Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание трансгенных линий белокочанной капусты с новыми агротехническими свойствами

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Создание трансгенных линий белокочанной капусты с новыми агротехническими свойствами"

На правах рукописи

ГРИБОВА Татьяна Николаевна

СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЛИНИЙ БЕЛОКОЧАННОЙ КАПУСТЫ С НОВЫМИ АГРОТЕХНИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ

Специальность 03.00.23 - биотехнология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2006

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии Центра «Биоинженерия» РАН Селекционной станции им. H.H. Тимофеева РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор,

академик РАСХН Скрябин Константин Георгиевич Кандидат биологических наук Камионская Анастасия Михайловна

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

Аграновский Алексей Анатольевич

Кандидат биологических наук Ралдугина Галина Николаевна

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Защита состоится «24» и ЮН Л. 2006 г. в /3 часов на заседании диссертационного совета Д.220.043.10 в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Адрес: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49 Ученый совет РГАУ - МСХА имени К. А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ РГАУ-МСХА

имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан «^>> г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.И. Карлов

Актуальность проблемы

Капусту белокочанную (Brassica oleracea var. capitata) выращивают в России повсеместно, практически во всех климатических зонах. Высокая продуктивность при известной простоте возделывания позволяет капусте белокочанной стабильно занимать третье место после злаковых культур и картофеля в отечественном сельскохозяйственном производстве [www.mosreg.ru/11820, 2006]. По содержанию в своем составе витамина С капуста белокочанная занимает одно из первых мест (до 45 мг\100 г), превосходя по этому показателю, например, лимоны (40мг\100г), и считается незаменимым его источником в зимнее время на большей части территории Российской Федерации.

В связи с этим, получение стабильного урожая капусты белокочанной является одной из важнейших задач отечественного растениеводства. Решение этой проблемы подразумевает как увеличение продуктивности культивируемых гибридов капусты, так и повышение их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды [Ranjekar Р. et al., 2003].

Селекция белокочанной капусты в последние годы вышла на качественно новый уровень благодаря созданию гибридов Fl, которые оказались устойчивыми, высокоурожайными и соответствующими всем стандартам современного промышленного овощеводства [Монахос Г.Ф., 2003].

Сегодня для создания сортов и гибридов белокочанной капусты с новыми направленно измененными агротехническими свойствами в сочетании с методами традиционной селекции перспективным представляется использование методов генетической инженерии. Комбинация традиционных способов селекции и методов трансгенеза позволяет эффективно совместить полезные признаки, кодируемые вносимым геном, с набором выгодных сортовых характеристик, полученных благодаря многолетнему труду селекционеров.

Промышленное земледелие предполагает интенсивное использование гербицидов для борьбы с сорняками. Многие годы для борьбы с сорняками в период вегетации использовали гербицид «Семерон». В настоящее же время, в списке разрешенных к использованию препаратов, гербициды для обработки вегетирующих растений отсутствуют [Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в 2005 году].

Поэтому разработка схемы создания гибридов капусты, включающей трансгенную компоненту и получение на ее основе устойчивых к гербицидам растений, представляется весьма актуальной задачей. Таким образом, создание трансгенных гербицидоустойчивых гибридов Fi позволит полностью механизировать процесс выращивания этой культуры.

Цели и задачи исследования

- создать трансгенные фертильные аналоги родительских форм перспективных гибридов белокочанной капусты, несущие ген фосфинотрицин-ацетилтрансферазы фаг), обеспечивающий устойчивость к гербицидам на основе фосфинотрицина;

- разработать схему селекционного процесса с участием трансгенной составляющей для получения гибридов капусты белокочанной;

- разработать эффективные протоколы регенерации и трансформации для четырех линий капусты белокочанной отечественной селекции Гэс 2, Мег- 2, Зму 7, Дрв 2;

- получить трансгенные растения четырех линий капусты белокочанной, экспрессирующих ген устойчивости к гербициду фосфинотрицину bar,

- провести молекулярно - биологический анализ полученных трансгенных линий капусты (ПЦР-анализ, дот-блот гибридизация, определение количества копий Т-ДНК инсерций методом AL-PCR);

- провести лабораторные и ограниченные полевые испытания на проявление признака в поколении Tj и проанализировать полученное расщепление.

Научная новизна

Впервые разработана схема селекционного процесса с участием трансгенной составляющей для получения гибридов капусты белокочанной. На основании схемы определена точка приложения трансгенной технологии в традиционном селекционном процессе, то есть, выбран компонент для генетической модификации.

С использованием метода агробактериальной трансформации впервые получены трансгенные фертильные аналоги стерильных родительских форм четырех линий капусты белокочанной.

Впервые для молекулярной характеристики полученных трансгенных растений капусты белокочанной применен метод полимеразной цепной реакции с пришитыми адаптерами (Adaptor Ligation-PCR).

Практическая значимость полученных результатов

Разработанная схема селекционного процесса может представлять важное практическое значение для РФ, поскольку создание трансгенных гибридов капусты белокочанной, устойчивых к гербицидам, позволит снизить затраты ручного труда в процессе выращивания.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены:

- как составная часть отчета по Государственному контракту №43.050.11.1537 от «05» февраля 2002 г. по теме «Изучение генетических основ получения трансгенных растений с заданными свойствами»

- на 7-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003)

- на 2-й конференции общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003)

- на II Московском международном конгрессе. «Биотехнология. Состояние и перспективы развития» (Москва, 2003)

- на VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Москва, 2005)

- на 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005)

- на III Московском международном конгрессе. «Биотехнология. Состояние и перспективы развития» (Москва, 2005).

Публикации

По результатам исследования опубликовано шесть тезисов и две статьи, подана одна заявка на изобретение, в которых отражены основные положения диссертации.

Структура и объем работы

Работа изложена 11a/OJL страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, главы результаты и обсуждения и выводов; содержит /Утаблиц, JLO рисунков и библиографический список из fiO наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования

Материалом для работы служили растения четырех линий капусты, фер-тильные аналоги стерильных родительских линий с цитоплазматической мужской стерильностью: Зму 7, Гэс 2, Мег-2 (среднепоздние) и Дрв 2 (поздняя). В качестве эксплантов использовали гипокотили и семядольные листья 7-8 дневных проростков, выращенных в культуре in vitro. Для модификации растений капусты использовали метод агробактериальной трансформации [Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р./Москва «Мир». 1991 - 408 стр.].

Бактериальные штаммы и плазмиды

В работе использовали агробактериальный штамм GV3101, содержащий вектор рВаг, полученный удалением из исходной плазмиды pBIBar [Падегимас Л., Шульга O.A., Скрябин К.Г. //МЬл.биол. т. 27. с. 947-951. 1993; Грибова Т.Н., Камионская A.M., Скрябин К.Г. // Биотехнология. Т.6, с. 12-19, 2005] кассеты экспрессии гена nptll. Плазмида рВаг содержит кассету экспрессии bar гена, под контролем 35S промотора и NOS терминатора. Экспрессия гена bar, кодирующего фермент фосфинотрицинацетилтрансферазу, обуславливает устойчивость к гербициду L-фосфинотрицину.

Трансформация и регенерация

Экспланты получали из проростков стерильных растений, выращенных в культуре in vitro.

Первичную селекцию регенерантов проводили in vitro на питательных средах с различной концентрацией селективного агента фосфинотрицина.

Адаптацию трансформантов к почвенным условиям проводили на гидропонной установке «Минивит-2».

Все полученные результаты экспериментов были обработаны с помощью методов математической статистики (дисперсионный анализ и метод %2) [Доспехов Б.А./М.: Агропромиздат.1985 - 351 с. ил.].

Молекулярный анализ

Молекулярно-генетический анализ трансформантов проводили при помощи ПЦР анализа со специфичными к трансгенной вставке праймерами, с использование дот-блот гибридизации и AL-PCR (adaptor ligation PCR).

ПЦР-анализ на наличие гена bar проводили с использованием специально подобранных и синтезированых праймеров. Амплификацию проводили на ам-плификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Москва).

