Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетика изоферментов в селекции гибридного подсолнечника

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетика изоферментов в селекции гибридного подсолнечника"

¡Ш - 8 МАЙ 1995

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАСТЕНИЕВОДСТВА ИМЕНИ Н. И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи

ТУРКАВ Сайда Заурбиевна

УДК 633. 854:577.15:575:631:32

ГЕНЕТИКА ИЗОФЕРМЕНТОВ В СЕЛЕКЦИИ ГИБРИДНОГО ПОДСОЛНЕЧНИКА

Специальность: 03.00.15 — генеть а

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ, 1995.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте масличных культур им. В. С. Пус-товойта в 1991—1994 гг.

Научный руководитель — кандидат биологических наук, старшин научный сотрудник Бочкарев Н. И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Фадеева Т. С., кандидат биологических наук Аннспмова И. Н.

Ведущее учреждение — Кубанский государственный университет, г. Краснодар.

Защита состоится __ 1995 г.

в часов па заседании , диссертационного совета

К 020.18.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н. И. Вавилова по адресу: 190000, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н. И. Вавилова.

Автореферат разослан «____»___ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е. В, Мажоров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В целях совершенствования методов селекции новых, высокопродуктивных гибридов подсолнечника необходимы эффективные методы генетического анализа исходного материала, позволяющие целенаправленно формировать селекционно ценные признаки в линиях и гибридах. Одной из основных задач гибридного семеноводства подсолнечника является поддержание высокого уровня генетической чистоты в процессе репродуцирования.

В генетике и селекционной практике очень важными для этих целей являются генетические маркеры. До недавнего времени в практике использовали морфологические маркерные признаки. Однако морфологические маркеры обладают рядом недостатков. Возможность их использования ограничена временем и четкостью генетического проявления, часто имеет место доминирование одного из родительских аллелей над другим п поэтому идентифицировать гетерозиготный фенотип практически невозможно.

Преимущество в применении биохимических маркеров, в особенности изоферментов, заключается в том, что они в меньшей степени подвержены средовой изменчивости и имеют кодоминантный тип наследования, что позволяет оценить гомо- и гетерозиготность растения. Метод электрофореза изоферментов — экспрессный и позволяет анализировать одновременно большое количество материала.

Изоферменты в настоящее время широко применяются в енстнческих и селекционных исследованиях. На подсолнечнике в последние годы зарубежными и российскими авторами выполнен ряд работ по изучению наследования изоферментов I решения с их помощью селекционно-генетических задач. Но число изученных изоферментных систем невелико и ана-1из изоферментных спектров еще недостаточно применяется 1ля повышения эффективности селекционно-семеноводческо-о процесса у гибридного подсолнечника. Поэтому изучеиие ■енетики изоферментов с целью увеличения количества био-:имических маркеров и их использование в селекции и семено-юдстве гибридного подсолнечника является актуальным.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явилось изучение генетики изоферментных систем подсолнечника для решения селекционно-семеноводческих проблем. Для ее достижения нужно было решить следующие задачи:

— изучить полиморфизм и генетический контроль изоферментных систем у культурного подсолнечника и его дикорастущих видов;

— провести тест на сцепление между изоферментными локусами и генами, контролирующими селекционно ценные признаки;

— провести биохимическую идентификацию инбредных линий, гибридов и коллекционных образцов подсолнечника;

— оценить генетическую чистоту родительских линий и гибридов подсолнечника с помощью анализа изоферментов.

Научная новизна работы.

1. Изучен полиморфизм трех изоферментных зон подсолнечника MDH 4, PGM 4, АСР Ь в коллекциях линий и образцов ВИР и вниимк.

2. Описан механизм наследования изоферментов, контролируемых локусом Mdh 5.

3. Проведен тест на сцепление между парами изоферментных локусов: Est 1-Mdh 5; Est 1-Pgd 1; Est 1-Pgm 4; Mdh 2-Gdh 1; Mdh 2-Acp 1; Mdh 2-Mdh 5; Gpi 1-Acp 1; Pgd 1-Mdh 2; Pgd 1-Mdh 5; Pgd 1-Mdh 5; Pgd 1-Gdh 1; Gdh 1-Acp 1; Gdh 1-Mdh 5; Pgm 1-Gdh 1; Pgm 4-Mdh 5, установлено сцепление между локусами Gpi 1-Mdh 5.

4. Проведен анализ сцепления между генами, кодирующи-■ ми изоферменты, и генами, контролирующими селекционно

ценные признаки.

5. Проведена биохимическая идентификация 130 образцов, линий и гибридов культурного и дикорастущего подсолнечника коллекций ВИР, ВНИИМК и югославской селекции

6. Обоснован и применен метод оценки генетической чистоты партий семян коммерческих линий и гибридов.

