Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВЫХ И ИЗОФЕРМЕНТНЫХ МАРКЕРОВ В ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОТИПОВ КАРТОФЕЛЯ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВЫХ И ИЗОФЕРМЕНТНЫХ МАРКЕРОВ В ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОТИПОВ КАРТОФЕЛЯ"

На правах рукописи

Дементьева Зоя Александровна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВЫХ И ИЗОФЕРМЕНТНЫХ МАРКЕРОВ В ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОТИПОВ КАРТОФЕЛЯ

06.01.05 —селекция и семеноводство 03.00.23 -биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006.

Работа выполнена в лаборатории черистемно-тканевых культур и микроклонирования Всероссийского научно-исследовательского института картофельного хозяйства им А Г Лорха

Научный руководитель

Научный консультант Официальные оппоненты

Ведущее учреждение

кандидат биологических наук |С М Мусйн"|

кандидат биологических наук Б В Анисимои

доктор биологических наук Т А Ежова

кандидат биологических наук НВ Хадеева

Институт физиологии растений имени К А Тимирязева РАН

Зашита состоится 10 октября 2006 г в ль часов на заседании Л -ционного совета Д 220 043 10 при РГАУ-МСХ*А имени К А Тим • » адресу

127550, Москва, Тимирязевская ул , 49, отдел защиты диссертаций Тел/факс (095)976-24-92

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библ РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева

Автореферат разослан «J5» cg2006 г

Ученый секретарь диссертационного совета

ГИК I в

Актуальность проблемы. При создании и поддержании генетических коллекций и банков сортов картофеля, и в особенности при воспроизводстве и масштабном размножении исходного материала в процессе оригинального семеноводства особую актуальность приобретают две главные задачи: абсолютная уверенность в элиминации патогенов и точное генетическое соответствие исходного «материнского» растения генотипу сорта.

Для сохранения сорта исключительно важное значение имеет контроль генетической стабильности, поскольку в следствие возрастания вероятности спонтанных мутаций, растения, регенерированные из эксплантов соматических клеток, могут иметь существенные морфологические изменения. Длительное депонирование растений картофеля в культуре in vitro, где условия развития растений значительно отличаются от естественных, к которым картофель приспособился эволюционно, также может привести к генетическим изменениям за счет соматических мутаций, обусловленных, например, изменением содержания гормонов. Кроме того, при поддержании в пробирочной культуре неизбежно имеет место и путаница, привносимая техническими исполнителями.

Перечисленные проблемы обусловливают остроту вопросов генетического мониторинга исходного материала в процессе оригинального семеноводства картофеля на всех этапах работы: при оздоровлении сортов, поддержании коллекции in vitro, клональном размножении на биотехнологических модулях.

При этом традиционные методы описания и характеристики образцов на основе морфологических признаков часто имеют ограничения из-за растянутости во времени и недоступности для наблюдения всех признаков одновременно. Кроме того, они не применимы, например, для идентификации сортов в культуре in vitro, рассады и миниклубней, полученных на биотехнологических модулях. Поэтому необходимость разработки и усовершенствования методов экспресс-идентификации генотипов и системы генетического мониторинга сортообразцов при формировании и поддержании генетических коллекций и банков сортов картофеля обусловливает актуальность настоящей работы.

Цель и задачи исследования. ЦЕЛЬЮ исследования являлась разработка технологических основ идентификации генотипов и генетического мониторинга исходного материала на основе белковых маркеров.

При этом ставились следующие ЗАДАЧИ:

1. Разработать системы белковых и изоферментных маркеров для идентификации и паспортизации сортов картофеля in vitro и in vivo.

2. Дать характеристику генетического разнообразия сортов различного происхождения на основе белковых маркеров: сортов, полученных в результате межсортовой гибридизации; генетически близких сортов — сибсов и по-лусибсов; соматических мутантов И кттгтонму ияриянтгт гпртпи; пчтр-гстцргча модифицированных сортов в сравнен ш с исходнййДУ-МСХА

3. Разработать технологию молек 'лярн&4Шё¥ипе№о%! M6iiVfti>fftftra бан ка сортов картофеля на этапах фор!«

^ Фонд научный лнгсрвтуры

^ т .., С? ^

оздоровленного исходного материала в процессе оригинального семеноводства

Научная новизна н практическая значимость Впервые дана количественная характеристика генетического разнообразия сортов различного происхождения по изоферментным и белковым маркерам Определен уровень полиморфизма сортов отечественной и зарубежной селекции, выявлены генетически родственные и дивергентные сорта, что может быть использовано в селекционной работе при подборе родительских форм для скрещивания Проведена кластеризация сортов согласно их происхождения сортов, полученных в результате гибридизации, сносов и полусибсов, соматических мутантов и клоновых вариантов, генетически модифицированных сортов Показано, что в таком ряду происходит закономерное уменьшение вариабельности при оценке на основе генетических дистанций Определены возможности и ограничения маркеров в идентификации отличий соматических мутантов, клоновых вариантов, сомаклонов и генетически модифицированных сортов от исходных генотипов

Предложена система молекулярно-генетического мониторинга образцов оздоровленного генобанка Обнаружено, что возможно появление линий, генетически отличающихся от исходных генотипов В Госреестре РФ выявлены сорта, неразличимые по белковым и изоферментным маркерам и являющиеся клоновыми вариантами или синонимами уже внесенных в реестр сортов

Личный вклад соискателя. Соискателю принадлежит разработка программы и методики исследований, схемы основных экспериментов и теоретическое обобщение полученных результатов Большая часть экспериментальных данных получена автором лично