В качестве метки при дот-блот гибридизации использовали зонды, меченые biotin-11-dUTP («Синтол», Москва), полученные методом ПЦР. Детекцию проводили помощью щелочной фосфатазы, ковалентно связанной со стрепта-видином.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конструирование вектора рВаг для трансформации капусты белокочанной

Задачей первого этапа работы было удаление гена устойчивости к канами-цину прШ, находящегося под промотором nosP и терминатора nosT из вектора pBIBar.

Рис. 1. Рестрикционный анализ дериватов рВ1Ваг (негатив) (а) и карта вектора рВаг (6).

Дорожки:

1 - продукт рестрикции плазмиды рВ1Ваг 2-7- продукты рестрикции дериватов рВ1Ваг 8 - маркер размера (Л НМШ)

Согласно данным рестрикционного анализа (рис.1 а), полученные производные плазмиды рВЮаг (дорожки 2-7 элекгрофореграммы) расщеплялись эн-донуклеазой рестриктции PstI на два фрагмента размером 6555 и 4412 п.н., что соответствует теоретически рассчитанному искомому размеру новой плазмиды, в то время как, исходный вектор pBIBar (дорожка 1) расщеплялся на три фрагмента размером 6555, 4923 и 1947 п.н.

Карта полученной плазмиды рВаг размером 10967 п.н. представлена на рис. 1 б.

2. Разработка схемы селекционного процесса с участием трансгенной составляющей

Для решения поставленной цели, нам необходимо было определить, какую компоненту будущего промышленного гибрида необходимо трансформировать чужеродным геном.

Учитывая возможный риск распространения трансгенной пыльцы (горизонтальный перенос) на близкородственные виды, связанного с перекрестным опылением, мы определили, что конечной трансгенной родительской формой в селекционном процессе должна быть форма с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС). Однако с точки зрения селекционного процесса линию с ЦМС нельзя использовать в качестве исходной для трансформации, так как в таком случае невозможно получить семенное потомство от самоопыления и, следовательно, растение, гомозиготное по трансгену. Вместе с тем, с точки зрения классической генетики, проявление чужеродного гена у трансгенных растений рассматривается как доминантная мутация, а генотип растения - первичного трансформанта - с единичной вставкой трансгена определяется как геми-зигота.

Исходя из вышеизложенного, в качестве исходных для трансформации нами были выбраны линии, каждая из которых являлась фертильным аналогом стерильной родительской формы, используемой в селекционном процессе при создании перспективных, высокоурожайных российских гибридов.

Для использования в промышленных посадках гибридов F1 капусты белокочанной, созданных на основе полученных трансгенных растений, мы разработали схему селекционного процесса для получения трансгенных родительских форм с ЦМС будущего гибрида F1, гомозиготных по гену bar (рис. 2).

3. Изучение регенерационной способности различных типов эксплан-

тов.

Дня анализа способности к регенерации различных частей растения использовали два типа эксплантов: семядольные листья и гипокотили.

В результате проведенных экспериментов было показано, что в качестве экспланта необходимо использовать гипокотили, т.к. при использовании семядольных листьев в качестве экспланта формирование морфогенного каллуса практически отсутствовало.

-л—

При использовании гипокотилей наблюдалось формирование морфогенно-го каллуса и регенерация.

Фертильный аналог стерильной линии, Т„ 1»г -

самоопьше1 bar - X bar -

скрещивание с ЦМС Лормой Ьаг . х Линия ЦМС

отбор на проявление признака, анализ аллельмого состояния трансгена по потомству, насыщающие скрещивания

I

Фертильный аналог bar bar

Лмиш» ЦМС bsr bar

Опылитель Материнская bar bar X форма m-шия ЦМС bar bar

размножение в

теплице

размножение в пола

Поддержание родительских форм

Материнская Отцовская форм.5 лпик» X форма ЦМС bar bar Линия 2

Промышпемжлй гкбрид с ЦМС bar -

Рис. 2. Схема селекционного процесса трансгенных растений для получения промышленных гибридов с ЦМС, устойчивых к гербицидам на основе фосфинотрицина

3.1. Изучение влияния фитогормонов на регенерационную способность линий капусты белокочанной.

С целью изучения влияния состава питательной среды на образование каллуса и последующее формирование регенерантов нами была разработана схема, состоящая 12 комбинаций питательных сред (табл. 1) с различным сочетанием цитокининов (БАП, кинетин), которая в дальнейшем была испытана для каждой изученной линии. Рабочий диапазон варьирования концентраций был выбран на основании анализа литературных данных.

Для оценки влияния комбинаций фитогормонов на образование каллуса и регенерацию исследовали следующие параметры: образование морфогенного или неморфогенного каллуса, скорость формирования каллуса, возможность соматического эмбриогенеза, эффективность регенерации, %.

3.1.1. ЛинииГэс 2 и Зму 7

Наиболее результативными оказался вариант с концентрацией б-БАП -2 мг/л и кинетина - 1 мг/л. Средняя эффективность регенерации составила 86,7% для линии Гэс2 и 81,1% для линии Зму 7. Таким образом, 11 вариант опыта, отражающий совместное действие невысоких концентраций кинетина и БАП был признан оптимальным для линий Гэс 2 и Зму 7.

Табл. 1. Варианты опыта (1-12) с различными сочетаниями фитогормонов для регенерации линий Гэс 2, Зму 7, Дрв 2и Мег-2

6-БАП, мг/л

Кинетин, мг/л 0 1,0 (0,5*) 2,0 (1,0*) 5,0 (2,0*)

0 1 2 3 4

0,5 5 6 7 8

1,0 9 10 11 12

' - Концентрация 6-БАП для линии Дрв 2.

3.1.2. Линия Дрв 2

Проведенный статистический анализ различных вариантов концентраций фитогормонов в питательной среде по выбранным нами параметрам позволил предположить, что для эффективной регенерации линии Дрв 2 решающим фактором является тип применяемого цитокинина, в данном случае БАП, а его концентрация не имеет значения. Наиболее результативными оказались варианты с концентрацией БАП 0,5, 1 и 2 мг/л - 2, 3 и 4. Средняя эффективность регенерации составила 74,4%, 61,1% и 47,8%, соответственно.

Основываясь на эффективности регенерации, фенотипических характеристиках (форма, цвет листьев, габитус) и способности к укоренению полученных регенерантов, 2 вариант был признан оптимальным для линии Дрв 2.

3.1.3. Линия Мег-2

Для подбора оптимальной концентрации фитогормонов в среде по регенерации линии Мег-2 было проведено две серии опытов, поскольку при использовании стандартной схемы оптимизации, состоящей из 12 вариантов питательных сред, не удалось достичь достаточно высокого уровня регенерации, необходимого для проведения трансформации. После добавления в питательные среды борной кислоты в концентрации 150 мг\л по предложенной схеме были проведены опыты по подбору оптимального сочетания фитогормонов, в которых оптимальным был признан 11 вариант.

3.2. Определение оптимальной концентрации селективного агента

В нашей работе для трансформации мы использовали генетическую конструкцию, содержащую селективный ген устойчивости к гербициду фосфинотри-цину (глюфосинат аммония).

Для определения эффективности гербицида фосфинотрицина как селективного агента в зависимости от генотипа, было проведено тестирование регенерантов каждой исходной линии на его действие. В результате были получены данные, при которых оптимальной концентрацией фосфинотрицина в питательной среде при отборе регенерантов для всех четырех линий была признана концентрация 5 мг/л.

Для выделения трансгенных растений в поколениях из большой выборки полученных семян, необходимо было определить предельную концентрацию гербицида в питательной среде для отбраковки нетрансгенных проростков.

Анализ данных по подбору концентрации селективного агента показал, что отбор трансгенных растений из семян при 100% гибели контрольных (нетранс-генных) растений необходимо проводить при концентрации фосфинотрицина 10 мг/л.

4. Первичный молекулярный анализ трансгенных растений капусты белокочанной

4.1. Выявление наличия гена bar в геноме растений капусты белокочанной при помощи ПЦР-анализа.