Практическая ценность результатов исследований. Изу ченные изоферментные системы позволяют проводить оценку генетической чистоты линий и гибридов подсолнечника в пе риод уборки семян или вскоре после ее завершения. Это поз воляет проводить выбраковку некачественного семенного ма териала до проведения, традиционного грунтконтроля, то ест1 избежать затрат, связанных с послеуборочной обработкой се мян. Метод анализа изоферментов может быть рекомендова> для идентификации линий и гибридов при их регистрации

о

государственной комиссией по сортоиспытанию. Изофермент-ные локусы с изученным аллельным составом рекомендуются в качестве маркеров для построения, генетической карты подсолнечника. Образцы коллекций культурного н дикорастущего подсолнечника, изученные по изоферменгному составу, являются ценным исходным материалом для селекционно-генетических исследований.

Апробация работы. Основные результаты исследовании были доложены на международной конференции по масличным культурам (Запорожье, Украина, 1994); международном симпозиуме «Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений» (Киев, Украина, 1994).

Публикации. По теме диссертации опубликованы три печатные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех разделов, выводов, рекомендаций, списка литературы и приложения. Включает 21 таблицу, 5 рисунков, 6 приложений. Список использованной литературы содержит 201 наименование, в том числе 158 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на экспериментальной базе ВНИИ масличных культур в 1991—1994 г.

В исследованиях были использоваиы 130 образцов, линий и гибридов культурного и дикорастущего подсолнечника: 10 однолетних и многолетних дикорастущих видов и подвидов рода Helianthus; 30 образцов из мировой коллекции подсолнечника различного таксономического положения (Анащен-ко, 1978) и географического происхождения; 50 инбредных линий коллекции Института растениеводства в г. Нови Сад, Югославия; 21 инбредная линия генетической коллекции ВНИИМК; два российских и три росссийско-американских гибрида, а также один гибрид казахской селекции и его родительские формы.

Работу вели с двумя последовательными генерациями — одной в поле и одной в фитотроне. Принудительное самоопыление и гибридизацию подсолнечника осуществляли общепринятым методом (Гундаев, 1971).

• Электрофоретический анализ изоферментов проводили в крахмальном геле (Левитес, 1986). Использовали три буферам

ные системы: гистидин-цитратную систему рН 5, 7 (Cardy et al, 1981); трис-цитратную рН 7, 8 (Torres, Diedenhofen, 1976) и трис-ЭДТА-боратную рН 8, 6 (модифицированная Портера). Гистохимическое окрашивание зон активности ферментов осуществляли по стандартным методикам (Vallejos, 1983; Леви-тес, 1986).

Изоферменгы и контролирующие их гены обозначали согласно общепринятым правилам (Корочкнн и др., 1977; Леви-тес, 1986).

В работе использовали 7 генов изоферментов и 5 генов селекционно ценных признаков, генетика которых была изучена ранее в работах ряда исследователей (Urie, 1985; Demurin, 1993; Толмачев, 1990; 1992; Лоскутов, 1993).

Математическую обработку результатов расщепления проводили с использованием критерия X2 и оценки частоты рекомбинации (Серебровский. 1970; Гершензон, 1979).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Генетика трех изоферментных систем подсолнечника

Малатдегидрсгеназа (MDH). На зимограммах малатде-гидрогеназы были выявлены 4 зоны ферментативной активности (MDH 1, MDH 2, MDH 3, MDH 4) ( рис. 1.). При изучении коллекций ВИР и ВНИИМК был обнаружен полиморфизм в зонах MDH 2, MDH 3 и MDH 4. Зона MDH 1 представлена двухполосным мономорфным спектром. Генетический контроль II и III зоц был изучен ранее (Kahler, Lay, 1985; Лоскутов, 1993). В зоне MDH 4 мы обнаружили три:фе-нотипических класса: два класса с однополоснымн спектрами, обладающими различной электрофоретической подвижностью, и один с двухполосным или трехполосным спектром (в зависимости от условий электрофореза). Однополосные фенотипы обозначены как: MDH 4-SS — с медленной, MDH 4-FF — с быстрой подвижностью изоферментов. Двух (трех) полосные фенотипы обозначили как MDH 4-FS. Для изучения генетического контроля этой зоны были проведены скрещивания между формами подсолнечника, имеющими разные типы спектров. При скрещивании образцов фенотипа MDH 4-FF с фенотипом MDH 4-SS в Fi получали третий тип спектра MDH 4-FS, в F2 наблюдали расщепление-на три фе-

нотипических класса в соотношении, близком к 1:2:1. В анализирующем скрещивании расщепление было близко к соотношению 1:1 (табл. 1).

