Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование белковых маркеров и паспортизация генофонда SOLANUM TUBEROSUM L. IN VIVO и IN VITRO

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование белковых маркеров и паспортизация генофонда SOLANUM TUBEROSUM L. IN VIVO и IN VITRO"

Ä i "« u

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖШ НАРОДОВ

На правач рукописи

МУСИНА Раиса Анасовна

ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВЫХ МАРКЕРОВ И ПАСПОРТИЗАЦИЯ ГЕНОФОНДА SOLANUM TUBEROSUM L. IN VIVO И IN VITRO

03.00,16 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

--1ЙВА&С-Л Е^«

Работа выполнена в шотехнологичег-ком центре Научно-исследовательского института картофельного хоаяйства

Партий руководитель -доктор сельскохозяйственных наук, профессор Л К Трофимец

Официальные оппоненты -доктор биологически* наук, профессор ¡й л Гулов кандидат биологических наук Л И. Хрусталева

Ведущая организация -Мясковский государственный университет им. Ы. В. Ломоносова

Защита состоится 1993 г. в час.

на заседании специализированного совета К. 053.2С. 16 в Российском университете друи5ы народов по адресу: 117198, г. Мэсква, ул. Миклухо-Маклая, д. 8

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6

Автореферат разослан «-/9<\тЛсуСл 1993 г.

Ученьй секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук // /У ^ (/ И.Н. Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТU

Актуальность проблемы. В последние годы в генетике-и биотехнологии растений-особое значение приобрели экспресс-методы биохимической идентификации генотипов. Биохимическое генотипировалие, позволяющее осуЕ^ствлять генетическое маркирование иеходшд и селекционных форы, сортов, гибридов и линия на основе специфичности биологических макромолекул, с успехом используется для паспортизации генофонда, селекционно- генетического анализа, сертификации и семенного контроля и защиты авторских прав.

В исследованиях по культуре картофеля значительное развитие получили методы биохимической идентификации генотипов, основанные на электрофоретичееком выявлении фенотипов белков и изоэимов клубней. В Международном центре картофеля (CIP, Перу) проведена паспортизация генофонда с использованием элеетрофоретических белковых маркеров (Huamnn Z. , Stegemann Н., 1989), что позволило освободиться от повторно и многократно встречающихся под разными номерами идентичных клонов и значительно уменьшить объем работ и затрат на депонирование коллекции. Существуют европейские определители сортов картофеля на основе спектров растворимых белков и аимограмм изозстераэ клубней С Stegemann Н. , Loeshke V. , 1976-, Stegemarin Н. , Sohra.k. D. ,1982;1985). К сожалению, ни одного сорта нашей страны в этих каталогах нет.

Разработка биохимической генетики и, в частности, направления, связанного с использованием белковых маркеров генетических систем, сегодня является одной из актуальных задач исследований по культуре картофеля. Необходимость таких исследований вызвана практическими потребностями для организации контрольно-сертификационной службы в системе безвирусного семеноводства, широким использованием в биотехнологии и генетике методов культуры изолированных клеток и тканей in vitro, где норфо.лого-физиологические -ритерии идентификации генотипов не выражены, а анализ генетически детерминированного полиморфизма белков позволяет решать эту задачу (Мусин С. М. ,1989). В системе беа-вирусного семеноводства картофеля важными нерешенными проблемами являются' сортовая идентификация и паспортизация генофонда депонируемых образцов на уровне пробирочных растений, контроль генетической стабильности и „крининг соматических мутаций мериклонов при оздоровлении сортов методом апикальной меристемы.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы была разработка научно-методических основ биохимической идентификации генотипов кар-

тофеля in vitro на основе белковых маркеров и паспортизация генофонда Solanum tuberosum L. in vivo и in vitro.

В задачи диссертационного исследования входило: 1)изучить генетически детерминированный полиморфизм растворимых белков и множественных молекулярных форм эстеразы и пероксидазы картофеля на уровне клубней, микроклубней и пробирочных растений; 2)изучить закономерности фенотипического проявления генов, контролирующих изоферменты пероксидазы и эстеразы, в цикле последовательных микрочеренкований пробирочных растений при депонировании оздоровленных сортообразцов in vitro; 3)определить возможность дифференциации сортов S. tuberosum Lno изоферментам .пробирочных растений; 4) провести паспортизацию сортов картофеля in vivo и in vitro на основе белковых маркеров.