В ходе проведения первых экспериментов по ПЦР-анализу полученных ре-генерантов было отмечено наличие неспецифических фрагментов и слабая амплификация гена bar. Ингибирование прохождения ПЦР происходило даже на плазмидной ДНК при добавлении раствора геномной ДНК не трансгенной капусты, что, возможно, связано с наличием ингибиторов неизвестной природы, выделяющихся вместе с ДНК капусты. Поэтому, нами была проведена оптимизация параметров ПЦР реакции: опробованы различные добавки (формамид, глицерин, диметилсульфоксид, бетаин), повышающие специфичность реакции и использовано несколько вариантов праймеров.

В результате проведенной работы были подобраны условия амплификации гена bar с наиболее подходящей парой праймеров bar l-bar2, что позволило использовать данный метод для анализа трансформантов капусты белокочанной.

ш

I ] о

Рис. 3 Электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 1% агарозном геле.

- слева направо:

- 1, 3, 4, 5, 6, 8 - ПЦР на препаратах ДНК из растений, не несущих ген bar, линия

Гэс 2;

-2,7- ПЦР на препаратах ДНК из растений, несущих ген bar, линия Гэс 2;

- 9 - контроль; продукт ПЦР на плазмидной ДНК pBAR; -10- ПЦР в отсутствии ДНК матрицы;

-11- маркер молекулярной массы (DNA Ladder 1000 bp, Fermentas).

Таким образом, ПЦР анализ трансформантов, прошедших первичный отбор на среде с фосфинотрицином на наличие гена bar проводился по оптимизированной методике.

В результате было отобрано 34 растения (и.т.с.) в которых амплифициро-вался фрагмент ДНК соответствующего размера. Пример электрофоретическо-го анализа продуктов ПЦР показан на рис. 3.

4.2. Выявление наличия гена bar в геноме растений капусты белокочанной при помощи дот-блот гибридизации.

Для уточнения результатов ПЦР и гарантированного утверждения о наличии гена bar в отобранных растениях, мы дополнительно использовали метод дот-блот гибридизации.

Наши предположения относительно необходимости проверки полученных ранее результатов ПЦР анализа трансформантов подтвердились. Так, например, для образцов № 1, 2, 6 линии Мег-2, № 10, 25 линии Зму 7 и № 17, 26, 27, 28 линии Гэс 2, отобранных по результатам ПЦР анализа как трансгенных, трансгенная природа методом дот - блот гибридизации не подтвердилась (рис. 4).

Ф О .

1 2 3 * 1 б 7 »

© & ® # @ . 4» ®

• 10 11 11 13 14 15 1«

«1 «¡Г

17 It 19

£t ф <S| ф |Ц

Эммг 1.S 1,0 0,i «•» «■»»

3 - 5, 7 -9,11 -16,18,19 - образцы, в которых ген bar присутствует в геноме растения;

1 -2, 6,17- образцы, в которых ген bar не присутствует в геноме растения; 3 мкг -0,5- разведение ДНК трансгенного растения картофеля с геном bar; «-» - образец ДНК не трансформированного растения капусты; «+»- образец ДНК плазмиды рВаг

г' лт\\j<,*• ,-• vj-У -it. »У.т|

I -: » и' A W.' ,

t" . ' , >• - "I /£

28 29 39 31 *

. _ Я ( .. <=V _ ii<

20-24- образцы, в которых ген bar присутствует в геноме растения; 25 -28 - образцы, в которых ген bar не присутствует в геноме растения;

29 - образец ДНК не трансформированного растения капусты;

30 - образец ДНК плазмиды рВаг;

31- образец ДНК трансгенного растения картофеля с геном bar;

Рис. 4

Пример анализа растений - регенерантов методом дот-блот гибридизации.

В результате проведения серии опытов по трансформации было получено 336 регенерантов, из которых после первичного молекулярного анализа, было отобрано 26 трансгенных растений четырех линий капусты белокочанной (табл. 2), таким образом, эффективность трансформации составила в среднем по всем четырем линиям 7,65 %.

Табл. 2. Результаты опытов по трансформации четырех линий капусты белокочанной.

Линия Количество, шт. Эффективность, %

эксппантов регенерантов трансформантов регенерации * трансформации

ГЭС 2 113 98 7 86,7 7,1

Мег-2 114 72 4 63,2 5,5

Дрв 2 110 82 9 74,7 10,9

Зму 7 103 84 6 81,5 7,1

Итого 440 336 26 -

* - процент регенерантов к общему количеству эксппантов;

** - процент полученных трансгенных растений от количества регенерантов.

5. Определение количества копий трансгенной вставки методом AL-PCR.

5.1. Амплификация геномной ДНК, фланкирующей Т-ДНК с 5' конца (правая граница Т-ДНЮ.

Для молекулярно генетической характеристики одного из полученных трансгенных растений капусты линии Мег-2 № 3117, отобранного по результатам первичного молекулярного анализа, нормально развитого, хорошо адаптировавшегося к условиям in vivo и включенного в схему селекционного процесса, мы использовали метод AL-PCR (adaptor ligation PCR). Метод включает в себя следующие этапы: рестрикцию геномной ДНК трансгенного растения, ли-гирование геномной ДНК с искусственно синтезированными адаптерами и два раунда ПЦР.

Для проведения рестрикции мы использовали рестриктазы, формирующие в месте разрыва «тупые концы»: EcoR V, Dra III, Hpa I, Zrm I и Ssp I. Рестрик-ционную смесь лигировали с адаптером, затем, для увеличения количества фрагментов, содержащих Т-ДНК и геномную ДНК провели две последовательных ПЦР со специфическими праймерами на адаптер (АР) и, соответственно, правую границу Т-ДНК (RB, RB1).

В результате проведения второго раунда ПЦР были получены единичные фрагменты ДНК длиной около 160 н.п. в случае с рестриктазой Hpa I, около 180 н.п. в случае с рестриктазой EcoKV и около 900 н.п. в случае с рестриктазой Dralll (рис. 5).

Поскольку, вероятность образования фрагментов одинакового размера при перенесении (встраивании) более одной копии Т-ДНК крайне мала, следовательно, по количеству фрагментов, амплифицированных при проведении специфических ПЦР, можно определить копийность трансгенной вставки. Таким

образом, полученные нами результаты анализа геномной ДНК анализируемого растения №3117 методом АЬ-РСК. позволяют сделать вывод о наличии единичной копии Т-ДНК в геноме.

1 2 3 4 5 М

- 150 н

Рис. 5 Электрофоретический анализ второй ПЦР на ДНК, обработанной рестриктазами EcoR V, Dra III, Нра I, Zrm I и Ssp I с праймерами API и RB2.

1 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой Нра I;

2 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой Ssp I;

3 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой EcoR V;

4 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой Dra III;

5 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой Zrm I; М - маркер размера 1000 н.п.

После секвенирования фрагментов ДНК размером около 160 н.п. (рестрик-таза EcoR V), около 150 н.п. (Нра I) и 900 н.п. (Zrm III) было показано, что последовательность фрагментов 150 н.п. и 160 н.п. включала в себя часть последовательности 35S промотора, правую границу Т-ДНК (RB), последовательность адаптера и заключенную между ними последовательность (рис. 6), которую мы проанализировали и не обнаружили гомологии с ДНК трансформирующего вектора рВаг.

npaÑMfp API

-■víVV-.jiAi-cVi.

nputmp RB2

Рис. б. Секвенированная последовательность фрагментов, полученных при рестрикции эндонуклеазами Есо11 V и Нра I.

Секвенированная последовательность фрагмента 900 н.п. содержала только неизвестную последовательность ДНК, фланкированную с обоих концов

адаптерами. Сравнительный анализ, проведенный в банке последовательностей NCBI Blast данной нуклеотидной последовательности, полученной при обработке геномной ДНК капусты рестриктазой DralII, выявил высокую степень гомологии с геномной ДНК Brassica napus var. napus и Brassica rapa var. pe-kinensis. Таким образом, мы сделали предположение, что в результате проделанной работы в данном случае мы случайным образом выделили и секвениро-вали фрагмент геномной ДНК капусты белокочанной.

5.2. Амплификация геномной ДНК, фланкирующей Т-ДНК с 3' конца (левая граница Т-ДНЮ

Для анализа левой границы Т-ДНК была использована та же последовательность операций, что и для правой границы. Однако никаких специфических фрагментов при проведении ПЦР на ДНК, обработанной всеми пятью используемыми рестриктазами, получено не было. Такие результаты позволили нам предположить, что отсутствие продуктов амплификации со специфическими праймерами на адаптер (АР) и область Т-ДНК, расположенную близко к левой границе (LB1, LB2), обусловлено делецией части Т-ДНК на 3' конце.