Апробация результатов диссертации Основные результаты работы доложены на школе молодых ученых «Современные методы селекции картофеля на устойчивость к болезням и качество» (Коренево, 2004), на научно-практической конференции, посвященной 75-летию ВНИИКХ «Состояние и перспективы селекции и семеноводства картофеля» (Москва, ВНИИКХ, 2006 г)

Опублнкованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, включая 4 научные статьи, 2 методических указания, 1 методические рекомендации

Стрлктура и объем работы Диссертация состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), выводов, предложений, списка использованной литературы и приложения

Материал изложен на 141 странице машинописного текста, содержит IЬ таблиц, 3С) рисунков, 1 приложение Список литературы включает 204 работы, из которых 140 на иностранном языке

Материалы и методика В ходе работы было проанализировано более 300 различных генотипов картофеля (сорта и гибриды) из разных источников полевые клубни сортообразцов из родительского и других селекционных питомников ВНИИКХ, сорта в культуре in vitro лаборатории меристемно-

тканевых культур ВНИИКХ; полевые клубни сортообразцов из ГорноАлтайского госуниверситета, ООО «Митрофановское» Челябинской области, Кемеровского НИИ Сельского хозяйства и др. Кроме того, анализировались изоэлектрофоретические спектры исходных сортов и их соматических мутантов, вариантных линий и сомаклонов, а также генетически модифицированных сортов, полученные в лаборатории ВНИИКХ в течение предыдущих лет. Для анализов использовали зрелые, среднекрупные полевые клубни, без видимого поражения грибными, бактериальными и вирусными болезнями, а также 6-8 недельные пробирочные микрорастения, синхронизированные по развитию одновременным черенкованием.

Методика исследования включала экстракцию белка, вертикальный диск-электрофореза (ЭФ) в трис-глициновой буферной системе по Davis (1964), изоэлектрофокусирование (ИЭФ) (pH 5,0-8,0 и 3,0-10,0), окрашивание на общий белок, пероксидазу или эстеразу в зависимости от цели эксперимента, сканирование или фотографирование гелей, составление белковых бинарных матриц по принципу присутствия (1) или отсутствия (0) компонентов спектров, на основании которых рассчитывались генетические дистанции и строились дендрограммы, отражающие скрытые генетические взаимосвязи генотипов картофеля. Для анализа полученных данных использовалось следующее программное обеспечение: Totallab fpr windows (денситометрическое сканирование спектров) и Statsoft Statistica 6.0 (расчет генетических дистанций и построение дендрограмм).

Результаты и обсуждение

Как известно, белок - индивидуальный продукт гена и является его надежным маркером, а сам метод сортовой идентификации по составу запасных белков клубней чрезвычайно эффективен. Результаты работы подтвердили имеющиеся данные о том, что межсортовые различия генофонда Solanum tuberosum ssp. tuberosum по электрофоретическим (ЭФ) и изоэлек-трофокусировочным (ИЭФ) спектрам белков клубней ярко выражены, что позволяет без труда дифференцировать сорта (рис. 1, 2). Различия обнаруживались в количестве белковых компонентов, их взаимном расположении и интенсивности окраски.

Белковые компоненты характеризовались по относительной электро-форетической подвижности и/или изоэлектрическим точкам. Было констатировано, что основная масса компонентов растворимых белков клубней относятся к медленно- и среднеподвижным. В общей сложности в генофонде изученных сортов картофеля идентифицировано 63 электрофоретических варианта растворимых белков клубней от 17 до 43 в зависимости от сорта, большая часть из которых являлась минорными и трудноразличимыми. При этом мономорфными оказались только 4 варианта, а уникальным - всего лишь один. По сортам они распределялись неравномерно, для каждого изученного сорта был характерен свой индивидуальный компонентный состав белков. Наибольшее количество компонентов отмечено у сорта Герань, наименьшее — у сорта Букет. Характерно, что сорта более раннеспелые имеют меньшее

t

количество полос в спектрах растворимых белков клубней, или же полосы проявляются у них в следовых количествах (например, сорт Удача)

Рис 1 Очектрофоретические спектры юпасных белков к iVI ней картофь^ш 1 - Неи^кии 2 7v-•овскоы 3 - Рождественский 4 - Пъъикинеи 5 - Ьлилаиста 6 Петерохргскии " - 1адож-lku« V - Сküjko. 9 itspopa 10 ОрсОеж^кии II laut 12 Веша 13 Чернеют 14 Брянский красный 1ç Брянский надежный 16 По^арскии }" Ства Брянщины 14 1с пия 19 -Победа 20 Образецнасиртоопреде1ение

Рис 2 Пзоэлектрофотировочныи спектры записных бе гков клхбнеи картофеъя I р!