Научная новизна и практическая ценность работы. Исследован генетически детерминированный полиморфизм растворимых белков, а также иэоэстеразная и иаопероксидазная генетические системы картофеля на уровне клубней, микроклубней и пробирочных растений. Описаны электро-форетические и. изоэлектрофоретические фенотипы изученных белковых систем, идентифицированы физико-химические свойства (pi, Rf, Ш) компонентов белков и множественных молекулярных форм изозимов. Показана дифференциальная экспрессия изоморфов эстеразной и лероксидазной систем в различных органах и тканях растений картофеля. Определены условия, обеспечивающие стабильность белкового критерия идентификации ге-ютипов на уровне пробирочных растения при депонировании коллекции оздоровленных сортообразцов in vitro. Впервые разработан метод идентификации генотипов картофеля in vitro на уровне пробирочных растений и проведена паспортизация основных отечественных и зарубежных сортов на основе стабильной, высокополиморфной и сортоспецифичной изоперок-сидазной генетической системы корней. Впервые в стране проведена паспортизация сортов картофеля in vivo и in vitro по фенотипам растворимых белков, изоэстераз и изопероксидаз клубней и микроклубней.

Изучено мультигенное семейство пататина - главного запасного белка картофеля. Показан межсортовой полиморфизм, идентифицировано положение компонентов пататинового комплекса в ЭФ и ИЭ^спектрах растворимых белков клубней и микроклубней. Выяснено, что нестабильность изоэстеразной системы на уровне .фобироч'ш растений связана с дифференциальной экспрессией компонентов пататинового комплекса.

Полученные.результаты расширяют представления о методах биохими-

2

ческого генотипирования на основе белковых и изозимных маркеров и могут использоваться в генетике, биотехнологии и селекции для паспортизации и идентификации сортов, гибридов и линий S. tuberosum L., контроля-и сертификащш семенного материала в системе беавярусного семе- ' новодства и при внутригосударственном и международном обмене генетическими ресурсами картофеля in vivo и in vitro.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на научно-техническом совете Биотехнологического центра Научно-исследовательского института картофельного хозяйства

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы, описок которых приводится.

Объем работы. Обшля объем диссартации составляет 205 страниц, вкяячая 0 таблиц и 65 рисунков. Список литературы - 241 наименование, в том числе 182 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ M МЕТОДЫ

В качестве материала для исследований использовали 125 сортов коллекции, депонируемой.а Биотехнологическом центре НИИКХ in vitro, а также 60 сортов Иэадународного питомника испытания сортов !сартофеля. Материал для анализов выращивали по методикам, используемым в Биотехнологическом центре НИИКХ (Трофимец и др., 1988). Для анализов использовали 6-недельные пробирочные растения (без корней) и корни пробирочных растений в возрг те 5-8 недель от момента черенкования, физиологически зрелые покоящиеся микроклубни и клубни. Подготовка исходного белкового препарата включала следующие этапы: 1)гомогенизация репрезентативной навески тканей в защитном'буферном растворе ( для клубней и микроклубней 10 мМ трис-глициновый буферный раствор pH 8,3 с защитными добавками: аскорбат Na - 0,5%, ЭДТА-Na - О,IX, ДЭДГК-Naj-0,052; 50 мм трис-ГЛИЦИНОВЫЙ буферный раствор pH 8,3, 1 мМ ЭДТА-Na;, ,1мЫ ДТТ, 5Х сахарозы - для пробирочных растений и корней); 2)экст-ракция растворимых белков в течение 1 ч при +4° С; 3) центрифугирование гомогената на центрифуге о охлаждением Вескшап J2-21 (15000 об/мин, 16 мин,+4° С); дробное разливание супернатанта по 100 мкл в пробирки Eppendorf и хранение при -70° 0 в замораживателе Sanyo MDF 381 AT.

При от »«делании молекулярных масс (Мм) компонентов по методике Лекыли (Laemmli U. К. . 1979) использовали рекомендованную "автором пос-

3

!