Предположив наличие делеции в районе 3' конца Т-ДНК, с помощью программы OLIGO, мы сконструировали специфические праймеры LB3 и LB4 на последовательность, близкую к 3' концу NOS терминатора. Используя вновь сконструированные праймеры LB3 и LB4, мы проанализировали рестрикцион-ные смеси по каждой используемой рестриктазе. После проведения ПЦР был получен единичный фрагмент в случае с рестриктазой Zrm I, размером около 300 н.п. Нуклеотидные последовательности праймеров LB3 и LB4 комплементарны последовательности, следующей в Т-ДНК после стоп кодона NOS-терминатора, следовательно, факт отжига и прохождения реакции свидетельствует о наличие целой последовательности регуляторного элемента (NOS-терминатора).

Результаты проведения двух последовательных ПЦР с праймерами LB4 и LB5 на ДНК, обработанной рестриктазами Zrm I, EcoR V, Нра I, Dra III, и Ssp I представлены на рисунке 7.

Проведенный анализ левой границы Т-ДНК, позволяет нам сделать вывод о наличие одной копии вставки в анализируемом геноме.

Поскольку, результаты определения копийности по правой и левой границе совпали, можно уверенно утверждать о наличии единичной копии Т-ДНК в анализируемом растении.

Для дальнейшего анализа был отобран клон, содержащий фрагмент размером 300 н.п., полученный при обработке геномной ДНК рестриктазой Zrm I. Сравнительный анализ данной секвенированной последовательности в банке последовательностей NCBI Blast показал высокую гомологию с последовательностями Brassica rapa subsp. pekinensis, Arabidopsis thaliana.

Следовательно, левая граница Т-ДНК также фланкирована растительной ДНК капусты, что свидетельствует об отсутствии в геноме растения-хозяина непереносимой части ДНК плазмиды.

Рис. 7. Электрофоретический анализ данных второй ПЦР на ДНК, обработанной рестриктазами Zrm\, EcoRV, Hpa I, Drain и SspI с праймерами API и LB5.

M - маркер размера 1000 н.п.

1 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой Zrm I;

2 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой EcoR V;

3 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой Hpa I;

4 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой Dra III;

5 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой Ssp I.

6. Анализ первого семенного поколения трансгенных растений 6.1. Расщепление в первом семенном поколении от самоопыления трансгенного растения

Для проведения селекционного процесса по разработанной нами схеме, часть цветков индивидуального трансформационного события №3117, обозначенного на схеме (рис. 2) как «Фертильный аналог стерильной линии Т0 bar -», была подвергнута самоопылению в условиях изоляции.

В результате самоопыления были получены семена поколения Ть которое, согласно закономерностям наследования по Менделю, должно было расщепляться на гетерозиготу (bar/ -), доминантную (bar/bar) и рецессивную гомозиготы (- / -), т.е. 3:1.

Для изучения фактического расщепления, полученные семена первого поколения проращивали на селективной среде с фосфинотрицином. В результате, из 56 семян поколения Tj растения №3117 на долю рецессивной гомозиготы пришлось 41 растение, т.е. неустойчивых растений оказалось больше, чем устойчивых. Исходя из полученных данных, было выдвинуто предположение, что, полученное расщепление соответствует 1:3, причем, одна доля растений (устойчивых) приходится на доминантную гомозиготу.

Ранее в опытах с контрольными семенами была определена рабочая концентрация селективного агента фосфинотрицина 10 мг\л при которой обеспечивается 100% гибель не трансгенных проростков, однако при использовании данной концентрации для отбора трансгенных проростков в поколениях, возможно, нами не было учтено аллельное состояние перенесенного гена, то есть

происходила гибель гетерозиготных растений из-за недостаточного уровня экспрессии.

Для подтверждения предложенного нами расщепления 1:3 полученные данные были обработаны с помощью метода /2, в результате чего было получено, что х2факт. =0,1. Поскольку х2факт. < х2теор., нулевая гипотеза принимается, т.е. доля устойчивых растений к неустойчивым распределяется как 1:3, а полученные устойчивые растения, являются гомозиготными по гену bar.

6.2. Расщепление в первом семенном поколении от скрещивания трансгенного растения со стерильной родительской формой

Для перевода трансгена на стерильную основу и получения гомозиготной по гену bar линии, параллельно, с другой части цветков растения №3117 была собрана пыльца, которой опылили соответствующую стерильную форму (Линия ЦМС). В этом случае были получены семена поколения Ti с теоретически ожидаемым расщеплением на гетерозиготу (bar/-) и рецессивную гомозиготу (-/-), т.е. 1:1.

Для выбраковки неустойчивых растений был проведен анализ полученных семян на проявление целевого признака. По результатам анализа расщепления мы обнаружили, что, как и в случае с самоопылением, количество неустойчивых растений больше, чем устойчивых. Однако, в данном случае, несмотря на то, что статистический анализ соответствия экспериментальных данных теоретически ожидаемым показал расщепление 1:3 (х2факт. = 2,4), мы не можем утверждать, как в случае с самоопылением, что выжили только гомозиготные по трансгену проростки, т.к. их просто не могло образоваться результате скрещивания.

Полученные нами результаты расщепления, возможно, связаны со снижением уровня экспрессии гена bar в части гетерозиготных растений, что привело к их гибели на повышенной селективном фоне и смещению доли устойчивых растений в сторону неустойчивых, либо с особенностями района встраивания Т-ДНК в геном растения (гиперметилированный, гетерохроматиновый районы).

6.3. Анализ первого семенного поколения трансгенных растений на проявление признака устойчивости в условиях in vivo.

Полученные трансгенные растения (Т0) линий Зму 7 (4 шт.) и Дрв 2 (2 шт.), прошедшие первичный молекулярный анализ с помощью ПЦР и дот-блот гибридизации, были включены в селекционный процесс согласно разработанной схеме.

После проведения скрещиваний трансгенных растений и получения семян первого поколения, нам необходимо было отобрать гомо- и гетерозиготные по трансгену растения. Для этого, полученные от скрещиваний семена проращивали, проростки обрабатывали раствором гербицида «Баста». Статистическая обработка данных по методу %2 показала следующие результаты:

■S расщепление в поколении Ti, полученного от самоопыления растений №1,

№3, №6 линии Зму 7 и растений №1, №4 линии Дрв 2 соответствовало 1:3. •S расщепление в поколении Ti полученного от скрещивания с ЦМС формой

растений №1, №4 линии Дрв 2 соответствовало 1:1. ■S потомство растения №2 линии Зму 7, полученного от самоопыления, оказалось полностью неустойчивым к фосфинотрицину, что, скорее всего, свидетельствовало о замолкании перенесенного гена уже в первом поколении.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор выражает огромную признательность за неоценимую помощь в выполнении работы Григорию Федоровичу Монахосу, директору селекционной станции им. H.H. Тимофеева; Ольге Альбертовне Шульге, руководителю группы генетической инженерии растений Центра «Биоинженерия» РАН и Геннадию Ильичу Карлову, руководителю Центра молекулярной биотехнологии - за ценные советы при планировании и проведении экспериментов.

Всему коллективу Центра «Биоинженерия» РАН и, особенно, сотрудникам группы трансформации растений за помощь, понимание и поддержку.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены различия в реакции генотипов четырех линий капусты белокочанной отечественной селекции Гэс 2, Мег-2, Зму 7, Дрв 2 на воздействие фито-гормонов в процессе регенерации. Эффективность регенерации 86,7% для линии Гэс 2 и 81,5% для линии Зму 7 достигается при содержании в питательной среде 6-БАП - 2 мг/л и кинетина - 1 мг/л; 63,2% для линии Мег-2 -при концентрации борной кислоты -150 мг/л, 6-БАП - 2 мг/л и кинетина - 1 мг/л; и 74,7% для линии Дрв 2 - 6-БАП 0,5 мг/л.

