Использование белковых и изоферментных маркеров в идентификации генотипов картофеля

Дементьева, Зоя Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Использование белковых и изоферментных маркеров в идентификации генотипов картофеля
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Использование белковых и изоферментных маркеров в идентификации генотипов картофеля"

На правах рукописи

Дементьева Зоя Александровна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВЫХ И ИЗОФЕРМЕНТНЫХ МАРКЕРОВ В ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОТИПОВ

КАРТОФЕЛЯ

06.01.05 — селекция и семеноводство 03.00.23 —биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006.

Работа выполнена в лаборатории меристемно-тканевых культур и микроклонирования Всероссийского научно-исследовательского института картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха

Научные руководителе

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

кандидат биологических наук |С.М. МусшП

кандидат биологических наук Б.В. Анисимов

доктор биологических наук Т. А. Ежова

кандидат биологических наук Н.В. Хадеева

Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН

Защита состоится 1 & октября 2006 г. в < & часов на заседании Диссертационного совета Д.220.043.10 при РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева по адресу:

127550, Москва, Тимирязевская ул., 49, отдел защиты диссертаций. Тел./факс: (095) 976-24-92

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан «1 (1Р /^Л1 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.И. Карлов

Актуальность проблемы. При создании и поддержании генетических коллекций и банков сортов картофеля, и в особенности при воспроизводстве и масштабном размножении исходного материала в процессе оригинального семеноводства особую актуальность приобретают две главные задачи: абсолютная уверенность в элиминации патогенов и точное генетическое соответствие исходного «материнского» растения генотипу сорта.

Для сохранения сорта исключительно важное значение имеет контроль генетической стабильности, поскольку в следствие возрастания вероятности спонтанных мутаций, растения, регенерированные из эксплантов соматических клеток, могут иметь существенные морфологические изменения. Длительное депонирование растений картофеля в культуре in vitro, где условия развития растений значительно отличаются от естественных, к которым картофель приспособился эволюционно, также может привести к генетическим изменениям за счет соматических мутаций, обусловленных, например, изменением содержания гормонов. Кроме того, при поддержании в пробирочной культуре неизбежно имеет место и путаница, привносимая техническими исполнителями.

Перечисленные проблемы обусловливают остроту вопросов генетического мониторинга исходного материала в процессе оригинального семеноводства картофеля на всех этапах работы: при оздоровлении сортов, поддержании коллекции in vitro, клональном размножении на биотехнологических модулях.

При этом традиционные методы описания и характеристики образцов на основе морфологических признаков часто имеют ограничения из-за растянутости во времени и недоступности для наблюдения всех признаков одновременно. Кроме того, они не применимы, например, для идентификации сортов в культуре in vitro, рассады и миниклубней, полученных на биотехнологических модулях. Поэтому необходимость разработки и усовершенствования методов экспресс-идентификации генотипов и системы генетического мониторинга сортообразцов при формировании и поддержании генетических коллекций и банков сортов картофеля обусловливает актуальность настоящей работы.

Цель и задачи исследования. ЦЕЛЬЮ исследования являлась разработка технологических основ идентификации генотипов и генетического мониторинга исходного материала на основе белковых маркеров.

При этом ставились следующие ЗАДАЧИ:

1. Разработать системы белковых и изоферментных маркеров для идентификации и паспортизации сортов картофеля in vitro и in vivo.

2. Дать характеристику генетического разнообразия сортов различного происхождения на основе белковых маркеров: сортов, полученных в результате межсортовой гибридизации; генетически близких сортов — сибсов и по-лусибсов; соматических мутантов и клоновых вариантов сортов; генетически модифицированных сортов в сравнении с исходными.

3. Разработать технологию молекулярно-генетического мониторинга банка сортов картофеля на этапах формирования, поддержания и размножения

оздоровленного исходного материала в процессе оригинального семеноводства.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые дана количественная характеристика генетического разнообразия сортов различного происхождения по изоферментным и белковым маркерам. Определен уровень полиморфизма сортов отечественной и зарубежной селекции, выявлены генетически родственные и дивергентные сорта, что может быть использовано в селекционной работе при подборе родительских форм для скрещивания. Проведена кластеризация сортов согласно их происхождения: сортов, полученных в результате гибридизации, сибсов и полусибсов, соматических мутантов и клоновых вариантов, генетически модифицированных сортов. Показано, что в таком ряду происходит закономерное уменьшение вариабельности при оценке на основе генетических дистанций. Определены возможности и ограничения маркеров в идентификации отличий соматических мутантов, клоновых вариантов, сомаклонов и генетически модифицированных сортов от исходных генотипов.

Предложена система молекулярно-генетического мониторинга образцов оздоровленного генобанка. Обнаружено, что возможно появление линий, генетически отличающихся от исходных генотипов. В Госреестре РФ выявлены сорта, неразличимые по белковым и изоферментным маркерам и являющиеся клоновыми вариантами или синонимами уже внесенных в реестр сортов.

Личный вклад соискателя. Соискателю принадлежит разработка программы и методики исследований, схемы основных экспериментов и теоретическое обобщение полученных результатов. Большая часть экспериментальных данных получена автором лично.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты работы доложены: на школе молодых ученых «Современные методы селекции картофеля на устойчивость к болезням и качество» (Коренево, 2004), на научно-практической конференции, посвященной 75-летию ВНИИКХ «Состояние и перспективы селекции и семеноводства картофеля» (Москва, ВНИИКХ, 2006 г.).

Опубликованность результатов. По материалам диссертации опубликовано S работ, включая 5" научных статей, 2 методических указания, 1 методические рекомендации.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), выводов, предложений, списка использованной литературы и приложения.

Материал изложен на 141 странице машинописного текста, содержит 18 таблиц, 39 рисунков, 1 приложение. Список литературы включает 204 работы, из которых 140 на иностранном языке.

Материалы и методика. В ходе работы было проанализировано более 300 различных генотипов картофеля (сорта и гибриды) из разных источников: полевые клубни сортообразцов из родительского и других селекционных питомников ВНИИКХ, сорта в культуре in vitro лаборатории меристемно-

тканевых культур ВНИИКХ; полевые клубни сортообразцов из ГорноАлтайского госуниверситета, ООО «Митрофановское» Челябинской области, Кемеровского НИИ Сельского хозяйства и др. Кроме того, анализировались изоэлектрофоретические спектры исходных сортов и их соматических мутантов, вариантных линий и сомаклонов, а также генетически модифицированных сортов, полученные в лаборатории ВНИИКХ в течение предыдущих лет. Для анализов использовали зрелые, среднекрупные полевые клубни, без видимого поражения грибными, бактериальными и вирусными болезнями, а также 6-8 недельные пробирочные микрорастения, синхронизированные по развитию одновременным черенкованием.

Методика исследования включала экстракцию белка, вертикальный диск-электрофореза (ЭФ) в трис-глициновой буферной системе по Davis (1964), изоэлектрофокусирование (ИЭФ) (pH 5,0-8,0 и 3,0-10,0), окрашивание на общий белок, пероксидазу или эстеразу в зависимости от цели эксперимента, сканирование или фотографирование гелей, составление белковых бинарных матриц по принципу присутствия (1) или отсутствия (0) компонентов спектров, на основании которых рассчитывались генетические дистанции и строились дендрограммы, отражающие скрытые генетические взаимосвязи генотипов картофеля. Для анализа полученных данных использовалось следующее программное обеспечение: Totallab for windows (денситометрическое сканирование спектров) и Statsoft Statistica 6.0 (расчет генетических дистанций и построение дендрограмм).

Результаты и обсуждение . Как известно, белок - индивидуальный продукт гена и является его надежным маркером, а сам метод сортовой идентификации по составу запасных белков клубней чрезвычайно эффективен. Результаты работы подтвердили имеющиеся данные о том, что межсортовые различия генофонда Solanum tuberosum ssp. tuberosum по электрофоретическим (ЭФ) и изоэлек-трофокусировочным (ИЭФ) спектрам белков клубней ярко выражены, что позволяет без труда дифференцировать сорта (рис. 1, 2). Различия обнаруживались в количестве белковых компонентов, их взаимном расположении и интенсивности окраски.

Белковые компоненты характеризовались по относительной электро-форетической подвижности и/или изоэлектрическим точкам. Было констатировано, что основная масса компонентов растворимых белков клубней относятся к медленно- и среднеподвижным. В общей сложности в генофонде изученных сортов картофеля идентифицировано 63 электрофоретических варианта растворимых белков клубней от 17 до 43 в зависимости от сорта, большая часть из которых являлась минорными и трудноразличимыми. При этом мономорфными оказались только 4 варианта, а уникальным - всего лишь один. По сортам они распределялись неравномерно, для каждого изученного сорта был характерен свой индивидуальный компонентный состав белков. Наибольшее количество компонентов отмечено у сорта Герань, наименьшее — у сорта Букет. Характерно, что сорта более раннеспелые имеют меньшее

количество полос в спектрах растворимых белков клубней, или же полосы проявляются у них в следовых количествах (например, сорт Удача).

Зона

ЯШииаЖд Л ЛЛП^ииЙИ* 14,« «11? 1»ао ..

Рис. 1. Электрофореттеские спектры запасных белков клубней картофеля: 1. - Невский; 2. - Лу-говской; 3. — Рождественский; 4. - Пушкинец; 5. - Ешювета; 6. - Петербургский; 7. - Ладожский; 8. — Сказка; 9. - Аврора; 10. — Оредежский; 11. - Лина; 12. — Весна; 13. - Чернский; 14. — Брянский красный; 15. — Брянский надежный; 16. — Погарский; 17. — Слава Брянщины; 18. — Ленин; 19. - Победа: 20. — Образец на сорпюопределение.

iiilSS

ff*

I - * ? I "

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Рис. 2. Нзоэлектрофокусировочпыи спектры запасных белков клубней картофеля: 1. - р! = 3.55: 2. - pï= -1,55; 3. -pi = 5,13; 4. - pi = 5.85; 5. - pi = 6,57; 6. - pi = б, 76+7,16; 7.-pi = / 8,55; 8. - pi = 9,9; 9. - Agria; 10. - Sanie; 11. - Russet Burbank: 12. -Черниговский; 13. -Romano; 14. - Santé

Электроморфы не дифференцировались по таким количественным признакам как интенсивность окраски и ширина линии, однако этот признак может отражать количество аллелей в тетраплоидном геноме картофеля от симплекса до квадриплекса. При этом количественно электроморфы отличались весьма существенно - от очень интенсивных до представленных в следовых количествах, что хорошо иллюстрируют денситограммы сортов (рис. 3).

штгщ

Рис. 3. Денситограммы спектров сортов: А. -ЭФ спектра сорта Петербургский, Б. - ИЭФ спектра Уральский сувенир

В биотехнологии картофеля часто необходимо быстро идентифицировать генотип уже в культуре in vitro. Эту задачу мы попытались решить используя генетически-детерминированный полиморфизм изопероксидазной и изоэстеразной ферментных систем. В наших экспериментах обе изофермент-ные системы демонстрировали ярко выраженный полиморфизм в зависимости от исследуемой ткани растения. Каждая изученная ткань (стебли и листья пробирочных растений; корни пробирочных растений, микроклубни, а также полевые клубни) одних и тех же генотипов характеризовалась легко узнаваемыми изоферментными спектрами, имея при этом совершенно определенные межсортовые различия (рис. 4).

Рис. 4. Электрофоретические спектры изопероксидаз и изоостераз сортов Луговской (а), Раменский (б), Резерв (в), Санте (г), Жуковский ранний (д): (а), (б), (в) и (г): 1 - клубни, 2. - .микроклубни, 3. - корни пробирочных растений, 4. - пробирочное растение (листья и стебли).