Таким образом, гибридологический анализ показал, что изоферменты MDH, выявленные в 4-й зоне ферментативной активности, контролируются локусом, который обозначен нами как Mdh. 5 и имеет, по крайней мере, два кодоминантных аллеля — Mdh 5-S и Mdh 5-F. Наличие двухполосного спектра у гетерознгот на некоторых зимограммах, возможно, возникает в силу того, что при определенных условиях электрофореза различия в электрофоретической подвижности изоферментов этой зоны невелики. Трехполосный гибридный фенотип говорит о димерной природе фермента.

Фосфоглюкомутаза (PGM). В семенах подсолнечника спектр изоферментов PGM представлен четырьмя зонами ферментативной активности (PGM 1, PGM 2, PGM 3, PGM 4) (рис, 2). Полиморфизм по I, II, III зонам не обнаружен. В зоне PGM 4 выявлено три типа изоферментных спектра — один однополосный и два двухполосных. Двухполосные фенотипы отличались между собой интенсивностью фракций. Однополосный фенотип был обозначен как PGM 4-SS; двухполосный с более интенсивным быстромигрирующим компонентом — как PGM 4-FF, и двухполосный с более интенсивным медленным компонентом — как PGM 4-FS.

Для изучения генетического контроля изоферментов IV зоны были проведены скрещивания между формами подсолнечника, имеющими разные фенотипы PGM. Скрещивая формы с фенотипом PGM 4-SS с формами, обладающими фенотипом PGM 4-FF, у гибридов Fi выявили фепогип PGM 4-FS. В F2 наблюдали расщепление в соотношении, близком к 1:2:1 (табл. 1).

Результаты гибридологического анализа показали, что изоферменты зоны PGM 4 контролируются локусом, который обозначен как Pgrn 4 и имеет два аллельных варианта — Pgm 4-S и Pgm 4-F. Двухполосный фенотип гомозиготы Pgm 4-F/Pgm 4-F может быть объяснен наличием в IV зоне PGM продуктов другого локуса. Аналогичная интерпретация спектра PGM этой зоны была и в работе Кахлера и Лэя (Kahler, Lay, 1985). Присутствие двух компонентов у гетерознгот по локусу Pgm 4 подтверждает мономерную структуру фермента.

MDH 4 MDH3 MDH 2

MDH 1

PGM 4

PGM 3 PGM 2 PGM 1

MDH 5: FF SS FS Генотип

Рис. 1. Типы изоферментных спектров малатдегидрогеназы подсолнечника.

Pgm4:

FF

SS

FS Генотип

Рис. 2. Типы изоферментных спектров фосфоглюкомутазы подсолнечника.

Кислая фосфатаза (АСР). На зимограмме кислая фосфа-таза подсолнечника представлена одной зоной .ферментативной активности. Здесь выявлено четыре однополосных варианта, различающихся своей электрофоретической подвижностью. Мы обозначили изоферменты в порядке увеличения электрофоретической подвижности к аноду как АСР ЬБЗ, АСР 1-ВВ, АСР 1-П, АСР 1-РР. Кроме того, были обнаружены, трехполосные спектры, которые в зависимости от сочетания обозначены компонентов как АСР 1-РБ, АСР 1-51, АСР ЬБВ, АСР ЬВИ, АСР 1-В1, АСР МИ (рис. 3).

ACPI

О

АСР 1: SS ВВ II FF FS SI SB BF Bl 1F Генотип

Рис. 3. Типы изоферментных спектров кислой фосфатазы подсолнечника.

Для изучения генетического контроля этой зоны были проведены комбинации скрещиваний подсолнечника с различными типами спектров, исключая форму с фенотипом АСР 1-ВВ, так как растение, обладающее таким типом спектра, при выращивании погибло.

При самоопылении и скрещивании линий с одинаковыми однополосными фенотипами в потомстве во всех, случаях выявляли родительские фенотипы. В скрещиваниях, различающихся по подвижности изоферментных форм, все гибри-

ды имели трехполосный тип спектра. В Иг в каждом случае получали расщепление иа три фенотипических класса в соотношении, близком к 1:2:1 (табл. 1).

Полученные результаты указывают на то, что изофермен-ты АСР 1 контролируются одним локусом Аср 1, который имеет, по крайней мере, четыре кодоминантных аллеля — Асо 1-Б, Аср 1-В, Аср 1-1, Аср ЬИ.

Трехполосный тип спектра у тетерозигот подтверждает ди-мерную структуру АСР.

Таблица 1.