3 55 2 pi 4 55 3 -pi 5 13 4 -pi 5 <<5 5 -pi 6 5' б -pi 6~6~~16 ~ - pi-4 55 X pi 9 9 9 igria 10 bunte II Russet Burhank 12 Черни?овскии 13 Romano 14 - Sante

Электроморфы не дифференцировались по таким количественным признакам как интенсивность окраски и ширина линии, однако этот признак может отражать количество аллелей в тетраплоидном геноме картофеля от симплекса до квадриплекса При этом количественно электроморфы отличались весьма существенно - от очень интенсивных до представленных в следовых количествах, что хорошо иллюстрируют дендрограммы сортов (рис 3)

iinii

Лё ->■ ^ «иг

12 3 ¿56

ч ю и i: i3 14

Рис. 3: Денситограммы спектров сортов: А. -ЭФ спектра сорта Петербургский, Б. - ИЭФ спектра Уральский сувенир

В биотехнологии картофеля часто необходимо быстро идентифицировать генотип уже в культуре in vitro. Эту задачу мы попытались решить используя генетически-детерминированный полиморфизм изопероксидазной и изоэстеразной ферментных систем. В наших экспериментах обе изофермент-ные системы демонстрировали ярко выраженный полиморфизм в зависимости от исследуемой ткани растения. Каждая изученная ткань (стебли и листья пробирочных растений; корни пробирочных растений, микроклубни, а также полевые клубни) одних и тех же генотипов характеризовалась легко узнаваемыми изоферментными спектрами, имея при.этом совершенно определенные межсортовые различия (рис. 4).

Рис. 4. Электрофоретические спектры изопероксидаз и изоэстераз сортов Луговской (а), Раменский (б), Резерв (в), Сайте (г), Жуковский ранний (д): (а), (б), (в) и (г): 1 - клубни, 2. - микроклубни, 3. — корни пробирочных растений, 4. — пробирочное растение (листья и стебли).

Изопероксидазная система картофеля показала себя как чрезвычайно полиморфная, многокомпонентная. ЭФ спектры пероксидаз выращенных в одинаковых условиях одновозрастных пробирочных растений характеризовались стабильностью и сортоспецифичностью. Ни один сорт не имел идентичного спектра с другими, и таким образом использование спектров изопероксидаз вполне удовлетворительно решает проблему сортовой идентификации картофеля в культуре in vitro. Наиболее специфичны были изопероксида-

*

зы корней и микроклубней Также показана многокомпонентность и ярко выраженная сортоспецифичность спектров изопероксидазной системы полевых клубней Таким образом, генетически детерминированный полиморфизм пе-роксидаз позволяет проводить сортовую идентификацию картофеля как in vitro так и т vivo

В отличие от пероксидаз изоэстеразы на уровне пробирочных растений обнаруживали ярко выраженную нестабильность электрофореграмм, выражающуюся в возрастании активности некоторых компонентов спектра у одного и того же генотипа даже при анализе растений одного возраста Вследствие этого использование изоэстераз в качестве маркеров в культуре in vitro не представляется возможным Однако спектры изоэстераз полевых клубней чрезвычайно сортоспецифичны и могут быть с успехом использованы для целей идентификации и паспортизации генотипов

При проведении исследований по характеристике генетического разнообразия картофеля было выделено несколько групп сортов сорта, полученные в результате гибридизации разных родительских форм, близкородственные сорта (сибсы и полусибсы), сорта, являющиеся соматическими мутантами или клоновыми вариантами, сомаклональные вариантные линии сортов, генетически модифицированные сорта

Полученные данные показали, что все сорта и гибриды, выведенные гибридизацией разных родительских форм, надежно различались по элек-трофоретическим и изоэлектрофоретическим спектрам запасных белков клубней Было констатировано, что чем больше образцы различались морфологически, тем большие различия наблюдались и в электрофоретических спектрах, а следовательно, и генетические дистанции между ними были выше. что позволяло без труда дифференцировать сорта даже в одном шектро-форетическом анализе запасных белков клубней (рис 5А,Б)

При изучении 69 сортов отечественной и зарубежной селекции, полученных в результате гибридизации разных родительских форм было выявлено, что межсортовые различия между ними весьма существенны среднее шачение генетической дистанции в этой группе сортов составляет приблизительно 0,37 Генетические дистанции варьировали от 0,12 (Елизавета ! Рождественский) до 0,57 (Накра / Светлячок) Неожиданное сходство в сравнении с остальными продемонстрировали сорта Импала (Голландия) и Рождественский (Россия, Санкт-Петербург), которые имея абсолютно разное происхождение, обнаруживали между собой генетическое расстояние равное 0,16 Этот факт может свидетельствовать о том, что селекция картофеля постепенно выходит на некоторое селекционное плато, и новые генисточники в скрещивания вовлекаются недостаточно, в том числе такие агрономически важные, как устойчивость к болезням и вредителям

Изученные сорта группировались в 2 главных кластера, первый из которых (I) включает практически все исследованные сорта, объединенные в 12 подкластеров Сорт Накра имел по отношению к остальным наибольшие генетические дистанции от 0,28 до 0,57 единиц (в среднем 0,43) и в группе с

сортами Ветеран и Бирюч образовывал обособленный кластер (кластер II) (рис. 5В).

£ Генетические дистанции

Рис. 5. Характеристика сортов картофеля, полученных в результате гибридизации: Полиморфизм запасных белков клубней картофеля при проведении: А.: электрофореза 1. - Невский, 2. - Луговской, 3. - Батя, 4. - Бежицкий, 5. - Букет, 6. - Белоснежка, 7. - Ветеран, 8. - Космос, 9. -Лакомка, 10. - Лира, 11. - Накра, 12. - Никулинский, 13. - Гаменский, 14. - Резерв, 15. - Сапры-кинский, 16. - Сокольскии, 17,- Бирюч, 18. - Аспия, 19. - Победа, 20. - Безымянный. Б: шоэлек-трофокусирования (рН 5-8): 1. - Невский, 2. - Луговской, 3. - Петербургский, 4. - Рождественский, 5. - Скороплодный, 6. - Осень, 7. - Эффект, 8,- Голубизна, 9. - Жуковский ранний, 10. - Ресурс, 11.- Русский сувенир, 12. - Удача, 13. - Никулинский, 14. - Россиянка, 15. - Юбилей Жукова. 16. - Утенок, 17. -Космос, 18. - Луговской. В.: Генетические взаимоотношения.