Изопероксидазная система картофеля показала себя как чрезвычайно полиморфная, многокомпонентная и воспроизводимая. ЭФ спектры перокси-даз выращенных в одинаковых условиях одновозрастных пробирочных растений характеризовались стабильностью и сортоспецифичностью. Ни один сорт не имел идентичного спектра с другими, и таким образом использование спектров изопероксидаз вполне удовлетворительно решает проблему сортовой идентификации картофеля в культуре in vitro. Наиболее специфичными

были изопероксидазы корней пробирочных растений. Также показана много-компонентность и ярко выраженная сортоспецифичность спектров изоперок-сидазной системы полевых клубней. Таким образом, генетически детерминированный полиморфизм пероксидаз позволяет проводить сортовую идентификацию картофеля как in vitro, так и in vivo.

В отличие от пероксидаз изоэстеразы на уровне пробирочных растений обнаруживали ярко выраженную нестабильность электрофореграмм, выражающуюся в возрастании активности некоторых компонентов спектра у одного и того же генотипа даже при анализе растений одного возраста. Вследствие этого, использование изоэстераз в качестве маркеров в культуре in vitro не представляется возможным. Однако спектры изоэстераз полевых клубней чрезвычайно сортоспецифичны и могут быть с успехом использованы для целей идентификации и паспортизации генотипов.

При проведении исследований по характеристике генетического разнообразия картофеля было выделено несколько групп сортов: сорта, полученные в результате гибридизации разных родительских форм; близкородственные сорта (сибсы и полусибсы); сорта, являющиеся соматическими мутантами или клоповыми вариантами; сомаклональные вариантные линии сортов; генетически модифицированные сорта.

Полученные данные показали, что все сорта и гибриды, выведенные гибридизацией разных родительских форм, надежно различались по элек-трофоретическим и изоэлектрофоретическим спектрам запасных белков клубней. Было констатировано, что чем больше образцы различались морфологически, тем большие различия наблюдались и в электрофоретических спектрах, а следовательно, и генетические дистанции между ними были выше, что позволяло без труда дифференцировать сорта даже в одном электро-форетическом анализе запасных белков клубней (рис. 5 А,Б).

При изучении 69 сортов отечественной и зарубежной селекции, полученных в результате гибридизации разных родительских форм было выявлено, что межсортовые различия между ними весьма существенны: среднее значение генетической дистанции в этой группе сортов составляет приблизительно 0,37. Генетические дистанции варьировали от 0,12 (Елизавета / Рождественский) до 0,57 (Накра / Светлячок). Неожиданное сходство в сравнении с остальными продемонстрировали сорта Импала (Голландия) и Рождественский (Россия, Санкт-Петербург), которые имея абсолютно разное происхождение, обнаруживали между собой генетическое расстояние равное 0,16. Этот факт может свидетельствовать о том, что селекция картофеля постепенно выходит на некоторое селекционное плато, и новые генисточники в • скрещивания вовлекаются недостаточно, в том числе такие агрономически важные, как устойчивость к болезням и вредителям.

Изученные сорта группировались в 2 главных кластера, первый из которых (I) включает практически все исследованные сорта, объединенные в 12 подкластеров. Сорт Накра имел по отношению к остальным наибольшие генетические дистанции от 0,28 до 0,57 единиц (в среднем 0,43) и в группе с

сортами Ветеран и Бирюч образовывал обособленный кластер (кластер II) (рис. 5В).

„ с «1 Слааа Бряницины ЬедрсиеУка Сузорье

Никули3г1скии _ Пакомкэ Ра^енскии

ЛуговЖи _ Алови Белая ночь Гранола „ Киви Ореде^кии

Садрыкин8<и5

КОЛЬСКИЙ

ежичкии

ЖЗ

_ Синтез _ Елизавета Рождественский рмпала

_ Петв| Свитанок

осмос

ГСКИЙ

вскии „Каролле .. Пушкинеи Маэстро (ФрТ Падаоуно* ^Роко _ Скарб Снерирь

Рябинушка невский ,, Сказка Чернскии

т ГДИ80

_ Талисман Леди Ротег

Нью-Ио'

зН-.-Щ. .

М: 1

«Ц М

^ ¡г ,......

диво сман регта

Ныр-Иорк Романо . Веема Жуковскшч раннии

7%а

Ауороза ерань

С|

Брянск.н

Ладожски „ Архидея тлячок

111 т г»

5ЖНЫЙ

_ .^орона Погарскии _ Бирюч

Ве'Чра

Эт-

р-

5=>

0.0

0,1

0.2

0.3

0,4

Генетические дистанции

Рис. 5. Характеристика сортов картофеля, полученных в результате гибридизации: Полиморфизм запасных белков клубней картофеля при проведении: А.: электрофореза 1. - Невский, 2. - Луговской, 3. - Батя, 4. — Бежщкий, 5. — Букет, 6. — Белоснежка, 7. - Ветеран, 8. — Космос, 9. -Лакомка, 10. - Лира, 11. - Накра, 12. - Никулинский, 13. - Раменский, 14. - Резерв, 15. - Сапры-кинекгш, 16. - Сокольский, 17. - Бирюч, 18. - Аспия, 19. - Победа, 20. - Безымянный. Б: изоэлек-трофокусирования (рН 5-8): 1. - Невский, 2. - Луговской, 3. - Петербургский, 4. - Рождественский, 5. - Скороплодный, 6. - Осень, 7. - Эффект, 8.-Голубизна, 9. - Жуковский ранний, 10. - Ресурс, 11. - Русский сувенир, 12. - Удача, 13. - Никулинский, 14. - Россиянка, 15. - Юбилей Жукова, 16. - Утенок, 17. - Космос, 18. - Луговской. В.: Генетические взаимоотношения.

Для большинства современных отечественных и зарубежных сортов картофеля характерна широкая генетическая основа, поэтому большинство сортов как отечественной, так и зарубежной селекции выявляют совершенно неожиданные генетические взаимосвязи и на дендрограммах в основном располагаются бессистемно и мозаично.

В группах близкородственных образцов (сибсов и полусибсов) количество идентичных полос в спектрах было наибольшим, однако, в большинстве случаев они надежно различались как минимум по 2 полоскам. Как и ожидалось теоретически, более близкими оказались сорта и гибриды, имеющие в парах одинаковых родителей (сибсы) (Колобок/Москворецкий (Ьпа х 1аешз1сЬ), Сотка/Столовый 19 (Олев х Приекульский ранний), 2017-13, 2273-

17, 2017-37, 2173-4 (Зарево х Эффект); 1965-6, 2134-20, 2134-5 (Эффект х Резерв) и 1969-16, 1969-21 (Эффект х Белоусовский), которые имели незначительные генетические расстояния, а на дендрограмме, полученной в результате кластеризации, располагались рядом (рис. 6А). Генетические дистанции между такими генотипами располагались в диапазоне от 0,07 (между сибсами 2134-20/2134-53 и 2273-17/2173-4) до 0,16 (между 2017-13/2017-34) (табл. 1.).

Калинка 2021-4 2097-41 2017-13 2086-102 21ЭС-3 ■ 19(9-21 -1НН 19M-7Í -2083-23 -Зарам -Уд«« ■ Эффакг ' Оссиь» 1 Голубизна -Скораплод. -

Генетически* дистэщии

0.' 0,2 0.3 0,4

Генетические дистанции Б

Рис. б. Генетические взаимоотношения сортов-сибсов и полусибсов.

Полусибсы Эффект (Раменский х 128-6), Осень (Гранола х 128-6), Голубизна (Гатчинский х 128-6), Скороплодный (128-6 х Анока), 2017-13 (Зарево х Эффект), 1969-21 (Эффект х Белоусовский), 1996-76, (Эффект х 946-3), 2085102, (Эффект х Аксеновский), 2083-23 (Эффект х 276-662), 2136-3 (Эффект х 1888-27), 1965-6 (Эффект х Резерв) и другие надежно различались по белковым и изоферментным спектрам, на дендрограммах располагались в основном предсказуемо, согласно своего происхождения, генетические дистанции в группах гибридов-полусибсов были относительно невысокими и в большинстве случаев не превышали 0,25 единиц (табл. 1, рис. 6А,Б).

Несмотря на явные морфологические различия, существенных изменений в ИЭФ спектрах в парах сорт / соматический мутант и сорт / клоновый вариант обнаружено не было. Так, пары сортов JIopx / Пестречинский, Смена / Июльский, Мажестик / Триалитури, Ермак / Ермак улучшенный, Весна (красная) / Весна белая и другие имели неразличимые спектры, нулевые генетические дистанции и на дендрограммах располагались вместе (рис. 7).

Генетические дистанции в парах различающихся по белковым маркерам сортов-мутантов Estima / Famosa (0,02) и Cardinal / Diamant (0,02) были очень малыми. Это доказывает, что вторые в парах действительно являются соматическими мутантами или клоновыми вариантами первых сортов. Однако, в паре Arka / Rubinia, в отличие от других генотипов изучаемой группы, наблюдались более существенные различия по всем белковым системам (ге-нетич. расст. 0,11), и их положение на дендрограмме определенно показывает, что это два разных генотипа, возможно имеющих близкое происхождение, однако навряд ли второй сорт является мутантом первого. Таким обра-

Таблица 1

Генетические дистанции в группах гибридов-сибсов и полусибсов

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

1 2021-4 0,00 0,18 0,25 0,27 0,32 0,30 0,23 0,27 0,27 0,27 0,27 0,55 0,45 0,45 0,43 0,30 0,25 0,27 0,34 0,48 0,50 0,52 0,50

2 2097-46 0,00 0,20 0,27 0,32 0,25 0,23 0,32 0,27 0,23 0,23 0,45 0,36 0,45 0,43 0,25 0,25 0,18 0,25 0,52 0,50 0,57 0,55

3 2017-13 0,00 0,11 0,16 0,14 0,20 0,30 0,30 0,16 0,16 048 0,39 ,034 0,32 0,23 0,14 0,25 0,14 0,45 0,43 0,45 0,48

4 2273-17 0,00 0,09 0,07 0,23 0,18 0,18 0,18 0,14 0,45 0,41 0,36 0,39 0,25 0,16 0,27 0,20 0,43 0,41 0,48 0,50

5 2017-34 0,00 0,16 0,32 0,23 0,27 0,18 0,18 0,45 0,41 0,36 0,39 0,30 0,20 0,25 0,23 0,39 0,36 0,43 0,45

6 2173-4 0,00 0,25 0,20 0,16 0,20 0,20 0,48 0,43 0,34 0,36 0,27 0,18 0,23 0,21 0,45 0,43 0,55 0,52

7 1965-6 0,00 0,09 0,09 0,23 0,23 0,50 0,50 0,36 0,39 0,11 0,16 0,14 0,20 0,48 0,50 0,48 0,50

8 2134-20 0,00 0,05 0,27 0,23 0,45 0,50 0,36 0,39 0,16 0,20 0,18 0,25 0,43 0,45 0,48 0,50

9 2134-5 0,00 0,27 0,27 0,45 0,50 0,41 0,43 0,20 0,20 0,23 0,25 0,48 0,50 0,52 0,55

10 1969-16 0,00 0,14 0,55 0,50 0,27 0,30 0,16 0,07 0,23 0,16 0,39 0,36 0,43 0,41

11 1969-21 0,00 0,50 0,41 0,32 0,34 0,16 0,16 0,18 0,16 0,48 0,45 0,48 0,50

12 Сотка 0,00 0,14 0,50 0,43 0,52 0,48 0,55 0,52 0,39 0,36 0,39 0,45

13 Столовый-19 • 0,00 0,45 0,39 0,52 0,48 0,50 0,52 0,34 0,36 0,34 0,36

14 Колобок 0,00 0,07 0,30 0,30 0,41 0,34 0,30 0,32 0,30 0,36

15 Москворецкий 0,00 0,32 0,27 0,43 0,36 0,27 0,30 0,32 0,34

16 1996-76 0,00 0,14 0,16 0,14 0,41 0,43 0,41 0,43

17 2085-102 0,00 0,25 0,14 0,41 0,39 0,41 0,43

18 2083-23 0,00 0,20 0,52 0,50 0,57 0,50

19 2136-3 0,00 0,50 0,48 0,45 0,52

20 Эффект 0,00 0,16 0,14 0,11

21 Скороплодный 0,00 0,20 0,18

22 Голубизна 0,00 0,16

23 Осень 0,00

зом, соматические мутанты и клоновые варианты отличаются от исходных сортов по маркерам весьма незначительно. Вероятно, величина генетической дистанции в 0,05 единиц является условной границей при идентификации соматических мутантов.