Результаты гибридологического анализа трех изоферментных систем подсолнечника

Краснодар, ВНИИМК. 1992—1994

Локус К с1, 3 о га а с 3 Н 3 1 Выборка Ожидаемое 1 соотношение Фактическое расщеплспие ! Х? | 1 Р

М(1Ь 5 РБХЗБ 25 1:1 11:14 0,36 0,65

РБХРв 87 1:2:1 22:46:16 2,23 0,38

Рйт 4 РЗХРЭ 391 1:2:1 101:192:100 0,20 0,90

Аср 1 РБХРБ 109 1:2:1 20:57:32 2,87 0,24

Р1 ХР1 66 1:2:1 13:35:18 0,99 0,59

2. Тест иа сцепление генов изоферментов и

селекционно ценных признаков подсолнечника

Для выяснения вопроса о сцеплении менаду локусами, контролирующими синтез изоферментов, а также для оценки сцепления этих генов с генами, контролирующими качество масла семян, устойчивость к заразихе расы С и короткосте-бельность подсолнечника, были подобраны и скрещены линии, различающиеся по двум или более признакам. Оценку частоты рекомбинации проводили по данным расщепления в анализирующих скрещиваниях и в потомстве Р2. Отклонения фактически наблюдаемых численностей фенотипических классов от теоретически ожидаемых при независимом наследовании оценивали методом X2. Оценку частоты рекомбинации вычисляли по формулам максимального правдоподобия.

Нами был проведен анализ сцепления между 20 парами изоферментных локусов (табл.2) и 27 двухлокусных комбинаций, где анализировали совместное наследование генов, контролирующих изоферменты и селекционно ценные признаки (табл. 3).

Наследование большинства локусов существенно не отличалось от независимого. Только в одном случае было обнаружено тесное сцепление для одной пары локусов Ор1 1 — МсШ 5. Расщепление по обоим генам этой комбинации хорошо соответствовало ожидаемому, но гипотеза о независимом их наследовании отвергалась, частота рекомбинации составила 0,09±0,02.

3. Характеристика образцов, линий и гибридов культурного и дикорастущего подсолнечника по изоферментным маркерам

Для биохимической идентификации определяли однородность и гетерогенность образцов. Каждому образцу по его изоферментному спектру присваивали соответствующий фенотип.

Для оценки полиморфизма у некоторых дикорастущих видов нами было изучено 10 однолетних и 10 многолетних дикорастущих видов и подвидов рода НеНапШиэ. Анализ проводили по восьми зонам семи изоферментных систем. Изученные образцы отличались полиморфизмом. Обнаружены редкие аллозимы у некоторых образцов по четырем системам: МЭН, ОР1, РОЭ, АБН, которые могут служить эффективными генетическими маркерами при скрещиваниях с культурным подсолнечником.

30 исследованных образцов подсолнечника коллекции ВИР, изученных по 9 изоферментным системам, оказались гетерогенными по большинству признакам. Обнаружены редкие ал-лозимные варианты, практически не встречающиеся у районированных сортов и гибридов по АБН (К 2132, К 2146, К 2138, К 2203, К 3094, К 3096, К 3168), ААТ (К 1639, К 3096, К 3191), (К 1899, К 2025, К 3131, К 3191, К 3228 (2). Все изученные образцы коллекции. ВИР с учетом гетерогенности отличаются друг от друга по изоферментным маркерам (табл. 4).

Таблица 2.

Значения X2 и частоты рекомбинации при анализе сцепления докусов, контролирующих изоферменты подсолнечника