ледовательность подготовки белкового раствора

Белки и изоферменты фракционировали на приборах для вертикального ЭФ (LKB 2001-001 Vertcal Electrophoresis Unit, LKß 2001-002 Double Length Vertical Electrophoresis Unit) и ИЭФ (Multiphor II) согласно методическим рекомендациям фирмы Pharmacia LKB Biotechnology (Швеция). Белковые компоненты в гелях идентифицировали по изоэлектричес-. ким точкам (ИЭТ, pi), UM и относительной электрофоретической подвижности (RИ. Использовали стандартные наборы белков - маркеров pi (Sigma IEF M 1) и ММ (Serva Protein Test Mixture 4, 5).

Гели окрашивали тотальным белковым красителем кумасси синим (Serva Blue R. G, W), либо выявляли изозимы пероксидазы и эстераэы в зависимости от целей эксперимента. Пероксидазную активность в гелях обнаруживали по модифицированной методике А. И. Бояркина (19S1), для чего в 200 мл 0,2 M ацетатного буфера pH 4,7 растворяли 120 мг бензи-дина и 1/2 таблетки аптечного пергидроля. Иаоэимы эстеразы окрашивали в 0,1 U фосфатном буфере pH 7,2, содержащем по 0,5 мг/мл «.-нафтилаце-тата и красителя Fast Blue ВВ. Избыток красителя из гелей отмывали в 102 растворе этанола с 5Х уксусной кислоты. Высушенные гели фотографировали с . нижней подсветкой через матовое стекло на пленку Мик-рат-300, сканировали на лазерном денситометре UltroScan XL (LKB).

При классификации злектрофоретических спектров растворимых белков и изоэстераз клубней опирались на методы, использованные в европейском каталоге-определителе сортов картофеля (Stegemann H., Loesch-ke Y., 1976). При анализе иэофершитов использовали единую номенклатуру для Solanum, Lycoperslcon и Capsicum (Qulros С. F., MsHale N. , 1985; Douches D.S., Qu i ros С. F., 1987; 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Дифференциальная активность изоморфов пероксидазы и эстераэы

в различных органах и тканях растений картофеля В наших экспериментах иэопероксидазная и изоэстеразная системы картофеля характеризовались ярко выраженной дифференциальной экспрессией отдельных изоморфов в зависимости от того, из какого органа (ткани) растэния экстрагировали оелковый образец (рис.1-3). Одни и те же генотипы имели сильно различающиеся изозстераэные и изопероксидаз-huô спектад в зависимости от изученного уровня. Дифференциальная зкс-4

\

прессия генов, контролирующих изоферменты, позволяет в динамике; с

разных позиция и многопданово охарактеризовать изучаемой генотипа Именно с этой точки зрения необходиш оценивать, последовательное описание-в диссертации феитипов обеих изученных изоферментных систем соответственно для корней, пробирочных растений, микроклубней и клубней. 3 работе детально описаны ЭФ И ИЭФ-спектрн двух изозишни систем, идентифицированы компонентный состав, рI, КГ, проведена количественная оценка отдельных изоморфов методом лазерной денситометрии.

НГ

0,0- 'Л>13

0,08- ЦП

_ , _ Я» М • •

0,13- V ? г1 *

~ * - ~ 'Ч I -т, Ьк И »

о,85-Шй иди

_ „. те Н .тч >! М1

0,34- % 0,40-

0,60-

К

и

18 Я 1|1№?

И ЯЙ « 8 м

ГШ":

И % и ©

8»

. 8

© ?

0,35-

0,53'

®

11,2,3,4 '5'.

Ряс. 1. Спектры ЭФ изопероксидаз (сверху) и изозетераз (снизу) йробирочннх растения, корней, микроклубней и клубней (слева направо) сортов: ЕЬа; 2. Резерв; 3. Баг^е; 4. Раме некий; 5. Луговской.

6

Рис. 2 . Лазерные денситограммы спектров ЭФ изопероксидаэ корней. Сорта указаны на денситограммах.

PI .