Для большинства современных отечественных и зарубежных сортов картофеля характерна широкая генетическая основа, поэтому большинство сортов как отечественной, так и зарубежной селекции выявляют совершенно неожиданные генетические взаимосвязи и на дендрограммах в основном располагаются бессистемно и мозаично.

В группах близкородственных образцов (сибсов и полусибсов) количество идентичных полос в спектрах было наибольшим, однако, в большинстве случаев они надежно различались как минимум по 2 полоскам. Как и ожидалось теоретически, более близкими оказались сорта и гибриды, имеющие в парах одинаковых родителей (сибсы) (Колобок/Москворецкий (кпа х

^етБгсЬ), Сотка/Столовый 19 (Олев х Приекульский ранний), 2017-13, 2273-

#

17, 2017-37, 2173-4 (Зарево х Эффект), 1965-6, 2134-20, 2134-5 (Эффект ч Ре-¡ерв) и 1969-16, 1969-21 (Эффект ч Бе юусовский), которые имели незначительные генетические расстояния, а на дендрограмме, полученной в результате кластеризации, располагались рядом (рис 6А) Генетические дистанции между такими генотипами располагались в диапазоне от 0,07 (между сносами 2134-20/2134-53 и 2273-17/2173-4) до 0,16 (между 2017-13/2017-34) (табл 1 )

т е аи-танции

Рис 6 Iьнетические взашиютнтиеъин сортов ¡.иосов и no-ivcuocoe

Полусибсы Эффект (Раменский к 128 6), Осень (Гранола к 128-6), Голубизна (Гатчинский х 128-6), Скороплодный (128-6 ч Анока), 2017-13 (Зарево ч Эффект), 1969-21 (Эффект х Белоусовский), 1996-76, (Эффект ч 946-3), 2085102, (Эффект ч Аксеновский), 2083-23 (Эффект ч 276-662), 2136-3 (Эффект ч 1888-27), 1965-6 (Эффект ч Резерв) и другие надежно различались по белковым и изоферментным спектрам, на дендрограммах располагались в основном предсказуемо, согтасно своего происхождения, генетические дистанции в группах гибридов-полусибсов были относитечьно невысокими и в большинстве случаев не превышали 0,25 единиц (табл 1,рис 6А,Б)

Несмотря на явные морфологические различия, существенных изменений в ИЭФ спектрах в парах сорт / соматический мутант и сорт / клоновый вариант обнаружено не было Так, пары сортов Лорх / Пестречинский, Смена / Июльский, Мажестик / Триалитури, Ермак / Ермак улучшенный, Весна (красная) / Весна белая и другие имечи неразличимые спектры, нулевые генетические дистанции и на дендрограммах располагались вместе (рис 7)

Генетические дистанции в парах различающихся по бо чковым маркерам сортов-мутантов Estima / Famosa (0,02) и Cardinal / Diamant (0,02) были очень малыми Это доказывает, что вторые в парах действительно являются соматическими мутантами или клоновыми вариантами первых сортов Однако, в паре Arka / Rubinia, в оттичис от других генотипов изучаемой группы, наблюдались более существенные различия по всем бечковым системам (ге-нетич расст 0,11), и их положение на дендрограмме определенно показывает, что это два разных генотипа, возможно имеющих близкое происхождение, однако навряд ли второй сорт является мутантом первого Таким обра-

Таблица 1

Генетические дистанции в группах гибридов-сибсов и полусибсов

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 [ 19 201 21 22 23

1 2021-4 0,00 0,18 0,25 0,27 0,32 0,30 0,23 0,27 0,27 0,27 0,27 0,55 0,45 0,45 0,43 0,30 0,25 0,27 0,34 0,48 0,50 0,52 0,50

2 2097-46 0,00 0,20 0,27 0,32 0,25 0,23 0,32 0,27 0,23 0,23 0,45 0,36 0,45 0,43 0,25 0,25 0,18 ¡0,25 0,52 0,50 0,57 0,55

3 2017-13 0,00 0,11 0,16 0,14 0,20 0,30 0,30 0,16 0,16 048 0,39 ,034 0,32 0,23 0,14 0,25 0,14 0,45 0,43 0,45 0,48

4 2273-17 0,00 0,09 0,07 0,23 0,18 0,18 0,18 0,14 0,45 0,41 0,36 0,39 0,25 0,16 0,27 0,20 0,43 0,41 0,48 0,50

5 2017-34 0,00 0,16 0,32 0,23 0,27 0,18 0,18 0,45 0,41 0,36 0,39 0,30 0,20 0,25 0,23 0,39 0,36 0,43 0,45

6 2173-4 0,00 0,25 0,20 0,16 0,20 0,20 0,48 0,43 0,34 0,36 0,27 0,18 0,23 0,21 0,45 0,43 0,55 0,52

7 1965-6 0,00 0,09 0,09 0,23 0,23 0,50 0,50 0,36 0,39 0,11 0,16 0,14 0,20 0,48 0,50 0,48 0,50

8 2134-20 0,00 0,05 0,27 0,23 0,45 0,50 0,36 0,39 0,16 0,20 0,18 0,25 0,43 0,45 0,48 0,50