Краснодар, ВНИИМК, 1992—1994

Пара локусов

Х>1

Рь

г±5Е

ЕэИ-МсШб Р2 1 85 0,69 2,57 3,07 0,54 0,43±0,05

ЕэП^сП Р2 3 441 0,70 3,96 1,37 0,84 0,47±0,02

ВС 1 74 1,95 0,86 1,35 0,25 0,43±0,06

ВС 1 39 1,10 0,02 2,23 0,18 0,38±0,08

ЕЗИ-Р2Ш4 р2 1 147 0,28 3,49 2,05 0,72 0,47±0,04

Мс1112-С11И1 2 241 2,16 0,63 1,46 0,83 0,47±0,04

Ш1Л2-РЙС11 р2 3 452 0,90 4,53 6,25 0,18 0,46±0,02

ВС 1 49 1,00 0,18 0,10 0,69 0,47±0,07

М(И12-Рдт4 1 158 3,72 0,08 0,86 0,93 0,49±0,04

Ш112-Мс11л5 Гг 1 86 0,79 2,81 8,53 0,07 0,37±0,05

М(1112-Аср1 Р2 1 114 1,44 4,09 1,98 0,74 0,49±0,05

врЛ-Рда! Рг 1 178 5,24 0,92 2,81 -0,59 0,46±0,04

арп-лмьб Р2 1 67 0,23 1,41 68,71 0,00 0,093±0,02

ОрП-Аср1 Р2 1 69 0,48 3,03 2,91 0,57 0,45±0,06

йрП-Р£;т4 Р2 1 137 7,03 0,88 3,23 0,52 0,45+0,04

ОрП-СсШ1 Р2 1 112 3,64 0,34 3,80 0,43 0,41 ±0,01

Р{Г(П-Р(гт4 Р2 2 313 3,23 0,39 9,05 0,06 0,41 ±0,03

Рй<И-М"йЬ5 Р2 1 86 1,54 2,26 1,33 0,86 0,44+0,05

РйЛ-Ос1Ы Р2 1 123 0,07 0,35 2,07 0,72 0,47±0,04

Ос1111 - Аср 1 Р2 1 109 0,08 2,87 9,73 0,04 0,47±0,05

а<№1-ЛМЬ5 Р2 1 124 1,23 4,65 3,68 0,45 0,50±0,04

Р2 1 81 2,18 0,51 5,05 0,28 0,48 ±0,0 5

Рвт4-Мс1115 Р2 I 75 2,79 0,76 0,44 0,98 0,50±0,06

Нами была выполнена идентификация инбредных линий югославской селекции по 7 изоферментным локусам. С учетом гетерогенности 50 линий были разделены на 37 групп, различающихся между собой. Процент уникальности составил 74. Предполагается, что линии, имеющие сходные генотипы по изученным локусам, имеют общее происхождение.

В нашей работе была проведена биохимическая паспортизация 15 инбредных линий генетической коллекции ВНИИМК и 5 коммерческих гибридов селекции ВНИИМК (табл. 5). Результаты исследования показали, что использование этих локусов позволяет распределить 15 линий в 12 групп. Одна группа включает три линии с одинаковыми генотипами (ВК 678, В К 639, ЛГ 24), причем две из них являются аналогами по составу токоферолов. Вторая группа включает линии ЛГ 17

и ЛГ 25, которые имеют общее происхождение. Уникальность исследованных линий составила 80%. Гибриды имели различные по изоферментам генотипы.

Таблица 3

Анализ сцепления между генами, контролирующими селекционно-ценные признаки и изоферментные локусы у подсолнечника