4,4 "* л и ^ ^ О Я в -- «RiiftÄf ° - » -ч в ©

6.55— & &

9,5-

р И » | ? м

шшмш

1

Рис. 3 . Спектры ИЭС (pH 3,5-9,5) изозстераз пробирочных растений сортов: 1. Aadappellen; 2. Agria; 3. Ajax; 4. Alctraria; 5. Ausoma; 6. Amazone; 7. Anosta; ß. Arzy; 9. Concorde; 10. Eba; 11. Estim; 12. Famosa; 13. Fianna; 14. Marfona, 15. Por'o; 16. Prior; 17. Producent; 10. Proiresöi 10. Resy; 20. Sirko; 21. Wilja; 22. Белоярский ранний; 23. Виктория; 24. Домодедовский (слева направо). 6

Проверка стабильности здектрофоретических фенотипов пероксидазы

и эстеразы на уровне пробирочных растений ._ ... -

Для определения условий,, необходимых для" адекватного использования белковых "маркеров на уровне пробирочных растений, мы провели цикл экспериментов с 10 сортами (рис, 4-7). Стабильность и генетически обусловленный полиморфизм электрофоретических фенотипов белков и иэо-зимов являются основными двумя условиями, которые должны соблюдаться при использовании белковых маркеров для идентификации генотипов н паспортизации генофонда. В идеале электрофоретический фенотип того или иного белка или иаоферментной системы при анализе лхзбого пробирочного растения одного и того же сорта должен быть полностью иден-РГ

о.ов-1 Р .

И-|!| И? О 1,5^

0,18 -Н ЙЙР^МЗ ?| | 1

^ 5 Н | М

Эй'' * ' Ч "" 0,34-' Й'^.«»'1

0,40

Oft а

Г» - -Л

0,60-а • -

г «

- i

©

Рис. 4. Спектры ЭФ ¡¡аолероксидаа различных частей пробирочных растений сортов: 1-4. Karin (1. пробирочное растение без корней; 2. листья; 3. стебель; 4. корни); 5-6. Лорх (корни); 7-8. Невский (корни); 9-11. ."уговской (корни); 12-27. пробирочные растения: 12-13. Crebella, 14-15. Лорх; 16-17. Белорусский ранний; 18. Вида; 19. Dita; 20 ¡Je? - . 21. Swatova; 22. Borka; 23. Уфимец; 24. Фзленский; 25. Хи-бинегежй:- 1'алахнт; 27. Alda (слева направо).

/

тичным. По всей видимости, в реальности этого быть не может, тем более при анализе такой подвижной системы, как находящееся в перманентном развитии, начиная от комфортных условий на свежей питательней среде до прогрессируют депрессии по мере расходования среды и загрязнения ее метаболитами, пробирочное растение.

По результатам наших экспериментов с разновозрастными пробирочными растениями и их отдельными частями (тканями) лишь изопероксидаз-ные спектры корней сохраняли стабильность при анализе растений от 5 до 8 недель от момента черенкования. Спектры изопероксидаз пробирочных растений без корней воспроизводимы лишь при условии использования

EST

Est S

ifrplpt

Est M

Est F

Рис. 5 . Спектры ЭФ 2. Парце; 3. Poprad; 4. 8. Былина; 9. El ipsa; 10. rla; 13. аоленский; 14-17, 8

Rf 0,0 <|>

0.14

- 0,25

0,33

■0,50

•0,77 |.-'0,83 @

изоэстераз керне й сортов: 1. Чернатица; Eta; 5. Янтарный; 6. Prior; 7. Ранняя роза; Уральский ранний; 11. Волжанин; 12. Alcma-Невский; 18-20. Луговской (слева направо).

fîîiî?

i

, ;U-0,35 №

Vv->. SV'"'"**' „'-•

« iv.'.i vi-;? H-vf"1* ' 'd " ti

Ф

Pita. б. А: Спектры ЭФ иаоэстераз nnofiunmm.n' ю,а « у„КлвМй»м ТГОр^ГГСЗ UiriübHOíjV« Tí вот iiazc.v;¡HOBúro пом-

ню««:! Ситары <*!• изоостераз микроклубяеЯ сортов: 1. Арина; 2. Белорусский 3; 3. Белоярский ранний; 4. Весна; 5. Волганин; 6. Шъер; 7. Искра; 8. Кристалл; 9. Лабинский; 10. Луговской; 11. Майка; 12. Надежда; 13.- tilda; 14. Santé; 15. Раменский; 16. Резерв; 17. Таловс-кий; 18. Энергия; 19. ЕЬа; 20.. Wilja (слева направо).