9 2134-5 0,00 0,27 0,27 0,45 0,50 0,41 0,43 0,20 0,20 ОДЗ 0,25 0,48 0,50 0,52 0,55

10 1969-16 0,00 0,14 0,55 0,50 0,27 0,30 0,16 0,07 0,23 0,16 0,39 0,36 0,43 0,41

и 1969-21 0,00 0,50 0,41 0,32 0,34 0,16 0,16 0,18 0,16 0,48 0,45 0,48 0,50

12 Сотка 0,00 0,14 0,50 0,43 0,52 0,48 0,55 0,52 0,39 р,36 0,39 0,45

13 Столовый-19 • 0,00 0,45 0,39 0,52 0,48 0,50 0,52 0,34 0,36 0,34 0,36

14 Колобок 0,00 0,07 0,30 0,30 0,41 0,34 0,30 0,32 0,30 0,36

15 Москворецкий 0,00 0,32 0,27 0,43 0,36 0,27 0,30 0,32 0,34

16 1996-76 0,00 0,14 0,16 0,14 0,41 0,43 0,41 0,43

17 2085-102 -- 0,00 0,25 0,14 0,41 0,39 0,41 0,43

18 2083-23 0,00 0,20 0,52 0,50 0,57 0,50

19 2136-3 ■— ' ¡0,00 0,50 0,48 0,45 0,52

20 Эффект — 0,00 0,16 0,14 0,11

21 Скороплодный 0,00 0,20 0,18

22 Голубизна 0,00 0,16

23 Осень 1 0,00

¡ом, соматические мутанты и к тоновые варианты отличаются от исходных сортов по маркерам весьма незначитетьно Вероятно, вечичина генетической дистанции в 0,05 единиц является условной границей при идентификации соматических мутантов

е —мтегии *

М&встис [_

Т(Ж*ЦГ*0М

Т*гов«ои Г -скчиН I

£ чн _ Ершит ш*Н Ьл •Оимсти ранн*««»} »чедниирм И" »»«я ли* (|щ »чгиняош 9 ¿к. КЗ*— »4га(св<м Ми 41 *

Лч«сп V Г~ иочдор

А^ии

^ЗПГСЛЗЙ V

Вл»М

4гап ь

Ьпэтд _ «*ейа}

и

Рис " Гдиетические взиилюотношь (ия сортов соматических иутантов и клонимых вариантов

Анализ вариабельности солшклопов показал сходные результаты Со-маклональная изменчивость выражалась как меткая флюктуация вокруг белкового «портрета» исходного генотипа - добавление 'исчезновение (качественные различия) или чаше как константное и полностью воспроизводимое изменение интенсивности (количественные различия) 1-2 компонентов бет-ков и/или изозимов при неизменности остальной части спектра Часто изменений в спектрах бетков не наблюдалось (например, сомаклоны сортов Лкь бимеп Столовый-19) (рис 8)

Ы К ь» ММ к* н» М

Былина Былина Я 1

Столовый 19 _

Столовый 18 42

чЛЬЯН0ВСЮМЙ!—

Ульянове™ 1!3|— Ульянове™«

J

I И 11 и и

Рис Ч А Размах ^очевсюшпънои вариаоельности сортов Учьяновскии и ¡юбимец 1 У хъяновскии/У) Л 2 11 - сомаклоны сорта VIьяновскии 2 У Я-"9 3 У Я 3 4 У К 129 5 У Я 93 6 - У Я 119 " - У Я-116 У У Я 69 9 У Я 9$ 10 - У Я 9') 11 У Я-ЧЗ 12 Любимец Л 13 16 сомаклоны сортаЛюоимец 13 .7 Я -!2о И /КЗ 15 - Л Я 33 16 — 7 Я 19 Е Генетические взаимоотношения некоторых порток и их сомаклонов

Сомаклон Были на-И 1 оттичался от исходного сорта на 0,03 единицы генетического расстояния, а сомактон Столовый-19 Я-2 не отчичался от ис-

ходкого генотипа Сомаклональные линии сорта Утьяновскии отличались более существенно Ульяновский Ульяновский [1-3 на 0.06, Ульяновский сМУльянонскии К-129 - на 0,09 единиц Таким образом размах сомаклональ-ной вариабельности чуть выше вариабельности, выявленной между соматическими мутантами, или сопоставим с ней (рис 8)

Различий при анализировании белковых спектров генетически модифицированных сортов обнаружено не было

Таким образом, проведенные исследования по генетическому разнообразию сортов картофеля различного происхождения на основе белков и изо-ферментов, как генетических маркеров позволили получить общие представления о закономерностях изменений компонентного состава спектров в зависимости от происхождения изучаемого генотипа Полученная информация о генетических дистанциях между сортами и гибридами может быть использована в селекционных программах при подборе родительских пар Так, скрещивания сортов, имеющих в парах наибольшие генетические дистанции, может помочь селекционерам в достижении максимального эффекта гетерозиса Выявленные закономерности изменения белковых спектров были использованы при решении практических задач, связанных с зкспресс-идентификацией генотипов картофеля Так, в совместных исследованиях была опровергнута гипотеза коллег из Горно-Алтайского госуниверситета (ГАГУ), что ряд переданных клонов за счет мутационных изменений в высокогорных условиях Горного Алтая приобрели генетически обусловленные отличия от исходных генотипов Первые же анализы показали что в ряде случаев ¡а мутантные формы принимались клоны сортовой примеси Так, из трех вариантов образцов с этикеткой сорт «Уральский сувенир» два были практически идентичны между собой (генетич расст 0,02) однако, они сильно отличаются от «оригинального» (генетич диет 0,23 и 0,26) (таол 2)