2. Получено 26 трансгенных растений четырех линий Гэс 2, Мег-2, Зму 7, Дрв 2, экспрессирующих ген bar, которые включены в схему селекционного процесса по созданию трансгенного гибрида капусты белокочанной, устойчивого к гербицидам на основе фосфинотрицина.

3. Эффективность трансформации для линий Гэс 2 и Зму 7 составляет 7,1%; для линии Мег-2 - 5,5% и для линии Дрв 2 - 10,9%.

4. В процессе переноса Т-ДНК в геном растения №3117 (линия Мег-2) произошла делеция участка 3' конца Т-ДНК, включая левую границу, не влияющая на функциональное проявление трансгена.

5. Нуклеотидные последовательности, фланкирующие Т-ДНК растения №3117, гомологичны с известными нуклеотидными последовательностями «GenBank» растительного происхождения (Brassica napus var. napus, Brassica rapa var. pekinensis, Arabidopsis thaliana), что указывает на интеграцию трансгена в геном растения.

6. При самоопылении трансгенных растений доля устойчивых растений к неустойчивым распределяется как 1:3, причем устойчивые растения, являются гомозиготными по гену bar. При скрещивании трансгенных растений с ЦМС формами расщепление соответствует 1:1.

7. Разработанная схема селекционного процесса с участием трансгенной компоненты позволяет избежать не контролируемый выпуск в окружающую среду трансгенной пыльцы, поскольку основана на использовании линий с ЦМС.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Грибова Т.Н. Изучение влияния различных концентраций и сочетаний фитогормонов на регенерацию линий капусты белокочанной. - Сборник тезисов 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых. 2003. -С. 96.

2. Грибова Т.Н., Ракитин А.Л., Стародубцева А.М. Создание вектора для трансформации растений на основе плазмиды pBIBar. - Сборник тезисов 2* конференции МОГиС «Актуальные проблемы генетики», 2003, том 2, С.115-116.

3. Грибова Т.Н., Стародубцева A.M., Скрябин К.Г. Создание трансгенных линий капусты белокочанной с новыми агротехническими свойствами. -Материалы II Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития М.: ЗАО «ПИК «Максима», РХТУ им.Д.И. Менделеева, 2003 - часть I, С. 191-192.

4. Грибова Т.Н., Головешкина E.H., Камионская A.M. Изучение наследования трансгена в поколениях от самоопыления трансгена в первом поколении растений дикорастущей капусты белоцветковой - Материалы VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». 2005. 56с.

5. Грибова Т.Н., Головешкина E.H., Камионская A.M., Скрябин К.Г. Изучение наследования трансгена в поколениях от самоопыления трансгенных растений дикорастущей капусты белоцветковой. - Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 4.1. Москва, 2005. 241с.

6. Грибова Т.Н., Камионская A.M., Скрябин К.Г. Получение трансгенных растений капусты с новыми агротехническими свойствами. - Сборник тезисов 9-ой Международной Пущинской школы - конференции молодых ученых, 2005, 343с.

7. Заявка на изобретение №2005110956 «Способ получение генетически модифицированных растений капусты белокочанной» дата приоритета 15 апреля 2005 г. Грибова Т.Н., Камионская A.M., Скрябин К.Г.

Грибова Т.Н., Камионская A.M., Монахос Г.Ф., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений капусты белокочанной Brassica oleracea var. capitata \ с новыми агротехническими свойствами. - Биотехнология. Т.6, 2005, 12-19 с.

Summary

Obtaining of Brassica oleracea var. capitata transgenic plants with new agrotechnical properties

To genetic transformation of the following four cabbage lines Ges 2, Drv 2, Zmu 7, Meg-2 the strain Agrobacterium tumefaciens GV3101 carrying plasmid pBar with bar gene under the control of 35SCMoV promoter and NOS 3 'terminator was used. The influence of different phytohormones concentrations and conditions under which the regeneration efficiency reaches 63-87% were chosen. It was shown that the mutual influence of both natural and synthetic kinds of cytokinin was demanded. 26 transgenic plants were obtained on the base of optimized method of transformation via Agrobacterium tumefaciens. The transgenic status of these plants was proved by PCR and dot-blot hybridization.

These lines were bar gene hemizygotic. For the first time the selective process scheme to obtain heterozygotic hybrid of cabbage with transgenic component was developed and applied.

As result of the scheme the point of transgenic technology application in traditional selective process was defined. Crossings were held and the first seed generation Ti was obtained.

1,0 печ. л.

Зак. 354.

Tap. 100 3K3.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грибова, Татьяна Николаевна

Список иллюстраций.

Список сокращений.

1. Актуальность проблемы.

2. Цели и задачи работы.

3. Научная новизна.

4. Обзор литературы.

4.1. Селекция капусты белокочанной. Сорта и гибриды.

4.2. Трансгеноз как новый метод селекции растений.

4.2.1. Трансформация Brassica oleracea сегодня.

4.2.2. Техника трансформации.

4.2.3. Маркерные гены.

4.2.4. Регуляторныс последовательности.

4.2.5. Агробактериальная трансформация.

4.2.6. Прямой перенос генов.

4.2.7. Наследование трансгенов у генетически модифицированных растений.

4.3. . Факторы, влияющие на эффективность трансформации.

4.3.1. Бактериальные штаммы и генотип растений.

4.3.2. Тип экспланта.

4.3.3. Оптимальные условия ко-культивирования.

4.3.4. Отбор трансформированных клеток.

4.3.5. Регенерация и снижение стрессовых факторов.

4.3.6. Характеристика трансформантов и экспрессия трансгенов.

4.4. Исследование геномного окружения сайтов интеграции Т-ДНК.

4.4.1. Метод обратной ПЦР (Inverse PCR).

4.4.2. Метод быстрой амплификации геномных окончаний (Rapid amplification of genomic ends - RAGE).

4.4.3. TAIL-PCR.

4.4.4. Метод AL-PCR (adaptor ligation PCR).

5. Материалы и методы.

5.1. Линии капусты, использованные в работе.

5.2. Методы ведения культуры in vitro.

5.2.1. Стерилизация семян.

5.2.2. Среды, использованные в работе для поддержания растений культуры in vitro и трансформационного процесса.

5.2.3. Состав и методика приготовления компонентов питательных сред.

5.2.4. Определение оптимальной концентрации селективного агента.

5.2.5. Подбор концентрации селективного агента для анализа поколений трансгенных растений.

5.2.6. Обработка проростков поколения Т1 раствором гербицида «Баста».

5.3. Создание вектора рВаг на основе плазмиды pBIBar.

5.3.1. Методика выделения плазмидной ДНК.

5.3.2. Рестрикция вектора.

5.3.3. Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля.

5.3.4. Лигирование вектора.

5.3.5. Методика приготовления компетентных клеток.

5.3.6. Трансформация E.coli лигированным вектором.

5.3.7. Трехродительская коньюгация.

5.4. Культура агробактерии.

5.4.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

5.4.2. Состав и способы приготовления среды для культивирования агробактериальных штаммов.

5.4.3. Наращивание агробактериалыюй культуры для трансформации.

5.5. Статистический анализ.

5.5.1. Дисперсионный анализ однофакторного опыта.

5.5.2. Наименьшая существенная разница.

5.5.3. Оценка соответствия между наблюдаемыми и ожидаемыми теоретическими) распределениями по критерию

5.6. Методика выделения растительной ДНК.

5.7. Методика проведения ПЦР.

5.7.1. Состав реакционной смеси для НЦР:.

5.7.2. Анализ продуктов НЦР.

5.8. Методика проведения дот-блот гибридизации.

5.9. Методика проведения AL-PCR.

5.9.1. Рестрикция геномной ДНК.

5.9.2. Конструирование специфических адаптеров и лигирование адаптеров с рестрикциоиной смесью.

5.9.3. Проведение ПЦР.

5.9.4. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля.

5.9.5. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР.

6. Результаты.

6.1. Конструирование вектора рВаг для трансформации капусты белокочанной.

6.2. Разработка схемы селекционного процесса с участием трансгенной составляющей.

6.3. Получение трансгенных растений капусты белокочанной, устойчивых к гербициду фосфинотрицину.

6.3.1. Изучение регенерационнои способности различных типов эксплаитов.