1

----, V- . ®

« ,, В 5 Ô Р И} I * пататии 3 ?*

G.Г,',- ~ -- ■ ~ Я

;.т. s as > f -i - -

л с 1 â - I * i. А в м ; g á -

9.5 - * „ , Л А ¿i íi » Л

12 3 Í 5 12 3 4 5 iji 2 t ®

Рис. 7 , h: Спектры ИЭФ ( pH 3,5-9,5) растворшди белков (слева) и иаоэстераз (справа) клубней сортов: 1. Луговской; 2. Орбйта; 3. Estima; 4. Prior; 5. Santé. Б: Спектры изозстераз (ИЭФ pH 3,5-9,5) пробирочных растений сортов Karin (1) и Невский (2) с резга™ усиленней чстеразпой активности в зоне пататинового комплегаа.

2- ) ■ 9 L е.-

одновозрастных пробирочных растений; мы описали фенотипы для 6-недельных растений.

Изозстеразная система картофеля, являясь наиболее стабильной на уровне клубней и микроклубней, характеризуется ярко выраавнной изменчивостью спектров на уровне пробирочных растений. Особо следует отметить очень интенсивный вариант зстеразы с Rf 0,39. Характерной и крайне нежелательной для белкового маркера особенностью этого варианта было то, что его активность могла резко возрасти при одновременном уменьшении интенсивности компонентов катодной зоны спектров даже при анализе растений одного возраста одного сорта ( см. треки NN 14-17 сорта Невский на рис.5). По-видимому, такой "всплеск" эстеразной активности в зоне с Rf 0,39 связан с физиологическим состоянием растения и объясняется началом экспрессии генов, ответственных за синтез белков пататинового комплекса при начинающемся спонтанном микроклуб-необразования. Для проверки такого предположения мы провели сопоставление эстеразных спектров образцов пробирочных растений и их корней с подобным феноменом усиления эстеразной активности в районе Rf 0,39 со спектрами изоэстераз микроклубней. Мзоэстеразы микроклубней (и клубней) проявляются на электрофореграммах в ^оне с Rf 0,35-0,53. В этой же зоне располагались компоненты зстераз корней и пробирочных растений, резко усиливших активность (рис.6). Анализ методом МЗФ (рис.7 Б) подтвердил, что резкое усиление эстеразной активности происходит в зоне белков пататинового комплекса,обладаюадах эстеразной активностью,, в количестве 10-15 изоморфов с р1-4,5-5,0 (рис.7 А).

Пататин - главный запасной белок картофеля

Около 40Х растворимых белков клубней составляет семейство, гли-копротеинов, объединяемых ■ названием "пататин"' (Recusen D. .Foote М., 1980; Racusen D., 1984). Сорта картофеля имеют 12-15 компонентов в комплексе пататина. В отличие от большинства запасных белков, пататин обладает энзиматической активностью, ферментативная функция пататина определена как зстеразная (липолитик-ацип-гидролазная).

Уы изучили мультигенное семейство пататина, определив Ш, Rf, pl его компонентов и положение в ЭФ и ИЭФ-спектрах растворимых белков клубней. На рис.7 А и 8 представлены результаты анализов в идентичных условиях разделения, когда половину гелей окрашивали на "обший" белок красителем кумасси, а другую - на эстеразную активность. Очевидно, 10

m

-* ■ -- Q

a b с 1 10 1 10

Рис. 8 . спектры ИЭФ (pH 4-6) растворимых белков Содом) г гпзо-эстераа Сопготч) клубкей сортов: í. ДутовскоЛ; 2. Орбите; a Estira; 1. Prior; 5. Santo; 6. Fianna; 7. Condore; 8. Agria; 9. Hertha; 10. Crebella. Белки - маркеры pi: а) ингибитор трипсина (р1-4,5Р); Ь) р-лактоглобулин А (р1-б,13); с) карбоангидраза бычья (р1-5,85).