. Краснодар, ВНИИМК, 1992—¡994

о |

Пара генов н о о ь о с Число семей Размер выборки Х2а , Х2в ! Х2ь Рь г±8Е

ТрЫ-ОсШ1 Р2 3 233 0,89 0,66 1,71 0,48 0,38±0,04

ТрЫ-ЕвИ Р2 2 171 1,12 0,31 5,31 0,07 0,38±0,04

ТрЬ1-МёЬ2 Р2 1 99 1,78 0,27 1,14 0,56 0,42±0,06

ТрЫ-Рй£]1 Р2 2 177 1,18 3,27 1,24 0,54 0,45±0,05

ТрЫ-ОрП Р2 1 77 1,25 0,12 0,07 0,96 0,49±0,07

Tphl-Pgm4 Р2 1 79 0,95 4,64 1,76 0,41 0,42±0,07

ТрЫ-МсШ5 ' Р2 1 83 2,93 1,84 0,61 0,73 0,43±0,07

ТрЬ2-0(1Ы Р2 2 163 0,02 0,20 1,98 0,37 0,48±0,05

Трьг-Еви Р2 2 197 1,06 . 1,63 3,48 0,18 0,40±0,04

ТрЬ2-1\Ш2 Р2 2 199 0,38 3,26 0,26 0,88 0,49 ±0,04

ТрЬ2-Ор11 Р2 2 104 2,51 0,31 2,62 0,27 0,38±0,03

Трьг-Ргси Р2 1 97 0,28 1,67 2,48 0,29 0,40±0,06

ТрЬ2-Рет4 Р2 2 158 0,68 2,65 1,02 0,60 0,46±0,05

ТрЬ2-МаЬ5 Р2 1 83 0,48 1,58 0,20 0,90 0,49±0,07

ОП-ЕвИ Р2 1 74 1,46 0,03 1,81 0,40 0,49±0,07

ОП-Рд(Л Рг 1 79 3,53 2,06 3,08 0,21 0,50 ±0,07

ОгЗ-ЕэИ Р2 1 93 0,81 0,29 7,93 0,02 0,36±0,06

ВС 1 33 0,04 0,28 0,94 0,35 0,42±0,08

ВС 1 67 4,31 0,66 0,45 0,35 0,46±0,06

ОгЗ-ОрИ р2 1 135 0,01 0,08 4,41 0,11 0,42±0,05

ОгЗ-МсШ2 р2 2 229 0,04 2,74 3,75 0,15 0,44±0,05

ВС 1 46 0,78 0,78 0,80 0,38 0,43±0,07

ОгЗ-РцсП р2 2 241 1,00 0,75 4,25 0,19 0,49±0,04

ВС 2 106 3,04 0,00 2,04 0,15 0,42±0,05

Огз-саы р2 1 157 0,05 2,61 0,43 0,80' 0,49±0,05

ОгЗ-Аср1 ъ 1 97 0,58 3,58 5,56 0,06 0,45±0,06

ОГЗ-Рйгп4 1 142 0,01 0,69 4,10 0,13 0,40±0,05

ОЧУ-ОСМ ?2 1 163 0,00 3,44 3,29 0,19 0,45±0,05

В\у-ОрП 1 132 0,36 1,64 2,65 0,27 0,43±0,05

Ош-МсШг Ъ 1 113 0,36 5,95 0,26 0,88 0,50±0,06

Dw-Acpl 1 100 0,05 4,08 0,29 0,86 0,47±0,06

Результаты биохимической паспортизации являются основой для оценки генетической чистоты коммерческих партий семян инбредных линий с участков размножения и гибридных семян с участков гибридизации.

Таблица 4

Характеристика образцов подсолнечника коллекции ВИР по девяти изоферментным маркерам

Краснодар, ВНИИМК, 1992—1994

ЬЬкер по каталогу

н

с/з ы

о

Изофермеитныс фенотипы

а

а

а а р.

к

а а

а

а

I <<

и

I

н

К 534 К 772 К 1232 К 1639 К 1651 К 1705 К 1747

8 К 1806

9 К1899

10 К 2023

11 К 2025

12 К 2045

13 К 2053

14 К 2057

15 К 2083

16 К 2132

17 К 2146

18 К 2184

19 К 2203

20 К 2417

21 К 3094

22 К 3096

23 К 3131

24 К 3168

25 .К 3173

26 К 3182

27 К 3191

28 К 3207

29 К 3228 (1)

30 К 3228 (2)

ур

\'Р Б

Р, Б ур, Р, Б Р, Б ур, Б Р Р

уР, Р, Б Б

ур, Р уР,Р Т.Б Р'

Р, Б Б

Р,Б

ур, Р ур,р

уР, Р, Б Р Р

Р,Б Р, Б

Б

Р, Б Р, Б Р,\'Р \Р, Р,Б

Б Р Р

Р, Б Р,Б Р, Б Б

Р Р Р Р Р Р

Р, 3

Б Б,Р Р, Б Р, Б Р, Б Р Б Р, Б Р, Б Б Р, Б Р, Б Р, Б Р, Б Б Р, Б Р, Б Р Р,Б Р, Б Р, Б Р

Р, Б Р, Б Р, Б Р, Б

Р

Р, Б

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р,Б

Р Б 8

Р, Б Б

Р, Б Б, Р Б Б Б

И, Б Р, Б Р, Б Р

Р, Б Р, Б Б

Р, Б И, Б Р, Б Б

Р, Б Р

Б

Р, Б

Р, Б

Р, Б

Р, Б

Р, Б

Р, Б

Р, Б

Р, Б

Р, Б Б

И, Б

Р, Б

Р, Б

Р, Б

Р, Б

И, Б

Р Р'

Р, Б Р

И, Б Р, Б Р Р

Р, Б Р, Б Б Р

Р, Б Р, Б

Б

Р Р

Р,Б

Р Р Р Р Р

Р, Б Р, Б Р,Б Б Р

Р, Б Р", Б

ур, Р, Р Р Р Р Р Р

Б Б

Б, Р Б, Р Б

Р, Б Р, Б Р, Б Р, Б, I Б

Б, I Р, Б Р, Б Р, Б Б

Р, Б Б

Б Б

Р, Б В

Р, Б Р, Б Б

Б, В Р, Б Б, I Р, Б

Б Б Р И, Б Р, Б Р, Б Б Б Б Б Б Б Б Б Б Б Б Б Б Б

Р, Б Б Б Б

Б Б Б Б

Р

Р, Б Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р, уР Р Р Р Р Р Р, Р Р Р

ур'

4. Оценка генетической чистоты линий и гибридов подсолнечника по изоферментным маркерам

Для доказательства адекватности оценки генетической чистоты линий и гибридов подсолнечника по изоферментным маркерам и традиционным методам полевой оценки нами был проведен ряд опытов сравнения результатов, полученных этими двумя методами.