Было сделано заключение, что генотипы с этикетками «высокогорье» и «среднегорье» не могу г быть мутантами оригинального сорта (рис Ч), а яв-1яются сортовой примесью Точно так же сильно различались по спектрам и генетическим дистанциям (0,35) сорт Символ и его предположительная му-тантная форма (табл 2, рис 9) Смешивание клонов различных генотипов наблюдалась и среди других проанализированных образцов из ГАГУ

Таблица 2

Генетические бистанции чьжду сортами \ральскии сувенир Симео I и их предпочитаемыми \птсттами

) . ~ "I Г ; 2 "¡^3 Т~4 Г~5 1

I 1 | Урачьскии сувенир (оригинальный) | ^ 0 26 0 23 О 28 | О 391

2 I Уральский сувенир (среднегорье) _ ___I__I и 04 | 0 16 ' 0 40 |

| 3 'Уральский сувенир (высокогорье)__)___,___^ 0 16 | 0 44

I 4 | Символ (оригинальный)__I ] ___ _ 0 35 |

Г5 , Симми (Пня)_______| Г I I

Таким образом, полученные экспериментальные данные, не подтвердили исходную гипотезу образования соматических мутантов картофеля в условиях Горного Алтая в зависимости от географической точки выращива-

ния. Большинство предполагаемых мутантов оказалось примесью других сортов.

ЩИ

т Ф ш щщ ж

• 3&. 5ЯГ Ж« •

-яг

«Ц я*.,

35. I

-ЗК &

Уральский сувенир (оригинальный). Уральский сувенир (сраднегорье). Уральский сувенир [высокогорье).

Сиывоп (Оригинальный) п (Иня)

0.1 0.2 0.3

Генетические дистанции

Рис. 9. А: Спектры сортов Уральский сувенир, Символ и их предполагаемых мутантов: I.

- Уральский сувенир оригинальный; 2. - Уральский сувенир (среднегорье); 3. - Уральский сувенир (высокогорье); 4. - Символ (оригинальный); 5. - Символ (Иня); Б: Генетические взаимоотношения

В ходе работы по идентификации различных сортов картофеля, были выявлены случаи, когда один и тот же генотип был распространен под разными сортовыми названиями. Такова ситуация с парами сортов Кемеровский

- Волжанин, Ресурс - Корона - Погарский, Жуковский ранний - Баритон, которые имеют полностью идентичные спектры по всем системам молекуляр-но-генетических маркеров (рис. 11). Несомненно, что эти генотипы могут быть включены в Госреестр только как клоновые варианты первых генотипов.

«V

<!*. М-

«с & "12 А

м Н

, а зк як

4 5 * *

шщш

I 2

1

Рис. 11. Идентификация сортов-синонимов (дупликатов) в Госреестре РФ: А (Спектр ИЭФ): 1. — Кемеровский, 2. — Волжанин; Б-В-Г: 1. - Жуковский ранний, 2. — Баритон (Б-В -Спектры ЭФ: Б - окраска на пероксидазу, В - окраска на общий белок,; Г-Д: 1. — Ресурс, 2. — Корона, 3. - Погарский. (Г — Спектр ИЭФ, Д- Спектр ЭФ окраска на общий белок).

В то же самое время, присланные из Свердловского НИИСХ два морфологически почти неотличимых гибрида Г-2 и Г-1-140-94 надежно различались по маркерам и были дифференцированы как два разных генотипа (гене-тич. расст. 0,16) (рис. 12А).

ifiii

12 12 3 4

Л Б

/.. J Идентификация сходства ралличия генотипов 4 идентификация раз-

личии ^ииридов Свердювскога НИИС V 1 - Г2 Г Г 1-140-44 Б идентификация сортовой принадлежности I Кристсш (Польша) 2 - Кристаи (ВШШЮС) J «П\шкински» IПочьшаI 4 Дстскосаьскии (BHllUKXt

'Экспресс-идентификация генотипов имеет важное значение при обмене оздоровленными микрорастениями с другими учреждениями Например, получив из Польши необходимые оздоровленные пробирочные растения сортов Лорх, Кристалл Резерв и ряд др> гих, были проведены анализы на генетическое соответствие этого материала образцам »тих сортов генобанка ВНИИКХ Доказав на основании белковых маркеров, что по генотипу они идентичны, эти сорта были использованы в дальнейшей работе в качестве здоровых исходных растений Однако, мы оказались в штрудлительном положении когда вместе с другими сортами из Польши поступил образец с красной кожурой под названием «Пушкински», который, к известному российскому сорту Пушкинец по морфологическим признакам никакого отношения не имс 1 Было сделано предположение, что это сорт Детскосельский Гипотеза бьпа подтверждена на основе изоэлектрофоретического анализа запасных белков клубней и сортообразец также пополнил генобанк (рис 12Б)

Таким образом, белковые и изоферментные маркеры позволяют успешно решать многие проблемы, неизбежно возникающие в ходе практической деятельности го поддержанию генетических коллекций и банков сортов картофеля

Для изучения возможности использования маркеров с целью мониторинга оздоровленных в меристемно-тканевой культуре депонируемых в ку 1ьтуре in vitro нами были проанализированы сорта Невский, Луговской и Резерв После регенерации и нескольких циклов черенкования, меристемные растения оценивались на соответствие исходному генотипу Целью анализа при этом являлось выявление качественных (появление новых или исчезновение имеющихся полос в спектрах) различий между меристемными линиями Далее линии проверялись на соответствие исходному генотипу по запасным белкам после выращивания в полевых условиях на уровне клубней Однако, отличии как между разными меристемными линиями, так и в сравнении с исходным сортом выявлено не было (рис 13)

Illiiiilïiliiii llltfiiipii

f £ 3 1 S s • % « 2 П s * « * * л ,r

#* » «К» Л ». * -*fl» aa* «r Ш

й if ^ ^ ^ 4 ^ Ц .( JÎ ^ M Г » ~ ' . • '' •• *

Tvi ; t ^ » * * *

'11 f'12. if'« S 2 3 SI» --

* * Î:ff5#4:*f.f t « «.il* * * * £«1

a в

Рис. 13. Контроль аутентичности оздоровленных меристемных линий. А - Резерв (микроклубни). В. - Невский (полевые клубни). Спектры ИЭФ рН 3-10.