компактная группа изоэстераз из 10-15 вариантов cpI-4,5-5,0 составляют пататиновый комплекс.

Б денатурирующих условиях (ЭФ по Laommli U.K. ,1973. с ДДС-Ма и С-керкаптозтанолом) различия между изоморфами пагатина теряются и они мигрируют как один компонент. В ЭФ-спеютрах он идентифицируется как доминирующий компонент с Ш-40 кД.

Паспортизация генофонда S.tuberosum L. in vitro по электрофоре-тическим вариантам пероксидазы корней пробирочных растений

Анализ 125 сортов показал, что ЭФ-спе^тры пероксидазы корней пробирочных растений гартофеля разделяются на семь зон электроморфами, по-видимому, мономорфными в генофонде культурных сортов (рис.9). Мы их использовали в качестве маркерных при делении спектров гга зоны Ргх 1-Ргх 7. В условиях наших экспериментов в общей сложности было идентифицировано 37 электроморфов пероксидазы;дифференциация 5 сортов ■ из 125 идентифицированных приведена в таблице, йэопероксидазная генетическая система корней пробирочных растений наиболее полно удовлетворяет требованиям биохимической идентификации генотипов картофеля и иепольэованз нами для паспортизации генофонда S. tuberosum L. in vitro.

11

PRX

Prx 7 i

Ш *

Prx 6 !

¡;

-Й < t} 4

Prx 5 К ' ! ; '.' (1 tí

H ■■•< ' .i U ¿»

\ . i

Prx 4

í!

м t

Prx 3 :. s?

t I H

(I » > •< я

' tí f¡ "Л ' li 4 '<*

t- 0,34 tt

0,40

W

Prx 2 :

. -------0.60

Prx 1>

Рис.9 . Спектры ЭФ изопероксидаз корней сортов: 1. Чернатица; 2. Парце; 3. Poprad; 4. Eta; 5. Янтарный; 6. Prior; 7. Early Rose; 8. Бьшша; 9. Elipsa; 10. Уральский ранний; 11. Волжанин; 12. Alomarla; la йценский; 14. Turbella; 15. Восе; 16. Весна; 17. Льво-вянка; 18. Зубренок; 19. Dita; 20. Волжский (слева направо).

Таблица . Дифференциация, сортов картофеля по электрофорети-ческим вариантам пероксидазы корней пробирочных растений

Ргх 1 Ргх 2 Ргх 3 Ргх4 Ргх 5 Ргхб Ргх7

N Сорта 12345678 12345678910 12345 1234 12345 1234 1

1 Аксеновский +-+—+++ ++-+-+-+-+ —++ —+----+ +—+ -

2 Бежецкий —у —•)-+-+-+ +—+ +--+ — ++ т—+ -

3 Белорусский ранний —+-+ +Ч-+-+-+-+ ----+ —+ +-—+ +-- + -

4 Белорусский 3. +—I—+++ ++—+-+-+ ----+ ----+ --++ -

Б Велоягский ранний —+++ -+-+-+-+-+ ----+ ^—+ —-++ —+ -

12 '

Полиморфизм проявлялся в каждой из семи зон пероксидазной активности, сорта идентифицированы по присутствию (+) или отсутствию (-) электроморфов пероксидазы без учета их интенсивности. Количественная ~ оценка спектров изопероксидаз документирована в виде лазерных денситограмм. Ш 125 изученных нами сортов лишь 1 пара имела идентичные спектра В таких случаях мы рекомендуем использовать высокополиморфную изоперок-сидазную генетическую систему пробирочных растений (с учетом ограничений по стабильности г одновозрастных). Вследствие выраженной тка-неспецифичности экспрессии отдельных иаоморфов изопероксидазные спектры пробирочных растений резко отличаются от спектров корней. Изопе-роксидазная генетическая система пробирочных растений молит использоваться как дополнительная и независимая от аналогичной системы корней при сортовой идентификации картофеля in vitro.

Паспортизация генофонда S. tuberosum L. in vivo и in vitro m спектрам растворимых белков и изоэстеразной и изопероксидазной генетическим системам клубней и микроклубней

Мы провели паспортизацию 60 сортов Питомника международного испытания сортов картофеля и ряда других наиболее распространенных генотипов на уровне клубней, а также 30 сортов на уровне мпсроклубней методами ЙЭФ и ЭФ и лазерной денситометр™. Анализировали генетически детерминированный полиморфизм растворимых белков, изозстеразную и изопероксидазную генетические системы.

В наших экспериментах с маркерами ЙЗТ белки клубней картофеля располагались в диапазоне р1-4,4-9,6. В самой кислой зоне вблизи анода (р!-4.5-5,0) располагались многочисленные узкие, тесно примыкающие друг к другу , плохо разделяющиеся компоненты семейства пататиновых белков. Далее по направлению к татоду, вплоть до очень характерного для спектров ИЗВ белков клубней картофеля мономорфного компонента с pl~ 6,3, разделяющего спектры пополам, выявлялись минорные и несколько интенсивных вариантов белков. Среди последних выделялись компоненты с р 1-5,3 и 5,7, присущие многим сортам. Наряду.с компонентом с ИЭТ 6,3, для большинства сортов был характерен своеобразный дуплет компонентов в районе р1«б,5-8,б (рис. 10-11). Шньшая часть сортов не обладали этими двумя вариантами белка, в том числе такие широко распространен!«, как Невский, Луговской. В диапазоне р1-7,7-9,5, в катодной зоне гелей, располагались наиболее интенсивные компоненты в спектрах ИЭФ балков клубней картофеля. В общей сложности в спектрах ИЭКрН 3,59,5 или 10) выявлялось до 30-40 компон чтов белков, в зависимости от

Г'

Я Si

si

^ А А "*

M»

abo

4M Л. » ¿b 4ÜW» «». ««FC1 'W —» да»

^»"'-««¡¿•eÄ»«»»

5 ^ *

« et

а «с

» <*

à

в

Рис.ю . Спектры ЮФ (pH 3,5-9,5) клубней сортов: 1. Белоярский ранний; 2. Condore; 3. Agria; 4. Aleñarla; б. Eba; 6. Santé; 7. Бежецкий; 8. Бронницкий; 9. Верба; 10. Marko; 11. Early Rose; 12. Erdcraft; 13. .Надежда; 14, Miranda; 15. Лорх; 16. Раменский; 17. Столовый IS; 18. Шлина; 19. Adretta (слева направо). Белки - маркеры pi: а) ингибитор трипсина (pI-4,55); b) "арбоангидраза В (pl-6,57); с) трипсиноген (р 1-9,3).

Р1

4.4 -f

'ШШвШавЯйШвмвв*

- £ 2--î * - I -

IT

6,55-* -

9.5-

« » _ в ^

± z - * 4 '

Рис. 11. Спектры ИЭФ (рН 3,5-10) растворимых белков микроклуОней сортов: 1. Таловский; 2. Ыайка; а Лабинский; 4. Луговской; 5. Крас-иопольский; 6. Искра; 7. Энергия; 8. Белорусский 3; 9. Белоярский ранний; 10. Надежда; 11. Elipsa; 12. Eba; 13. Ибъер; 14. Santé; 15. Вэватор; 16. Пересвет; 17. Темп; 18. Кристалл; 19. Невский; 20. Восе; 21. Арина; 22. Лорх (слева направо). 14

генотипа. Генетически детерминированный полиморфизм вариантов белков клубней и микроклубней наблюдался на всем протяжении спектров ИЗФ от pl-4s 4 до 9,6.

В системе Дэвиса (Davis В. J., 1964) основная масса компонентов растворимых белков клубней относятся к медленно- и среднеподвижным. Для удобства описания ЭФ-фенотипов мы разделили спектры белков на 5 . зон по мономорфным компонентам с Rr 0,53; 0,45; 0,32; 0,18. В общей сложности при анализе 60 генотипов № идентифицировали 54 варианта растворимых белков. Шношрфными оказались только 4 варианта, во всех зонах отмечался выраженный межсортовой полиморфизм.