Паспортизация инбредных линий и гибридов подсолнечника генетической коллекции ВНИИМК по изоферментным маркерам

Краснодар, ВНИИМК, 1992—1994

Изоферментные; фенотипы

Название о) | rf

линий н ьо E 1 Q a a о X a U £ о

ш £ о a a < Он

8283 SS SS SS SS SS SS SS

К 824 Б SS SS SS SS SS SS FF

В К 464 SS SS FF SS FF SS SS

В К 639 SS SS FF SS FF SS FF

В К 678 SS SS FF SS FF SS FF

ЛГ 24 SS SS FF SS FF SS FF

М 41 FF SS FF SS FF SS SS

ВК 541 FF SS FF FF SS SS SS

СЛ 2121-2 FF FF SS FF SS SS SS

ВК 571 FF FF SS FF FF FF SS

ЛГ 17 FF FF SS SS SS SS SS

ЛГ 21 FF FF FF SS SS FF FF

ЛГ 25 FF FF SS SS SS SS SS

ЛГ 15 FF FF FF SS FF и FF

ЛГ 18 vFvF SS FF FF SS FF FF

Краснодар-

ский 885 FS SS FF FS FS SS SS

Краснодар-

ский 917 FS FS FS FS FF FS FS

СМК 411 FF SS FF FS FS SS SS

СМК 416 FF FS FS FS FT FS SS

СМК 831 FS FS SS FS FS FS SS

Изофсрментный состав линий и гибридов определяли предварительной паспортизацией. Образцы анализировали по пяти ферментным системам (EST, MDH, GP1, PGD, GDHj.

Опыт А. В данном опыте мы ставили цель выяснить соответствие групп растений, отобранных как типичные и нетипичные для определенных линий и гибридов методом анализа изоферментов этим же группам растений при их оценке по фенотипу в поле.

В результате анализа 88 семянок установлено, что линии ВК 464 и ВК( 571 обладают типичными для них спектрами по всем пяти ферментным системам. Оценка этих же растений по морфологическим признакам подтвердила их типичность.

При анализе семянок линии ВК 678 методом электрофореза мы обнаружили образцы, имеющие типичные и нетипич-

ные спектры изофермептов. К отдельной группе были отнесены образцы, отличающиеся от типичных лишь по одному признаку, что могло быть вызвано как внутрилиненной изменчивостью, так и генетическим засорением. Результаты сравнения соответствия показателей типичности растений, полученных методом электрофореза изоферментов и их полевой оценкой, показали, что растения, выделенные как типичные и нетипичные, практически одинаково идентифицируются обоими методами. Растения, признанные методом электрофореза изоферментов нетипичными по спектру одного фермента, при оценке полевым методом были разделены на две группы — 56% типичных и 44% нетипичных. Это говорит о том, что у линий присутствует внутрилинейная изменчивость признаков, по которым отбор не ведется. В этой связи возникает необходимость при формировании линий коммерческих гибридов проводить анализ изоферментов с целью выбраковки по-томов, гетерогенных хотя бы по одному признаку.

При анализе семян гибрида Краснодарский 917, переопыленному при цветении чужеродной пыльцой, нами были выделены образцы, имеющие типичные и нетипичные спектры по пяти пзоферментным маркерам, а также образцы, имеющие изоферментные фенотипы, характерные для материнской формы гибрида. Растения, выделенные как типичные и нетипичные, практически одинаково идентифицировались обоими методами. Растения, имевшие материнский спектр при анализе изоферментов, имели фенотип материнской формы гибрида.

Этот опыт подтверждает, что определение типичности и нетипичности растений определенных линий и гибридов методом анализа изоферментов соответствует традиционным методам оценки.

Опыт Б. Цель данного опыта — сравнение результатов оценки генетической чистоты выборки семян методом электрофореза изоферментов и выборки семян из той же партии методом грунтконтроля в поле по фенотипу. По пяти пзоферментным системам было предварительно анализировано 159 семян гибрида. Из этой же партии семян гибрида посеяли в поле 391 семянку для оценки генетической чистоты по морфологическим признакам. Результаты, полученные при сравнении этих двух методов, существенно не различались (Х2=0,38; 0,80<р<0,90).

Проведенные опыты подтвердили, что метод оценки генетической чистоты, линий и гибридов подсолнечника с по-

мощью электрофореза изоферментов адекватен полевым методам оценки.

На основе предварительной биохимической паспортизации (табл. 5) в течение ряда лет мы выполняли оценку генетической чистоты семян инбредных линий с участков размножения и гибридов (р!) с участков гибридизации. На основании полученных результатов были приняты решения по характеру использования селекционно-семеноводческого материала.

Нами был проведен анализ возможных погрешностей оценки генетической чистоты с помощью нзоферментньтх маркеров. Погрешность метода генетических маркеров равна частоте возникновения в источнике загрязнения гамет с идентичным отцовскому компоненту генотипом, если загрязнение осуществляется переопылением, или частоте зигот с генотипом загрязняемого образца для случая механического засорения. Переопыление более трудно поддается выявлению, нежели механическое загрязнение. При частоте загрязнений, равной частота невыявленных загрязнений равна fx (где х — вероятность появления данного генотипа), а частота выявленных —

Иначе говоря, погрешность метода является систематической ошибкой и приводит к занижению оценки частоты генетических загрязнений анализируемой партии семян. Установлено, что для того, чтобы погрешность метода не превышала 0,1 достаточно анализировать 7 маркерных генов.