Etwa бал» баска красная

Лорх

Пестрачинскии Намастм Триалигурн Rai» RaiaM Луговской Лугоктй Iii Смена Июльский Epuai

Ериагуп}чшанный

Кукасии piHHHuii Жугокний ран. М.1 Жуиммий ран. М.2 Жукомкий ран.Ы.3 Жугоютй ран. Iii .4 Сншол СимопМ Кондор КондорU

ММ

AgiteM

ЩатгожЙ Brte BrijeM Esting Famosa Ml RubNt CarJal Ornat Certaviolel Carte Wie

iiettst* Sesago

Рис. 7. Генетические взаимоотношения сортов- соматических мутантов и клоповых вариантов.

Анализ вариабельности сомаклонов показал сходные результаты. Со-маклональная изменчивость выражалась как мелкая флюктуация вокруг белкового «портрета» исходного генотипа — добавление/исчезновение (качественные различия) или чаще как константное и полностью воспроизводимое изменение интенсивности (количественные различия) 1-2 компонентов белков и/или изозимов при неизменности остальной части спектра. Часто изменений в спектрах белков не наблюдалось (например, сомаклоны сортов Любимец, Столовый-19) (рис. 8).

-fy^ft'M ifei'ifei - Baa".'»W • M, **'¿»Н к fi

^"f У** " ' j^f

* . 4 t V-'li*/.. ¿Ü^ Ъ'^- - »i -r 'b.i V

* -*Ь„ • y**," »r * \; * с frr .. ;•<» г'»'r..z*!-^ «*■*

• '■. ** • 1*4 ж* fcit»'- 4km ть *

. ; * лт «а»', фт Шш Ш» т* ШШ *

§ ц тщ -mmm-rn» ar

Былина Л Бьшина И-1 Столовый 19 А Столовый 19 Я2 Ульяновский(К Ульяновский КЗ Ульяновский ^29

Рис. 8. А.: Размах сомаклоналъной вариабельности сортов Ульяновский и Любимец: 1. -Ульяновский(У.) Л; 2-11. - сомаклоны сорта Ульяновский: 2. - У. Я-79, 3. - У. Я-З; 4. - У. Я-129; 5. - У. Я-93; 6. - У. Я-119; 7. - У. Я-116; 8. - У. Я-69; 9. - У. Я-98; 10. - У. Я-90; П. -У. Я-83; 12. Любимец (11; 13-16. - сомаклоны сорта Любимец: 13. - Л. Я-426; 14. -Л. Я-З; 15. - Л. К-ЗЗ; 16. — Л. Я-19. Б: Генетические взаимоотношения некоторых сортов и их сомаклонов.

Сомаклон Былина-И. 1 отличался от исходного сорта на 0,03 единицы генетического расстояния, а сомаклон Столовый-19 Я-2 не отличался от ис-

ходного генотипа. Сомаклональные линии сорта Ульяновский отличались более существенно: Ульяновский ск/ Ульяновский Я-3 - на 0,06, Ульяновский ^Ульяновский И-129 - на 0,09 единиц. Таким образом размах сомаклональ-ной вариабельности чуть выше вариабельности, выявленной между соматическими мутантами, или сопоставим с ней (рис. 8).

Различий при анализировании белковых спектров генетически модифицированных сортов обнаружено не было.

Таким образом, проведенные исследования по генетическому разнообразию сортов картофеля различного происхождения на основе белков и изо-ферментов, как генетических маркеров позволили получить общие представления о закономерностях изменений компонентного состава спектров в зависимости от происхождения изучаемого генотипа. Полученная информация о генетических дистанциях между сортами и гибридами может быть использована в селекционных программах при подборе родительских пар. Так, скрещивания сортов, имеющих в парах наибольшие генетические дистанции, может помочь селекционерам в достижении максимального эффекта гетерозиса.

Выявленные закономерности изменения белковых спектров были использованы при решении практических задач, связанных с экспресс-идентификацией генотипов картофеля. Так, в совместных исследованиях была опровергнута гипотеза коллег из Горно-Алтайского госуниверситета (ГАГУ), что ряд переданных клонов за счет мутационных изменений в высокогорных условиях Горного Алтая приобрели генетически обусловленные отличия от исходных генотипов. Первые же анализы показали, что в ряде случаев за мутантные формы принимались клоны сортовой примеси. Так, из трех вариантов образцов с этикеткой сорт «Уральский сувенир» два были практически идентичны между собой (генетич. расст. 0,02), однако, они сильно отличаются от «оригинального» (генетич. диет. 0,23 и 0,26) (табл. 2).

Было сделано заключение, что генотипы с этикетками «высокогорье» и «среднегорье» не могут быть мутантами оригинального сорта (рис. 9), а являются сортовой примесью. Точно так же сильно различались по спектрам и генетическим дистанциям (0,35) сорт Символ и его предположительная му-тантная форма (табл. 2, рис. 9). Смешивание клонов различных генотипов наблюдалась и среди других проанализированных образцов из ГАГУ.

Таблица 2

Генетические дистанции между сортами Уральский сувенир, Символ и их предполагаемыми мутантами

1 2 3 4 5

1 Уральский сувенир (оригинальный) 0,26 0,23 0,28 0,39

2 Уральский сувенир (среднегорье) 0,04 0,16 0,40

3 Уральский сувенир (высокогорье) 0,16 0,44

4 Символ (оригинальный) 0,35

5 Символ (Иня)

Таким образом, полученные экспериментальные данные, не подтвердили исходную гипотезу образования соматических мутантов картофеля в условиях Горного Алтая в зависимости от географической точки выращива-

ния. Большинство сортов.

предполагаемых мутантов оказалось примесью других

'-Л--г' ' К*'-;

"V-' ** -. * у» »*л ;

•С- -.-.».У " ■--' ££3ьа *

-.. лаавф - щи

та;, ва 4£» ¿¿а

2 3 4 5

Уральский сувенир (оригинальный). Уральский сувенир (среднегорье). Уральский сувенир (высокогорье).

Символ (Оригинальный) Символ (Иня)

0,1 0.2 0,3

Генетические дистанции

Рис. 9. А: Спектры сортов Уральский сувенир, Символ и их предполагаемых мутантов: 1.

— Уральский сувенир оригинальный; 2. - Уральский сувенир (среднегорье); 3. - Уральский сувенир (высокогорье); 4. — Символ (оригинальный); 5. — Символ (Иня); Б: Генетические взаимоотношения

В ходе работы по идентификации различных сортов картофеля, были выявлены случаи, когда один и тот же генотип был распространен под разными сортовыми названиями. Такова ситуация с парами сортов Кемеровский

- Волжанин, Ресурс - Корона - Погарский, Жуковский ранний - Баритон, которые имеют полностью идентичные спектры по всем системам молекуляр-но-генетических маркеров (рис. 11). Несомненно, что эти генотипы могут быть включены в Госреестр только как клоновые варианты первых генотипов.

'1 2

1 2

'М М '

¿у 4 л?*

^¡З^Е^4 лвв* 2ЕВК» '388»' ^рВСГ..

Рис. 11. Идентификация сортов-синонимов (дупликатов) в Госреестре РФ: А (Спектр ИЭФ): 1. - Кемеровский, 2. - Волжанин; Б-В-Г: 1. - Жуковский ранний, 2. - Баритон (Б-В -Спектры ЭФ: Б - окраска на пероксидазу, В - окраска на общий белок,; Г-Д: 1. - Ресурс, 2. - Корона, 3. - Погарский. (Г- Спектр ИЭФ, Д- Спектр ЭФ окраска на общий белок).

В то же самое время, присланные из Свердловского НИИСХ два морфологически почти неотличимых гибрида Г-2 и Г-1-140-94 надежно различались по маркерам и были дифференцированы как два разных генотипа (гене-тич. расст. 0,16) (рис. 12А).

12 12 3 4

Л Б

Рис. 12. А: Идентификация сходства различия генотипов: А - идентификация различий гибридов Свердловского НИИСХ: 1.-Г2, 2. — Г-1-140-94; Б - идентификация сортовой принадлежности: 1. Кристалл (Польша), 2. • Кристалл (ВНИИКХ), 3. - «Пушкински» (Польша), 4. - Детскосельский (ВНИИКХ).

Экспресс-идентификация генотипов имеет важное значение при обмене оздоровленными микрорастениями с другими учреждениями. Например, получив из Польши необходимые оздоровленные пробирочные растения сортов Jlopx, Кристалл, Резерв и ряд других, были проведены анализы на генетическое соответствие этого материала образцам этих сортов генобанка ВНИИКХ. Доказав на основании белковых маркеров, что по генотипу они идентичны, эти сорта были использованы в дальнейшей работе в качестве здоровых исходных растений. Однако, мы оказались в затруднительном положении когда, вместе с другими сортами из Польши поступил образец с красной кожурой под названием «Пушкински», который, к известному российскому сорту Пушкинец по морфологическим признакам никакого отношения не имел. Было сделано предположение, что это сорт Детскосельский. Гипотеза была подтверждена на основе изоэлектрофоретического анализа запасных белков клубней, и сортообразец также пополнил генобанк (рис. 12Б).

Таким образом, белковые и изоферментные маркеры, позволяют успешно решать многие проблемы, неизбежно возникающие в ходе практической деятельности по поддержанию генетических коллекций и банков сортов картофеля.

Для изучения возможности использования маркеров с целью мониторинга оздоровленных в меристемно-тканевой культуре депонируемых в культуре in vitro нами были проанализированы сорта Невский, Луговской и Резерв. После регенерации и нескольких циклов черенкования, меристемные растения оценивались на соответствие исходному генотипу. Целью анализа при этом являлось выявление качественных (появление новых или исчезновение имеющихся полос в спектрах) различий между меристемными линиями. Далее линии проверялись на соответствие исходному генотипу по запасным белкам после выращивания в полевых условиях на уровне клубней. Однако, отличий как между разными меристемными линиями, так и в сравнении с исходным сортом выявлено не было (рис. 13).

МОШЛМРММ Ш М1

4'- 1 «* л # » п 4* * г* «

# <§*. й* 4* # Л Ш щ •"*"* т^'^к^чк ■¿¡¿'■'¿к

■ я:? >Й' § 2« л ч- и ъ да ж -г*. чл'-Л'*'5""»^-'":'

**■ Т* ** .

« « I. и- *, о- л Ь 'и ** <** Хшг-дМЬ Чт I

• М ш #>.•»■ т ■*»> Й» * • «"»■ •»• *» «• ..'. • » --«.,: ; .'-'„-..г,'

«Й «Й «Й : «8'. «к ' «I- $ ф ¡»¡ь «<« & «к • ^ ||| .«■». 5

А ' В

Рис. 13. Контроль аутентичности оздоровленных меристемных линий. А - Резерв (микроклубни), В. - Невский (полевые клубни). Спектры ИЭФрН 3-10.