Однако возможность появления регенерантных растений, отклоняющихся от исходного сорта, при оздоровлении полностью не исключается. Так, в совместных исследованиях с немецкими коллегами (Шенк и др., 1989) были идентифицированы четкие различия одного компонента спектра белков микроклубней у трех оздоровленных меристемных линий сорта Аркула по сравнению с исходным.

Обычно сорта имеют устойчивые фенотипические признаки, которые не зависят от условий выращивания растений. Однако было замечено, что небольшая часть сортов имеют достаточно устойчивую тенденцию формировать вариантные линии, отличающиеся от исходного генотипа. Так, после ускоренного размножения на биотехнологических модулях сортов Волжанин («ЭТК Меристемные культуры») и Невский (ООО «Митрофановское») было замечено образование мутантных (или вариантных) линий.

Молекулярно-генетический анализ показал, что все 5 линий сорта Волжанин незначительно различались между собой. При этом отличия выражались в исчезновении одного или двух компонентов ИЭФ спектров в сравнении с оригинальной линией сорта, сохраняя все характерные белковые компоненты. Генетические дистанции между проанализированными линиями варьировали от 0,02 до 0,05 (табл. 3).

Таблица 3

Генетические дистанции между исходными оригинальными и вариантными линиями сортов картофеля

1 2 3 4 s 7 8 9 10 11 12

1 Невский М1 о.ос 0,02 0,05

2 Невский М2 0,00 0,04

3 Невский Л 0,00

4 Волжанин -2 0,00 0,04 0,04 0,05 0,05

5 Волжанин -1 0,00 0,04 0,05 0,02

7 Волжанин -4 0,00 0,02 0,02

8 Волжанин -5 0,00 0,04

9 Волжанин -3 0,00

10 Жуковский ранний <Й 0.00 0,04 0,02

11 Жуковский ранний М1 0,00 0,02

12 Жуковский ранний М2 0,00

1

3 к

4 5

WfrP' рМ **

i

Put. 14 Спектры и.июстрир\тщие различия иеж-dv лариантнылш гиниями сортом Вол жанин (1/ и Жукокскии рачнии (В и В) I (спектры ИЭФ> I 5 сириантные линии 1-5 сорта Вочжанин Б (Спектры пероксидазы клубней) В (^чектрофорстические спектрщ 1 Жиоанш раннии <ори шииъныи) 2 Акукинскии ранний \t2 J tk\кг>вскии раннии W

Невскии М1 Невский М2 невский 01 вопжанин-2 волжанин-'

Бапжании-Э Кбмеоовский Вйпжанмч-5

Эолжаним-4 Жуковский раннии <Я ЖУхивосий речи им М2 Чуковский ранний М1

* Э Э1 02 0 3 04

Генетические расстояния

Рис, /ь.ньтиче\,киь «ыилшотношения между оригинальными и к^риалтными линиями с ортов картофеля Невский. Втжинип иЖуковскии раннии

Аналогичная ситуация наблюдалась по сорту Невский Клубни обнаруживали четкую дивергенцию по морфологическим признакам клубней линия М1 утратила розовые пазки и приобрела сетчатость кожуры, линия ¿М2 имела только сетчатость кожуры (табл 4) Другие морфологические признаки не были доступны для наблюдения, что свидетельствует о таком существенном недостатке традиционной методики определения сортовой принад-тежности по морфологическим признакам, как растянутость во времени и недоступность всех признаков одновременно Однако несмотря на столь резкие изменения по фенотипическим признакам анализируемые образцы имели лишь незначительные отличия в пектрофоретических спектрах, как и в случае с сортом Волжанин Генетические дистанции между линиями сорта Невский варьировали в пределах от 0,02 до 0,05, что свидетельствует о том, что данные генотипы, несомненно, являются вариантными (или мутантными) линиями сорта Невский и не могут быть примесью другого сорта (рис 14, 15, табл 3)

Таблица 4

Фенотипические различия сортов Невский и Жуковский ранний, согласно таблице

„Na признака ПО UPOV Признак Степень выраженности признака в балдах

Невский1' Жуковский ранний

Ор. Ml М2 Ор. Ml М2

18 Лист: интенсивность зеленой окраски 4 4 5

28 Растение: высота 4 4 5

36 Растение: время увядания ботвы 1 2 3

39 Клубень: окраска кожуры 3 3 4

40 Клубень: окраска основания глазка 3 3 2

_J) Клубень: сетчатость кожуры 1 3 3

' По сорту Невский для наблюдения были доступны только клубни. 2> Оценки типичных сортов цитированы по Симаков и др. (2005)

3> Признак сетчатость кожуры клубней отсутствует в официальной таблице признаков UPOV, поэтому в работе было предложено следующее подразделение сортов по признаку сетчатость кожуры: 1. - сетчатости нет, 3. - кожура слабосетчатая, 5. - средняя сетчатость кожуры, 7. -сильносетчатая кожура

Аналогичные изменения в спектрах запасных белков клубней наблюдались при анализе трех морфологически отличающихся линий сорта Жуковский ранний, поддерживаемых в родительском питомнике отдела генетики ВНИИКХ (рис. 14,15, табл. 3,4).