Генетическая чистота партии семян определяется в выборке из нее, причем размер выборки на несколько порядков меньше размера партии. Поэтому можно считать, что частота нетипичных семян в выборке является случайной величиной р, а ее оценка для всей партии имеет соответствующую ошибку эр, которая зависит от размера выборки.

где п — число проанализированных семян. Мы обычно анализируем выборку из партии около 100 семян. Такой размер выборки позволяет выявлять разницу 5% между стандартной частотой 95% и выборочной оценкой при уровне значимости 5%. Для того, чтобы выборка обеспечивала существенность различий между оценкой g=0,94 и 0,95 при 1% уровне значимости при частоте загрязнений 0,05, нужно проанализировать 3152 семян.

р = { (1 — х) =1 —

В заключение можно сказать, что анализ генетической чистоты коммерческих партий семян необходим для оперативного принятия решения по характеру использования испытываемой партии. Наиболее эффективным и экономически оправданным для этих целей является метод анализа изоферментных спектров.

ВЫВОДЫ

1. Выявлен полиморфизм по трем изоферментным зонам (МОН 4, РОМ 4, АСР 1). Подтвержден характер наследования изоферменгов кислой фосфатазы (АСР) и фосфоглюко-мутазы (РОМ).

2. Впервые изучен генетический контроль четвертой зоны ферментативной активности малатдегидрогеназы (МОН 4). Описан локус МсНт 5, контролирующий эту зону, с двумя ко-доминантными аллелями.

3. Выявлены у некоторых дикорастущих видов подсолнечника редкие аллозимы по четырем изоферментным системам (МОН, ОР1, РОО, АБН).

4. Проведен тест на сцепление между изоферментными локусамн в 20 двухлокусных комбинациях. Обнаружено сцепление для пары локусов Ор1 1 — МсПт 5, частота рекомбинации 0,09±0,02. По остальным комбинациям установлено независимое наследование.

5. Установлено независимое наследование изоферментных локусов и генов, контролирующих качество масла семян, устойчивость к заразихе расы и С и короткостебельность подсолнечника в 27 двухлокусных комбинациях.

6. Проведена биохимическая классификация 110 образцов, линий и гибридов подсолнечника коллекций ВИР, ВНИИМК и югославской селекции. Процент уникальности по 9 изоферментным маркерам для 30 образцов коллекции ВИР составил 100, для 15 линий генетической коллекции ВНИИМК по 7 изоферментным маркерам — 80, для 50 линий югославской селекции по 7 изоферментным маркерам — 74, для 7 гибридов по 7 изоферментным маркерам — 100.

7. Установлено, что метод оценки генетической чистоты линий и гибридов подсолнечника электрофорезом изофермен-тов адекватен полевым методам оценки.

8. Для практических целей семеноводства проведена оценка генетической чистоты 15 партий семян линий с участков размножения и 8 партий гибридов (Р;) с участков гибридизации. Генетическая чистота линий колеблется от 73,4 до

100, гибридов — от 59,3 до 94,1. На основании анализа генетической чистоты приняты решения о дальнейшем использовании селекционного материала.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ

Для идентификации гибридов и линий подсолнечника при передаче на государственное испытание рекомендуется проводить изоферментную паспортизацию по следующим системам: EST, MDH, GPI, PGD, GDH, АСР, PGM.

В целях оценки генетической чистоты коммерческих партий семян линий и гибридов подсолнечника предлагается надежный метод — анализ изоферментов, позволяющий получать данные о генетической чистоте в период созревания семян, что даст возможность принимать решение об их дальнейшем использовании к моменту уборки урожая. Это позволит значительно сократить затраты на послеуборочную обработку семян в случае их выбраковки по генетической чистоте.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лоскутов А. В., Толмачев В. В., Туркав С. 3. Использование изо-ферментных маркеров в геиетике и селекции подсолнечника //Тез. докл. международной конференции «Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений».— Киев, 1994.—С. 42—43.

2. Loskulov A., Turkav S< Isozyme gene markers in sunflower //Thesis of repots International compositae confer., Royal Botanic Gardens.— Kew, 1994,— P. 124.

3. Loskulov A., Demurin Ya., Obraztsov I., Bochkarev N., Turkav S., Efimenko S. Isozymes, tocopherols and fatty acids as biochemical markers of the genetic purity in sunflower //Helia,— 1994.— Vol. 17, № 21.— P. 5—10.