Однако возможность появления регенерантных растений, отклоняющихся от исходного сорта, при оздоровлении полностью не исключается. Так, в совместных исследованиях с немецкими коллегами (Шенк и др., 1989) были идентифицированы четкие различия одного компонента спектра белков микроклубней у трех оздоровленных меристемных линий сорта Аркула по сравнению с исходным.

Обычно сорта имеют устойчивые фенотипические признаки, которые не зависят от условий выращивания растений. Однако было замечено, что небольшая часть сортов имеют достаточно устойчивую тенденцию формировать вариантные линии, отличающиеся от исходного генотипа. Так, после ускоренного размножения на биотехнологических модулях сортов Волжанин («ЭТК Меристемные культуры») и Невский (ООО «Митрофановское») было замечено образование мутантных (или вариантных) линий.

Молекулярно-генетический анализ показал, что все 5 линий сорта Волжанин незначительно различались между собой. При этом отличия выражались в исчезновении одного или двух компонентов ИЭФ спектров в сравнении с оригинальной линией сорта, сохраняя все характерные белковые компоненты. Генетические дистанции между проанализированными линиями варьировали от 0,02 до 0,05 (табл. 3).

Таблица 3

Генетические дистанции между исходными оригинальными и вариантными линиями сортов картофеля

1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12

1 Невский М1 о,ос 0,02 0,05

2 Невский М2 0,00 0,04

3 Невский & 0,00

4 Волжанин -2 0,00 0,04 0,04 0,05 0,05

5 Волжанин -1 0,00 0,04 0,05 0,02

7 Волжанин -4 0,00 0,02 0,02

8 Волжанин -5 0,00 0,04

9 Волжанин -3 0,00

10 Жуковский ранний с1г 0,00 0,04 0,02

11 Жуковский ранний М1 0,00 0,02

12 Жуковский ранний М2 0,00

jij-.il л,. л Я? та?

1 2 3 В

Рис. 14. Спектры, тлюстрирующие различил между вариантными линиями сортов Волжанин (А) и Жуковский ранний (Б и В). А. (спектры ИЭФ): 1-5 - вариантные линии 1-5 сорта Волжанин, Б. (Спектры пероксидазы клубней), В. (электрофоретические спектры) 1. - Жуковский ранний (оригинальный), 2. - Жуковский ранний М2, 3,- Жуковский ранний М1.

Невский М1 Невский М2 Невский Волжанин-2 Волжанин-1 Волжанин-3 Кемеровский Волжанин-5 Волжаиин-4 Жуковский ранний' <й Жуковский ранний М2 Жуковский ранний М1

0,0 0.1 0.2 0.3 0.4

Генетические расстояния

Рис. 15. Генетические взаимоотношения .между оригинальными и вариантными линиями сортов картофеля Невский, Волжанин и Жуковский ранний

Аналогичная ситуация наблюдалась по сорту Невский. Клубни обнаруживали четкую дивергенцию по морфологическим признакам клубней: линия М1 утратила розовые глазки и приобрела сетчатость кожуры; линия М2 имела только сетчатость кожуры (табл. 4). Другие морфологические признаки не были доступны для наблюдения, что свидетельствует о таком существенном недостатке традиционной методики определения сортовой принадлежности по морфологическим признакам, как растянутость во времени и недоступность всех признаков одновременно. Однако несмотря на столь резкие изменения по фенотипическим признакам анализируемые образцы имели лишь незначительные отличия в электрофоретических спектрах, как и в случае с сортом Волжанин. Генетические дистанции между линиями сорта Невский варьировали в пределах от 0,02 до 0,05, что свидетельствует о том, что данные генотипы, несомненно, являются вариантными (или мутантными) линиями сорта Невский и не могут быть примесью другого сорта (рис. 14, 15, табл. 3).

Таблица 4

Фенотипические различия сортов Невский и Жуковский ранний, согласно таблице _сортоотличительных признаков УРОУ_

№ признака по UPOV Признак Степень выраженности признака в баллах

Невский0 Жуковский ранний

Ор. Ml М2 Ор. Ml М2

18 Лист: интенсивность зеленой окраски 4 4 5

28 Растение: высота 4 4 5

36 Растение: время увядания ботвы 1 2 3

39 Клубень: окраска кожуры 3 3 4

40 Клубень: окраска основания глазка 3 3 2

._М Клубень: сетчатость кожуры 1 3 3

" По сорту Невский для наблюдения были доступны только кчубни. 2> (Уценки типичных сортов цитированы по Симаков и др. (2005)

3> Признак сетчатость кожуры кчубней отсутствует в официальной таблице признаков UPOV, поэтому в работе было предложено следующее подразделение сортов по признаку сетчатость кожуры: 1. - сетчатости нет, 3. - кожура слабосетчатая. 5. - средняя сетчатость кожуры, 7. -сильносетчатая кожура

Аналогичные изменения в спектрах запасных белков клубней наблюдались при анализе трех морфологически отличающихся линий сорта Жуковский ранний, поддерживаемых в родительском питомнике отдела генетики ВНИИКХ (рис. 14, 15, табл. 3,4).

Таким образом, результаты выполненной работы свидетельствуют о том, что использование белковых маркеров может обеспечить получение надежных показателей в идентификации отклоняющихся форм, возникающих в процессе оздоровления, биотехнологического размножения и возделывания сортов картофеля.

Поскольку появление отклоняющихся линий нежелательно, а их использование совершенно недопустимо в оригинальном семеноводстве, этот метод может быть рекомендован для проведения контроля типичности оздо-равливаемых, поддерживаемых в культуре in vitro и размножаемых сортооб-разцов картофеля в процессе оригинального семеноводства.

ВЫВОДЫ

1. Изучен полиморфизм запасных белков, изоэстеразной и изопероксидазной систем клубней картофеля. Исследованные молекулярно-генетические системы картофеля демонстрируют высокий уровень полиморфизма и могут быть рекомендованы для решения актуальных задач для идентификации генотипов в селекции и семеноводстве картофеля.

2. Разработан метод сортовой идентификации картофеля in vitro по изофер-ментам микрорастений и запасным белкам микроклубней. Наилучшей для использования в культуре in vitro является изопероксидазная система корней пробирочных растений.

3. Электрофоретические спектры эстераз и запасных белков на уровне клубней и микроклубней картофеля, находящихся в состоянии покоя, удовлетворяют всем требованиям, необходимым для идентификации генотипов.

4. Показано, что изоэстеразная система на уровне микрорастений in vitro характеризуется ярко выраженной лабильностью, связанной с резким усилением эстеразной активности в зоне проявления пататина. Вследствие этого они не могут быть использованы для целей сортовой идентификации, а сам феномен нестабильности требует дополнительного изучения.

5. Дана количественная характеристика генетического разнообразия сортов различного происхождения: сортов, полученных в результате отдаленной гибридизации, генетически родственных сортов (сибсов и полусибсов), соматических мутантов, клоновых и сомаклональных вариантных линий, генетически модифицированных сортов.

6. Выявлено, что генетические дистанции между неродственными сортами находятся в диапазоне от 0,12 до 0,57, между сибсами и полусибсами -обычно не превышают 0,25.

7. Выявлены возможности и ограничения белковых маркеров в идентификации отличий соматических мутантов, клоновых вариантов, сомаклонов, разных меристемных линий и генетически модифицированных сортов от прежде зарегистрированных (генетические дистанции не превышают

0.05.. Это является подтверждением, что мутантная или вариантная линия произошла от данного сорта, и не может быть другим сортом, полученным в результате гибридизации.

8. Показано, что метод белковых маркеров позволяет эффективно выявлять отклоняющиеся от оригинальных линии картофеля, в том числе возникающие в результате ошибок технического персонала (путаница и смешивание сортов).

9. Отличающихся от исходных сортов оздоровленных меристемных линий не выявлено. Показано, что генетические изменения вероятны при получении миниклубней на биотехнологических модулях, а следовательно необходима система мониторинга получаемого материала.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Мусин С.М., Дементьева З.А., Якупова Р.Х. Характеристика генетического разнообразия сортов картофеля: молекулярно-генетический подход. / Вопросы картофелеводства. - М: ВНИИКХ, 2005. - С. 98-114.

2. Мусин С.М., Дементьева З.А. Молекулярная диагностика и идентификация исходного материала картофеля. / Вопросы картофелеводства: Актуальные проблемы науки и практики. - М., 2006. - С. 92-98.

3. Дементьева З.А., Мусин С.М., Яшина И.М. Возможности использования белковых маркеров для дифференциации генетически близких генотипов картофеля - сибсов и полусибсов. / Вопросы картофелеводства: Актуальные проблемы науки и практики. — М., 2006. — С. 99-104.

4. Дементьева З.А. Белковые маркеры в идентификации генотипов картофеля. // Картофель и овощи. - 2006. - №7. — С. 30.

5. Дементьева З.А. Полиморфизм белков клубней картофеля и возможности его использования в селекции и семеноводстве // Научный журнал КубГАУ [Электронный ресурс]. - Краснодар: КубГАУ, 2006. - № 05(21). -8 с. - Режим доступа: http://ei.kubagro.ru/2006/05/pdf/03.pdf

6. Мусин С.М., Петухов С.Н., Якупова Р.Х., Симакова A.A., Дементьева З.А., Шмыгля И.В., Бирюкова В.А., Дорохов Д.Б., Игнатов А.Н., Цветков И.Л. Методические указания по использованию белковых маркеров для идентификации генотипов картофеля. — М., 2003. - 25 с.

7. Петухов С.Н., Мусин С.М. Морозова H.H., Трофимов Р.Н., Дементьева З.А. Методические указания по использованию дигаплоидов, диких и примитивных диплоидных видов в селекции картофеля. — М., 2005. - 25 с.

8. Мусин С.М., Симаков Е.А., Анисимов Б.В., Усков А.И., Хромова JI.M., Бойко В.В., Бойко Ю.П., Петухов С.Н., Шмыгля И.В., Дементьева З.А., Бирюкова В.А., Бабоша A.B., Кондакова O.A., Аршава Н.В. Методические рекомендации по технологии оздоровления сортов картофеля. - М., 2005. -65 с.

1,25 печ. л.

Зак. 632.

Тир. 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дементьева, Зоя Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современное состояние в области идентификации генотипов картофеля

1.2. Молекулярно-генетические маркеры в идентификации генотипов, выявлении генетического разнообразия и паспортизации генофонда картофеля

1.3. Мировой опыт использования белков и изоферментов как генетических маркеров для идентификации и паспортизации генотипов картофеля

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Получение белкового экстракта из клубней картофеля

2.3. Методы биохимического разделения генотипов картофеля

2.3.1. Электрофорез запасных белков и изоферментов

2.3.2. Изоэлектрофокусирование

2.4. Методы окраски гелей

2.5. Документация результатов и статистическая обработка данных

3. БЕЛКОВЫЕ И ИЗОФЕРМЕНТНЫЕ МАРКЕРЫ КАРТОФЕЛЯ

Ф 3.1. Белковые маркеры клубней картофеля

3.2. Изопероксидазная система картофеля

3.3. Изоэстеразная система картофеля

4. ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ СОРТОВ КАРТОФЕЛЯ

4.1. Полиморфизм сортов, полученных в результате гибридизации разных родительских форм

4.2. Вариабельность генетически близких сортов и гибридов - сибсов и полусибсов

4.3. Характеристика вариабельности соматических мутантов, клоно$| вых вариантов и сомаклональных вариантных линий ь 4.4. Идентификация отличий генетически модифицированных сортов от исходных

4.5. Практическое применение белковых маркеров: идентификация предположительных мутантов, сортов - синонимов и дупликатов

5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА В ПРОЦЕССЕ ОРИГИНАЛЬНОГО СЕМЕНОВОДСТВА КАРТОФЕЛЯ

5.1. Идентификация аутентичности оздоровленных в мери-стемно-тканевой культуре регенерантных растений исходным сортам

5.2. Идентификация отклоняющихся от исходного генотипа вариантных линий картофеля ^

6. МЕТОДОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БЕЛКОВЫХ И ИЗОФЕРМЕНТНЫХ МАРКЕРОВ ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОТИПОВ КАРТОФЕЛЯ

ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Использование белковых и изоферментных маркеров в идентификации генотипов картофеля"

Актуальность проблемы. Как продовольственная культура, занимающая четвертое место в мире, картофель заслуженно считается вторым хлебом России. Поэтому решение научно-методических и практических вопросов селекции и семеноводства в картофелеводстве имеет исключительно актуальное значение.