6.3.2. Изучение влияния фитогормонов на регенерационную способность линий капусты белокочанной.

6.3.3. Определение оптимальной концентрации селективного агента.

6.4. Первичный молекулярный анализ трансгенных растений капусты белокочанной.

6.4.1. Выявление наличия гена bar в геноме растений капусты белокочанной при помощи ПЦР-анализа.

6.4.2. Выявление наличия гена bar в геноме растений капусты белокочанной при помощи дот-блот гибридизации.

6.4.3. Трансформация четырех линий капусты белокочанной.

6.5. Определение количества копий трансгенной вставки методом AL-PCR.

6.5.1. Амплификация геномной ДНК, фланкирующей Т-ДПК с 5' конца (правая граница Т-ДНК).

6.5.2. Амплификация геномной ДНК, фланкирующей Т-ДНК с 3' конца (левая граница Т-ДНК).

6.6. Анализ первого семенного поколения трансгенных растений.

6.6.1. Расщепление в первом семенном поколении от самоопыления трансгенного растения.

6.6.2. Расщепление в первом семенном поколении от скрещивания трансгенного растения со стерильной родительской формой.

6.7. Анализ первого семенного поколения трансгенных растений на проявление признака устойчивости в условиях in vivo.

7. Выводы.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Грибова, Татьяна Николаевна

7. Выводы

1. Выявлены различия в реакции генотипов четырех линий капусты белокочанной отечественной селекции Гэс 2, Мег-2, Зму 7, Дрв 2 на воздействие фитогормонов в процессе регенерации. Эффективность регенерации 86,7% для линии Гэс 2 и 81,5% для линии Зму 7 достигается при содержании в питательной среде 6-БАП - 2 мг/л и кинетина - 1 мг/л; 63,2% для линии Мег-2 - при концентрации борной кислоты -150 мг/л, 6-БАП - 2 мг/л и кинетина - 1 мг/л; и 74,7% для линии Дрв 2 - 6-БАП 0,5 мг/л.

2. Получено 26 трансгенных растений четырех линий Гэс 2, Мег-2, Зму 7, Дрв 2, экспрессирующих ген bar, которые включены в схему селекционного процесса по созданию трансгенного гибрида капусты белокочанной, устойчивого к гербицидам на основе фосфинотрицина.

3. Эффективность трансформации для линий Гэс 2 и Зму 7 составляет 7,1%; для линии Мег-2 - 5,5% и для линии Дрв 2 - 10,9%.

4. В процессе переноса Т-ДНК в геном растения №3117 (линия Мег-2) произошла делеция участка 3' конца Т-ДНК, включая левую границу, не влияющая на функциональное проявление трансгена.

5. Нуклеотидные последовательности, фланкирующие Т-ДНК растения №3117, гомологичны с известными нуклеотидными последовательностями «GenBank» растительного происхождения (Brassica napus var. napus, Brassica rapa var. pekinensis, Arabidopsis thaliana ), что указывает па интеграцию трансгена в геном растения.

6. При самоопылении трансгенных растений доля устойчивых растений к неустойчивым распределяется как 1:3, причем устойчивые растения, являются гомозиготными по гену bar. При скрещивании трансгенных растений с ЦМС формами расщепление соответствует 1:1.

7. Разработанная схема селекционного процесса с участием трансгенной компоненты позволяет избежать не контролируемый выпуск в окружающую среду трансгенной пыльцы, поскольку основана на использовании линий с ЦМС.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грибова, Татьяна Николаевна, Москва

1. Alt-Morbe J, Nedderman P, Von Lintig J, Weiler E, Schroder J. Temperature-sensitive step in Ti-plasmid virregion induction and correlation with cytokinin secretion by Agrobactcria // Molecular Genomics and Genetics. 1989. N. 213. P. 1-8.

2. Arumuganathan K., Earle E. Nuclear DNA content of some important plant species // Plant Molecular Biology. 1991. V. 9. P. 208-218.

3. Axelsson et al. 2000, Genome, 43:679-688

4. Breclin C, Chalot F, Botton E, Jouanin L, Dore C. Potential use of the aux2 gene from Agrobacterium rhizogencs as a conditional negative marker in transgenic cabbage // Transgenic Research. 1993. N. 2. P. 48-55.

5. Berthornieu P, Jouanin L. Transformation of rapid cycling cabbage (Brassica olcracea var. capitata) with Agrobacterium rhizogencs // Plant Cell Report. 1992. N. 11. P. 334-338.

6. Berthornieu P, Breclin C, Chariot F, Dorre C, Jouanin L. Routine transformation of rapid cycling cabbage (Brassica oleracea)-molecular evidence for regeneration of chimeras // Plant Science. 1994. N. 96. P. 223-235.

7. Birboim H., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmids // Nuclear Acid Research. 1979. V.7. P. 1513-1523.

8. Brasileiro A, Leplre J, Muzzin J, Ounnoughi D, Michel M, Jouanin L. An alternative approach for gene transfer in trees using wild-type Agrobacterium strains // Plant Molecular Biology. 1991. N. 17. P. 441-452.

9. Braun A. Thermal studies on the factors responsible for tumor initiation in crown gall // Am J Botany. 1947. V. 34. P. 234-240.

10. Braun A. A physiological basis for autonomous growth of the crown-gall tumor cell // Proc Natl Acad Sci USA. 1958. V. 44. P. 344349.

11. Brukhin V., Clapham D., Elfstrand M., von Arnold S. Basta tolerance as a selectable and screening marker for transgenic plants of Norway spruce // Plant Cell Reports. 2000. V. 19. N. 9. P.899-903.

12. Budar F., Thia-Toongf, Montagu van M. Agrobaktcriu?n-mcd'mtcd gene transfer results mainly in transgenic plants transmitting T-DNA as a single Mendelian factor// Genetics. 1986. V. 114. P. 303-313.

13. Campisi L, Yang Y., Yi Y., Heilig E, Herman B, Cassista A. Generation of enhancer trap lines in Arabidopsis and characterization of expression patterns in the inflorescence // Plant Journal. 1999. V. 17. P. 699-707.

14. Christey MC, Sinclair BK. Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala) rape (В. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation // Plant Science. 1992. N. 87. P. 161-169.

15. Colby S, Juncosa A, Meredith C. Cellular differences in Agrobacterium susceptibility and regenerative capacity restrict the development of transgenic grapevines // Journal American Society Horticultural Science. 1991. N. 116. P. 356-361.

16. Choi Y., Noh E., Han M., Son S. Adaptor-aided PCR to identify T-DNA junctions in transgenic plants // BioTechniques. 1999. V. 27. P. 222-226.

17. Cheng M., Jarret R., Li Z., Demski J. Expression and inheritance of foreign genes in transgenic peanut plants generated by Agrobacterium-mediated transformation // Plant Cell Report. 1997. V.16. P. 541544.

18. Collins F., Weissman S. Directional cloning of DNA fragments at a large distance from an initial probe: a circularization method // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984 V.81. P. 6812-6816.

19. Cormack R., Somssich I. Rapid amplification of genomic ends (RAGE) as a simple method to clone flanking genomic DNA// Gene. 1997. V. 194. P. 273-276.

20. David С, Tempre J. Genetic transformation of cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis) by Agrobacterium rhizogencs // Plant Cell Report. 1988. N. 7. P. 88-91.

21. De Block M, De Brouwer D, Tenning P. Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the expression of bar and neo genes in transgenic plants // Plant Physiology. 1989. N. 91. P. 694-701.

22. De Buck S., De Wilde C., Montagu van M., Depicker A. T-DNA vector backbone sequences are frequently integrated into the genome of transgenic plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation // Mol. Breed. 2000. V. 6. P. 459-468.

23. Delzer B, Somers D, Orf J. Agrobacterium tumefaciens susceptibility and plant regeneration of 10 soybean genotypes in maturity groups 00 to II // Crop Science. 1990. N. 30. P. 320-322.

24. Deroles S.C. Gardner R.C. Analysis of the T-DNA structure in a large number of transgenic petunias generated by Agrobacterium-mediated transformation // Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. P. 365-377.

25. Devic M, Albert S, Delseny M, Roscoe T. Efficient PCR walking on plant genomic DNA // Plant Physiology and Biochemistry. 1997. V. 35. P. 331-339.

26. Eimert K, SchrEoder C, Siegemund F. Expression of the NPTII-sequence in cauliflower after injection of Agrobacterium into seeds // Journal Plant Physiology. 1992. N. 140. P. 37-40.

27. Eimert K, Siegemund F. Transformation of cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis) an experimental survey // Plant Molecular Biology. 1992. N. 19. P. 485-490.

28. Errampali D., Patton D., Castle L., Mickelson K., Hansen K., Schnall J., Feldmann K., Meinke D. Embryogenic lethals and T-DNAinscrtional mutagenesis in Arabidopsis // Plant Cell. 1991. V. 3. P. 149-159.

29. Finnegan J, McElroy D. Transgene inactivation: plants fight back // Biotechnology. 1994. N. 12. P. 883-888.

30. Fladung M. Gene stability in transgenic aspen (Populus). Flanking DNA sequences and T-DNA structure / / Molecular Genomics and Genetics. 1999. V. 260 P. 574-581.

31. Fry J, Barnason A, Horsch R. Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens based vectors // Plant Cell Report. 1987. N. 6. P. 321-325.

32. Fu X., Du L.T., Fontana S. et. al. Linear transgene constructs lacking vector bacbone sequences generate low- copy-number transgenic plants with simple integration patterns //Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 11-19.

33. Gamborg O., Miller R., Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. // Experimental Cell Research. 1968. V.50. P. 151-158.

34. Genji Q. Obtaining and analysis of flanking sequences from T-DNA transformants of Arabidopsis // Plant Science. 2003. V. 165. P. 941949.

35. Goodwin I, Todd G, Ford-Lloyd B, Newbury H. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mcdiatcd transformation vary according to plant species // Plant Cell Report. 1991. N. 9. P. 671-675.

36. Graaff E., Dulk-Ras A., Hooykaas P. Deviating T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plants // Plant Molecular Biology. 1996. V. 31. P. 677-681.

37. Hamada M, Hosoki T, Kusabiraki У, Kigo T. Hairy root formation and plantlet regeneration from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera Zenk.) mediated by Agrobacterium rhizogenes // Plant Tissue Culture Letter. 1996. N. 6. P. 130-133.

38. Hamill J., Rounslcy S, Spencer A, Todd G, Rhodes M. The use of the polymerase chain reaction in plant transformation studies / / Plant Cell Report. 1991. V. 10. P. 221-224.

39. Hobbs S.L., Jackson J.A., Baliski D.S. Genotype- and promoter-induced variability in transient beta-glucoronidase expression in pea protoplast // Pants Cell Reporns. 1990. V. 9. P. 17-20.

40. Hoekema A, Hirsch P, Hooykaass P, Schilperoort R. A binary vector strategy based on separation of vir- and T-region of Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid // Nature. 1983. N. 303. P. 179-180.

41. Hoeven van der C. Variability of organ-specific gene expression in transgenic tobacco plants // Transgenic Res. 1994.V. 3. P. 159-165.

42. Holford P, Hernandez N, Newbury H. Factors influencing the efficiency of T-DNA transfer during co-cultivation of Antirrhinum majus with Agrobacterium tumefaciens // Plant Cell Report. 1992. N. 11. P. 196-199.

43. Holbrook L, Miki B. Brassica grown gall tumrigenesis and in vitro of transformed tissue // Plant Cell Report. 1985. N. 4. P. 329-332.

44. Horsch R.B. Fry J.E., Hoffmann L.A.N. Inheritance of functional forein genes in plants // Science. 1984. V. 223, N4653. P. 496-499.

45. Hosoki T, Shiraishi K, Kigo T, Ando M. Transformation and regeneration of ornamental kale (Brassica oleracea var. acephala DC) mediated by Agrobacterium rhizogenes // Scientist Horticulturae. 1989. N.40. P. 259-266.

46. Hosoki T, Kanbe H, Kigo T: Transformation of ornamental tobacco and kalemediated by Agrobacterium tumefaciens and A, rhizogenes harbouring a reporter p-glucuronidase gene // Japan Society Horticultural Science. 1994. N. 63. P. 167-172.

47. Hosoki T, Kigo T. Transformation of Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera Zenk.) by Agrobacterium rhizogenes harbouring a reporter ^-glucuronidase gene // Journal Japan Society Horticultural Science. 1994. N. 63. P. 589-592.

48. Iglesias V., Moscone E., Papp I. Molecular and cytogenetic analyses of stably and unstable expressed transgene loci in tobacco // The Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1251-1264.

49. Jakowitsch J., Papp I., Moscone E.A. Molecular and cytogenetic characterization of a transgene locus that induces silencing and methylation of homologous promoters in trans // Plant J. 1999. V.17. P.131-140.

50. Jordan MC, McHughen A. Transformed callus does not necessarily regenerate transformed shoots // Plant Cell Report. 1988. N. 7. P. 285-287.

51. Kohli A., Leech M., Vain P. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. V.95. P. 7203-7208.

52. Kuai В., Perret S., Wan S., Dalton S., Bettany A., Morris P. Transformation of oat and inheritance of bar gene expression // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2001. V. 66. P. 79-88.

53. Li Z., Yu M., Zhang H., Wang H., Wang L. Improved rapid amplification of cDNA ends (RACE) for mapping both the 5' and 3' terminal sequences of paramyxovirus genomes / / Journal of Virological Methods. 2005. V. 130. P. 154-156.

54. Lin J-J, Assad-Garcia N, Kuo J. Effects of Agrobacterium cell concentration on the transformation efficiency of tobacco and Arabidopsis thaliana // Focus. 1994. V. 16. N. 3. P. 70-73.

55. Liu Y., Whittier R. Thermal asymmetric interlaced PCR: Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from PI and YAC clones for chromosome walking // Genomics. 1995. V. 25. P. 674-681.

56. Liu Y, Mitsukawa N, Oosumi Т., Whittier R. Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR // Plant Journal. 1995. V.8. P. 457463.

57. Mannerlof M., Tenning P. Variadility of gene expression in transgenic tobacco //Euphytica. 1997. V. 98. P. 133-139.

58. Matzke M.A., Matzke A.J.M. Epigenetic silencing of plant transgenes as a consequence of diverse cellular defence responses // Cel. and Mol. Life Sci. 1998. V. 54. P. 94-103.

59. Matzke M.A.,Priming M., Tronovsky J., Matzke A.J.M. Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed tobacco plants//ЕМВО J. 1989. V. 8. P. 643-649.

60. McBride K, Svab Z, Schaaf D, Hogan P, Stalker D, Maliga P. Amplification of a chimeric Bacillus gene in chloroplasts leads to an extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco / / Biotechnology. 1995. N. 13. P. 362-365.

61. McGarvey P., Kaper J. A simple and rapid method for screening transgenic plants using the PCR // BioTechniques. 1991. V. 11. P.428-430.

62. Metz T, Dixit R, Earle E. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of broccoli (Brassica oleracea var. italica) and cabbage (B. oleracea var. capitata) // Plant Cell Report. 1995. N.15. P. 287-292.

63. Metz TD, Roush RT, Tang JD, Shelton AM, Earlc ED. Transgenic broccoli expressing a Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein: implications for pest resistance management strategies // Molecular Breeding. 1995. N. 1. P. 309-317.

64. Meyer P. Understanding and controlling transgene expression // Trends Biotechnology. 1995. N. 13. P. 332-337.

65. Mullins, Chen X, Romaine P, Raina R, Geiser DM, Kang S. Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum: an enceinte tool for insertional mutagenesis and gene transfer // Phytopathology. 2001. V. 91. P.173-180.

66. Murata M, Orton T. Callus initiation and regeneration capacities in Brassica species // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1987. N. 11. P. 111-123.

67. Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans // Plant Cell. 1990. N. 2. P. 279-289.

68. Narasimhulu S, Prakash S, Chopra V. Comparative shoot regeneration in diploid and amphidiploid Brassica species and their interspecific hybrids // Canadian Journal Botany. 1992. N. 70. P. 1513-1514.

69. Padegimas L., Reichert N. Adaptor ligation-based polymerase chain reaction-mediated walking // Anal Biochemistry. 1998. V. 260. P. 149-153.

70. Parkin et al. // Genome. 1995. V. 38. P. 1112-1131.

71. PasseFegue E, Kerlan C. Transformation of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis) by transfer of cauliflower mosaic virus genethrough cocultivation with virulent and avirulent strains of Agrobacterium // Plant Science. 1996. N. 113. P. 79-89.

72. Pawlowski W., Somers D. Transgenic DNA integrated into the oat genome is frequently interspersed by host DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 12106-12110.

73. Peach C, Velten J. Transgene expression variability (position effect) of CAT andGUS reporter genes driven by linked divergent T-DNA promoters // Plant Molecular Biology. 1991. N. 17. P. 49-60.

74. Petit A, David C, Dahl GA, Ellis JG, Guyon P, Casse-Delbart F, Tempre J. Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacteriumrhizogenes cooperate for opine degradation / / Molecular Genetics and Genomics. 1983. N. 190. P. 204-214.

75. Prols F., Meyer P. The methylation pattens of chromosomal integfration regions influense gene activity of transferred DNA in Petunia hybrida //Plant Journal. 1992. V. 2. P. 465-475.

76. Pua EC, Mehra-Palta A, Nagy F, Chua N. Transgenic plants of Brassica napus L. // Biotechnology. 1987. N. 5. P. 815-817.

77. Puddephat I.J., Riggs T.J., Fenning T.M. Transformation of Brassica oleracea L.: a critical review //Molecular Breeding. 1996. V.2. P. 185-210.

78. Radchuk V., Ryschka U., Schumann G., Klockc E. Genetic transformation of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis) by direct DNA uptake into mesophyll protoplasts // Physiologia Plantarum. 2002. N.3. V. 114. P. 429.

79. Radke S, Turner J, Facciotti D. Transformation and regeneration of Brassica rapa using Agrobacterium tumefaciens // Plant Cell Report. 1992. N. 11. P. 499-505.

80. Raina S., Mahalingam R. Chen F., Fedoroff N. A collection of sequenced and mapped Ds transposon insertion sites in Arabidopsis thaliana // Plant Molecular Biology. 2002. V. 50. P. 93-110.

81. Ramanathyn V., Veluthambi K. Transfer of nonTDNA portions of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiA6 from the terminus of TLDNA //Plant Mol. Biol. 1995. V. 28. P. 1149-1154.

82. Reynolds J. Regeneration in vegetable species // Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. / Ed. Vasil IK. London. Academic Press. 1986. V. 3. Plant Regeneration and Genetic Variability, P. 151-178.

83. Salas M., Park S., Srivatanakul M., Smith R. Temperature influence on stable T-DNA integration in plant cells // Plant Cell Report. 2001. V. 20. P. 701-705.

84. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 84. P. 5463-5467.

85. Schmulling T, Schell J. Transgenic tobacco plants regenerated from leaf disks can be periclinal chimeras // Plant Molecular Biology. 1993. N. 21. P. 705-708.

86. Siebert P., Chenchik A, Kellogg D., Lukyanov K., Lukyanov S. An improved PCR-method for walking in uncloned genomic DNA // Nuclear Acids Research. 1995. V.23. P. 1087-1088.

87. Sheikholeslam S, Weeks D. Acetosyringone promotes high efficiency transformation of Arabidopsis thaliana explants by Agrobacterium tumefaciens // Plant Molecular Biology. 1987. N. 8. P. 291-298.

88. Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // Journal Molecular Biology. 1975. V. 98. P. 503-517.

89. Spertini D, Beliveau C., Bellemare G. Screening of transgenic plants by amplification of unknown genomic DNA flanking T-DNA // BioTechniques. 1999. V. 27. P. 308-314.

90. Srivastava V, Reddy AS, Guha-Mukhejee S. Transformation and regeneration of Brassica oleracea mediated by an oncogenic

91. Agrobactcrium tumefaciens // Plant Cell Report. 1988. N. 7. P. 504-507.

92. Stachel S., Timmerman В., Zambryski P. Generation of single-stranded T-DNA molecules during the initial stage of T-DNA transfer for Agrobacterium tumefaciens to plant cells // Nature. 1986. V.322. P. 706-712.

93. Swensen J. PCR with random primers to obtain sequence from yeast artificial chromosome insert ends or plasmids / / Bio-Techniques. 1996. V. 20. P. 486-491.

94. ТетрГе J, Casse-Delbart F. Plant gene vectors and genetic transformation: Agrobactcrium Ri plasmids // Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants / Ed. Vasil IK. London: Academic Press, 1987. V. 6. P. 25-49.

95. Tepfer D. Genetic transformation using Agrobacterium rhizogenes // Physiology Planta. 1990. N. 79. P. 140-146.

96. Van Haute E., et al., // EMBO J. 1983 - V.2. - P. 411418.

97. Vickers J, Graham G., Henry R. A Protocol for the Efficient Screening of Putatively Transformed Plants for bar, the Selectable Marker Gene, Using the Polymerase Chain Reaction / / Plant Molecular Biology Reporter. 1996. V. 14. N 4. P. 363-368.

98. Verma SC, Rees H. Nuclear DNA and the evolution of allotetraploid Brassicae // Heredity. 1974. N.33. P. 61-68.

99. Wang M.-B. High-efficiency of a Pglucuronidase gene in rise is correlated with repetitive transgene structure but is independent of DNA methylation // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 29-38.

100. Wijbrandi J, de Both M. Temperate vegetable crops // Science Horticultural. 1993. N. 55. P. 37-63.

101. Williams J, Pink D, Biddington N. Effect of silver nitrate on long term culture and regeneration of callus from Brassica oleracca var. gemmifera // Plant Cell Tissue Organ Culture. 1990. N. 21. P. 61-66.

102. Zambryski P, Joos H, Genetello C, LeemansM, Van Montagu M, Schell J. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity // EMBO J. 1983. N. 2. P. 2143-2150.

103. Zambryski P. Chronicles from the Agrobacterium -plant cell DNA transfer story // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1992. V. 43. P.465-490.

104. Zee S, Johnson B. Cole crops // Handbook of Plant Cell Culture / Ammirato PV, Evans DA, Sharp WR, Yamada Y (eds). Macmillan, New York. 1984. V. 3, P. 227-246.

105. Zhou Y, Newton R., Gould J. A simple method for identifying plant/T-DNA junction sequences resulting from Agrobacterium-mediated DNA transformation // Plant Molecular Biology Report. 1997. V. 15. P. 246-254.

106. Гаииаров M. ГМ продукты. Мифы и реальность. М.: 2004.

107. Дейнеко Е.В., Загорская А.А, Филипенко Е.А., Филипенко М.Л., Комарова Н.И., Кочетов А.В., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) при инбридинге // Генетика. 1998. Т. 34,№9. С.1212-411.

108. Доспехов Б. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований) // М.: Агропромиздат. 1985. 351 с.

109. Конвенция о биологическом разнообразии. Текст и приложения. 1992.

110. Луговой А., Луговой А. Динамика производства овощей на орошаемых землях краснодарского края // 2004

111. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: «Мир». 1984. 480 с.

112. Методические указания по оценке биобезопасности гснно-инженерно-модифицированных растений, Москва, 2002.

113. Моиахос Г.Ф. // Схема селекции Fj гибридов капусты кочанной на основе линий с цитоплазмотической мужской стерильностью. / Доклады III Международной научной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова, Москва, 2003.

114. Падегимас Л., Шульга О., Скрябин К. // Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum и Solanum tuberosum, устойчивых к гербициду фосфинотрицину / Мол. Биол. 1993. Т. 27. №4. С.947-951.

115. Пивоваров В.Ф., П.Ф. Конопков, В.П. Никулыпин. Овощи новинки на вашем столе. М.: ВНИИССОК, 1995. 226 с.

116. Постановление Правительства РФ от 16 февраля 2001 г. № 120 "О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов".

117. Федеральный закон №86 от 05 июня 1996 г. "О государственном регулировании в области генно-ииженерной деятельности".129. http: / /www.gossort.com130. www.agbios.com, GM-database, Maize, DAS 06275-8