Таким образом, результаты вытюдненной работы свидетельствуют о том, что использование белковыху может обеспечить получение надежных показателей в идентификации отклоняющихся форм, возникающих в процессе оздоровления, биотехнологического размножения и возделывания сортов картофеля.

Поскольку появление отклоняющихся линий нежелательно, а их использование совершенно недопустимо в оригинальном семеноводстве, этот метод может быть рекомендован для проведения контроля типичности оздо-равливаемых, поддерживаемых в культуре in vitro и размножаемых сортооб-разцов картофеля в процессе оригинального семеноводства.

ВЫВОДЫ

1. Изучен полиморфизм запасных белков, изоэстеразной и изопероксидазной систем клубней, картофеля. Исследованные молекулярно-генетические системы картофеля демонстрируют высокий уровень полиморфизма и могут быть рекомендованы для решения актуальных задач для идентификации генотипов в селекции и семеноводстве картофеля.

2. Разработан метод сортовой идентификации картофеля in vitro по изофер-ментам и запасным белкам микрорастений и микроклубней. Наилучшими для использования в культуре in vitro являются изопероксидазные системы корней и микроклубней пробирочных растений.

3 Электрофоретические спектры эстераз и запасных белков на уровне клубней и микроклубней картофеля, находящихся в состоянии покоя, удовлетворяют всем требованиям, необходимым для идентификации генотипов

4 Показано, что изоэстеразная система на уровне микрорастений in vitro характеризуется ярко выраженной лабильностью, связанной с резким усилением эстеразной активности в зоне проявления пататина Вследствие этого они не могут быть использованы для целей сортовой идентификации, а сам феномен нестабильности требует дополнительного изучения

5 Дана количественная характеристика генетического разнообразия сортов различного происхождения сортов, полученных в результате отдаленной гибридизации, генетически родственных сортов (сибсов и полусибсов), соматических мутантов, клоновых и сомаклональных вариантных линий генетически модифицированных сортов

6 Выявлено что генетические дистанции между неродственными сортами находятся в диапазоне от 0,12 до 0,57, между сибсами и полусибсами -обычно не превышают 0,25

7 Выявлены возможности и ограничения белковых маркеров в идентификации отличий соматических мутантов, клоновых вариантов сомаклонов, разных меристемных линии и генетически модифицированных сортов от прежде ¡арегистрированных (генетические дистанции не превышают 0,05) ')то является подтверждением, что мутантная или вариантная линия произошла от данного сорта, и не может быть другим сортом, полученным в результате гибридизации

8 Показано, что метод белковых маркеров позволяет эффективно выявлять отклоняющиеся от оригинальных вариантные линии, возникающие в результате ошибок технического персонала (путаница и смешивание сортов)

9 Сличающихся от исходных сортов оздоровленных меристемных линии не

выявлено Показано, что генетические изменения вероятны при получении миниклубней на биотехнологических модулях, а слетовательно необходима система мониторинга получаемого материала

Список публикаций по теме диссертации:

1 Мусин С М , Дементьева З.А., Якупова Р X Характеристика генетического разнообразия сортов картофеля молекулярно-генетический подход / Вопросы картофелеводства -М ВНИИКХ, 2005 -С 98-114

2 Мусин С М , Дементьева З.А Молекулярная диагностика и идентификация исходного материала картофеля / Вопросы картофелеводства Актуальные проблемы науки и практики - М , 2006 - С 92 98

3 Дементьева З.А , Мусин С М , Яшина И М Возможности использования белковых маркеров для дифференциации генетически близких генотипов картофеля - сибсов и полусибсов / Вопросы картофелеводства Актуальные проблемы науки и практики -М,2006 -С 99-104

4. Дементьева З.А. Полиморфизм белков клубней картофеля и возможности его использования в селекции и семеноводстве // Научный журнал КубГАУ [Электронный ресурс]. - Краснодар: КубГАУ, 2006. - № 05(21). -8 с. — Режим доступа: http://ei.kubagro.ru/2006/05/pdf/03.pdf

5. Мусин С.М., Петухов С.Н., Якупова Р.Х., Симакова A.A., Дементьева ЗА., Шмыгая И.В., Бирюкова В.А., Дорохов Д.Б., Игнатов А.Н., Цветков И.Л. Методические указания по использованию белковых маркеров для идентификации генотипов картофеля. — М., 2003. - 25 с.

6. Петухов С.Н., Мусин С.М. Морозова H.H., Трофимов Р.Н., Дементьева З.А. Методические указания по использованию дигаплоидов, диких и примитивных диплоидных видов в селекции картофеля. - М., 2005. — 25 с.

7. Мусин С.М., Симаков Е.А., Анисимов Б.В., Усков А.И., Хромова JI.M., Бойко В.В., Бойко Ю.П., Петухов С.Н., Шмыгая И.В., Дементьева З.А., Бирюкова В.А., Бабоша A.B., Кондакова O.A., Аршава Н.В. Методические рекомендации по технологии оздоровления сортов картофеля. — М., 2005. — 65 с.

1,25 печ т

Зак 632

Тир 100 экз

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К А Тимирязева 127550, Москва, уч Тимирязевская, 44