Одним из самых значимых достижений при этом является разработка методов создания и поддержания банка здоровых сортов картофеля (БЗСК) и способов масштабного быстрого размножения чистого от патогенов исходного материала. При этом особую актуальность приобретают две главные задачи: абсолютная уверенность в элиминации всех патогенов и гарантия сохранения исходного статуса здоровья при депонировании коллекции сортооб-разцов, во-первых, и точное генетическое соответствие оздоровленного реге-нерантного меристемного растения или отобранного в поле здорового «материнского» растения исходному генотипу, во-вторых.

Для описания и характеристики образцов при формировании и поддержании генных банков обычно используют дескрипторы на основе морфологических признаков, эколого-географических различий происхождения образца, устойчивости к болезням и вредителям (Huaman et al., 2000). Однако, многие из таких оценок субъективны, зависимы от условий окружающей среды, а сам подход чрезмерно растянут во времени, поскольку признаки недоступны для наблюдения одновременно. Кроме того, он неприменим для сортовой идентификации растений in vitro, рассады и миниклубней, получаемых на различных биотехнологических модулях. Между тем, при формировании, депонировании и использовании материала БЗСК часто требуется быстро идентифицировать сорт в культуре in vitro.

Разрабатываемые в дополнение к традиционным методам современные аналитические способы исследования специфичности биологических макромолекул с использованием белковых и ДНК-маркеров позволяют на принципиально новой основе решать проблемы семенного контроля и идентификации генотипов на всех этапах работы. Значение молекулярно-генетических методов все более возрастает в выявлении новых форм и генисточников, паспортизации генофонда и характеристике биоразнообразия гермоплазмы картофеля, а также в управлении генетическими банками (Кочиева, 1999, 2004, Хавкин, 1997; Дорохов и др., 2001).

Контроль генетической стабильности после биотехнологических манипуляций имеет исключительно важное значение для сохранения сорта (Struik, Wiersema, 1999). По сравнению с другими видами растений картофель более подвержен мутационным изменениям, которые, безусловно, могут быть интересным источником генетической изменчивости (Shepard et al., 1980; Sanfordt et al., 1984), однако они абсолютно недопустимы при формировании, поддержании и использовании банка сортов картофеля.

Растения картофеля, регенерированные из очень маленьких эксплантов соматических клеток в технологиях оздоровления, имеют чрезвычайно низкую генетическую стабильность вследствие возрастания вероятности спонтанных мутаций. А длительное депонирование оздоровленных сортообразцов в культуре in vitro, защищая образец от вторичного заражения, с одной стороны, может привести к явным генетическим изменениям, обусловленным как соматическими мутациями, так и не до конца изученным явлением «вит-рификации», а также изменением содержания гормонов, с другой (Шарафут-динова и др., 2001). Так, поддержание генобанка десятилетиями только в культуре in vitro и использование в практическом семеноводстве зачастую одной единственной линии приводило к тому, что сорт с течением времени невозможно было узнать. Кроме того, неизбежно имеет место и путаница, привносимая техническими исполнителями.

Перечисленные проблемы наряду с диагностикой фитопатогенов обусловливают остроту вопросов генетического мониторинга материала на всех этапах работы в культуре клеток и тканей при оздоровлении сортов, поддержании коллекции, микроразмножении in vitro, клональном размножении на гидро-, и ионитопонных биотехнологических установках, где условия развития растений значительно отличаются от естественных, к которым картофель приспособился эволюционно, и генетические изменения вполне возможны, или даже провоцируются. Существует настоятельная необходимость в разработке и усовершенствовании недорогих экспресс-методов идентификации генотипов на любом этапе работы и системы генетического мониторинга сортообразцов при формировании и поддержании коллекций и банков сортов картофеля, что обусловливает актуальность настоящей работы.

Кроме того, в связи с введением в действие законов «О семеноводстве» и об «Охране селекционных достижений», эти методы должны стать средством доказательства аутентичности заявленного сорта (Дорохов и др., 2001). До регистрации и распространения все новые сорта должны пройти молеку-лярно-генетическую идентификацию и паспортизацию по стандартной методике. Такая процедура может решить проблемы, относящиеся к возможному появлению в Госреестре сортов-двойников и защитить права селекционеров и патентообладателей.

Цель и задачи исследования. ЦЕЛЬЮ исследования являлась разработка технологических основ идентификации генотипов и генетического мониторинга исходного оздоровленного материала БЗСК на основе белковых маркеров.

При этом ставились следующие ЗАДАЧИ:

2. Дать характеристику генетического разнообразия сортов различного происхождения на основе белковых маркеров: сортов, полученных в результате межсортовой гибридизации; генетически близких сортов - сибсов и по-лусибсов; соматических мутантов и клоновых вариантов сортов; генетически модифицированных сортов в сравнении с исходными.

3. Разработать технологию молекулярно-генетического мониторинга банка сортов картофеля на этапах формирования, поддержания и размножения оздоровленного исходного материала в процессе оригинального семеноводства.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые дана количественная характеристика генетического разнообразия сортов различного происхождения по изоферментным и белковым маркерам. Определен уровень полиморфизма сортов отечественной и зарубежной селекции, выявлены генетически родственные и дивергентные сорта, что может быть использовано в селекционной работе при подборе родительских форм для скрещивания. Проведена кластеризация сортов согласно их происхождению: сортов, полученных в результате гибридизации, сибсов и полусибсов, соматических мутантов и клоновых вариантов, генетически модифицированных сортов. Показано, что в таком ряду происходит закономерное уменьшение вариабельности при оценке на основе генетических дистанций. Определены возможности и ограничения маркеров в идентификации отличий соматических мутантов, клоновых вариантов, сомаклонов и генетически модифицированных сортов от исходных генотипов.

Впервые предложена система молекулярно-генетического мониторинга образцов оздоровленного генобанка. Обнаружено, что возможно появление линий, отклоняющихся от исходных генотипов.

В Госреестре РФ выявлены сорта, неразличимые по белковым и изоферментным маркерам и являющиеся клоновыми вариантами или синонимами уже внесенных в Госреестр РФ сортов.

Опубликованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, включая 4 научных статей, 2 методических указания, 1 методические рекомендации.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Дементьева, Зоя Александровна

ВЫВОДЫ

2. Разработан метод сортовой идентификации картофеля in vitro по изофер-ментам микрорастений и запасным белкам микроклубней. Наилучшими для использования в культуре in vitro являются изопероксидазные системы корней и микроклубней пробирочных растений.

0,05). Это является подтверждением, что мутантная или вариантная линия произошла от данного сорта, и не может быть другим сортом, полученным в результате гибридизации.

8. Показано, что метод белковых маркеров позволяет эффективно выявлять отклоняющиеся от оригинальных вариантные линии, возникающие в результате ошибок технического персонала (путаница и смешивание сортов).

9. Отличающихся от исходных сортов оздоровленных меристемных линий не выявлено. Показано, что генетические изменения вероятны при получении миниклубней на биотехнологических модулях, а, следовательно, необходима система мониторинга получаемого материала.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Дементьева, Зоя Александровна, Москва

1. Березовиков П.Д. Электрофорез суммарных глобулинов клубней картофеля / Материалы научн. иссл. по вопр. улучшения качества прод. товаров. 1970.-Вып. 1.-С. 23-28.

2. Бирюкова В.А., Велишаева Н.С., Зайцев B.C., Хавкин Э.Е., Хромова Л.М., Шилов И.А. ДНК-дактилоскопия картофеля и его дикорастущих сородичей. / Вопросы картофелеводства. М.: ВНИИКХ, Россельхозакадемия, 2004.-С. 114-123.

3. Бирюкова В.А., Зайцев B.C., Хавкин Э.Е., Хромова Л.М. Генотипиро-вание сортов картофеля на основе анализа полиморфизма умеренных повторов. / Вопросы картофелеводства: Актуальные проблемы науки и практики. -М., 2006.-С. 54-62.

4. Богатых И.М., Князев В.А. Исследование белкового комплекса листьев картофеля методом электрофореза в полиакриламидном геле. / Научн. тр. Курского с.-х. ин-та. 1973.-Т.8.-Вып. 1.-С. 113-117.

5. Бойко В.В., Мусин С.М. Применение биологически активных веществ в культуре апикальной меристемы при оздоровлении картофеля. / Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда. М., 1997. -С. 401.

6. Бояркин А.И. Быстрый метод определения активности пероксидазы // Биохимия. 1951. - т. 16. -№4. - С. 352-357.

7. Будин К.З., Бавыко Н.Ф., Турулева Л.М. Значение диплоидных видов картофеля и пути использования их в селекции. // Научн.-техн. бюлл. ВИР, 1984.-Вып. 145.-С. 1-8.

8. Букасов С.М., Григорьева С.К., Гаврилюк И.П. Иммунохимическое изучение белков клубней некоторых видов картофеля. // Доклады ВАСХНИЛ. 1969. - №5. - С. 8-11.

9. Бургутин А.Б., Мусин С.М., Бутенко Р.Г. Сегрегация биохимических генетических детерминант у сомаклональных вариантов межвидового соматического гибрида картофеля. // Физиология растений. 1994. - т. 41. - №6. -С. 843-852.

10. Вологдина Л.Н., Гончарова H.H., Козлова Л.Н. и др. Сорта картофеля: Каталог. 2005./ Сост.: Л.И. Носевич. Минск: Институт картофелеводства HAH Беларуси, 2005. - С. 90-109.

11. Донец Н.В., Мусин С.М., Попов A.C. Стабильность состава полиморфных белков растений картофеля, полученных из меристем после криогенного хранения. // Сельскохозяйственная биология. 1991. - № 3. - С. 7683.

12. Дорохов Д.Б., Сеитова A.M., Игнатов А.Н., Цветков И.Л., Супрунова Т.П., Лаптева М.Н. ДНК-идентификация проблемы и перспективы. // Селекция и семеноводство. 1999. - №4. - С. 44-46.

13. Дорохов Д.Б., Супрунова Т.П., Сеитова A.M., Фортэ A.B., Серова A.C. Методические указания по использованию маркеров на основе ДНК для идентификации генотипов картофеля. М., 2001. - 25 с.

14. Дубровский И.Г., Витол И.С., Аветисов В.А., Мелик-Саркисов О.С. Изопероксидазный анализ побегов на корнях картофеля. // Доклады ВАСХНИЛ. 1990. - №1. - С. 18-21.

15. Зайцева Н.Д. Методические указания по определению районированных сортов картофеля. -М.: Россельхозиздат, 1972. 103 с.

16. Кавац Я.Э., Роне В.М. Изоэнзимы пероксидазы хвои в популяциях ели обыкновенной. // Генетические исследования древесных в Латвийской ССР. Рига, 1975.-С. 58-63.

17. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры. М.: Колос, 1983.-320 с.

18. Костина Л.И. Руководство по апробации картофеля. М.: Агропром-издат, 1985.-95 с.

19. Кочиева Е.З. Использование методов на основе полимеразной цепной реакции для анализа и маркирования растительного генома. // Сельскохозяйственная биология. 1999. - №3. - С. 3-14.

20. Кочиева Е.З. Геномный полиморфизм представителей сем. Solanaceae (род Solanum, род Lycopersicon, род Capsicum). автореферат дисс. на соиск. уч. ст. доктора биол. наук, 2004. - 32 с.

21. Лавриненко И.А., Лавриненко О.В. Изоферментный спектр перокси-даз у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.). // Генетика. 1997. - Т. 33. -№1.- С. 40-45

22. Ладыгина Е.А. Фракционный состав и изоферментные спектры белков картофеля при заражении вирусом Y. / Электрофорез в полиакриламид-ном геле и его применение в биол., с.-х., мед. и пищ. промышленности. М., 1972.-С. 125-127.

23. Ладыженская Э.П., Кадыржанова Д.К., Любимова Н.В. Прощенко М.А., Кораблева Н.П. Метлицкий Л.В. Электрофоретическое исследование белков плазмалеммы клубней картофеля. // Биохимия. 1980. - Т. 45. - №9. -С. 1619-1629.

24. Левитес Е.В. Генетика изоферментов растений. Новосибирск: Наука, 1986.- 144 с.

25. Леонова Н.С., Солоненко Л.П., биохимические различия у картофеля на разных уровнях дифференциации в культуре тканей . / Использование клеточных технологий в селекции картофеля. М., 1987. - С. 89-94.

26. Леонова Н.С., Солоненко Л.П., Контарева Н.И. Генетический полиморфизм белков картофеля в культуре тканей. / 5 Съезд Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Вавилова. Москва, 1987. - С. 159.

27. Малова Е.Л., Щульгина А.И., Мосолов В.В. Изучение термостабильных белков картофеля методом электрического фокусирования. // Прикладная биохимия и микробиология. 1975. - Т. 11. - Вып. 4. - С. 576-579.

28. Мусин С.М. Полиморфизм белков картофеля и возможности его использования в селекции и семеноводстве / Использование клеточных технологий в селекции картофеля. -М., 1987. С. 77-78.

29. Мусин С.М. Биохимические и молекулярно-генетические предпосылки использования белков картофеля как генетических маркеров. // Пути развития картофелеводства. Рукопись деп. во ВНИИТЭИагропроме 20.09.88. N 585/8 ВС-88 Деп., 12 с.

30. Мусин С.М. Полиморфизм белков и возможности его использования в идентификации генотипов в культуре in vitro. Автореф. дис. на соиск. ученой степени канд. биол. наук. М.:МГУ, 1989. - 19 с.

31. Мусин С.М. Возможности использования белковых маркеров в биотехнологии картофеля. 4. Скрининг сомаклональной вариабельности. // Биотехнология в картофелеводстве. М., 1991. - С. 34^14.

32. Мусин С.М. Мифы, ошибки и фальсификации в истории селекции картофеля. // Достижения науки и техники АПК. 2004. - № 6. - С. 29-35.

33. Мусин С.М., Ланева И.И., Мусина P.A. К вопросу о контроле генетической стабильности сортов в системе безвирусного семеноводства картофеля: соматические мутации и вариабельность мериклонов. // Селекция и семеноводство картофеля. М., 1992. - С. 73-81.

34. Мусин С.М., Мусина P.A. Возможности использования белковых маркеров в биотехнологии картофеля. 3. Паспортизация генофонда и прикладные аспекты проблемы. Биотехнология в картофелеводстве. М., 1991. -С. 24-34.

35. Мусин С.М., Петухов С.Н. Молекулярно-генетические маркеры в селекции картофеля с использованием нередуцированных гамет дигаплоидов. // Экологическая генетика растений и животных. Кишинев, 1987. - С. 212.

36. Мусин С.М. Петухов С.Н., Склярова Н.П. Использование полиморфизма белков клубней в селекции картофеля на основе метода мейотической полиплоидии. // Доклады ВАСХНИЛ. 1988. - №10. - С. 1215.

37. Мусин С.М., Симаков Е.А. Возможности использования полиморфных белков как генетических маркеров в идентификации соматических мутантов картофеля. / Селекция, семеноводство и биотехнология картофеля. -М, 1989.-С. 112-123.

38. Мусин С.М. Трофимец Л.Н. Использование белков микроклубней в идентификации генотипов (сортов, гибридов и линий) картофеля in vitro// Доклады ВАСХНИЛ. 1988. - №7 - С. 15-17

39. Мусин С.М., Фенина H.A., Трофимец Л.Н. Сортовая идентификация и семенной контроль картофеля с использованием белковых маркеров. // Селекция, семеноводство и биотехнология картофеля. М., 1989. - с. 135.

40. Мусин С.М., Хромова Л.М. Белковые маркеры в скрининге генетически обусловленной изменчивости регенерантных линий картофеля. / Биология культивируемых клеток и биотехнология. Новосибирск, 1988. - С. 258.

41. Мусина P.A. Исследование белковых маркеров и паспортизация генофонда Solanum tuberosum L., in vivo и in vitro: Автореф. Дисс. канд. биол. наук, 1993,- 16 с.

42. Мусина P.A., Мусин С.М. Биохимическая паспортизация генофонда S. tuberosum ssp. tuberosum in vitro по электрофоретическим вариантам пе-роксидазы корней пробирочных растений. // Селекция и семеноводство картофеля. М., 1992.-с. 65-73.

43. Мусина P.A., Мусин С.М., Анисимов Б.В., Трофимец Л.Н. Запасные белки клубней картофеля как биохимические маркеры. // «Использование клеточно-тканевых культур и селекционных биотехнологий в растениеводстве». Новосибирск, 1993. - С. 21-35.

44. Писарев Б.А., Трофимец Л.Н., Анисимов Б.В., Мусин С.М., Князев В.А., Мусина P.A., Русинова Е.Я. Методы оценки оздоровленных сортов имеристемных линий в элитном семеноводстве картофеля. М., Информагро-тех, 1991.-39 с.

45. Полянская С.И. Электрофорез белков картофеля сорта Вармас в по-лиакриламидном геле. / Некоторые вопросы биотехнологии и медицины на Дальнем Востоке. Владивосток, 1968. - С. 18-21.

46. Селихова О.Д., Семиков В.Ф., Сафонов В.И. Белковый комплекс клубней картофеля и его электрофоретические свойства при разных условиях питания. // Сельскохозяйственная биотехнология. 1969. - Т. 4. - №4. - С 553-555.

47. Симаков Е.А., Анисимов Б.В., Коршунов A.B. и др. Сортовые ресурсы и передовой опыт производства картофеля. М.: ФГНУ «Росинформагро-тех», 2005.-С. 296-307.

48. Созинов A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. М.: Наука, 1985. -272 с.

49. Созинов A.A. Генетические маркеры у растений. // Цитология и генетика. 1993.-т. 27.-№5.-С. 3-14.

50. Уайтхед Т., Мак-Интош Т., Финдлей У. Определение сортов картофеля по ботве. Определение сортов картофеля по генеративным органам. / Кар-тофель.-М., 1955. С. 40-58. (перевод с англ.)

51. Утешев B.JL, Трофимец JI.H., Анисимов Б.В., Мусин С.М., Попов Б.А., Алябьева A.B., Мусина P.A. Организационно-методические основы сертификации и контроля качества оздоровленного семенного картофеля в Московской области. М., ГОСНИТИ, 1990. - 21 с.

52. Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводсте. // Сельскохозяйственная биология, 1997. №5. - С. 3-21.

53. Хавкин Э.Е. Молекулярная селекция растений: Место ДНК-технологий в создании новых сортов сельскохозяйственных культур. // С.-х. Биология, 2003. №3. - С.26-41.

54. Шарафутдинова Г.Г., Мардамшин А.Г., Мустафина А.Р., Кудоярова Г.Р. Сравнительный анализ гормонального баланса растений картофеля различной длительности культивирования in vitro. // Вестник Башкирского университета, 2001. №2 (II). - С. 133-135.

55. Шенк Г., Мусин С.М., Бойко В.В. Идентификация сортов и мутант-ных линий картофеля из ГДР в культуре in vitro. / Селекция, семеноводство и биотехнология картофеля. М., 1989. С. 123-129.

56. Яшина И.М. Методические указания по оценке отличимости, однородности, стабильности сортов картофеля и отбору отечественных сортов -эталонов. М., 2000. - 28 с.

57. Albani М.С., Wilkinson M.J. Inter simple sequence repeat polymerase chain reaction for the detection of somaclonal variation. // Plant Breed. 1998. -V. 117.-№6.-P. 573-575.

58. Ashkenazi V., Chani E., Lavi U., Levy D., Hillel J., Veilleux R.E. Development of microsatellite markers in potato and their use in phylogenetic and fingerprinting analyses.// Genome. 2001. - V. 44. - P. 50-62.

59. Azariah M.D. Bolters in potatoes. // Indian Potato Journal. 1961. - № 3. -P. 38-41.

60. Bailey D.C. Isozymic variation and plant breeder's right. / Tanksley S.D., Orton T.J. (eds.). Isozymes in plant genetics and breeding, part A. Elsevier, Amsterdam, 1983.-P. 425-440.

61. Barta J., Curn V., Divis J. Study of biochemical variability of potato culti-vars by soluble protein, isoesterase, and isoperoxidase electrophoretic patterns. // Plant Soil. Environ. 2003 (5). - V. 49. - P. 230-236.

62. Burgutin A.B., Musin S.M., Butenko R.G. Segregation of genetic determinants in somaclonal variants of potato somatic hybrid. // Biology of plant cell culture and biotechnology. Almaty, 1993. - P. 80.

63. Castillo F.J. Peroxidases and stress In: C Penel, Th Gaspar & H Greppin, eds, Plant Peroxidases 1980-1990. Topics and Detailed Literature on Molecular, Biochemical and Physiolog-ical Aspects, University of Geneva, (1992). P. 187203

64. Chakrabarti S.K., Birhman R.K., Pattanayak D. Genetic similarity analysis and identification of Indian potato cultivars by random amplified polymorphic DNAs.//Indian J. Exp. Biol. 1999. - V. 37.-№ 11.-P. 1123-1128.

65. Consden R, Gordon A.N., Martin A.J.R. Ioniphoresis in silica jelly: A method for the separation of aminoacids and peptides. // Biochem. J. 1946. - V. 40.-P. 33-41

66. Contreras A., Mansilla R. Elecroforesis de proteínas y esterase como método químico de identificación en papas. // Turrialba. 1989. - V. 39. - P/ 193198.

67. Cook R.J. Gel electrophoresis for identification of plant varieties. // Journal of Chromatography. 1995. -V. A 698. - P. 281-299.

68. Cook R.J. New approach to potato variety identification. // Potato Research. 1999. - V. 42. - P. 529-539.

69. Czupryn M., Toczko K. Variety-specifity of soluble protein of potato tubers. // Acta sol. Bot. Polon. 1974. - V. 43. - № 4. - P. 491-498.78. . Davis B.J. Disc electrophoresis to human serum protein. //Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1964. - V. 121. - P. 404-427.

70. De Jong H., Murphy A.M. Congo: A Versatile Blue-Fleshed Heritage Potato Variety with Many Name. / Potato Gene Resources Newsletter Potato Research Centre / http://res2.agr.ca/Fredericton/nb/nlO 03 01 e.htm. ISSN 1496-497X

71. Demeke T., Kawchuk L.M., Lynch D.R. Identification of potato cultivars and clonal variants by random amplified polymorphic DNA analysis. // American Potato Journal. 1993. - V. 70. - P. 561-570.

72. Desborough S.L. Potato {Solanum tuberosum L.). / Isozymes in Plant Genetics and Breeding. Amsterdam: Elsevier Scientific Publishers, 1983. - P. 167188.

73. Desborough S., Peloquin S.J. Disc electrophoresis of tuber proteins from Solanum species and interspecific hybrids. // Phytochemistry. 1965. - №5. - P. 727-733.

