberg-New York: Springer, 1971. V. 2. P. 65-81.

241. Sung Z.R. Mutagenesis of cultured plant cells //Genetics. 1976. V. 84. P. 51-57.

242. Swiezynski K.M. Inheritance of resistance to viruses // Potato genetics. 1994. P. 229-363.

243. Takebe L., Labib G., Melchers G. Regeneration of whole plants from isolated mesophyll protoplasts of tobacco // Naturwissenschaften. 1971. V. 58. №6. P. 318-320.

244. Taylor A.L. Gurrent linkage map of Escherichia coli II Bacterid. Rev. 1970. V. 34. №2. P. 155-175.

245. Tchuraev R.N., Stupak I.V., Tropynina T.S. et al. Epigenes: desing and construction of new hereditary units // FEBS Lett. 2000. V. 486. № 3. P. 200-202.

246. Thieme R., Dinu I., Darsow U. et al. Use of somatic hybridization to transfer resistance to late blight and Potato Virus Y (PVY) into cultivated potato // Plant Breed, and Seed Science (PBSS). 2004. V 50. P. 113-118.

247. Thieme R., Gavrilenko T., Thieme T., Heimbach U. Production of potato genotypes with resistance to potato Virus Y by biotechnological methods // Plant Biotechnol. 1999. P. 557-560.

248. Thieme T., Thieme R. Evaluation of resistance to potato virus Y (PVY) in wild species and potato breeding clones of the genus Solarium II Aspects Appl. Biol. 1998. V. 52. P. 355-359.

249. Thomas B.R., Pratt D. Isolation of paraquat-tolerant mutants from tomato cell cultures // Ibid. 1982. V. 63. P. 169-176.

250. Tommiska T., Hamalainen J., Watanabe K., Valkonen J. Mapping of gene Nxphu that controls hypersensitive resistance to potato virus X in Solarium phureja IvP35 // Theor. Appl. Gen. 1998. V. 96. № 6-7. P. 840-843.

251. Torrey J.G. Kinetin at trigger for mitosis in mature endomitotic plant cells // Exptl. Cell Res. 1961. V. 23. P. 281-299.

252. Traub P., Nomura M. Streptomycin resistance mutation in Escherichia coli: alteredribosomal protein// Science. 1968. V. 160. № 3824. P. 198-199.

253. Trukhachev A.A., Salganik R.I. The effect of desoxyribonuclease on the sintesis of DNA of Vaccinia Virus II Virology. 1967. № 3.

254. Truve E., Aaspollu A., Honkanen J. et al. Transgenic potato plants expressing mammalian 2'-5' oligoadenilate synthetase are protected from potato virus X infection under field conditions // Bio-Technol. N.Y., 1993. V. 11. P. 1048-1052.

255. Valkonen J.P.T. Natural genes and mechanisms for resistance to viruses in cultivated and wild potato species // Plant Breed. 1994. V 12. P 1-16.

256. Valkonen J., Brigneti G., Salazar L. et al. Interactions of the Solanum sp. of the Etuberosa group and 9 potato-infecting viruses and viroid // Ann. Appl. Biol. 1992. V. 20. P. 301-313.

257. Van Loon L.C., Van Strien E.A. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR1 type proteins // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1999. V. 55. P. 85-97.

258. Vardi A., Epstein E., Breiman A. Is the Phytophtora citrophthora culrure filtrate a reliable tool for the in vitro selection of resistant Citrus variants? // Theor. and Appl. Genet. 1986. V. 72. № 4 P. 569-574.

259. Vyskot B. Epigenetic control of gene expression in plant // Vortr. Sflanzenzuchtung. 2000. H. 48. S. 297-304.

260. Waddington C. H. The epigenotype // Endevaour. 1942. V. 1. P. 18-20.

261. Waterhouse P., Graham M., Wang M. Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 13959-13964.

262. Weisblum G., Davies J. Antibiotic inhibitors of the bacterial ribosome // Bacteriol. Rev. 1968. V. 32. P. 493-528.

263. Wenzel G., Bolik M., Deimling S. et al. Breeding for disease resistance crop plants by cell culture techniques // Plant tissue and cell culture. N.Y.: AlanRLiss, 1987. P. 343-358.

264. Widholm J.M. Anthranilate syntetase from 5-methyltryptophan-susceptible and resistant cultured Daucus carota cells // Biochim. Biophys Acta. 1972. V. 279. № l.P. 48-57.

265. Wiik L. Fungicide strategies against late blight in Sweden // Late blight: managing the global threat Proc. of the Global Initiativeon Late Blight. Conference. Germany, Hamburg, 2002. P. 165.

266. Willmitser R.M. Characterisation of developmentally and environ-mentally regulated genes in potato // Biochem. Soc. Trans. 1937. V. 15. № 1. P. 12-14.

267. Wills C. The wisdom of the genes. Oxford: Oxford univ. Press, 1991.

Информация о работе

Леонова, Нина Семеновна
доктора биологических наук
Улан-Удэ, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Изменчивость в культуре картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro и возможности ее использования в селекции и семеноводстве - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы