Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изоферментные системы в гибридологическом анализе подсолнечника

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изоферментные системы в гибридологическом анализе подсолнечника"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАСТЕНИЕВОДСТВА ИМЕНИ Н. И. ВАВИЛОВА

ртв од

На правах рукописи

~ пул

ЛОСКУТОВ

Андрей Васильевич

УДК 633.854.78:575.173

ИЗОФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ В ГИБРИДОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

ПОДСОЛНЕЧНИКА

Специальность: 03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1993

Работа выполнена во Всероссийском! научно-исследовательском институте масличных культур им. В. С. Пустовойта в 1987—1990 гг.

Научный руководитель — доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН Драгавцев В. А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Фадеева Т. С., доктор биологических наук, профессор Гаврилюк И. П.

Ведущее учреждение — Институт цитологии' и генетики СО РАН г. Новосибирск.

Защита диссертации состоится 1993 г. в /у часов

на заседании Специализированного совета Д 020.18.02 во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н. И. Вавилова по 'адресу. 190000, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н. И. Вавилова.

. у Г]

Автореферат разослан ^й*4 ¡**) 1993 г.

Ученый секретарь совета доктор биологических наук

Э. А. Гончарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш: В решении проблемы увеличения производства растительного масла в России . важная роль принадлежит новым высокопродуктивным-гибридам подсолнечника. При их создании и скорейшем внедрении в производство необходима комплексная разработка методов и приемов, позволяющих' интенсифицировать селекционный процесс и семеноводство.

В генетике и селекционной практике вахнуп роль играют генетические маркеры. Маркерные гены используют дл1^Генетического разнообразия селекционного материала и для его паспортизации (Конарев, 1983: Созинов, 1985; Левитес. 1986; Кснарев, 1937; Лоперэля, Асыка, 1983).

Традиционно для генетического исследования использовались вариации морфологических признаков; окраска, форма, размеры и другие. Однако, возможность использования этих признаков ограничена временем и четкостью генетического проявления.

Принципиально новые возможности использования генетических маркеров в генетике и селекции появились с открытием

полиморфизма белков, в особенности, иэоферментов, Основным преимуществом изоферментов является кодоминантный тип наследования, позволяющий оценить гомо- и гетерозиготность растения. Иэоферменты. являясь прямыми продуктами активности ге-hoü. менее подвержены влиянию внешней среды и поэтому более надегны, как маркеры.

Для наиболее генетически изученных культур .таких как кукуруза, пшеница, томаты, горох и др. изоферменты использу->-ч для регистрации и биохимической паспортизации сортов, 'линий и гибридов (Goodman, .Stuber, 1980; Kahler, et. al., 1984; Мснастырева и др.', 1976; Nielsen, Johansen, 1986); для оценки генетической чистоты коммерческих партий семян (Arus, 1983). Изофермёнтный анализ предусматривается в'ряде селекционных схем. что позволяет, сокращать селекционный процесс процоиц rtqnksley, Rick, 198П; Tanksley, 19ЯЗ; Orten.

Легальность изучения и использования изоферментов в

.- п" ;'-"тпчческих млргерив у т'Л'-пнечнига обусловлена

• м г, ,1,--"¡«лкой тучеь'н«."-:^«- г»^■ «i* культура-

пп

Целью наших исследований было изучение генетики ферментных систем подсолнечника, с перспективой использования полученных результатов для решения различных генетических и селекционных задач.

Задачи исследования. • 1. Изучить полиморфизм и генетический контроль восьми ферментных систем подсолнечника: АДГ, МДГ, 6-ФГД, ИДГ. ГДГ, ГФИ,' ÁKO, ЭСТ. 2. Определить частоту рекомбинации между генами, кодирующими иэоферменты, и генами, контролирующими морфологические признаки. 3.Провести биохимическую паспортизацию инбредных линии селекции БНИИМК, линий и образцов из ген. коллекций ВНИИМК и ВИР.

Научная новизна. Впервые в нашей стране проведены исследования по генетике изоферментов подсолнечника. Изучен полиморфизм восьми ферментных систем подсолнечника на материале коллекций ВНИИМК и ВИР. Впервые описан механизм наследования изоферменов контролируемых локусами Gdh 1 Асо 1, Mdh 4. Впервые проведен анализ сцепления локуса Est 1 с локусами Adh 1, Mdh 2, Mdh 4. Idh 2. Gdh 1. Gpi 1; локуса Асо 1 с локусами Mdh 2 и Gpi 1, локуса Mdh 4 с локу-сом Pgd 1. Оценено сцепление между генами кодирующими иэоферменты. и генами, контролирующими морфологические маркерные признаки. Проведено исследование внутриклеточной локализации различных форм МДГ подсолнечника. Впервые проведе-иэоферментная идентификация более 70 линий и образцов подсолнечника коллекций ВНШМК и ВИР.

Практическая ценность. Полученные данные по биохимической идентификации инбредных Линий селекции ВНИИМК позволяют практически использовать изоферменты для характеристики селекционных форм подсолнечника, оценивать генетическую чистоту селекционного материала,- осуществлять контроль за гибридностыз, регистрировать линии , гибриды и сорта при предоставлении авторских прав селекционеру. Линии и образцы из генетических, коллекций ВНШМК и ВИР классифицированные с помощью изоферментов, являются ценным исходным материалом для селекционно-генетических исследований подсолнечника. Изофер-ментные локусы с изученным генетическим контролем представляют собой удобные маркеры для,построения генетической карты подсолнечника.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Краевой научно-технической конференции молодых ученых и специалистов (Краснодар, "1988); конференциях молодых ученых

ВНИИМК (Краснодар, 1989, 1991); Всесоюзном симпозиуме "Моле------

кулярные механизмы генетических процессов" (Москва. 1990); Республиканской конференции молодых ученых (Одесса, 1990); Пятой международной школе-конференции по генетике (Албена, Болгария, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликовано десять научных работ.

Структура и объем: работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, выводов и рекомендаций, списка использованной литературы и приложения. Она изложена на 161 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 19 рисунков, 15 приложений. Список литературы включает 191 источник, из них 153 - иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали различные формы культурного подсолнечника Helianthus аппииз L.: 41 линия из коллекции ВНИИМК и 29 линий и образцов из мировой коллекции ВИР. В работе был также использован образец СФ 1 с ЦМС Н. rigidus.

Опыты проводили на центральной экспериментальной базе ВНИИМК в 1987 - 1990 гг. Ежегодно вели работу с двумя последовательными генерациями - одной в поле и одной в фитотроне. Принудительное самоопыление и гибридизацию подсолнечника проводили общепринятыми методами (Гундаев, 1971).

Электрофоретический анализ изоферментов проводили в крахмальном геле (Левитес, 1986). Использовали три буферных системы: трис-цитратную систему pH 5,7 (Wendel, Stuber, 1984); трис-цитратную pH 7,0 (Wendel," 1984) и трис-ЭДТА-бо-ратную pH 8,0 (модифицированная Портера). Гистохимическое окрашивание белковых зон осуществляли по стандартным методикам (Vallejos, 1983; Левитес, 1986).

Изоферменты и контролирующие их гены обозначали согласно общепринятым правилам (Корочкин.1977; Левитес, 1986 К

Для изучения субклеточной локализации ферментов малат--дегидрогенаэы использовали суспензию обогащенную митохонд-

риями.

В работе использовали 7 морфологических маркерных признаков, генетика которых была изучена ранее б работах ряда исследователей duras, Stoenescu. 1982; Демурин, Толмачев 1986; Боровкова и др. 1991).

Для проверки статистических гипотез о соответствии фактических расщеплений теоретически ожидаемым использовали критериЯ, частоту рекомбинации оценивали методом максимального правдоподобия.

ЭКСПЕРИМЕНТАЖ1ЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 . Генетика восьми изоферментных систем подсолнечника.

Алксгольдегидрогеназа (АДГ). Б семенах подсолнечника спектр- изоферментов АДГ представлен тремя зонами ферментативной активности (ADH 1, ADH 2, ADH 3) (рис. 1). При анализе, большого числа различных образцов иэ коллекции ВИР и ВЙШШК, отмечено, что такой тип спектра является наиболее характерным. Только у образца СФ 1 (с ЦМС от И. rigidus) на спектре в зонах ADH 1 и ADH 3 вместо одной полосы с очень малой частотой наблюдали три (рис. 1).

При самоопылении и скрещивании растений с однополосыми спектрами в i (фенотип IFF) и 3 (3SS) зонах, в потомстве тип спектра сохранялся, что свидетельствола о гомозигстности исследуемых растений по генам, контролирующим эти зоны. При опылении растений с трехполосым спектром в зоне i (фенотип 1FS) пыльцой растений с однололосым спектром (фенотип IFF) в потомстве наблюдали расщепление на 2 фенотигшческих класса в соотношении 67:7Î (табл. 1).Полученное соотношение согласуется с теоретически ожидаемым I : I при моногенном наследовании признака. Это позволяет сделать вывод 6 том, что изофер-менты зоны ADH 1 контролируются двумя аллелями одного локу-са, обозначенного как. Adh 1 . Наличие трехпояосого спектра у гетерозигот подтверждает димерную структуру фермента АДГ подсолнечника. Аналогичные результаты получены б работах Торреса (Torres, 1983).

Изоферменты, выявленные в зоне ADH 2 представляет собой межлокусные гетеродимеры. Однако." при изучении различных об-k разцов, кроме основных изоферментов в зоне АР H 2 выявлены дополнительные фракции, генетическая природа коп-рых оста; г-

ся пока не' ясной. В то же время эти фракции являлись достаточно стабильным для ряда образцов признаком, по которому они различались между собой (рис. 1 и)>.

Отмечен ряд случаев, когда подвижность, изоферментов контролируемых аллелем Лей 1-Г менялась, и этот признак характеризовал некоторые образны (рис. 1(е>). Тест на множественный аллелизм не подтвердился. Такое разнообразие может детерминироваться модификатором, изменявшим подвижность изоферментов, определяемых генсм Айп 1 .

Были найлены различия между образцами по относительной интенсивности основных изоферментов, кодируемых локусами АсИ* 1 и АоЬ 2. Это состояние" также стабильно поддерживалось внутри линий (рисЛ Сж.з)). Это может свидетельствовать о наличии факторов, регулирующих относительную экспрессию генов А<ЗЪ 1 и АсЗЪ 2.

В коллекции ВИР был обнаружен образец К 2299 с гетерозиготным типом спектра в зоне АБН 1 (рисЛ (г)). Однако при самоопылении расщепления по лежу су Асй 1 не наблюдали, .все семена имели гетерозиготный тйп спектра. . При скрещивании этого образца с линиями имеющими обычный тип спектра, у гибридов был фенотип К 2299. В потомстве Г2 наблюдали расщепление несущественно отличающееся от соотношения 3:1 (табл. 1). В данном случае изоферменты АДГ в семенах образца К 2299 можно определить как доминантный признак. Было сделано предположение, что у образца К 2299 по локусу Асй 1 выявлен такой феномен, как фиксированная гетерозиготность.

Малатдегидрогеназа (МДГ). На электрсфореограмме МДГ подсолнечника представлена четырьмя зонами ферментативной активности (МЛН 1, МОН 2, МОИ 3, МВН 4)(рис. 2). При изучении коллекции ВИР и ВНИИМК был обнаружен полиморфизм в зонах КОН 2 и МБН 3.

В зоне МБН 2 обнаружено три типа спектров: два трехголосых и один однополосый. Трехполосые фенотипы отличались между собой интенсивностью фракций. Однополосый фенотип был

обозначен как 2РГ; тре.чполосый, с более интенсивными медленной и промежуточной фракциями, как 2ЭЗ и трехполосый с более .'.-тепоивными быстрой и промежуточной фракциями как 2ГЗ. При ••••рриивании образцов $»нотипа с фенотипом 258 в Г1 получали третий тип спектра в наблюдали расщепление на 3

фенотипических класса в соотношении близком к 1:2:1. В анализирующем скрещивании расщепление было близко к соотношению 1 :1 (табл. i).

Таким образом, гибридологический анализ показал, что фенотипы в виде трех типов спектров, выявленных во .2 зоне активности МДГ, контролируются двумя аллелями одного локуса, обозначенного как Mäh 2. а аллельные варианты его - как Mdh 2-F и Mdh 2-S. Аналогичная интерпретация спектра МДГ этой зоны была и в работе Кахлера и Лэя (Kahler, Lay, 1985).

Наличие трехполосого фенотипа у гомозигот (Mdh 2-S/ Mdh 2-S) объясняется наличием в зоне 2 продуктов двух генов, способных к образованию межлокусных гетеродимеров.

Свободная ассоциация субъединиц кодируемых разными генами, указывает на одинаковую субклеточную локализацию изо-ферментов. Обогащенную митохондриями суспензию из 5-7 дневных проростков подсолнечника анализировали в сравнении с обычным гомогенатом из сухих семян. На спектре митохоид-риальная фракция была представлена только 2 зоной ферментативной активности МДГ. Это подтверждает предположение об общей субклеточной локализации изоферментов, контролируемых лонусом Mdh 2 и локусом обозначенным как Mdh 3.

Нами изучался механизм наследования изоферментов зоны MDH 3. При изучении коллекции образцов подсолнечника было выявлено, по крайней мере, четыре типа спектра, причем каж-■ дый вариант .представлен не менее, чем тремя или четырьмя фракциями. Кроме того, типы спектров различались относительной интенсивностью полос. При самоопылении различных форм с трехполосыми фенотипами в потомстве расщепления не наблюдали. Было предположено, что изоферменты этой зоны наследуются устойчивым блоком множественных молекулярных форм фермента (рис. 2).

Для изучения генетического контроля изоферментов зоны MDH 3 скрещивали растения с разными фенотипами. У гибридов Fi на эимограмме выявлен спектр, состоящий из четырех фракций, а в F, обнаружено расщеплениеблизкое к соотношению 1:2:1 (табл. 1).

На основании результатов гибридологического аналнза сделан вывод о том, что изоферменты зоны MDH 3 контролируются локусом, обозначенным как Mdh 4, и имеющим-три аллеля:

Mdh 4hS, Mdh 4-F, Mdh 4-vF.

6-фосфоглсконатдегидрогеназа (6-ФГД). Три зоны ферментативной активности выявлено на зймограммах 6-ФГД подсолнечника (рис. 3). При анализе коллекции пояийорфйзй, 'предстай-" ленный тремя изоферментными фенотипами, был выявлен только в зоне PGD 1.. Два фенотипа имели по одному изоферменту (1FF и 1SS) и один фенотип был трехполосый (1FS).

Для изучения генетического контроля изоферментов зоны PGD i скрещивали формы, контрастные по подвижности изоферментов . У гибридов выявлены трехполосые типы- спектров. В потомстве F, этих гибридов наблюдали расщепление 65;112:65, , которое соответствовало теоретически ожидаемому .1 :2:1 при моногенном наследовании (табл. 10.

Таким образом, определено, что изоферме'нты 6-ФГД, выявленные в 1 зоне, контролируются локусом, обозначенный как Pgd 1 и имеющим Два аллеля - Pgd 1-F и Pgd 1 -S. Трехполосый фенотип у гетероэигот Подтверждает дймерйу» природу 6-ФГД.

Изоцитратдегидрогеназа (ИДГ). На зимограмме ИДГ подсолнечника представлена двумя зонами ферментативной • активности (рис. 1). Полиморфизм в зоне IDH 1 не был обнаружен. ' В зоне IDH 2 при изучении коллекции образцов выявлены три типа изо-ферментных спектров, два однополосых (2FF и 2SS) и один трех полосый (2FS).

Для изучения генетического контроля изоферментов зоны IDH 2 скрещивали формы контрастные по подвижности изоферментов. Гибриды имели трехполосый фенотип (2FS). В потомстве Fj получили расщепление 67:120:60 соответствующее теоретически ожидаемому соотношению 1:2:1 при Моногенном наследовании (табл. 1 ). .

Проведенный гибридологический анализ показал, что' йзо-ферментны зоны IDH 2 контролируются локусом,обозначенным как Idh 2 и имеющим, По крайней йере,. два аллельных варианта. Трехполосый гибридный фенотип подтверждает димерную природу фермента.

Глутаматдегидрогенаэа (ГДГ). Изоферменты ГДГ подсолнечника* на спектре представлены одной зоной (GDH 1)(рис. 5). При изучении коллекции образцов выявлено три фенотипических класса изоферментов: два однополосых (1FF и 1SS), незначи-

АБН 3 АШ! 2

АБН 1

Асй 1: ГГ ГБ ГГ ) генотипы

АсЗЬ 2: ББ БЭ ГБ БЭ

абвгдежз Рис. 1. Типы изоферментных спектров алкогольдегидроге-назы подсолнечника.

О

ЮН 4 МЛН 3

ЮН 2

ЮН 1

МсЗЬ 2: ЙБ ЭЭ ГГ ГЗ гено-МсЬ 4: РР 7рур ЗБ уРБ тип Рис. 2. Типы спектров малатдегид-рогеназы подсолнечника.

О

РОТЗ РСЮ2

РОТ

Рва 1: ГГ ЗБ ГБ генотип

Рис. 3. Типы спектров 6-фосфоглвконатдегидро-геназы подсолнечника.

О

Ш 2 ЮН 1

1с1Ь 2: ГГ ББ РЗ генотип

Рис. 4. Типы изоферментных спектров изоцитратдегидро-геназы подсолнечника.

О

сы

ОТИ

(ИЬ 1: РР ББ ГЗ генотип

Рис. 5.Типы изоферментных спектров глутаматдегидро-геназы подсолнечника.

+

тельно различающихся электрофоретической подвижностью иэоферментов, и один тип спектра, представлен в виде широкой полосы (1FS), которая занимает промежуточное положение.

Для изучения генетического контроля иэоферментов ГДГ скрещивали растения имеющих разные типы спектров. При скрещивании образцов с контрастными по подвижности иэоферментов фенотипами в гибридах F, выявляли спектр в виде широкой полосы. В F, ращепление было 178:330:177, что соответствовало теоретически ожидаемому соотношению 1:2:1 при моногенном наследовании (табл. 1).

Результаты гибридологического анализа показали, что ГДГ подсолнечника, контролируется одним локусом, обозначенным как Gdh 1, и имеющим, по крайней, мере, два аллеля.

ГДГ по своей структуре является гексамером у большинства видов растений (Сухаржевская, 1980; Левитес, Î986). В нашем случае, вероятнее всего, гетерозиготы Gdh 1-FS на спектре представлены семью полосами, но в силу незначительного различия в электрофоретической подвижности иэоферментов четкого семиполосого спектра не удается получить. .

Глюкозофосфатизсмераза (ГФИ). На спектре ГФИ подсолнечника представлена двумя зонами активнобти фермента. Однако, зона GPI 2 не всегда выявляется на спектре и полиморфизм в ней не был обнаружен. В зоне GPI 1 'обнаружено три четких типа спектров (рис. 6): два однополосых (1FF и 1SS) и один трехполосый (1FS).

Для изучения генетического контроля иэоферментов i зоны были прведены скрещивания между формами подсолнечника, имею-щихразные фенотипы ГФИ.

При скрещивании контрастных по подвижности иэоферментов форм в Ft выявлен трехполосый тип спектра. В F, наблюдали расщепление в соотношении, близком к 1:2:1. В анализирующем скрещивании получено расщепление на два фототипических класса, в соотношении близком к 1:1 (табл. i).

Проведенный гибридологический анализ показал, что изо-ферменты зоны GPI 1 контролируются локусом, который обозначен как Gpi 1, и имеет, по крайней мере, два аллеля. Трехполосый фенотип у гетерозигот подтверждает димерную структуру фермента.

Аконитаэа (АКО). В сухих семенах подсолнечника АКО не имеет активности. Для анализа семена проращивали в течении 2-д. суток. На эимограмме аконитаэа чаще представлена одной зоной ACO { (рис.7). Зона ACO 2 выявлялась не всегда и нами не изучалась. В зоне ACO Í выявлено три типа спектров; ■ два , двухполосых (1SS и ÍFS) и один однополосый (IFF). Двухполо-сые спектры между собой различались относительной интенсивностью фракций.

При скрещивании образцов с однополосым фенотипом (IFF) с образцом с двухполосым фенотипом (ÍSS), у которого более медленная фракция была более интенсивная, в гибриде Ft выявляли другой двухполосый фейотип, у которого болеё интенсивной была более быстрая фракция. В Fa получили расщепление 39:82:41 соответствующее теоретически ожидаемому соотношению 1:2:1 при моногенном наследований (табл. 1).

Результаты гибридологического анализа показывают, что изоферменты зоны ACO Í контролируются локусом, который обозначен как Acq í и имеет два аллельных варианта Acq 1-FF и Acó Í-SS. Наличие в фенотипе гомозигот Acó Í-SS двух фракций можно объяснить присутствием в этой зоне продуктов еще одного локуса. Двухполосый тип спектра у гетерозигот подтверждает мономерную структуру фермента.

Эстераза ОСТ). Активность фермента эстеразы подсолнечника на эимограмме представлена двумя зонами (рис.8), причем зона EST 1 выявляется при анализе сухих семян, зона EST 2 имеет активность в зеленых тканях. Полиморфизм был обнаружен в обеих зонах. Нами исследовалась только {зона, в которой выявлено шесть фенсйипйческйх классов изоферментов, три од-нополосых .и три двухполосых. •

При скрещивании форм, контрастных по подвижности изоферментов, у гибридов р4 на спектре выявляла три типа двухполосых спектров. В F, в каждом случае .получали расщепление на три фенотипических класса в соотношении близком к 1:2:1. В анализирующих скрещиваниях расщепление было на два класса в соотношении йяизкоц к 1:1 (табл. 1 У.

Полученные результаты указывают на то, что изоферменты эстеразы, выявляемые электрофоретическим анализом сухих семян подсолнечника, контролируются одним локусом, обозначении

— GPI 2

GPI 1

0

Gpi 1: FF SS FS генотип

Рис. 6. Типы изоферментных спектровглюкозофосфатйзо-мераэы подсолнечника.

О

АСО 2 АСО 1

Асо 1: FF SS FS генотип

Рис. 7. Типы изоферментных спектров аконитаэы подсолнечника.

EST '2 EST 1

Est 1: SS FF vFvF FS vFS vFF генотипы Рис. 8. Типы изоферментных спектров зстеразы подсолнечника.

как Est 1. Который имеет, по крайней' мере, три аллеля: Est 1-S, Est 1 -F, Est 1-vF.

Двухполосый тип спектра у гетерозигот подтверждает мономерную структуру фермента. Однако, в ряде случаев, на спектре гомозиготы имели двухполосый фенотип, а гетерозиготы - четырехполосый. Появление дополнительных фракций» можно объяснить разным разрешением белков при прохождении электрофореза. Поэтому для правильной интерпретации спектров необходимо всегда иметь контроль, образец с известным генотипом.

Таблица 1

Наследование изоферментов подсолнечников

До «¿у с '1'иП скрещивания Ожидаемое соотношение Наблюдаемое расщепление V P

Adh 1 FS X FS . 1:1 67:71 0,12 0,73

F(FS)xF(FS) 1:3 16:61 0.73. 0.39

Mäh 2 FS X FS 1:2:1 162:344:189 2,17 0,34

FF X FS 1:1 11:12 0,04 0.84

FS X FF 1:1 8:10 0,22 0,64

FS X SS 1:1 5:6 0,10 0,75

Mdh 4 FS X FS 1:2:1 4:7:4 0,07 0,97

vFS X vFS 1:2:1 52:120:59 0,77 0.68

6Pgd 1 FS X FS 1:2:1 65:112:65 1,33 0,51

Idh 2 FS X FS 1:2:1 67:120:68 0,89 0.64

Gdh 1 FS X FS 1:2:1 178:330:177 0,92 0,63

Gpi 1 FS X FS 1:2:1 133:247:128 0,48 0,79

SS X FS . 1:1 33:32 0,02 0.89

Aco 1 FS X FS 1:2:1 39:82:41 0,08 0,96

Est 1 FS X FS 1:2:1 • 270: 491:283 ' 4,00 0,14

FS X FF 1:1 29:27 0,08 0,78

FS X SS 1:1 64:78 1.38 0.24

SS X FS 1:1 64:55 0,68 0,41

vFS X vFS 1:2:1 ' 97:168:90 1,30 0,52

vFF X vFF 1:2:1 28:73:34 1 .43 0.49

2. Анализ сцепления изоферментных и морфологических маркерных локусов подсолнечника ' Для выяснения вопроса о сцеплении между локусами, контролирующими изоферменты, а также для оценки сцеплёния этих локусов с локусами, контролирующими морфологические маркерные признаки у подсолнечника, были подобраны и скрещены линии, контрастные по двум и более признакам.

Гибриды ?! были проверены на гибридность по изофермент-ным маркерам.

Оценку частоты рекомбинации между локусами проводили по данным расщепления в анализирующих скрещиваниях и Г,. Предварительно вычисляли статистику хг, характеризующую отклонение фактически наблюдаемых численностей фенотипических классов от теоретически ожидаемых при независимом наследований. Оценку частоты рекомбинации вычисляли по формула», максимального правдоподобия.

Нами анализировалось 10 двухлокусных комбинаций изоферментных генов (табл. 2) и 12 двухлокусных комбинаций, где

Анализ сцепления

Таблица 2

локусов, контролирующих иэоферментьг у подсолнечника

Пары локусов Тип скрещивания Размер выборки Р ----1

Ее! 1-Ср1 1 к 168 1,18 1,18 7,07 0,13

48 2,08 0,08 3,00 0,08

Ез1 1 -Асаь 1 ВС 154 3,74 1,27 0,93 0,39

Еэ1 1-ИЬ 2 94 0,04 5,97 2,23 0,74

Еэг 1 -4x111 1 235 2,97 1.61 3,95 0,41

МйЬ 1 г! 427 3,70 0,86 1,44 0,84

ВС 48 0,75 4,08 0,33 0.59

Мс111 2Ч;р1 1 МсЙ1 2-Асо 1 г, 135 1,13 1,49 5 67 0,23

р» 94 0,87 3,26 2,17 0,71

МсШ 4-Ез1 1 г* 128 0,06 1,55 3,98 0,41

-1 ^ 1 г? 54 . 1 V ^ 3,67 0.45

йр! 1-Дсо > ЧЬ ¡■1,80 2.98 ! ..... 1 .49 0.83

анализировали совместное наследование генов, контролирующих изоферменты и морфологические маркерные признаки (табл. 3).

Таблица 3

Анализ сцепления между генами, контролирующими морфологические маркерные признаки, и изоферментными локусамя в Г, у подсолнечника

Г.-!: -

,'. О.л К

Г-Г:.- 1 ' ГО

!--">;! г

7-К:-,; ;

Ук-Кв' ' \ гХ;

'7<-. -0; •: '

Е--Г?;- 1 ¿2

1

Р-ЕйТ. 1 СО

Р-0р1 1 59 Г"7

« г = и,¿8 *» df "= 2 »»» бГ = 4

— - |

7, 07.; б'.гз

0, 7г { л

0: ! 3 ' '70

с -и . 2",

0. (¡2 0.25

0.\:2 1 ,1 0

о, ¿0 1 , ¿и

3,53 3,58

/л л с 4 ЛЛ

'7 , ' . ;. ?

и, иь

с1. - р 1

! 32 Г. Г'-'

: 5 0.9.7

о С, 99

0 42 0,-3

1 С',

07 0,65

! : 7! 0, 70

0 1о 0.34

2 14 0,34

1: СО С '

■ ■ - - о', 5?

I ^илгапе.- г- дд^ лип.^ V-им

^шгголфпаиил ий ГТГЛИЧа —

ОбНЙру-

'Л у •• Нсаепяеия® по • п ионало охидаемо-

цу, но гипотеэа о независимом их наследовании отвергалась приуровне эначтаости 0,004. и. частота рекомбинации была 0,28 ± 0,06.

3. Биохимическая идентификация образцов и линий подсолнечника

Результаты изучения изоферментного состава 29 образцов и линий генетической коллекции ВИР и 14 образцов и линий Генетической коллекции ВНИИМК представлены в таблицах 4 и 5.

Определяли однородность и гетерогенность образцов. Каждому образцу по его изоферментному спектру присваивали соот-ветствувдий фенотип.

Таблица 4

Характеристика образцов подсолнечника коллекции ВИР ; по изоферментным маркерам

ш/ш Номер Изоферменты

ТТЛ клмг

*т/ 39 ии Ка1аЛиГУ | ЮН

ш ЕБТ юн РИЗ (ЗРГ Ш А00

Т" 1933 УР(УШ р Р Р Б Б РБ

г 2226 Б г Б Р Р Р Р»

3 , 2227 .га ЕБ Б(РБ) Р. РБ Б РБ

4 2299 Б Б Б Б Р Р

5 2301 Е Б(РБ) Р Р : Б Р —

6 2310 р . Г Р Т Б Б Б

7 . 2394 Б Б Б Р Б Р Б

8 2397 Б Б Р Р . Б. Б Р .

9 2398 . Б Б Б Р Б Р. Р •

10 2399 Б(РБ) Б Б Р Б Б Р

И 2402 • Е: Б Р Р — Т РБ

12 2425 уЕ(УРБ, ■ «кг* Р(ЕБ> ■ Б РБ — Б ТБ

13 2495 . VI111 / Т . Б Б , Б Р — Е

14 2499 РБ Р(РБ Б(РБ) Р — Р Р

15 2511 . РБ ТБ • РБ Т РБ — Р(РБ)

1& 2522 Б Б Б Б Б Б Б

17 2530 Е Б £ Р Р Б Б

18 2536 Г Г Г Р • —. Г Б

19 2592 • ЕБ Б • Б Р — . Р —

20 ' 2593 Г. Р(РБ) Б РБ — Р(РБ) —

21 . 2632 Е(РБ) Т Б Р — — Б(РБ)

22 2636 Р(РБ> Р(РБ) Б • р(ге> — - • РБ

23 2783 . УРР . Р(РБ Б Р(РБ) РБ Г Б(га>

24 2786 Б Б Р Р Б т.

25 2788 ' ■ Б .Б Б Р Б .Г" Б

26 2792 Р Б • Р Б т Б

27 3050 . Б(УРБ) . РБ Б Б — . ■ — Р

28 3105 - РБ Б(РБ) Р(РБ) Р(РБ) - . Р(РБ) Б(РБ)

29 3107 ..га РБ РБ Р — Б(РБ)

Из 29 исследованных образцов подсолнечника коллекции ВИР 12 являются однородными (все семена выборки были гомозиготными по изучаемым ферментым _маркерам)._ остальные были гетерох'енны хотя бы по одному из признаков (табл, 4).

С учетом этой гетерогенности 29 образцов по 7 ферментным локусам были разделены на 27 групп, различающихся между собой. И только между образцами К 2788 и К 2394. а также ' К 2397 и К 2786 различий не было. И тем не менее, в данной изученной коллекции образцов уже наблюдается высокий процент уникальности (93%).

В тоже время, для полной идентификации 14 линий и образцов генетической коллекции ВНШМХ было достаточно всего пяти изоферментных маркерных локусов (с учетом гетерогенности у некоторых образцов)(табл. 5).

' Таблица 5

Характеристика линий и образцов подсолнечника генетической коллекции ВНИИМК по изоферментным маркерам

Изофермента Название линий и образцов

ЕБТ ЮН РШ (ЗР1 АСО

Б 3 Б Р Р Сл 2349

Сл 2371

Р(РБ) ' Э Р с 424927

Г 5 Э Р Б ЛГ 9

ЭСРЗ) 1 207

РЗ Р Р ■ 23-2-3-5

З(РЗ) с* о Г ■ Г 23-2-5 '

Р г р р Л 2094-13

Б Б г 12БН 47

Г (КЗ) Р(РЗ) ? БСГБ) Д 359

р ¥ Р Сл 2950

Б К 562

V 5(РЗ) 15-2-1

РЗ Г ? Р (ГБ) К 1933

Таблица 6

Характеристика инбредных линий подсолнечника селекции ГНИИМК по изоферментам

Изоферменты Линии подсолнечника

EST MDH PGD GPI GDH IDH ACO

F s S BK 57

S F F BK 458

S F • S S BK 373 BK 465

S F F S . s s К 1607

S S s s BK 470

F S S F s F BK 65 . BK 490

F F" F F BK 160

S s BK 460 э BK 511

S F S F BK 135/1 BK 359

S F S BK 152

F F . s S BK 119

S S F S BK 462

F F S S S BK 64 BK 369

F bk m

F S F S S S К 575

F F F S ' S BK 429

S # S F S s S BK ¿"9

vF F F F s S F ' EK 435

S F s Г» О F К 1721

Биохимическая паспортизация линий и гибридов предполагает знание их генотипов по максимально возможному числу

;-ер;,-:ен;л-л:х локуслв. ~Ъ нм.лм рологг еылс изучено 24 инбредные :П'лчнечника jv.'ürüüi 5K.22.Si. Д;;л биохимической пас-

■ -р; L' '-.ччеств- w; г -ров и ■п^ль^^вали ¡.'зсфермеягы 7

M":i . 0-.SK Oi'oi'fM ПО-'''i ?

■Пл р«тим 7 маркерам ?=- якчик быт: распределены в 19

-Lyn;; П.-'.гг- I рупп и.лолл о У л. i.'.« ü и с одинаковыми генотипами ¡.о 7 .¡оофермен^нмм лилуопм. Уникальность исследованных линий Унелл н-гл-о -¡ис.-:-; ло-аользу-'/кх маг керны;; локу-■■ г ь-..зг«ч «о, лог;ьо,л;т р.-лллль Mi-кду ooioi! л вое чикии. Данные биохимической паспортизации .можно использовать

и ию Ulicnn-c l-fHfl-lrfUMCKIIM ЧИ'*Т1ТИ лиич» лпполопаиист

: иориднос-|-й у гибридов, для установления как уникальности, так и идентичности создаваемых форм подсолнечника.

ВЫВОДЫ

1. Изучены восемь изоферментных систем подсолнечника на материале генетических коллекций ВИР и BHffliMK. По всем восьми системам обнаружен полиморфизм и изучено наследование

ййс-у^рме.чтов.

Г. Дл-! гло-фе; '!<-,.: л.-c«evw* ллутамалл^гвдгогеназы, л:' яитаг-ь. и ллн третвг-н лолл р^рдонтатикнеЯ активности ма~ "vro.t г : пр^ло'^'-г'чъ: ос-"л о-ннул г-лдели генетического

L ■:'.!': рол-;

'? Hji!;;i:Hii ocooo;ih:-.:;;: h спектрах иао^ерментов алко-: "льлллллрлгеназы, ;,лл;агдегилрегемазы, ветераны ранее нео-ллллноле spyriwu ».«•.-.»г.^атеячки и именья» значение для ин~ i epnpe'i ¿дин ктрсв.

4. Определено независимое наследование между изофер-h :•!!.-:>•:! «га з Ю-гк тауч^нлнх двухлокускых

" -м-",!;) -0Ü--';

5. Изучено сцепление между изоферментными локусами и генами контролирующими морфологические маркерные признаки в 12-ТИ ввухлокугяих M-iHfHwwwev ftionpapp» ("¡НПО НЭЙД9Н0 «^ЖДУ

■ ■ • !. • ■';_,■>■■;;-• , ч :,■ -"-тло~?чоп ;! окраски яэычко-

. л , :: ;v____: jj^-¿.¿йы !;, частота реком-

,■.'■': ■; ■ : ; л - -онным комбинациям

генов определено независимое наследование.

6. Проведена биохимическая классификация 63 образцов и линий подсолнечника из коллекций ВИР и ВНИИМК. Процент уникальности по 7 изоферментным маркерам для 29 образцов ВИР составил 93; для 1-4 образцов ген-коллекции ВНИИМК - 100;. для 24 инбредннх линий селекции ВНИИМК -79.

Предложения.для практического использования результатов

Результаты наших исследований могут быть использованы в различных генетико-селекционных и семеноводческих программах. Для оценки генетической чистоты инбредных линий и определения уровня гибридности коммерческих партий семян гибридов подсолнечника по изоферментным маркерам. Для ускорения получения инбредных линий, путем оценки и отбора семян по максимальной гомозиготности локусов . контролирующих изофер-менты. Для биохимической классификации образцов и линий генетических коллекций подсолнечника.-

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ' ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ • 1. Лоскутов A.B., Боровкова И.Г. Возможность использования изоферментов в селекции подсолнечника//Тез. докл.а Краевой научн. тех. конф. мол. ученых. - Краснодар, 1988. -С. 40-41.

2. Лоскутов А.В., Боровкова И. Г., Боровков А.Ю. Генетический анализ изоферментных вариантов у подсолнечника //Бюл. НТИ ВНИИМК. - Краснодар. 1988. - Вып. 4(103) - С. 22-29.

3. Лоскутов A.B., -Боровкова И.Г.. Боровков А.Ю. Генетика изоферментов подсолнечника Helianthus annuus L. Анализ наследования и сцепления трех ферментных локусов подсолнечника/ /Генетика.- М., 1990. - Т.26., № 11. - С. 2079-2082.

. 4. Боровкова И.Г., Лоскутов A.B., Мачулина Л.В., Боровков А.Ю. Использование белков и изоферментов для идентификации сортов и линий подсолнечника//Тез. докл. 7 Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов".-М. ,1990. - С. .129!

5. Лоскутов A.B., Толмачев В.В. Генетический анализ 6 изоферментных локусов подсолнечника и перспектива использования их в генетике и селекции//Теэ. докл. Республиканской конференции "Методы интенсификации селекционного процесса".-Одесса, 1990.- С. 62-63.

6. Лоскутов А.В., Боровкова И.Г. Идентификация линий

подсолнечника с помощью изоферментов//Бюл.НТИ ВНИИМК.- Краснодар,1990. -Вып. 4(111). - С. 17-18. .

"" 7"—Losl:utov A.V Polymorphism of "sunflower "proteins and isoenzymes =nid its using for line and variety identification //Thesis of repots 5 International youth school-conference on genetics - Albena, 1990.

8. Боровкова И.Г., Лоскутов А.В., Толмачев В.В. Анализ наследования и сцеплеты лс-кусов, кодирующих морфологические признаки и изоферменты у подсолнечника Helianthus annuus L./ Генетика. - М. ,1991 .- Т.27. Л 10. - С. 1773-1780.

9. Акисимова И Н , лоскутов А.В., Боровкова И.Г Идентификация линий подсолнечника методами электрофореза гелиан-тинина и изоферментов//Доклады ВАСХНИЛ.' - М.. 1991. - Л 6. -С. 12-15.

10. Боровкова И.Г.. Лоскутов А. В. Изоферменты-маркеры генов//В кн.: Биология, селекция и возделывание подсолнечника. - М. .1992. - С. 61-64.

< у . i ■'"