74. Desborough S., Peloquin S.J. Esterase isozymes from Solanum species and interspecific hybrids. // Phytochemistry. 1966. - № 6. - P. 984-994.

75. Desborough S., Peloquin S.J. Potato variety identification by use of electrophoresis patterns of tuber proteins and enzymes. // American Potato Journal. -1968a. V. 45. - № 6. - P. 220-222.

76. Desborough S., Peloquin S.J. Acid gel disc electrophoresis of tuber proteins from Solanum species. // Phytochemistry. 1968b. - № 8. - P. 425-429.

77. Desborough S., Peloquin S.J. Tuber proteins from haploids, selfs and culti-vars of group Tuberosum separated by acid gel disc electrophoresis. // Theor. Appl. Genet. 1969. - V. 39. - V. 43-47.

78. Douches D.S., Lundlam K. Electrophoretic characterization on North American potato cultivars. // American Potato Journal. 1991. - V. 68. - P. 767780.

79. Douches D.S., Lundlam K., Freyre R. Isozyme and plastid DNA assessment of pedigrees of nineteenth century potato cultivars. // Theor. Appl. Genet. -1991.-V. 82.-P. 195-200.

80. Douches D.S., Quiros C.F. Genetic analysis of a diploid synaptic mutant through electrophoretic markers. // American Potato Journal. 1986. - V. 63. -№ 8.-P. 420.

81. Douches D.S., Quiros C.F. Use of 4x-2x crosses to determine gene-centromere map distances of isosymes loci in Solanum species. // Genome. 1987. -V. 29.-P. 519-529.

82. Douches D.S., Quiros C.F. Additional isosyme loci in tuber-bearing So-lanums: Inheritance and linkage relationships. // Journal of Heredity. 1988. -V. 79.-P. 379-384.

83. Easton G.D., Nagle M.E. Giant hill selection for control of Verticillium dahliae in potato. // Plant diseases. 1987. - V. 71. - P. 937-940.

84. Elsen A., Soost R.K. Peroxidase polymorphism in Citrus //Journal of Heredity. 1976. - V. 67. - № 4. - P. 199-203.

85. Fielder M.R. Genetic control of four cathodal peroxidase isozymes in barley// Journal of Heredity. 1976. -V. 67. №1. - P. 39-42.

86. Gavrilenko T., Thieme R., Tiemann H. Assessment of genetic and pheno-typic variation among intraspecific somatic hybrids of potato Solanum tuberosum L. //Plant Breed.- 1999. -V. 106. №3. - P. 205-213.

87. Gell P.G.H., Hawkes J.G., Wright S.T.C. The application of immunological method to the taxonomy of species within the genus Solanum. Proceeding of the Royal Society, 1960, v. 151, p. 364-383.

88. Gerbrandy S.J., Shankar V., Shivaram K.N., Stegemann H. Conversion of potato phosphorilase isosymes. // Phytochemistry. 1975. - V. 14. - P. 23312333.

89. Gebhardt C., Ritter E., Debener T., Schachtschabel U., Walkemeier B. RFLP analysis and linkage mapping in Solanum tuberosum. // Theor. Appl. Genetic 1989. -V. 78.-P. 65-75.

90. Giovannini T., Alicchio R., Concillo L. Genetic analysis of isozyme and restriction fragments patterns in the genus Solanum. II J. Genet. Breed. 1993. -V.47.- P. 237-244.

91. Glendinning D.R. The performance of progenies obtained by crossing group Andigena and Tuberosum of Solanum tuberosum. II European Potato Journal. 1969. - V. 12.-P. 13-19.

92. Gorg R., Schachtschabel U., Ritter E., Salamini F., Gebhardt C. Discrimination among 136 tetraploid potato varieties by fingerprints using highly polymorphic DNA markers. // Crop Sei. 1992. -V. 32. - P. 815-819.

93. Grill D., Esterbauer H., Dobering I., Klansek E. Die Peroxidase-Isoenzymmaster von Picea abies, Abies alba und Larix decidua//Phyton (Acta Rei Botanicae).- 1982a. V. 22. - №2. - P. 201-211.

94. Grill D., Esterbauer H., Dobering I., Klansek E. Peroxidase-Isoenzymmaster in vier Pinus-species. // Phyton (Acta Rei Botanicae). 1982. - V. 22.-№2.-P. 233-241.

95. Grill D., Holzer K., Esterbauer H. Untersuchungen zur variabilitat des per-oxidase-isoenzymmusters der flehte und deren brauchbarkeit fur genetische Studien//Angewandte Bot. 1985. - V. 59. - P. 233-237.

96. Grison C.L. Identification des varietes de povve de terre par electropho-rese.// Pomme de Terre Uranc. 1980. - an. 41. - №398. - P. 135-143.

97. Hamill D.E., Brewbaker J.L. Isoenzyme polymorphism in flowering plants. IV. The peroxidase isoenzymes of maize (Zea mays). // Physiol, plantarum.- 1969. V. 2.-P. 945-958.

98. Hawkes, J. G. The history of the potato. F. Roy. hort. Soc.: 1967. V. 92.- P. 207-24; 249-62; 288-302; 364-365.

99. Hill H.D. A comparative study of certain tissues of giant hill and healthy potato plants. // Phytopathology. 1934. - V. 15. - 577-598.

100. Holm, D.G. Sangre selection studies: I. Selection and comparative trials. // American Potato Journal. 1988. - V. 65. - P. 21-26.

101. Hosaka K., Ogawa K. Genetic diversity in Japanese and North American potato cultivars evaluated by RAPD analysis. // Sei. Rep. Fac. Agr. Kobe Univ. -1994.-V. 21.-P. 39-42.

102. Howard, H. W. Genetics of the potato: Solanum tuberosum. London: Logos Publishing, 1970. - P. 69-88.

103. Huamann Z. Conservation of potato genetic resources at CIP. H CIP Circular. 1986. - V. 14 (2).-P. 1-7.

104. Huamann Z., Salas A., Gomez R., Panta A., Toledo J. Conservation of Potato Genetic Resources at CIP. II Potato, Global Research and development. V. 1 -Shimla, 2000.-P. 102-112.

105. Hunter R.L., Market C.Z. Histochemical demonstration of enzymes separated by zone electrophoresis in starch gels. // Science. 1957. - V. 125. - P. 1294-1295.

106. Kahn A.A., Malhotra S.S. Peroxidase activity as an indicator of SO injury in jack pine and white birch // Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 1982. -V. 177.-P. 643-650.

107. Kawchuk L.M., Lynch D.R., Thomas J., Penner B, Sillito D., Kulcsar F. Characterization of the Solanum tuberosum simple sequence repeats and application to potato cultivar identification. // American Potato Journal. 1996. - V. 73. -P. 325-335.

108. Kieliszewska-Rokicka B. Peroxidase activity in varieties of Weigela and Pinus sylvestris resistant and susceptible to SO. // Arboretum Kornickie. 1979. -V. 24.-P. 313-320.

109. Kieliszewska-Rokicka B. Isozymes of peroxidase, indole-3-acetic acid oxidaze and polyphenoloxidase of poplar and pine. // Acta Physiologia Plantarum. 1980.-V. 2.-P. 195-207.

110. Kim J.H., Joung H., Lim Y.P. Estimation of genetic variation and rela-tioship in potato (Solanum tuberosum L.) cultivars using AFLP markers. // American Journal of Potato Research. 1998. - V. 75. - P. 107-112.

111. Kormut'ak A., Heldak J., Subova D. Soluble proteins and isoesterazes as taxonomic markers tested on nine wild Solanum species and eight Slovakian potato varieties. Potato Research. - 1999. - V. 42. - P.619-926.

112. Korori A.A., Hinterstoisser B., Lang H.P.,Ebermann R. Seasonal alteration of plant peroxidase isoenzyme pattern in Latrix deciduas. //Phyton (Austria). -1992. V. 32. - №2. - P. 307-313.

113. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4. // Nature. 1979. - V. 227. - P. 680-685.

114. Lawrence, D.F., S.A. Slack, R.L. Plaisted. 1994. Russet Bake-King: A uniform russeted sport of Bake-King. // American Potato Journal. 1994. - V. 71(2). -P. 127.

115. Leever G, Trank W.A., Shaver G., Miller J.C., Pavlista A.D. Norgold Russet, Superior and Red La soda strains selected for potato cultivar improvement in Nebraska. // American Potato Journal. 1994. - V. 71. - P. 133-144.

116. Lickl E., Beck R.H.F., Ebermann R. Response of peroxidase and amylase isoenzyme activities of Aesculus hippocastanum and Picea abies to hamma and to gamma and beta irradiation//Phyton (Acta Rei Botanicae). 1987. - V. 27. - №2. -P. 177-180.

117. Loeschke V., Stegemann H. Protein muster der kartoffel knolle ein Sortencharakteristikum. // Iber. Biol. Bundesanst. - 1965. - A 52 - A 53.

118. Loeschke V., Stegemann H. Proteine der Kartoffelknollen in Abhängigkeit von Sorte und Virosen (Polyacrylamid-Elektrophorese). // Phytochemistry. -1966a. №5.-p. 985-991.

119. Loeschke V., Stegemann H. Polyacrylamid-Elektrophorese zur Beurteilung von Proteinen der Kartoffel. // Z. Naturforschung. 1966b. - V. 21b. - №9. - P. 879-888.

120. Love, S.L., Thompson-Johns A.L., Barker T.P., Corsini D.L. Comparisons of Russet Burbank clones from various geographic regions of the United States and Canada. //American Potato Journal. 1992. - v. 69. - P. 299-307.

121. Macias M.M., Mancilla R.T., Contreras A.M. Identification de clones de papa chilena (Solanum ssp. tuberosum) por electrophoresis de proteinas y es-terasas. // Agro. Sur. 1989. - V. 17. - P. 56-63.

122. Macko V., Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined electro-focusing and electrophoresis. Identification of varieties. Hoppe-Seylers. // Z. Physiol. Chem. 1969. -V. 350. - №7. - P. 917-919.

123. Mäder M & Amberg-Fisher V (1982) Role of peroxidase in lignifications oftobacco cells.//Plant Physiology. 1982.-V. 70.-P. 1128-1131.

124. Mandolino G., DeMarco S., Faeti V., Bagatta M., Carboni A., Ranalli P. Stability of fingerprints of Solanum tuberosum plants derived from conventional tubers and vitro-tubers. // Plant Breed. 1996. - V. 115. -P. 439-444.

125. Mair G. Bestimmung osterreichescher kartoffelsorten mit Hilfe der gelelektrophorese. // Inform. 1981. - V. 1. - P. 3-4.

126. Martinez-Zapater J.M., Oliver J.L. Genetic analysis of isozyme loci in tetraploid potatoes (Solanum tuberosum L.). II Genetics. 1984. - V. 108. - №3. -P. 665-679.

127. Martinez-Zapater J.M., Oliver J.L. Isozyme gene duplication in diploid and tetraploid potatoes. // Theor. Genet. 1985. - V. 70. - № 2. - P. 172-177.

128. May B., Staub J.E., Kuhns L.J. Potato cultivars: genetic variation within putative clones. // American Potato Journal. 1982. - V. 59. -№ 4. - P. 179-187.

129. McGregor C.E., Lambert C.A., Greyling M.M., Louw J.H., Warnich L. A comparative assessment of DNA fingerprinting techniques (RAPD, IS SR, AFLP and SSR) in tetraploid potato (Solanum tuberosum L.) germplasm. // Euphytica. -2000,- 113.-№2.-P. 135-144.

130. Mendosa H.A., Haynes F.L. Genetic basis of heterosis for yield in auto-tetraploid potato. //Theor. Appl. G. 1974. - V. 45. - P. 21-25.