йвоэетеразный комплекс клубней составляет компоненты спектров с 0,35<Rf<0,53. Всего было идентифицировано 27 электрофоретических вариантов эстеразы с выраженным генетическим полиморфизмом.

Изопероксидазные системы клубней и микроклубней также многоком-поненты (27 и 28 вариантов соответственно) и сортоспецифичны;несколько неожиданным было то, что изопероксидазные спектры клубней и мик- . роклубней одних и тех же сортов сильно различались.

Для целей- сортовой идентификации мы собрали каталог электрофо-реграм изученных белковых систем. Шмимо фотографий и самих гелей, для документации результатов анализа мы просканировали все треки на лазерном денситометре UltroSean XL с кепользоваггкем гсомтьютерггой ' программы Gel Scan XL.

ВЫВОДЫ

1. Изучены электрофоретические фенотипы растворимых белков и множественных молекулярных форм пероксидазы и эстеразы картофеля на уровне клубней, микроклубней и пробирочных растений; варианты белков и изоморфы ферментов охарактеризованы по изоэлектриуеским тошеам (pi) и относительной электрофоретической подвижности (Rf).

2. Показана диг Чренциальная экспрессия изоморфов пероксидазы и эстеразы в листьях, стеблях и корнях пробирочных растений, а также в ют.роклубнях и клубнях. Обнаружен значительный полиморфизм , по обеим изоферментяш системам в генофонде культурных автогетраплоидных сортов.

3. Изучены стабильность и изменчивость зимограмм пероксидазы и эстеразы из различных органов пробирочных растений в цикле последовательных микрочеренкований при депонировании коллекции оздоровленных сортообразцов in vitro. Показано, что стабильность злектрофоретичес; кого критерия идентификации генотипов ---.ртофеля наиболее полно саблю-

дается при анализе фенотипов пероксндазы корней пробирочных растений в возрастном интервале 5-8 недель от момента черенкования.

4. Разработана система дифференциации сортов картофеля по элект-рофоретическим фенотипам пероксидазы корней пробирочных растений и проведена паспортизация генофонда S. tuberosum L. in vitro (125 сортов),

5. Изопероксидазная система пробирочных растений без корней (стебель+листья) также полиморфна и сортоспецифична и отличается от спектров корней вследствие тканеспецифичности; она может использоваться как дополнительная при сортовой идентификации картофеля in vitro при условии использования одновоэрастных пробирочных растений.

6. Йэоэстеразная система подвержена значительным изменениям в зависимости от возраста и физиологического состояния пробирочных растений. Идентифицированные различия выражались в резком изменении интенсивности определенных изоморфов б зоне белков пататинового комплекса и связаны, по-видимому, с экспрессией генов запасных белков в начале спонтанного микроклубнеобразования.

7. бучено мультигенное семейство пататина - главного запасного белка картофеля: -определены компонентный состав, изоэлектрические точки иэоморфов, молекулярная масса, пока: л межсортовой полиморфизм, идентифицировано положение компонентов пататинового комплекса в элек-трофоретических и изозлектрофоретических спектрах растворимых белков клубней.

8. Проведена паспортизация сортов картофеля на основе электрофо-ретических спектров растворимых белков и зимограмм изоэстераз и изо-лероксидаз микроклубней и клубней.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Организационно-методические основы сертификации и контроля качества оздоровленного семенного картофеля в Московской области// U- ГОСНИТИ. - 1990.-21 с. (со, .т. Утешеа ЕД.Трофимец ЛЕ, Анисимов R R , Мусин С. М., Попов Б. А. , Алябьева А. В. ).

2. Возможности использования белковых маркеров в биотехнологий картофеля. 3. Паспортизация генофонда и прикладные аспекты проблемы// Тр. НИИКХ.-Биотехнология в картофелеводстве.-М.-1991. С. 24-34. (со-авт. Мусин С. М. ).

3. Биохимическая идентификация генотипов картофеля// Методы оценки оздоровленных сортов и меристемных линий в элитном семеноводс-тре ка^'Офедя. - М. - 1991,- С. 18-37. (соавт. Писарев Б. А., Трофимец ,1 }1, Анисимов R В. , Ыусин С. М., Князев R А., Русинова Е. Я).

16