131. Metakowsky E.V., Novoselskaya A.I., Sozinov A.A. Problems of interpreting results obtained in studies of somaclonal variation in gliadin proteins in wheat. // Theor. Appl. Genet. 1987. - V. 73. - № 75. - P. 764-766.

132. Milbourne D., Meyer R., Bradshaw J.E., Baird E., Bonar N., Provan J., Powell W., Waugh R. Comparision of PCR-based marker systems for the analysis of genetic relationships in cultivated potato. // Mol. Breed. 1997. - V. 3. - P. 127-136.

133. Milbourne D., Meyer R.C., Collins A.J., Ramsay L.D., Gebhardt C., Waugh R. Isolation, characterization and mapping of simple sequence repeat loci in potato. // Mol. Gen. Genet. 1998. - V. 259. - P. 233-245.

134. Mori M., Hosaka K., Umemura Y., Kaneda C. Rapid identification of Japanese potato cultivars by RAPDs. // Japan Journal Genet. 1993. - P. 167-174.

135. Musin S.M., Schenk G., Bojko V.V., Trofimec L.N. Gelelektrophoretische Identifizierung einer Mutante der Kartoffelsorte «Arkula». Archiv fur Zuchtungsforschung. -Berlin, 1989. 19. - №4. - S. 327-329.

136. Nakajima R, Yamazaki I. The mechanism of indole-3-acetic acid oxidation by horseradish peroxidases. // Journal of Biological Chemistry. 1979. - V. 10.254(3).-P. 872-878.

137. Nieto A.R., Sancho A.C., Barros M.V., George J.L. Peroxidaze zy-mogrammes at constant and gradient pH electrophoresis as an analytical test in the identification of potato varieties. // J. Agric. Food. Chem. 1990. - V. 38. - P. 2148-2153.

138. Novak J. Characterystica domain uprawnych in dzikich gatunkow ziemni-aka metoda electroforetycznego rosdialn bialek. //Hod. Rostl. Adlimat. Inasieum. -1973.-V. 17,-№2.-P. 129-140.

139. Ohms J. P. Erkennung der sortenxeinheit in der elektrophoretischen sortendiagnostic von kartoffel.// Kartoffelban. 1979. - V. 30. - №6. - S. 212214.

140. Ohms J. P. Bestimmung von kartoffelsorten mittels gel-elektrophorese. // Inform. 1981.-P. 1-3.

141. Oliver J.L., Martinez-Zapater J.M. Allozyme variability and phylogenetic relationships in the cultivated potato (Solanum tuberosum) and related species. // Plant Syst. Evol., 1984.-V. 198.-№1/2.-P. 1-18.

142. Oliver J.L., Martinez-Zapater J.M. A genetic classification of potato culti-vars based on allozyme patterns. // Theor. Appl. Genet. 1985. - V. 69. - V. 305311.

143. Plaisted R.L., Hoopes R.W. The past record and future prospects for the use of exotic potato germplasm. // American Potato Journal. 1989. - V. 66. - P. 603-627.

144. Prevost A., Wilkinson M.J. A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars. // Theor. Appl. Genet. 1999. - V. 98.-P. 107-112.

145. Provan J., Powell W., Waugh R. Microsatellite analysis of relationships within cultivated potato (Solanum tuberosum). // Theor. Appl. Genet. 1996. - V. 86.-P. 975-984.

146. Quiros C.F., McHale N. Genetic analysis of isozymes variants in diploid andtetraploidpotatoes. //Genetics.- 1985.- V. 111.-№ 1.-P. 131-135.

147. Racusen D., Weller D.L. Molecular weight of patatin, a major potato tuber protein.// J. Food Biochem. 1984. - №8. - P. 103-107.

148. Rafalsky J.A., Tingey S,V., Williams J.G.K. RAPD markers a new technology for genetic mapping and plant breeding. // Ag. Biotech. News Info. - 1991. -V.3.-P. 645-648.

149. Rafalski J.A., Vogel J.M., Morgante M., Powell W., Andre C., Tingey S.V. Generating and using DNA markers in plants. In: Birren B., Lay E. Non-Mammalian genomic analysis: a practical gide. San Diego: Academic Press, 1996.-P. 75-134.

150. Ramaiah P.K., Durzan D.J., Mia A.J. Amino acids, soluble proteins, and isozyme patterns of peroxidase during the germination of jack pine // Can. J. Bot. -1971.-V. 49.-P. 2151-2161.

151. Rasmussen, J.O.; Rasmussen, O.S.: Characterization of somatic hybrids of potato by use of RAPD markers and isozyme analysis. // Physiologia Plantarum. -1995.-V. 93. P. 357-364.

152. Raymond S., Weintraub Z. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. - 1959. - V. 130. - P. 711.

153. Reisfeld R.A., Lewis U.J., Williams D.E. // Nature. 1962. - V. 195. - P. 281.

154. Rickemann V.S., Desborough S. Inheritance of three electrophoretically determined protein band in potato (Solarium tuberosum L.). II Theor. Appl. Genet. 1978a.-V. 52. -№4. - P. 187-190.

155. Rickemann V.S., Desborough S. Elucidation of the evolution and taxonomy of cultivated potatoes with electrophoresis. // Theor. Appl. Genet. 1978b. -V. 52. -№5.- P. 217-220

156. Salaman R. N. Potato varieties. Cambridge University Press, 1926. -378 p.

157. Sanfordt J.C., Weeden N.F., Chui Y.C. Regarding the novelty and breeding value of protoplast-derived variants of Russet Burbank (Solarium tuberosum 1.). // Euphytica. 1984. - V. 33. - P. 709-715.

158. Schulz H. Aktivitatbestimmung von peroxidase-isoenzymen in nadeln von Pinus sylvestris // Biochimie und Physiologie der Pflanzen. 1985. - V. 180. - P. 177-192.

159. Shapiro A.L., Vinuela E., Maizel J.V. Molecular weight estimation of polypeptidae chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. //Biochem Biophys. Res. Commun. 1967. - V. 28. - P. 815-820.

160. Shepardt G.C., Bidney D., Shahi E. Potato protoplasts in crop improvement. // Science. 1980. - P. 17-24.

161. Simon P.W., Peloquin S.J. Inheritance of electrophoretic variants of tuber proteins in Solanum tuberosum haploids. // Biochemical Genetic. 1980. - V. 18. -№11/12.-P. 1055-1063.

162. Smith D.B. Variation in the electrophoretic band pattern of tuber proteins from somaclons of potato. // Journal of Agricultural Science. 1986. - V. 106. -№2.-P. 427-428.

163. Smithies O. Zone electrophoresis in starch gel: Group variation in the serum proteins of normal human adults. // Biochemical Journal/. 1955. - V. 61. -P. 629-641.

164. Sonnewald U, Hajirezaei MR, Kossmann J, Heyer A, Trethewey RN, Willmitzer L Increased potato tuber size resulting from expression of a yeast inver-taze. // Natural Biotechnology. 1997. - V. 15. - P. 794-797

165. Sontag T., Salovaara H., Ulvinen O. PAG elecrtrophoresis variants of six finnish potato cultivars. // J. Agric Sci. Finland. 1985. - V. 57. - P. 147-154.

166. Sosinski B., Douches D.S. Using polymerase chain reaction-based DNA amplifcation to fingerprint North American potato cultivars. // Hort.Science. -1996.-V. 31.-P. 130-133.

167. Staub J.E., Kuhns L.J., May B., Grun P. Genetic basis of alkaline phosphatase and glucosephosphate isomerase in Solanum. // Theor. Appl. Genet. -1984.-V. 67,-№6.-P. 505-513.

168. Stegemann H. Neu Sortenbestimmung von Kartoffel.// Der Kartoffelbau. -1970. -V. 21.-P. 338-339.

169. Stegemann H. Characterization of proteins from potatoes, and the Index of European Varieties. / The Biology and Taxonomy of the Solanaceae. J.G. Hawkes, R.N. Lester, A.D. Skelding (Eds). London: Academic Press, 1979. - P. 279-284.

170. Stegemann H. Biochimische Methoden und enzyme zur dastellung polymorpher proteine / Seminar fuer Haustiergenetic. Hannover, 1980a. - S.l-7,

171. Stegemann H. Leistungsfaelhigkeit elektrophoretischer Methoden fuer genetic und Sortendiagnose. / Seminar 4. 1980b. - S. 119-130.

172. Stegemann H., Retrospect on 25 years of cultivar identification by protein patterns and retrospects for future. / Proc. Int. Seed Testing Assn. on Biochemical Tests for Cultivar Identification. Cambridge University Press, 1983. - P. 20-31.

173. Stegemann H., Francsen H., Macko V. Potato proteins: genetic and physiological changes, evaluated by one- and two-dimensional PAA-gel-techniques. Z. Naturf. 1973. - v. 28b. - P. 722-732.

174. Stegemann H., Loeschke V. Uber die Proteine der Kartoffelknolle. // Landw. Forsch. 1961. -V. 14. - P. 259-262.

175. Stegemann H., Loeschke V. Index of European potato varieties. Identification by electrophoretic spectra. Berlin: Arno Brynda GmbH, 1976. - 215 pp.

176. Stegemann H., Loeschke V. Indexing of European potato varieties. //Potato Research. 1977. -V. 20. - V. 2. - P. 101-110.

177. Stegemann H., Matern U., Loeschke V. Protein patterns of potato tubers regenerated from protoplasts. / Jahresbericht. Biol. Bundesanst. Braunschweig F.R.G., 1979.-P 121.

178. Stegemann H., Schnick D. Index 1982 of European potato varieties. B. -1982.-220 pp.

179. Stegemann H., Schnick D. Index 1985 of European potato varieties. / Mitteilungen der Biologsche Bundesanstalt. 1985. - V. 227. - 128 pp.

180. Stoll G., Effmert B. Sortenbestimmung bei kartoffeln duch electrophorese der knollenproteine. // Saat Pflanxgut. 1982. - Jg. 23. - V. 9. - P 150-151.

181. Struik P.C., Wiersema S.G. Seed potato technology. NIVAA, Wageningen Press, Wageningen, the Nitherlands, 1999. - 383 pp.

182. Tanksley S.D., Orton T.J. Isozymes in plant genetics and breeding, part A. -Elsevier, Amsterdam, 1983. -P. 425-440.

183. Tognolli M., Overney S., Penel C., Greppin H., Simon P. A genetic and enzymatic survey of Arabidopsis thaliana peroxidases// Plant Peroxidase Newsletter. 1999.-№14.-P. 3-12

184. Tsvetkov I., Seitova A., Musin S., Suprunova T., Dorokhov D. Russian potato cultivars identification by protein and DNA profiling. // «Global Conference on Potato». New Delhi: India, 1999. - P. 14.

185. Uijtewaal B.A., Suurs L.C.J.M., Jacobsen E. Protoplast fusion of mono-haploid (2n=x=12) potato clones: identification of somatic hybrids using malatedegidrogenase as a biochemical marker. // Plant Science. 1987. - V. 51. - P. 277284.

186. Weber K., Osborn M. Reliability of molecular weight determinations by dodecyl-polyacrylamide gel electrophoresis. // Journal of Biological Chemistry. -1969.-V. 244.-P. 4406-4412.

187. Werner H.O. Performance of clonal strains of Triumph potatoes. // American Potato Journal. 1940. - V. 17. - P. 66-80.

188. Zwartz J.A. Characteristics of potato proteins in relation to potato varieties. // Bibl. Nutr. Dieta. 1965. - №7. - P. 221-232.

189. Zwartz J. Potato varieties and their protein electrophoregram characteristics. // European Potato Journal. 1966. - № 9. - P. 11-128.1. Ш 137

Информация о работе

Дементьева, Зоя Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 06.01.05

Диссертация

Использование белковых и изоферментных маркеров в идентификации генотипов картофеля - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы