Создание искусственных белков методами направленного мутагенеза

Татьков, Сергей Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание искусственных белков методами направленного мутагенеза
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание искусственных белков методами направленного мутагенеза"

На правах рукописи

□03064560

Татъков Сергей Иванович

СОЗДАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ БЕЛКОВ МЕТОДАМИ НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА

03.00.03 —молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 3 АВ Г 2007

Кольцово - 2007

003064560

Работа выполнена во ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздрав-соцразвития России

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор А.А. Ильичев

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор М.И. Воевода

доктор биологических наук, профессор С.И. Беликов доктор биологических наук, профессор С.Н. Загребельный

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г. Москва

Защита состоится « 2 » ноября 2007 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцове Новосибирской области, 630559; тел. (8-383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан « ¿Г

2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Э.Г. Малыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К настоящему времени белки нашли широкое применение в различных отраслях промышленности, медицине и для научных исследований. Поскольку белки используются, как правило, в условиях, отличных от тех, в которых они обычно функционируют, одной из актуальных задач является направленное изменение специфичности их действия, активности, стабильности, или, как в случае белковых вакцин, иммуногенности.

Для создания новых белков или изменения свойств уже существующих используется целый ряд методов. Наиболее важными являются методы проб и ошибок, направленного мутагенеза и управляемой эволюции. Метод проб и ошибок использует статистический мутагенез для получения библиотек мутантных молекул, среди которых проводится поиск белков с необходимыми свойствами. Использование перетасовки генов улучшило результативность метода, позволило в ряде случаев существенно повысить активности биокатализаторов (Williams et al., 2004). Еще в первых работах Фершта с соавторам (Eisenstein, 2004) было показано, что знание структурно-функциональной организации белка позволяет направленным мутагенезом получать молекулы с нужными свойствами. Результативность такого подхода весьма высока, поскольку при его использовании поиск целевых белков проводится среди ограниченного числа вариантов. Однако расшифровка структурно-функциональной организации белка является очень сложной задачей, которая для многих молекул не решена до сих пор. С 1997 г. начал активно развиваться метод управляемой эволюции белков (Holmberg et al., 2005). Для его реализации необходимо установить химическую или физическую связь между геном и продуктом его экспрессии. Для таких целей в настоящее время широко используется любой из вариантов дисплея. Затем проводится дивергенция гена методами статистического мутагенеза и среди полученной библиотеки отбираются нужные варианты с помощью соответствующих методов селекции.

Поскольку одним из наименее трудоемких вариантов получения белков с нужными свойствами является направленный мутагенез молекул с известной структурно-функциональной организацией, основной целью нашей работы явилось совершенствование методов расшифровки структурно-функциональной организации и применение полученных знаний для создания белковых молекул с новыми свойствами.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования -разработка рациональной методологии направленного изменения белков и ее применение для получения мутантных у-интерферонов. Для ее достижения необходимо было решить следующие задачи:

• Создать эффективные методы направленного мутагенеза.

• Обосновать стратегии применения статистического мутагенеза для картирования функциональных районов белковой молекулы.

• Разработать стратегии получения стабильных белков направленным мутагенезом по нефункциональным районам молекул.

• Создать методы усиления иммуногенных свойств белков путем слияния тестируемого белка с у-интерфероном.

Научная новизна. Предложена рациональная методология получения искусственных белков, основанная на знании их структурно-функциональной и доменной организации. Основными направлениями при ее реализации являются: сокращение числа остатков лизина, аргинина в нефункциональных участках, введение дополнительных связей между субъединицами белковой молекулы, междоменное слияние. В рамках предложенной методологии разработаны эффективные методы локализованного мутагенеза и стратегия определения структурно-функциональной организации белка, основанная на использовании библиотек мутантных генов с множественными мутациями, полученными либо в результате локализованного мутагенеза по всему гену, либо по консервативным последовательностям в неструктурированных участках белковой молекулы.

Впервые на примере у-интерферона человека продемонстрирована возможность повышения у молекулы белка протеолитической стабильности, растворимости, снижения образования телец включения путем частичной замены аргининовых и лизиновых аминокислотных остатков, не входящих в состав функциональных сайтов молекулы.

Для лейкоцитарного и иммунного интерферонов показана возможность получения вариантов белков с новыми свойствами путем междоменного слияния. Доказано, что слияние доменов у-интерферона и сла-боиммуногенного альфа-фетопротеина человека (AFP) приводит к стимуляции высокого уровня гуморального ответа на AFP.

Впервые экспериментально доказано, что высокая мутагенность 4-аминооксибутнламина обусловлена его взаимодействием с остатками цитозина в ДНК и устойчивостью модифицированного цитозина к ферментам репарации. В результате реакции образуется N4-(4-aMH-нобутокси)-дезоксицитидин, способный индуцировать С->Т транзи-ции. Синтезирован новый мутаген Ш-(4-аминобутокси)-дезоксицити-дин-5'-трифосфат, который включается при синтезе ДНК in vitro как вместо dCTP, так и dTTP. В первом случае индуцируются G->A, а во втором - A-»G транзиции. Разработаны три варианта локализованного мутагенеза с использованием 4-аминооксибутиламина: введение G-»A транзиций в район, комплементарный модифицированному олигонук-леотиду; введение С->Т транзиций в одноцепочечные участки ДНК дуплексов обработкой их аминооксибутиламином; введение G-»A и A-»G транзиций при включении К4-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5'-трифосфата в ходе синтеза ДНК in vitro. Предложенные методы локализованного мутагенеза были использованы для получения библиотек мутантных генов а2- и у-интерферонов человека, содержащих мутации как по всей длине гена, так и в отдельных его районах.

Впервые исследованы мутагенные свойства олигонуклеотидов, содержащих пирофосфатное, фосфамидное (этилендиамин, 2,6-диамино-гексановая кислота, гексаметилендиамин) звено. Индуцируемые мутации предопределены нуклеотидной последовательностью олигонукле-отида, но присутствие в его структуре пирофосфатного или гексамети-лендиаминового звена наиболее сильно (в несколько раз) повышает выход мутантов. Доказано, что мутации возникают в ходе репарации промежуточного гетеродуплекса ДНК, включающего олигонуклеотид-мутаген.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований получен ряд аналогов лейкоцитарного и иммунного интерферонов, на которые оформлены авторские свидетельства и патенты.

Аналоги у-интерферона - дельтаферон, эсферон, а также биферон -обладают протеолитической стабильностью, высокой активностью, на их основе разрабатываются новые иммуномодулирующие лекарственные препараты.

Разработанная стратегия определения структурно-функциональной организации белков отличается универсальностью и может быть применена в молекулярной биологии, вирусологии, микробиологии, биотехнологии, белковой инженерии и других областях биологии для решения широкого круга задач, связанных с определением структурно-функциональной организации белковых молекул.

Созданные методы локализованного мутагенеза 4-аминооксибути-ламином и К4-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5'-трифосфатом могут использоваться везде, где требуется получить мутантные микроорганизмы, гены или белки.

Предложенная методология создания искусственных белков может быть положена в основу конструирования новых ферментов, цитоки-нов и других белковых молекул. Например, принцип повышения про-теолитической стабильности молекул путем сокращения числа остатков лизина, аргинина в нефункциональных районах был успешно применен при разработке устойчивого к протеазам аналога фактора некроза опухоли (Корепанова и др., 1994).

Положения, выносимые на защиту:

• Библиотеки мутантных генов с множественными мутациями могут быть использованы для определения функционально важных остатков экспрессируемых ими белков. Остатки, замена которых встречается исключительно в инактивированных молекулах, как правило, входят в состав функциональных центров. Роль остатков, встречающихся и в инактивированных, и в активных молекулах, невозможно определить анализом библиотек белков с множественными мутациями.

• Консервативные мотивы в петлевых участках белковых молекул содержат функционально важные остатки.

• Замена лизина, аргинина в нефункциональных участках белковой молекулы повышает ее протеолитическую стабильность, уменьшает образование телец включения в ходе биосинтеза.

• Введение остатков с отрицательно заряженными боковыми группами в соседние а-спирали гидрофобного ядра белка не влияет в целом на его пространственную структуру, но повышает ее стабильность и может привести к усилению удельной активности.

• Гибридный белок IFN-AFP, включающий домен у-интерферона, вызывает более сильный гуморальный иммунный ответ, чем его отдельные составляющие.

• Модифицикация олигонуклеотидов 4-аминооксибутиламином индуцирует G-»A замены в комплементарных районах ДНК, а обработка одноцепочечных участков ДНК приводит к появлению С-»Т транзиций.

• Синтезированный Ж-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5'-три-фосфат включается in vitro в ходе синтеза комплементарной цепи ДНК-полимеразами вместо тимидина или цитидина и индуцирует транзиции G->A или A-»G.

• Достаточно введения всего лишь одного пирофосфатного или гексаметилендиаминового звена в олигонуклеотид для повышения его мутагенных свойств в несколько раз.

• В ходе олигонуклеотид-направленного мутагенеза по схеме Зол-лера-Смита мутации индуцируются преимущественно по репарационному пути и рядом расположенные неспаренности могут удаляться независимо друг от друга.

Апробация результатов диссертации и публикации. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции «Итоги и перспективы теоретических, практических и клинических исследований по проблеме интерферона» (Тбилиси, 1985), Всесоюзном съезде микробиологического общества «Достижения микробиологии - практике» (Алма-Ата, 1985), Всесоюзной конференции «Новые направления в биотехнологии» (Пущино, 1988), Всесоюзном совещании «Молекулярные механизмы мутагенеза» (Новосибирск, 1988), Всесоюзном совещании по НК-дуплексам (Киев, 1989), на I Всесоюзной конференции «Геном человека» (Переяславль-Залесский, 1990), Международном симпозиуме «Synthetic oligonucleotides: problems and frontiers of practical application» (Москва, 1991), Международном симпозиуме по белковой инженерии «Seventh International symposium on metabolism and enzymology of nucleic acids including gene and protein engineering» (Братислава, 1991), Международной конференции «Medical biotechnology immunization and AIDS» (Ленинград, 1991), Всесоюзной конференции «Современные аспекты применения интерферонов и других иммуномодуляторов» (Киев, 1991), Всероссийской отчетной конференции по направлению «Белковая инженерия» (Москва, 1993), на семинаре кафедры природоведения Университета Братиславы (Братислава, 1993), на семинаре Университета г. Витген (Германия, 1995), Международной конференции «The 26th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, ISOBM 1998» (Щвеция, 30 августа-4 сентября 1998), а также на научных конференциях ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово Новосибирской области, с 1984 г.).

По материалам диссертации опубликовано 48 работ.

Работа выполнена в 1984—1999 гг. в ГНЦ ВБ «Вектор» в рамках научно-технических тем и государственных научно-технических программ: «Новейшие методы биоинженерии», «Ген-направленные биологически активные вещества»; по гранту РФФИ № 96-04-49-426 «Структурно-функциональный анализ эукариотического белкового фактора (eRFl), контролирующего освобождение полипептидных цепей в рибосомах при трансляции» (1996-1998 гг.).

На разных этапах в работе принимали участие О.Ю. Смирнова, Р.Ю. Цивковский, М.Ш. Азаев, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ, а также H.H. Карпышев,

A.М. Ерошкин, Г.П. Кищенко, В.А. Куличков, Г.А. Кузьмичева, JI.H. Семенова, Г.Ф. Сиволобова, П.И. Поздняков, Г.В. Кочнева, A.A. Граж-данцева, О.И. Серпинский, В.М. Блинов, А.Н. Болдырев, Л.И. Карпенко, А.И. Закабунин, JI.P. Лебедев, В.И. Масычева, Е.Д. Даниленко,

B.А. Иванисенко и другие сотрудники ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» - автор приносит им искреннюю благодарность.

Особую признательность автор выражает д.б.н. профессору В.А. Петренко, который был инициатором исследования структурно-функциональной организации лейкоцитарного интерферона, уделял много внимания развитию работы на всех ее последующих этапах, а также академику РАН профессору Л.Л. Киселеву и д.б.н. Л.Ю. Фроловой, которые привлекли внимание автора к проблеме структурно-функциональной организации эукариотического фактора терминации трансляции, предоставили возможность работы с этим белком, впервые выделенным ими, и всесторонне исследовали свойства полученных мутантных факторов терминации, наконец, сыграли решающую роль в подготовке результатов работы к публикации.

Автор также хотел бы выразить признательность академику РАН профессору Л.С. Сандахчиеву и Т.Н. Шубиной, без чьей поддержки он не смог бы приступить к исследованиям в области применения направленного мутагенеза для получения новых белков.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, главы «Материалы и методы», трех глав, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждение, и выводов. Работа изложена на 263 страницах, включая 13 таблиц и 66 рисунков. Список литературы из 471 наименования включает 60 отечественных работ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. РАЗВИТИЕ МЕТОДОВ ЛОКАЛИЗОВАННОГО МУТАГЕНЕЗА

В поисках эффективного мутагена для локализованного мутагенеза мы обратили внимание на 4-аминооксибутиламин (АОБА) -Н2КО(СН2)4ЫН2, производное гидроксиламина. В реакции с модельным соединением дезоксицитидин-5'-трифосфатом АОБА проявлял химические свойства, аналогичные О-метилгидроксиламину (ОМГА) -мутагену, механизм взаимодействия которого с нуклеиновыми кислотами был хорошо изучен. Конечными продуктами взаимодействия ОМГА с цитозином являются К4-метокси-6-метоксиамино-5,6-дигид-роцитозин (соединение IV, И. = СН3, рис. 1.1) и Ы4-метоксицитозии (соединение III, Я = СН3). ОМГА в качестве мутагена способен вызывать транзиции в-» А в комплементарной цепи ДНК. Однако мутагенные

тмн-

III

Рис. 1.1. Продукты взаимодействия цитидина (I) с гидроксиламином и его производными (Н-1У), (Я - Н или алкил, - дезоксирибоза)

свойства АОБА были значительно выше, чем у ОМГА. Высокий мутагенный потенциал АОБА и направленность его мутагенного действия преимущественно на одноцепочечные участки ДНК делали его весьма перспективным для разработки эффективных схем локализованного статистического мутагенеза.

1.1. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ВВЕДЕНИЯ МУТАЦИЙ В ОГРАНИЧЕННЫЙ РАЙОН ДНК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОЛИГОНУКЛЕОТИДА, МОДИФИЦИРОВАННОГО АОБА

Для проверки гипотезы, согласно которой высокая мутагенная активность АОБА обусловлена малоэффективным удалением из ДНК модифицированных им цитидинов, мы воспользовались методом оли-гонуклеотид-направленного мутагенеза. В качестве мутагена взяли олигонуклеотид, модифицированный аминооксибутиламином. После синтеза комплементарной цепи ДНК in vitro и трансфекции компетентных клеток Е. coli отбор мутантных клонов осуществляли гибридизацией с исходным немодифицированным олигонуклеотидом, меченным по 5'-концу радиоактивным фосфором (Tatkov et al., 1991а).

Схема эксперимента, структура олигонуклеотида, возможные нук-леотидные замены представлены на рис. 1.2. В качестве мутагена в данном случае был применен модифицированный с помощью АОБА олигонуклеотид, использованный нами ранее для замены Arg-33 на Cys в гене интерферона-а2. Степень модификации олигонуклеотида можно было контролировать по изменению его электрофоретической подвижности, поскольку модификация цитидина АОБА приводила к появлению дополнительного положительного заряда за счет первичной аминогруппы. Мутантные клоны выявляли гибридизацией с немодифицированным олигонуклеотидом колоний, перенесенных на нитро-целлюлозный фильтр. Так как комплекс олигонуклеотида с мутантной ДНК менее термостабилен, отбирали клоны, дающие отрицательный гибридизационный сигнал при повышении температуры отмывки фильтра. Девять клонов содержали, как и предполагалось, единичные замены G-»A. Эффективность мутагенеза составила примерно 3 %. Анализ фаговых ДНК мелкощепящими рестриктазами и секвенирова-ние всего гена IFN-a2 не выявили каких-либо других отличий в этом гене и в ДНК вектора (Smirnova et al., 1992; Смирнова и др., 1992).

Таким образом, модифицированный АОБА олигонуклеотид вызывал индукцию G->A транзиций только в комплементарном участке

lfsc lkdchdf

CTT TTC TCT TGC CTG AAA GAC TGT CAT GAC TTC a G GAC TTT CTG ACA GTA CTG

lfsclknyhnf

CTT TTC TCT TGC CTa AAA aAC TaT CAT aAC TTC

Рис. 1.2. Направленный мутагенез модифицированным олигонуклеотидом а — фрагмент аминокислотной (сверху) и нуклеотидной последовательности исходного ин-терферона-альфа2; звездочками в структуре олигонуклеотида отмечены цитозины, модифицируемые 4-аминооксибутиламином; б - возможные иуклеотидные (указаны строчными буквами) и соответствующие им замены аминокислотных остатков в последовательности

интерферона-альфа2 человека

ДНК. Нуклеотидные замены были обнаружены в трех положениях из четырех возможных: два мутанта содержали замену G-*A в кодоне 30-го остатка, пять - в 32-м и два клона - в 33-м (см. рис. 1.2).

1.2. ПОЛУЧЕНИЕ МУТАЦИЙ МОДИФИКАЦИЕЙ АО Б А ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ УЧАСТКОВ ДНК

Возможность использования АОБА в схеме локализованного мутагенеза, основанной на модификации in vitro дуплекса с одноцепочеч-ным участком, мы исследовали на примере гена ylFN человека (Tatkov et al., 1991а). Ген был реклонирован в фаг М13тр8 по сайтам EcoRI и Pstl из плазмиды pIFN-y-trp2, а в качестве экранирующего полинук-леотида использовали репликативную форму (РФ) ДНК М13шр8, гид-ролизованной по тем же самым сайтам. Попытки достроить модифицированный АОБА гибридный комплекс до полноразмерной двухцепо-чечной ковалентно-замкнутой РФ ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы фага Т4 оказались безуспешными. Мы предположили, что in vivo репликативный аппарат бактериальной клетки сможет достроить гибридный комплекс, поэтому после его модификации АОБА реакционной смесью трансфицировали компетентные клетки Е. coli.

Для определения мутаций из десяти клонов были выделены фаговые ДНК и секвенированы по методу Сэнгера. Был обнаружен клон, ДНК которого содержала только транзиции С->Т в мутированном гене. Эти результаты подтверждали избирательное взаимодействие АОБА с цитозиновыми основаниями в одноцепочечных районах ДНК.

1.3. ПОЛУЧЕНИЕ АОБА-ПРОИЗВОДНОГО dCTP (dC**TP) И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО СУБСТРАТНЫХ СВОЙСТВ В ПОЛИМЕРАЗНОЙ СИСТЕМЕ IN VITRO

Доказав, что олигонуклеотидом, модифицированным АОБА, можно вводить G-»A транзиции в комплементарный район, а модификацией АОБА одноцепочечного участка ДНК индуцируются С-»Т транзиции, мы предположили, что в обоих случаях мутации вызываются модификацией АОБА цитозиновых остатков, а высокий выход мутантов обусловлен, по-видимому, устойчивостью модифицированных нук-леотидов к репаративному удалению. Однако, какое из соединений (II, III или IV, см. рис. 1.1) индуцировало мутации, оставалось неизвестным. Скорее всего, таким мутагеном могло оказаться соединение III или К4-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5'-трифосфат (dC**TP).

Для выяснения влияния кислорода в аминобутокси-группе на мутагенные свойства дезокситрифосфата было решено синтезировать К4-(6-аминогексил)-дезоксицитидин-5'-трифосфат (в дальнейшем dC*TP). Оба трифосфата синтезировали по известным методикам (рис. 1.3) с незначительными модификациями. Однородность получен-

nh2

N Н

NaHS03, H2N(CH2)6NH2

N I

55 °C, pH 7,3

"О

so3

hn(ch2)6nh2

N I

pH 9,0

h2n(ch2)6nh2 n

n' I

R1 dC*TP

nh2

N I

H3NO(CH2)4NH2 70 °C, pH 5,5

hno(ch2)4nh2

N I

Рис. 1.3. Схема синтеза модифицированных дезоксицитидин-5'-трифосфатов (Ri - дезоксирибозил-5'-трифосфат)

ных веществ подтверждали тонкослойной хроматографией и ионообменной ВЭЖХ, а их структуру - качественными реакциями с нингид-рином, УФ- и Н'-ЯМР-спектрами (Tat'kov et al., 1995).

Исследование кинетики включения в ходе полимеразной реакции in vitro показало, что dC*TP включался исключительно вместо дезокси-цитидин-5'-трифосфата, a dC**TP - вместо обоих пиримидиновых де-зокситрифосфатов. Следовательно, можно было предположить существование у dC**TP двух таутомерных форм: имино- (преобладающая, имитирует dTTP) и амино- (минорная, имитирует dCTP). При включении dC**TP в геноме М13 были обнаружены точки терминации реакции, которые преодолевались понижением температуры синтеза до 12 °С. Было установлено, что в ходе ферментативного синтеза образуются полинуклеотиды строго определенной длины. В начале реакции число полинуклеотидов, различающихся по своей длине, было не менее 5, когда вместо dTTP вводили dC**TP, и не менее 8-9, когда dC**TP вводили вместо dCTP.

По ходу реакции наблюдали постепенное исчезновение низкомолекулярных и увеличение содержания высокомолекулярных полинуклеотидов. Аналогичные явления отмечались как при 37 °С, так и при 12 °С независимо от того, вводили ли dC**TP вместо dTTP или dCTP. В контрольных экспериментах в присутствии всех четырех немодифи-цированных трифосфатов синтез полинуклеотидов проходил полностью до образования высокополимерного продукта, а в отсутствие хотя бы одного из четырех дезокситрифосфатов не наблюдался. Мы предположили, что при включении dC**TP в синтезируемую цепь фрагментом Кпенова ДНК-полимеразы I в ДНК проявляются точки терминации, линейно расположенные по геному. Терминация растущей цепи в этих точках не является окончательной, скорее, напоминает резкое замедление полимеразной реакции. Фрагмент Кленова постепенно преодолевает «участок торможения», и реакция продолжается, видимо, с обычной скоростью до следующего «района торможения».

Для выяснения природы «участков торможения» мы попытались установить, нет ли их связи с особенностями первичной структуры ДНК. Для этого были использованы три различные пары праймер:мат-рица. На гель наносили продукты терминации и параллельно четыре секвенирующие смеси по Сэнгеру, полученные с тех же самых праймеров. Как видно из рис. 1.4, точки терминации совпадают с по-ли(А)-районами в случае введения dC**TP вместо dTTP и, предположительно, с поли(0)-участками при введении dC**TP вместо dCTP.

GATC * G A T С * G A T С

M,3ms2 GCGGA ACGTCGTGTA

GTGACTGGGA AAACCCTGGC GTTACCCAAC TTAATCGCCT TGCAGCACAT

M13Wp8inf CTTACAGG TTGCGTTTCG

GAAAAGCTGA СCTAATTATTС GGTAACTGAC TTGAATGTCC AACGCAAAGC

M13mpRlnl GG TTTAACAGCT GAAAATGAAG

AGGAGAGTGA CAGAAAAATA ATGCAGAGCC AAATTGTCGA CTTTTACTTC

Рис. 1.4. Определение районов тер ми нации синтеза ДНК in vitro при включении dC**TP вместо tiTTP с помощью метода Сэш ера (звездочкой отмечен анализируемый фрагмент)

а -матрица SS ДНК Ml 3ms2; 6. в - М 13mp8inf, но с разных прайм еров. Внизу - после дова-тельноегь ДНК, прилегающая к 3'-концам Прайм еров (а, б и в соответственно). Подчеркнуты участки торможения синтеза ДНК

В случае (dA)n участков эффективное торможение наблюдается только, если п > 3. В свете полученных данных стало понятно, почему не удалось достроить до репликативной формы гетеродуплекс с одно-цепочечным участком, модифицированным аминооксибутиламином. Видимо, в однрцеиочечном районе появлялись модифицированные кластеры полиС (п > 4), па которых тормозился матричный синтез комплементарной цепи ДНК фрагментом Кленова ДНК полимеразы 1 (Татьков и др., 1995b).

1.4. ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАГЕННЫХ СВОЙСТВ dC"TP

Для исследования мутагенных свойств модифицированных трифос-фатов dC*TP и dC**TP мы воспользовались одноцепочечной ДНК M13ms2 (фенотип Lac+) и олигонуклеотидом-праймером, связывающимся с районом 78-93 гена lacZ'. В ходе синтеза второй цепи модифицированные трифосфаты включались в участок ДНК, комплементарный 5'-началу гена lacZ'. Они должны были индуцировать мутации на N-конце «-пептида уЗ-галактозидазы Е. coli, в результате чего мог бы измениться фенотип трансформированных бактериальных колоний (Lac+ -5» Lac-).

При использовании dC*TP вместо dCTP по вышеприведенной схеме не удалось обнаружить ни одной белой или голубой колонии среди 5000 проанализированных клонов. Если же вместо dCTP использовали dC**TP, то выход мутантов составлял 3,4 ± 0,4 %, и 1,5 ± 0,2 %, если модифицированный трифосфат включали in vitro вместо dTTP. Анализ нуклеотидной последовательности начала гена lacZ' подтвердил, что при включении dC**TP вместо dCTP индуцируются G-»A транзиции, а при замене dTTP на аналог наблюдаются A-»G транзиции, как мы и ожидали. Полное секвенирование всего гена а-пептида /3-галактози-дазы показало отсутствие мутаций в других его районах.

Таким образом, с использованием 4-аминооксибутиламина были разработаны три схемы высокоэффективного локализованного мутагенеза: индукция G->A транзиции в район ДНК, комплементарный модифицированному олигонуклеотиду; С->Т мутаций в одноцепочечном модифицированном участке ДНК и G->A, С-*Т транзиций при включении dC**TP вместо dTTP или dCTP in vitro.

1.5. ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАГЕННЫХ СВОЙСТВ

МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

Ранее было показано (Петренко и др., 1986,1988), что частичная замена фосфодиэфирной связи на фосфотриэфирную в олигонуклеотиде может существенно повысить эффективность олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза, и высказано предположение, что повышение эффективности мутагенеза фосфотриэфирными аналогами олигонуклео-тидов обусловлено исключительно репарационным путем закрепления мутации и обязательным присутствием по обеим сторонам гетеродуп-лексной области участков, устойчивых к нуклеазам.

Для уточнения реального вклада репарационного пути закрепления мутаций мы воспользовались мутационной системой, в которой исходная ДНК-матрица генерировала рецессивный, а мутант - доминантный фенотип. В случае преобладания репарационного пути закрепления мутаций колонии с доминантным Ьас+-фенотипом должны быть гомогенными, т.е. не содержать клеток с Ьас"-фенотипом. Если же колония с мутантным фенотипом образовалась по репликационному пути, то она должна быть гетерогенной с равным соотношением клеток обоего фенотипа. Для выяснения того, насколько обязательно присутствие по обеим сторонам гетеродуплексной области участков, устойчивых к нуклеазам, были синтезированы олигонуклеотиды, у которых только с З'-стороны от гетеродуплексной области на расстоянии 6 нуклеоти-дов располагались модифицированные звенья: пирофосфатное, фосфа-мидное (этилендиаминовое, гексаметилендиаминовое, 2,6-диамино-гексановое) или рибонуклеотидное.

1.5.1. Роль репарационного пути в закреплении мутаций, индуцированных олигонукпеотидами

Для оценки вклада репликационного и репарационного путей в возникновении мутаций при олигонуклеотид-направленном мутагенезе мы разработали мутационную систему, позволяющую фенотипически различать как гомо-, так и гетерозиготные мутантные колонии (Петренко и др., 1990Ь). Система включала в себя четыре типа бактериофагов: М13тр1, М13тз1, М13тз2, М13тр1ДТ и плазмиды рММ1 и рММЗ. Плазмида рММ1 была получена замещением малого РуиП-фрагмента в риС18 на аналогичный участок из РФ ДНК М13тз1, содержащий неактивный 1ас2'-тън. Плазмида рММЗ была получена мутагенезом из рММ1 и являлась плазмидным аналогом М13т&2. С использованием данной системы мы исследовали роль репарации при индукции мутантов 17-мерами (фосфодиэфирными или фосфотри-эфирными аналогами), 24-мерами и 25-мерами, содержащими этилендиаминовое, гексаметилендиаминовое или пирофосфатное звено; а также 25- и 26-мерами с рибонуклеотидом в своем составе.

Основное внимание мы уделяли превращениям Ьас~-матриц в Ьас+-мутанты, так как именно в этих случаях легче всего обнаружить гетерозиготные колонии, свидетельствующие о репликативном закреплении мутаций. Результаты титрования Ьас+-колоний показали, что большинство из них являются гомозиготными независимо от того, какой тип мутации (делеция или вставка) образуется, происходит ли мутагенез на

плазмиде или бактериофаге. Вместе с тем, 5-10 % Ьас+-мутантных колоний представляли собой гетерозиготы, в которых соотношение клеток с фенотипами Lac+ или Lac- сильно варьировало.

Мы предположили, что гетерозиготные колонии возникли в результате котрансформации бактерий фагами различных генотипов. Для проверки нашего предположения мы трансформировали компетентные клетки Е. coli JM103 смесью ДНК двух бактериофагов различного генотипа (1ас+/1ас~). Соотношение ДНК подбиралось таким образом, чтобы на чашке Петри количество Ьас+-колоний составляло всего несколько процентов от общего их числа. В результате титрования 20 Ьас+-колоний было установлено, что две из них оказались гетерогенными и соотношение содержания в них фагов 1ас+/1ас~-генотипа отличалось от 1:1. Таким образом, гетерогенные мутантные колонии, соотношение фагов в которых сильно отличается от 1:1, могли возникнуть в результате котрансформации бактерии несколькими молекулами ДНК, различающимися по генотипу. Полученные данные полностью подтвердили ранее высказанную гипотезу (Петренко и др., 1988) о предпочтительном репарационном механизме олигонуклеотид-на-правленного мутагенеза.

1.5.2. Мутагенные свойства

модифицированных олигонуклеотидов

Для упрощения выявления мутантов было решено сцепить модификацию олигонуклеотида с маркерной мутацией, которую было бы легко фенотипически определять в мутационных системах на основе бактериофага М13. С этой целью были синтезированы олигонуклеотиды, комплементарные началу /acZ'-гена, клонированного в бактериофаге M13mpl. В качестве маркерной мутации была выбрана делеция Т19 (рис. 1.5), а модифицированный узел разместили напротив С26. При гибридизации с матрицей M13mpl 26-мер образовывал область неспа-ренности против Т19, а против C2g располагался гуанозин; 25-меры с модифицированным узлом образовывали две области неспаренности: против Т19 и С26; у 24-меров размер области неспаренности против модифицированного узла был расширен и захватывал С2б и С27.

На основании опытов с фосфотриэфирными аналогами олигонуклеотидов мы предположили, что введение пирофосфатных или фосфа-мидных связей, устойчивых к эндо- и экзонуклеазам, приведет к усилению, а включение рибонуклеотида - к ослаблению мутагенных свойств аналогов олигонуклеотидов, поскольку в бактериальных клетках суще-

Lac Z' ,

ÄfOACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA M13mpl ATGCCTA—GTGACC+GCAGCAAAATGT-5'

Маркерная мутация: Модифицированный узел напротив С26

деления Т[9

+ Гуанозинмонофосфат в случае 26-мера. У 25-мера обозначает замену С2б, 24-мера -замену С26 и С2? на межнуклеотидный линкер

Lac Z' -—

Äf©ACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA М13шр1 ATGCCTA- GTGACC + С AG С AAAATGT- 5'

Маркерная мутация: Модифицированный узел

делеция Т19 напротив С,б и С27

Lac

1 10 20 30

ДТПШ АС С ATG ATTACG G АТ^С ACTG G СС GTC GTTTTAC АА М13тр1ДТ Lac+

1 10 20 30

Äf©ACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA M13mpl

Lac" a

1 10 20 30

Ж® АС С AT§G ATTAC G G ATTC ACTG G С С GTC GTTTTACAA M13msl Lac+

1 10 20 30

AT© ACCATP3ATTACGGA"TQCACTGGCCGTCGTTTTACAA M13ms2

Рис. 1.5. Компоненты тест-системы (а) для исследования мутационных свойств модифицированных олигонуклеотидов и структура 24-меров (б), 25- и 26-меров (в). Подчеркнуты отличия от нуклеотидной последовательности гена lacZ' бактериофага M13mpl

ствует ферментный комплекс, удаляющий РНК-затравки в ходе ДНК-синтеза. Для исследования мутагенных свойств олигонуклеотидов с неприродными связями мы разработали простую тест-систему {см. рис. 1.5) на основе бактериофага М13шр1 и его производных (Петренко и др., 1989).

При использовании одноцепочечной ДНК бактериофага M13mpl по Ьас_-фенотипу легко можно было отобрать мутанты, содержащие

либо двойную делению Т19 и С26 (обозначим их количество буквой А), либо только единичные делении Т19 (их количество равно Т) или С26 (их количество обозначим буквой С). Кроме того, среди Ьас+-мутантов могли содержаться также и те, у которых в районе С26 произошла нук-леотидная замена при сохранении маркерной делеции Т19 (их количество обозначим буквой О). Тогда общее количество мутантов, которые можно было выявить по изменению фенотипа на матрице М13шр1, равно А+Т+С+И. На матрице М13гпз1 по Ьас+-фенотипу можно было отобрать мутанты, содержащие только единичные делеции Т19 или С26, либо с маркерной делецией Т19 и нуклеотидной заменой в районе С26, т.е. Т+С+И. На матрице М13тз2 по Ьас--фенотипу можно было обнаружить только мутанты с единичной делецией С26, т.е. С (Рей-епко е! а1., 1991а; 1991Ь).

1.5.3. Мутагенные свойства рибоаналогов дезоксирибоолигонукпеотидов

Исследования проводили с применением двух рибоаналогов: 26-ме-ра, который кодировал маркерную делецию Т19 и содержал гуанозин напротив С26, и 25-мера, который индуцировал как маркерную делецию Т19, так и делецию С26 рядом с гуанозином. Как оказалось, появление в составе олигонуклеотида рибозвена не повлияло на выход маркерной делеции Т19, но индуцировало эффективную репарацию в районе рибонуклеотида. Видимо, репарационные события происходили на очень коротком участке, поскольку вероятность появления Т19 не отличалась от выхода мутантов, индуцированных фосфодиэфирным олиго-нуклеотидом. Появление мутации С26, которая находилась рядом с ри-бозвеном и на расстоянии всего 6 нуклеотидов от Т19, обнаружить не удалось (Петренко и др., 1990а).

1.5.4. Пирофосфатные производные

Мутагенные свойства пирофосфатного 25-мера исследовали на матрицах М13тр1, М13тз1 и М13тз2. Было установлено, что он, как и его природный аналог, индуцирует три типа делеции: А (двойную Т19 и С26) и единичные Г(Т19), С (С26). Оба типа единичных делеций были представлены в равной степени, но основную долю мутантов (97 %) составляли бактериофаги с двойной мутацией. Появление пирофосфат-ной связи в олигонуклеотиде существенно (в 4-6 раз) повысило его мутагенные свойства. Причем выход мутантов зависел от структуры гете-

родуплекса: при одной области неспаренности выход мутантов был на 40 % выше, чем в случае двух.

Просеквенировав 30 различных мутантов, индуцированных пиро-фосфатными производными олигонуклеотидов, мы не обнаружили ни одной вставки или нуклеотидной замены в районе пирофосфатного звена. Следовательно, введение пирофосфатной группы вместо меж-нуклеотидной связи значительно повышает мутагенные свойства оли-гонуклеотида и не вызывает каких-либо иных мутаций, кроме обусловленных неспаренностями в гетеродуплексе. Повышение выхода мутантов с маркерной делецией, возможно, обусловлено устойчивостью пирофосфатной связи к эндонуклеазам, входящим в состав репарационных систем клетки (Петренко и др., 1991).

1.5.5. Фосфамидные производные олигонуклеотидов

Нами были исследованы мутагенные свойства 25-меров, содержащих модификацию в комплементарном С26 районе в виде лизинового (лиз-25-мер), гексаметилендиаминового (гмда-25-мер) или этилендиа-минового (эда-25-мер) межнуклеотидных линкеров. Кроме того, был синтезирован 24-мер с гексаметилендиаминовым звеном, в котором де-леция в комплементарной области С26 была расширена до двух нуклео-тидов (G26, G27).

Введение фосфамидной связи в олигонуклеотид приводило к повышению выхода мутантов в 2,5-3 раза по сравнению с фосфодиэфирным олигомером. Выход мутантов зависел от типа связи и повышался в ряду: эда-25-мер < лиз-25-мер < гмда-25-мер. Как и в случае фосфоди-эфирных олигонуклеотидов или пирофосфатных аналогов, выход мутантов для фосфамидных аналогов зависел от количества неспаренно-стей в гетеродуплексе: при одной области неспаренности выход мутантов был выше, чем в случае двух.

Итак, из вышеизложенного следует, что олигонуклеотиды, содержащие этилендиаминовое, лизиновое, гексаметилендиаминовое или пирофосфатное звено, как и их обычный фосфодиэфирный аналог, индуцируют только мутации, предопределенные их нуклеотидными последовательностями. Сами по себе модифицированные межнуклеотид-ные связи не вызывают каких-либо дополнительных мутаций.

Разработанная нами молекулярная модель позволила точно определить мутагенный потенциал как модифицированных олигонуклеоти-

дов, так и модификаций в их составе. Оказалось, что все мутации индуцируются исключительно по репарационному пути, причем достаточно введения одного пирофосфатного или фосфамидного звена в состав олигонуклеотида для значительного повышения его мутагенных свойств.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ РАЙОНОВ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ

2.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИБЛИОТЕК МУТАНТНЫХ БЕЛКОВ

К началу нашего исследования можно было предположить, что в молекуле а2-интерферона человека (Ни-1Р1Ч-а2), вероятнее всего, имеется несколько функциональных центров, которые являются кон-формационными, т.е. аминокислотные остатки, входящие в их состав, могли быть распределены каким-то образом по первичной структуре молекулы. Для их выявления мы и решили воспользоваться методом статистического мутагенеза по всей длине молекулы.

Ранее было показано, что слияние генов Ни-^N-«2 и а-донора /?-га-лактозидазы привело к получению гибридного белка, обладающего как антивирусной активностью интерферона, так и а-пептида (Петренко и др., 1984; 1985Ь). Проявление гибридным белком двух активностей позволило легко определять удельную активность его мутантных вариантов без выделения (Е'е^епко е1 а1., 1988Ь). У проанализированных 10 мутантных гибридных белков 42 остатка были изменены, а 123 аминокислотных остатка - нет (рис. 2.1). Мутации распределились почти равномерно вдоль всего интерферонового домена, затронули как поверхностные, так и «-спиральные участки, и подавляющее их большинство относилось к неконсервативным заменам. Среди мутаций, сосредоточенных в поверхностных участках молекулы, только в трех позициях (4, 39, 109) встречалась консервативная замена Р->С. Среди замен в а-спиральных участках также наблюдалась единственная консервативная замена Н-»У (57 позиция), которая находилась во второй спирали. Таким образом, анализ замен с точки зрения их подобия (по боковым группам заменяемых остатков) не мог выявить функционально важные аминокислотные остатки в молекуле лейкоцитарного интерферона.

В то же время встречающиеся среди мутантных белков наборы мутаций, содержащих от 8 до 15 аминокислотных замен, снижали их

mature ifn alpha (1)

mif228 (1)

mif237 (1)

raif238 (1)

raif239 (1)

mif229 (1)

mif236 (1)

mif234 (1)

mif233 (1)

mif232 (1)

mif231 (1)

Consensus (1)

mature ifn alpha (51)

mif228 (51)

mif237 (51)

mif238 (51)

mif239 (51)

mif229 (51)

mif236 (51)

mif234 (51)

mif233 (51)

raif232 (51)

mif231 (51)

Consensus (51)

mature ifn alpha (101)

mif228 (101)

mif237 (101)

mif238 (101)

mif239 (101)

mif229 (101)

mif236 (101)

mif234 (101)

mif233 (101)

mif232 (101)

mif231 (101)

Consensus (101)

mature ifn alpha (151)

mif228 (151)

mif237 (151)

mif238 (151)

mif239 (151)

mif229 (151)

mif236 (151)

raif234 (151)

mif233 (151)

mif232 (151)

mif231 (151)

Consensus (151)

1 50

CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKA

CDLSQTHSLGFRRTLMLLAQMRRISLFFCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKA

CDLPQTHFLGFRRILMLLAQMRRISFFFCLKDRHDFGFSQEEFGNQFQKA

CDLPQTHFLGFRRILMLLVQMRCISLFSCLKDRYDFGFPQEEFGNQFQKA

CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDCHDFGFPQEEFGNQFQKA

CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMCRIFFFFCLKDRHDFGFSQEEFGNQFQKA

CDLLQIHSLGFRRTLMLLVQMRRISLFFCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKA

CDLLQTHSLGSRRILMLLAQMRRIFLFSCLKDCHDFGFPQEEFGNQFQKV

CDLSQIHSLGFRRTLMLLAQMRRISLFFCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKA

CDLSQIHFLGSRRILMLLAQMRRIFFFSCLKDRHDFGFSQEEFGNQFQKA

CDLSQIHSLGFRRILMLLAQMRRIFFFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKA

CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKA

51 100

ETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVI

ETILVLHEMIQQIFNLFFIKDFFAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVI

EIISVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYIELYQFLNDLEACVI

ETILVLYEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDEILLDKFYIELYQQLNDLEVCVI

EIIPVLHEMIQQIFNLFFTKDSSAAWDEILLDKFYIELYQQLNDLEVCVI

EIISVLHEMIQQIFNLFSIKDFSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVI

ETILVLHEMIQQIFNLFFTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVI

EIIPVLHEMIQQIFNLFFIKDSFAAWDEILLDKFYTELYQQLNDLEACVI

EIISVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVI

EIISVLHEMIQQIFNLFFTKDSSWWDETLLDKFYTELYQQLNDLEVCVI

EIIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSVAWDEILLDKFYTELYQQLNDLEACVI

ETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVI

101 150

QGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRS

QGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQCITLYLKEKKYSSCVWEWRAEIMRS

QGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSSCAWEWCAEIMRF

QGVGVTETSLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSLCAWEWRAEIMRF

QGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRIILYLKEKKYSLCAWEWCVEIMRS

QGVGVTETLLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAVJEWRAEIMRS

QGVGVTEIPLMKEDSILAVRKYFQRITFYLKEKKYS PCAWEWRAEIMRF

QGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMCS

QGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQCITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRS

QGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRS

QGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQCITLYLKEKKYSPCAWEWRVEIMRS

QGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRS

151 165

FSLSTNLQESLRSKE

FFLSINLQESLRSKE

FFLSTNLQESLRSKE

FSLSTNLQESLRSKE

FSLFTNLQESLRSKE

FSLSTNLQESLRSKE

FFLSTNLQESLRSKE

FSLSTNLQESLRSKE

FSLSINLQESLRSKE

FSLSTNLQESLRSKE

Рис. 2.1. Выравнивание мутантных аналогов интерферона-а2 в соответствие с их

удельной антивирусной активностью Вверху - активные аналоги: ппШ8 (-0,5 пи037 (-0,5 1ц), ттпШ8 (-1^), пнШ9 (-1,5 mif229 (-1,5 внизу, начиная с гш!236, - неактивные аналоги

удельную активность неодинаково. Кластерный анализ мутантных белков по их первичной последовательности косвенно подтверждал, что снижение антивирусной активности происходило не в результате кумулятивного эффекта от мутаций, а вследствие замен конкретных остатков (рис. 2.2). Принимая во внимание тот факт, что до 75 % остатков может быть заменено в ходе эволюции белка с сохранением пространственной структуры, мы предположили, что все исследованные нами аналоги имеют одинаковую вторичную и третичную структуры. Анализируя функциональные активности белков с идентичной вторичной структурой и, вероятно, с одинаковой пространственной конфор-мацией, мы пренебрегли кумулятивным эффектом от накопления мутаций и предположили, что изменения активности связаны с конкретными аминокислотными заменами, которые могли указывать на функционально важные районы в молекуле интерферона. В результате такого анализа была определена группа остатков, которая могла играть функциональную роль в молекуле интерферона (рис. 2.3).

Для проверки нашей гипотезы о функционально важных остатках мы воспользовались олигонуклеотид-направленным мутагенезом и получили мутантные интерфероны, содержащие те же замены в 32,33,50, 144, 145, 149 позициях, что и статистические мутанты, но в виде единичных мутаций. На примере шести мутантов было полностью подтверждено предположение, что данные конкретные замены снижают

I-mif 228 (0,0442)

-mif 233 (0,0164)

-mif 236 (0,0450)*

__mif 237 (0,0357)

-mif 238

-mif 229 (0,0421)

—__mif 231 (0,0313)*

-mif 232 (0,0354)*

__mif 234 (0,0379)

_j -mif239 (0,0409)

--IFN-a2 (0,0162)

Рис. 2.2. Филогенетическое дерево полученных мутантных интерферонов (в скобках указаны генетические расстояния) Дерево построено методом UPGMA по программе Vector NTI. По генетическим отличиям выделяются три кластера мутантных вариантов зрелого лейкоцитарного интерферона: (228,233,236,237,238); (229,231,232); (234,239, IFN-a2). В каждом кластере присутствуют как активные, так и инактивированные белки - отмечены звездочкой

СОЬРОТНБЬС ЗГ^П-МИ-АО МИтЗЬРЗС!. КРКНОРСРРС! ЕЕРСМОРОКА

* * * *

* * * # *

ЕИРУШЕМ! ОСНРГЛ-РЭТК DSSAAWDETL ЮКРУТЕЬУО <Э1.Ы01-ЕАСУ1

»* * * *

* ф * * * * *

* * * * •

СЮУСУТЕТРЬ МКЕРЭНАУР КУРСЖ1Т1_У1_ KEKKYSPCAW ЕУУРАЕШРЭ

» # ф ф ф ф ф ф ф ***

ф ф ф ф ф ф ф ф ф

Р31_5ТЫ1_С1ЕЗ ЬВЭКЕ * *

* *

Рис. 2.3. Роль аминокислотных остатков молекулы лейкоцитарного интерферона

человека в формировании «антивирусной детерминанты» Одной звездочкой обозначены замены остатков, которые снижают антивирусную активность в 3 раза, двумя звездочками - в 10 раз, тремя - в 100 и более раз. Над структурой отмечены функционально важные остатки лейкоцитарного интерферона, обнаруженные нами, под структурой — другими авторами (вплоть до 2005 г.)

удельную антивирусную активность более чем в 100 раз (Петренко и др., 1988Ь).

К 2005 г. рядом авторов была подтверждена функциональная значимость 19 из 23 (83 %) остатков, впервые идентифицированных нами в качестве функционально важных (Петренко, Татьков, 1990; Рейепко е! а1., 1991с). Среди них оказалось 14 гидрофильных и 9 гидрофобных остатков.

Таким образом, наше предположение о том, что структурно-функциональную организацию белковых молекул можно изучать локализованным мутагенезом гибридного гена, состоящего из генов исследуемого белка и какого-либо фермента, полностью оправдалось. При определении влияния замен остатков на активность исследуемого домена можно пренебречь не только существованием в гибридном белке второго домена, но и кумулятивным влиянием на активность молекулы нескольких одновременных замен в первом.

2.2. ПОИСК ФУНКЦИОНАЛЬНО ВАЖНЫХ ОСТАТКОВ СРЕДИ КОНСЕРВАТИВНЫХ МОТИВОВ

В НЕСТРУКТУРИРОВАННЫХ ОБЛАСТЯХ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ

В клетках прокариот два фактора терминации катализируют отщепление пептидной цепи отрибосомного комплекса. Один (Ю71) отделяет цепь, когда рибосома достигает нонсенс-кодонов ТЛАА, иАО; другой (11Е2) - по достижении кодонов ИАА, 1ЮА. Кроме того, известен еще и третий фактор терминации (ИРЗ), который не обладает самостоятельной каталитической активностью, но стимулирует действие двух других факторов.

Эукариотический фактор терминации трансляции (в дальнейшем еКР1) - белок, играющий очень важную роль в осуществлении точности белкового синтеза в клетках эукариот. Он способен узнавать все три стоп-кодона (в отличие от прокариотических факторов), связываясь с ними в А-участке рибосомы, и осуществлять ОТР-зависимый гидролиз пептидил-тРНК с образованием свободного полипептида. Можно предположить, что в составе еМЧ существует структурный участок, взаимодействующий со стоп-кодонами в А-участке рибосомы аналогично тому, как аминоацил-тРНК реагирует с комплементарным ей ко-доном в том же самом участке рибосомы. Изучение структурно-функциональной организации еИР1 могло бы обогатить наши знания о природе РНК-белкового взаимодействия.

2.2.1. Теоретический расчет предполагаемых мутаций в

К началу работы ничего не было известно о пространственной структуре хотя бы одного из известных прокариотических или эука-риотических ИЛ, как в индивидуальном виде, так и в комплексе с любым из его субстратов. Сравнением аминокислотных последовательностей пяти эукариотических еКР1, известных к тому времени и находящихся в базе данных СспЬапк, был обнаружен консервативный район 172-194, в котором наблюдалось полное совпадение остатков. В самом центре этого «суперконсервативного» домена факторов терминации трансляции находился мотив СИХлО. При сравнении всех известных белковых последовательностей как эукариотических еЯЛ, так и прокариотических факторов терминации Ш*!, КР2 был выделен тот же «суперконсервативный» домен, а в его центре - уникальный мотив 0X00(5 (где X - любой аминокислотный остаток). Расчеты вторичной структуры фактора терминации подтверждали, что обнаруженный консервативный домен, скорее всего, находится в петлевом участке

eRFl Wild-type

G181S

R182G

G183R

G183A

G184S

174

189

VDLPKKHGRGGQSALR hLLLJJJLLLJHHHHH

VDLPKKHSRGGQSALR hLLLJJJJLLJ HHHHH

VDLPKKHGGGGQSALR hLLLJJJLLLJ HHHHH

VDLPKKHGRRGQSALR hLLLJJJJLLJHHHHH

VDLPKKHGRAGQSALR hLLLJJJLLLJJHHHH

VDLPKKHGRGSQSALR hLLLJJJLLLJJHHHH

Рис. 2.4. Предсказанная вторичная структура еЯР1 человека в районе мотива ОХСЮО и предложенные аминокислотные замены для тестирования функциональной активности

данного района фактора терминации Н - а-спиральный участок с высокой вероятностью; Ь - высокая вероятность петлевого участка; й - низкая вероятность спирали; I - низкая вероятность вхождения остатка в петлю

(рис. 2.4). Анализ гидрофобности также указывал на ее резкое изменение в исследуемом районе.

При рассмотрении возможных аминокислотных замен в eRFl мы решили не менять R в мотиве GRGGQ, поскольку он не является высококонсервативным. Первый и третий G было решено заменить сери-ном, который находится в одной группе взаимозаменяемости с глицином, и, следовательно, такая замена не могла оказать существенного влияния на вторичную структуру полипептидной цепи в этом районе. При замене второго глицина решено было проследить влияние увеличения положительного заряда в этом районе на функциональную активность белка. И поскольку один остаток аргинина уже находился рядом с глицином, мы решили заменить второй G на R. Расчеты вторичных структур мутантных факторов подтвердили сохранение петли в исследуемом районе (см. рис. 2.4).

2.2.2. Получение мутантных белков eRF1

При мутагенезе использовали укороченный ген фактора терминации человека, клонированный в плазмиде pQE-ЗО, и полноразмерную копию гена, клонированную по EcoRI сайту в бактериофаге М13тр19. Нами были получены пять мутантных генов, кодирующих замены аминокислотных остатков в обнаруженном высококонсервативном мотиве GXGGQ: SRGGQ (G181S); GGGGQ (R182G); GRAGQ (G183A); GRRGQ (G183R); GRGSQ (G184S).

Для получения полноразмерных белков eRFl дикого и мутантных типов нами были сконструированы плазмиды pTTF, обеспечивающие экспрессию полноразмерной копии гена eRFl в Е. coli, а также пяти му-

тантных вариантов. Исходный фактор терминации еМЧ и его мутант-ные варианты были выделены в гомогенном состоянии. Для оценки влияния замен остатков на функцию фактора терминации мутантные факторы сравнивались по КТ-активности, определенной по методу Каски с использованием £-те1-РНК в качестве субстрата, и по ОТР-аз-ной активности комплекса мутантного еМЧ с нормальным еЯРЗ. Фактор еИРЗ был впервые обнаружен Л.Л. Киселевым с соавторами, которые установили, что еКРЗ сам по себе не обладает ИР-активностью, однако сильно стимулирует активность сИП при низких концентрациях стоп-кодонов. Ими же было показано, что еЯБЗ имеет СТР-связываю-щие мотивы в своей структуре и обладает вТР-азной активностью только в присутствии рибосом и еИР1.

Как видно из табл. 2.1, замены в 183 и 184 остатках привели к утрате И^-активности, тогда как замены в 181, 182 - не повлияли на нее. Нефункциональные мутантные факторы конкурировали с активным еМ71, снижая терминирующую активность в тесте при их добавлении в систему (табл. 2.2). Вместе с тем, замены остатков в данном мотиве не сказались на способности мутантных факторов стимулировать вТР-аз-ную активность еКРЗ в присутствии рибосом (рис. 2.5). Таким образом, нами впервые были получены доказательства того, что высококонсервативный мотив СвС) входит в состав функционального сайта молекулы эукариотического фактора терминации eR.Fl, участвующего в запуске стоп-кодонзависимого катализа гидролиза пептидил-тРНК в Р-центре рибосомы (БпЯоуа е1 а1., 1999).

вЭР—-ОТР —- 0 в 0 о 0 I) (!

ИлЬскоте Нитап еЯРЗ Нитап еКК1 ++++++ ++++++— ++++++ ++++++— 1 II м II II II 1

\Vild-type 01815 С18311 СШЭ С183А Ш82С

Рис. 2.5. Влияние мутаций на способность еИЛ стимулировать вТР-азную активность еИРЗ в присутствии рибосом

Ta6nuifa 2.1. Влияние мутаций на функцию терминации трансляции фактора eRFl человека

Активность терминации трансляции, срт

Факторы терминации при UAAA при UAGA при UGAA

eRFl eRF3 50 2,5 50 2,5 50 2,5

Wt - 2600 0 2500 0 2700 0

G181S - 2120 0 2520 0 2800 0

R182G - 2100 0 2300 0 2200 0

G183R - 0 nd 0 nd 0 nd

G183A - 0 nd 0 nd 0 nd

G184S - 0 nd 0 nd 0 nd

wt + nd 2000 nd 1850 nd 1760

G181S + nd 1920 nd 1650 nd 1600

R182G + nd 1900 nd 1500 nd 1750

G183R + 0 nd 0 nd 0 nd

G183A + 0 nd 0 nd 0 nd

G184S + 0 nd 0 nd 0 nd

Примечание. Активность фактора eRFl определяли по количеству освобожденного формил-метионина (f[35S]Met) после добавления к рибосомальному комплексу стоп-кодона в концентрации 50 или 2,5/iM. (wt- eRFl дикого типа; nd - not determined, не определяли.)

Таблица 2.2. Ингибирование терминации трансляции неактивными мутантными факторами eRFl человека

eRFl Активность терминации трансляции

cpm %

wt 5700 100

G181S 6800 >100

wt + G181S 8780 >100

R182G 6500 >100

wt + R182G 9270 >100

G183R 0 0

wt + G183R 740 12,9

wt + G183A 1050 18,4

G183A 0 0

G184S 0 0

wt + G184S 2800 49,1

Примечание.Об активности терминации трансляции судили по количеству формил-метионина (Д353]МеО, освободившегося из комплекса Г[353]МсМ1ШАМе'*ииСАиОиДАЛ *ЦиСАиСиААА с рибосомами после добавления сЯР 1, его мутантных форм или их смесей.

3. ПОЛУЧЕНИЕ НОВЫХ БЕЛКОВ

НА ПРИМЕРЕ у-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА

В качестве объекта исследования нами был выбран у-интерферон человека. В клетках Е. coli белок синтезировался в виде нерастворимых телец включения, обладал антивирусной, антипролиферативной и им-мунорегулирующими активностями. Особенно ценным свойством ре-комбинантного у-интерферона оказалось эффективное подавление размножения внутриклеточных паразитов.

Однако рекомбинантный у-интерферон, как и его природный аналог, легко разрушался протеазами. По сравнению с а- и /З-интерферо-нами пространственная структура у-интерферона человека оказалась нестабильной. Достаточно было нагреть или подкислить раствор, как у-интерферон необратимо денатурировал.

К настоящему времени было установлено, что в молекуле у-интерферона человека имеется не менее двух функциональных сайтов: кон-формационный центр связывания с рецептором и секвенциальный сигнал ядерной транслокации NLS. Центр связывания образуют остатки, входящие в АВ-петлю, F-петлю и в консервативный район С-конца (рис. 3.1). В последовательность сигнала транслокации входят остатки KTGKRKR из консервативного района С-конца. Сохранность обоих сайтов крайне важна для проявления молекулой функциональных активностей. Следовательно, пытаясь повысить стабильность молекулы, заменять остатки в этих районах нежелательно.

Поскольку чувствительность молекулы у-интерферона к протеазам обусловлена наличием на С-конце сайтов узнавания трипсиноподоб-ными протеазами, образованными положительно заряженными остатками лизина и аргинина, мы предположили, что их замена может повысить устойчивость молекулы к протеазам. Так как концевой район не структурирован, замены могли быть самыми разнообразными: можно полностью удалить RR сайт или до 12 аминокислотных остатков, частично заменить остатки в KRKR-мотиве. Также представлялось интересным уменьшить суммарный положительный заряд С-конца введением отрицательно заряженного остатка. Такая мутация могла бы пролить свет на роль электростатических взаимодействий в проявлении активности у-интерферона.

Согласно косвенным данным, снижение стабильности димера приводит к падению антивирусной активности и эффективности ренатура-ции белка, поэтому мы предположили, что повышение его стабильности, наоборот, повысит антивирусную активность белка и положительно скажется на ренатурации. Для структурной стабилизации была вы-

Рис. 3.1. Схематическое представление димера у-интерферона и взаимодействия

а-спиралей в нем

а — спирали изображены в виде цилиндров и пронумерованы с N-конца у-интерферона буквами A-F соответственно. Штриховкой отмечены спирали второй субъедшшцы димера

(Ealick et al., 1991)

брана С-спираль - в ней нет функциональных остатков и взаимодействие между С-спиралями существенно для создания гидрофобного «цементирующего» ядра в димере. Так как на обоих концах спирали располагались положительно заряженные остатки, мы предположили, что введение аминокислотного остатка с отрицательно заряженной боковой группой повысит устойчивость спиральной конформации и положительно скажется на функциональных свойствах молекулы.

3.1. ВЛИЯНИЕ ИНТРОДУКЦИИ ОТРИЦАТЕЛЬНОГО ЗАРЯДА В С-СПИРАЛЬ НА СТАБИЛЬНОСТЬ И АКТИВНОСТЬ ^-ИНТЕРФЕРОНА

Уровень синтеза мутантного белка эсферона, содержащего вместо серина в позиции 51 остаток аспарагиновой кислоты (S51D), составлял 20-40 % от суммарного клеточного белка в штамме Е. coli МН-1 (рис. 3.2). Весь белок в клетке находился в виде телец включения. В го-

ylFN Met Gin Ser Gin lie Val Ser Phe Туг Phe Lys Leu Phe Lys Asn

ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC З'-G GTT TAA CAG ctG AAA ATG AAG

S51 Met Gin Ser Gin Ile Val Asp Phe Туг Phe Lys Leu Phe Lys Asr

ATG CAG AGC CAA ATT GTC gaC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC

Sali

Рис. 3.2. Схема получения эсферона (S51D) Показаны фрагменты нуклеотидной и соответствующей аминокислотной последовательности у-интерферона в области мутации. Неспаренные в олигонуклеотиде и мутантные основания в гене эсферона указаны строчными буквами. Сверху подчеркнут Ser, замененный в ходе мутагенеза на остаток Asp, снизу - возникший в результате мутагенеза сайт рестрикции Sali

могенном состоянии эсферон был получен по той же схеме, что и на-тивный у-интерферон (Tatkov et al., 1991Ь;Татьковидр., 1994,1996b).

КД-спектры и скорости тушения флуоресценции триптофана в позиции 36 у эсферона и рекомбинантного у-интерферона совпадали (рис. 3.3), а по скорости тушения тирозиновых остатков (4, 14, 53

1,00-,

0,50 -,-,-,-,

12 3 4

Концентрация йодистого калия, %

Рис. 3.3. Зависимость интенсивности флуоресценции раствора эсферона от концентрации йодистого калия (К1) Условными обозначениями Жив отмечено тушение флуоресценции тирозиновых (У), Д и О - триптофановых остатков (XV)

и 98 позиции) оба белка различались. Следовательно, их вторичная и локальная структуры в районе 36-го остатка были идентичны. Поскольку пространственная структура вокруг триптофановых остатков в обоих белках была одинаковой, то и скорости тушения флуоресценции остатков т ирозина в 4, 14 позициях, расположенных намного дальше от мутатщи, чем \¥36, должны были совпадать. Видимо, и тирозино-вый остаток в 98 положении, который находится в ЕР-петле, характеризующейся высокой подвижностью ее остатков, не являлся причиной изменения скорости тушения флуоресценции тирозиттовых остатков. Лишь т ирозин в позиции 53 находится рядом с мутацией. Следовательно, замена 10 привела к локальному возмущению пространственной структуры и не отразилась на вторичной структуре.

Мутация 551 П не повлияла на устойчивость эсферона к трипсину (рис. 3.4), на аффинитет к специфичному клеточному рецептору (табл. 3.1), образование димеров (рис. 3.5), фагоцитозстимулируюшую и антипролиферативную активности, но повысила на 3 °С температуру денатурации.

и гз м

Ц Эсфсрон I | 0133Е

Щ Ш4

I ИЗ 8 [=| П9Д 3 Де.чьтаферон

Дсльтаферон

В38 ¡324 013.1Н Эсферон

уШЫ

Рис. 3.4. Изменение гфотеояитичеекйй стабильности мугашных аналоге® по сравнению с мативным у-интерфероном под действием трипсина (0,1% раствор трипсина в 10 мМ буфере Трис-НС1: р!I 7.4; 30 ПС)

Таблица 3.1. Свойства мутантных у-интерферонов

Белок K„,M ABA, МЕ/мг

VSV KMC

ylFN ! х 10 lD 2 ± 0,8 х I07 2 ± 0,5 X Ю7

В24 4 х 10~ul 1,7 ± 0,4 х 107 1 ± 0.6 X 107

В38 2 X 10"!0 1,9 ± 0,6 X 107 1 ± 0,6 X 107

D92 2X10 1(1 2,5 ±0,8 х 107 5 ± 0,8 х 106

Q133E 3 X Ю"10 1,5 ± п,6 х 107 8±0,6х 105

Эсферон (S5JD) 1 х 10 !0 2 ±0,5 х 10s 1 ± 0,5 х Ш7

Дельтаферон 1 X 1,3 ± 0,5 X 107 1 ± 0,4 X 10fi

IFN-AFP 1 х 10 * <1 X 105 <1 х 10s

Примечание. Ка - константа диссоциации, выраженная в молях (М), комплекса Ш1-меченных аналогов y]FN с рецепторами на поверхности клеток лимфондной линии U-937; ABA - антивирусная активность, определенная на культуре клеток L68 но подавлению цитопатического действия вируса везикулярного стоматита (VSV) или jj шефа ломи о-кардита мышей (KMC).

11ротиворечивые данные были получены нами по антивирусной активности зеферона. По подавлению цитопятического действия вируса везикулярного стоматита на клетках фибр об ластов человека L68 удельная антивирусная активность эсферона составила 200 млн МЕ/мг и оказалась в 10 раз выше, чем у рекомбинантного у-интерферона, а при изучении подавления цитопатического действия вируса энцефа-ломиокардита на той же культуре клеток человека наоборот - почти н 2 раза ниже, чем у /IFN.

Рис. .1.5 Влияние мутаций на образование димер-

ной формы у-интерферона I - маркеры молекулярного веса: 2 очищенный дель-тнферон: 3 - очищенный дельтаферон после ковалент-ной сшивки; 4 очищенный рскомбинантный у-ингер-ферон человека; 5 - димер у-шггерферона после ковал ситной сшивки; 6 — гибридный белок |ГЫ-АКР до сшивки: 7 - он же. но после ковалентной сшивки. Для аналогов эсфсрона (8510), ВЗК. В24, ¿02, 0133 фиксация димеров нослс ковалентной сшивки не отличается от рекомбинантного /-интерферона

12 3 -15 6 7

3.2. ПОЛУЧЕНИЕ С-КОНЦЕВЫХ АНАЛОГОВ у-ИНТЕРФЕРОНА С ПОВЫШЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ КТРИПСИНОПОДОБНЫМ ПРОТЕАЗАМ

Пытаясь повысить устойчивость молекулы у-интерферона к протеа-зам, мы заменили сайт RR на GS (мутант В24), центральные RK в NLS -также на GS (мутант В38), ввели обе мутации (В24 и В38) в молекулу (мутант D92) и из гена D92 гидролизом по BamHI сайту с последующим лигированием получили ген дельтаферона, который кодировал укороченный на 10 а.о. с С-конца мутантный у-интерферон (рис. 3.6).

Чтобы выяснить, как скажется на свойствах у-интерферона появление в С-концевом районе кислых остатков с отрицательно заряженной боковой группой, нами был сконструирован мутант Q133E, в котором в положении 133 глутамин был заменен остатком глутаминовой кислоты (Смирнова и др., 1994; Татьков и др., 1995а). Уровень продукции всех полученных С-концевых мутантных у-интерферонов существенно не отличался от продукции исходного белка и достигал 15-20 % от суммарного белка клетки.

Антивирусная активность всех аналогов, определенная по подавлению цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на фибробластах человека L68, была примерно одинакова и различалась лишь в системе вируса энцефаломиокардита и L68 (см. табл. 3.1). Введение мутации В24 или В38 снижало активность мутантного белка до 50 %, двойной мутации - до 25 %, а у дельтаферона активность против вируса энцефаломиокардита упала до 5 % от антивирусной активности исходного рекомбинантного у-интеферона. Активность мутанта Q133 составила всего 40 %. Все мутантные белки образовывали димеры (см. рис. 3.5), обладали высоким аффинитетом к специфическому клеточному рецептору (см. табл. 3.1), имели идентичные и характерные для у-интерферона спектры КД, что свидетельствовало о совпадении их вторичной структуры.

Исследование фагоцитозстимулирующей и антипролиферативной активностей на клетках человека не выявило отличий от исходного у-интерферона даже для дельтаферона, который в системе вируса энцефаломиокардита и клеток человека L68 отличался по антивирусной активности от остальных аналогов (см. табл. 3.1). Все мутации в С-конце-вой области, кроме Q133, повышали устойчивость аналогов как к про-теазе OmpF, ассоциированной с клеточной мембраной Е. coli, так и к трипсину (см. рис. 3.4).

Мутации повлияли также и на способность аналогов у-интерферона образовывать тельца включения в клетках штамма-продуцента. Содер-

130 140

Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gin CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG

130 140

Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Gly Ser Ala Ser Gin CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT GGA TCC GCA TCC CAG

BamHI

130 140

Gly Ser Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gin GGA TCC AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG

BamHI

130 140

Gly Ser'Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Gly Ser1 Ala Ser Gin . GGA TCC AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT GGA TCC GCA TCC CAG

BamHI BamHI

....... 130 ^

Gly Ser1 Ala Ser Gin GGATCC GCATCC CAG

BamHI

130 140

Arg Lys Arg Ser Glu Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gin CGA AAA AGG AGT GAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG

Рис. 3.6. Аминокислотная и нуклеотидная последовательность С-концевой области у-интерферона человека и мутантных вариантов а - рекомбинантный /-интерферон; б - В24; в - В38; г - D92 или биферон; д - дельтаферон; е - Q133Е. Штриховкой отмечены измененные кодоны и соответствующие им аминокислотные остатки. Снизу указан ВагаН1-сайт рестрикции

жание белка в цитоплазме при приблизительно равном уровне экспрессии возрастало в ряду уШЧ, В24, 0133, В38, В92, дельтаферон. Наиболее выраженный эффект был отмечен в случае дельтаферона, который на 90-95 % находился в растворимом состоянии. При понижении температуры культивирования с 37 до 30 °С усиливался внутриклеточный синтез рекомбинантных белков в растворимой форме. Особенно выраженный температурный эффект наблюдался для мутанта С) 133. Если

содержание рекомбинантного у1Е1Ч в цитоплазме в ходе биосинтеза при 30 °С повышалось до 10—20 %, то в случае С) 133 - до 90 % вместо 10 % при 37 °С.

Известно, что уПТ^ через сайт на С-конце (128-КЛК11-131, Ка = = 1,5 X 10~9 М) связывается с гепарином и гепараном. Связывание с ге-параном способствует быстрому удалению интерферона из крови и избирательному накоплению его в селезенке и печени. Уже через 10 мин после внутривенного введения у-интерферона в крови остается не более 7-8 % от его первоначального количества. Мы предположили, что замены на С-конце у-интерферона могли сказаться на аффинитете му-тантных белков к гепарину, гепарану и на скорости удаления из кровеносного русла. И действительно, мутантные белки В38, Б92 и дельта-ферон, содержащие замены в сайте КККЛ, проявили значительно более низкий аффинитет к гепарину по сравнению с исходным у-интер-фероном. Неожиданным оказалось, что и у эсферона (Б5Ш) также понизилось связывание с гепарином. Полученные результаты позволяют предположить, что выведение из кровотока эсферона (851 Б), биферона (В38), дельтаферона и двойного мутанта Б92 по механизму связывания с межклеточным или мембранным гепараном будет медленнее, чем для рекомбинантного у-интерферона, соответственно увеличится их период полувыведения из организма человека.

Поскольку для дельтаферона были получены противоречивые данные по антивирусной активности на культуре клеток, мы провели более подробные исследования его активности на мышах (Та^оу е1 а1., 2000). На экспериментальной модели адъювантного артрита мышей было установлено, что дельтаферон по уровню антифлогогенной активности существенно не отличался от рекомбинантного у-интерферона (табл. 3.2).

Таблица 3.2. Влияние препаратов уШЫ и его аналога дельтаферона на развитие местной воспалительной реакции у белых беспородных мышей в разные сроки после введения полного адъюванта Фрейнда (ПАФ)

Препарат Объем артритного узла, см3

через 1 сут через 2 сут через 3 сут

Физиологический раствор 0,98 ± 0,06 1,40 ±0,14 1,40 ± 0,13

уИЫ, 103Е 1,04 ±0,10 0,90 ±0,04* 1,03 ±0,03*

Дельтаферон, 103 Е 1,11 ±0,06 0,97 ±0,05* 0,95 ± 0,06*

у1ПЧ, 105Е 1,18 ±0,08 1,01 ±0,05* 1,07 ±0,03*

Дельтаферон, 105 Е 0,94 ±0,04 0,94 ±0,06* 0,95 ± 0,06*

* Различия с контролем достоверны при р < 0,05.

ET И

u I et

<=C

о -J 1б

|2H

ca ©

£ ^

e 1 © 1 & 1

+ + о.

? e s

Группы иммунизированных мышей

Рис. 3.7. Влияние у-интерферона или дельтаферона на образование специфических антител (а) и фагоцитарную активность лейкоцитов крови иммунизированных белых мышей (б) Использованы мыши весом 18-20 г, по 8 особей в каждой группе. Препараты вводили животным по 0,1 мл внутримышечно с интервалом через две недели, трижды. БЦЖ — группа мышей, иммунизированных только БЦЖ (30 мг по белку); МБЧ - только искусственными микобактериальными частицами (20 мг дс РНК и 30 мг белков БЦЖ); М+Г - микобактериальными частицами (МБЧ) при одновременном введении с 10 мкг /-интерферона; М+Д - микобактериальными частицами (МБЧ) при одновременном введении с 10 мкг дельтаферона; М+Г+Ф-МБЧ при одновременном введении с 10 мкг у-интерферона и 10 мкг фактора некроза опухоли альфа; М+Д+Ф - МБЧ при одновременном введении с 10 мкг дельтаферона и 10 мкг фактора некроза опухоли альфа; Ф р-р - контроль: мышам вводили только физиологический раствор. Определяли антитела против суммарных белков

М. bovis BCG (вакцина БЦЖ)

Дельтаферон так же, как и рекомбинантный у-интерферон, стимулировал (рис. 3.7, а) у мышей образование специфичных антител (ЬеЬес1еу е! а!., 2002), а при совместном введении с фактором некроза опухоли альфа подавлял их синтез, повышал фагоцитарную активность лейкоцитов иммунизированных животных (Лебедев и др., 2002; Азаев и др., 2003, 2004), особенно при совместном введении с ФНО-альфа (см. рис. 3.7, б).

3.3. УСИЛЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ АНТИГЕНОВ ПУТЕМ СЛИЯНИЯ С ДЕЛЬТАФЕРОНОМ

Слияние белков или их доменов может привести к созданию молекул с совершенно новыми свойствами. Особенностью мономера у-ин-терферона является подвижный С-конец, расположенный возле пучка из пяти непараллельно уложенных а-спиралей. Хотя С-конец играет важную роль в образовании димера и проявлении наиболее полного

спектра активностей, присущих ylFN, тем не менее, можно было ожидать, что при присоединении к нему какого-то другого пептида структура домена-мономера сохранится, следовательно, можно было бы рассчитывать на появление новых свойств у гибридного белка. С этой целью мы решили исследовать, как повлияет слияние у-интерферона человека с другим белком на иммуногенные свойства последнего, поскольку ранее было установлено адъювантное действие ylFN в отношении ряда антигенов.

В качестве второй составляющей гибридного белка нами был выбран альфа-фетопротеин человека (AFP), выполняющий различные биологические функции в организме. Его синтез является признаком ранних стадий некоторых онкологических заболеваний, а при иммунизации им животных появляется очень низкий уровень антител. Для встройки в 3'-конец гена ylFN мы решили взять не полный ген AFP, а его фрагмент, кодирующий С-концевой домен белка с несколькими функциональными сайтами.

Ген гибридного белка IFN-AFP экспрессировали в клетках Е. coli МН-1 аналогично тому, как это делалось для продуцента ylFN и его мутантов. Электрофорез суммарных клеточных белков (рис. 3.8, а) показал, что содержание целевого белка не превышало 5 %, в то время как экспрессия ylFN в аналогичных условиях достигала 30-40 %. Таким образом, добавление к С-концу у-интерферона домена AFP значительно снизило уровень продукции гибридного белка (Татьков и др., 1996а).

В клетках Е. coli белок IFN-AFP нарабатывался в виде телец включения аналогично исходному рекомбинантному ylFN (см. рис. 3.8, в), понижение температуры культивирования с 37 до 30 °С не приводило к усилению его синтеза в растворимой форме, как это наблюдалось для аналогов у-интерферона с мутациями в С-концевой области. Для выделения гибридного белка IFN-AFP из телец включения мы воспользовались препаративным электрофорезом в ПААГ в системе Лэммли. Тельца включения перед электрофорезом растворяли с помощью SDS. В результате был получен денатурированный гибридный белок не менее 95%-ной чистоты (см. рис. 3.8, г). Для ренатурации гибридного белка был использован метод 10-кратного разбавления его раствора в 8 М мочевине 10 шМ ацетатом аммония. Для чистоты эксперимента рекомби-нантный ylFN и его мутантные аналоги, использованные в дальнейших экспериментах в качестве контролей, ренатурировались по той же самой схеме. Гибридный белок IFN-AFP в растворе образовывал димеры (см. рис. 3.5), хотя и не настолько прочные, как рекомбинантный у-ин-терферон или дельтаферон: при денатурации их SDS на электрофорезе

12 3 4

] 1 3 ¡1 5 6 7 8 9 1011 12

2_3

66453629 —

2014-

98-

66- 98- w

66- W»

45- " Р 45- щ

36-

29- 29- т

Рис. 3.8. Выделение гибридного белка IFN-AFP препаративным электрофорезом а - электрофор с гра м м а в ¡2,5 % ПААГ суммарных клеточных белков: I - маркеры молекулярных масс; 2 - pIFN-AFP. 3 - p!FN-B3S; 4 - pAFP. Положение гибридного белка IFN-AFP отмечено стрелкой; 6 — результаты Вестерн-блот-анализа суммарных клеточных белков: 2-7 - проявление антителами к у-интерферону человека; $-\2 -проявлениеантителамик АФП;\ - маркеры молекулярных масс; 2-А - pIFN-AFP; 5 - pAFP; 6 - plFN-B38; 7-8 - природный АФП; 9-11 pIFN-AFP; 12-pAFP; « - определение внутриклеточной локализации белка иммуноблоттингом с антителами к АФП: ! - растворимая клеточная фракция; 2 - нерастворимая клеточная фракция; г - очистка гибридного белка препаративным электрофорезом: I маркеры молекулярных масс; 2- очищенный гибридный белок IFN-AFP; 3- гибридный белок IFN-AFP после растворения телец включения

и в иммуноблоте всегда видна примесь димера, а в случае гибридного белка — нет.

Спектры КД рекомбинантного у-интерферона и гибридного белка IFN-AFP в дальней УФ-облаетя отличались (рис. 3.9, а) вследствие уменьшения процента а-спиралей в гибридном белке за счет вклада фрагмента AFP, в котором доля спиральных участков меньше, чем в j'IFN (44 Ii 62 % соответственно). КД-спектр IFN-AFP в ближней УФ-области (ели рис. 3.9, 6) существенно отличался от спектра j'IFN. Как известно, сигналы в этой области спектра возникают из-за асимметричного окружения остатков с ароматическими боковыми группами и отражают третичную структуру белка, В рекомбинантнсм у-интерфероне имелось 9 фенилалэниповых остатков, 4 тир очи новых, один триптофановый. В С-домене Й-фетопротеина их было существенно больше: 15 фенилаланиновых, 9 тирозиновых и ни одного тритггофано-вого остатка. Видимо, а-фегонротеиновые ароматические остатки внесли существенный вклад в спектр, чем и объясняется отличие спектров рекомбинантного и гибридного белков в ближней УФ-области.

200 210 220 230 240 Длина волны, нм

250 270 290 310 Длина волны, нм

Рис. 3.9. КД-спектры рекомбинантного /-интерферона и гибридного белка IFN-AFP в дальней (а) и ближней (б) УФ-областях 1 - рекомбинантный у-интерферон; 2 - гибридный белок IFN-AFP

Снизился в 100 раз аффинитет гибридного белка к специфическому клеточному рецептору по сравнению с у-интерфероном. Антивирусная активность также снизилась, как минимум, в 10 раз по сравнению с дельтафероном и в 200 раз по отношению к рекомбинантному ylFN (см. табл. 3.1).

Однако ряд активностей, присущих у-интерферону, сохранился (Kosarev et al., 1998). Гибридный белок IFN-AFP достоверно повышал долю фагоцитирующих клеток в общей популяции моноцитов примерно с 48 до 60 % в широком диапазоне его концентраций от 1 до 100 нг/мл (рис. 3.10, а). У гибридного белка IFN-AFP сохранилась такая же, как и у рекомбинантного у-интерферона, способность к подавлению пролиферации мононуклеарных клеток (см. рис. 3.10, б), причем наибольший эффект проявлялся при низких концентрациях белков (1 нг/мл, снижение в 3-4 раза), а при более высоких концентрациях этот эффект уменьшался (Цивковский и др., 1999).

Иммуностимулирующее действие гибридного белка исследовали на кроликах. Ни у одного из животных с помощью реакции гиперчувствительности замедленного типа не было обнаружено специфической реакции на введение AFP в дозе 2 и 20 мкг. Также не было установлено достоверного увеличения индексов пролиферации в реакции бласттрансформации лимфоцитов. Таким образом, гибридный белок IFN-AFP не вызывал усиления клеточного иммунитета к AFP.

Максимальный гуморальный иммунный ответ наблюдали у кроликов, иммунизированных гибридным белком в полном адъюванте

3 60-

В 2:5 1

Q Ii

ylFN ¡FN-AFP ylFN I PN-AFP

Рис. 3.10. Стимулирование фагоцитирующей активности моноцитов человека (а) и подавление пролиферации (о) мононукяеарных клеток доноров гибридным белком (IFN-AFP) в сравнении с рекомбинантным у-интерферон ом

Фрейнда (ПАФ). Титры антител к AFP в этой группе после трех последовательных иммунизации достигали уровня 1:8000. В группе кроликов, иммунизированных AFP с ПАФ, титры антител к AFP были значительно ниже и составляли 1:800. В шестой группе кроликов, которых иммунизировали смесыо AFP с у-интерфероном в ПАФ, также наблюдали образование антител к AFP, однако титры были намного ниже, чем в двух предыдущих группах. В восьмой группе животных, которых иммунизировали гибридным белком на основе /3-галактозид азы GAL-AFP, антител к а - фетопр отеи ну в сыворотке обнаружено не было. Таким образом, в гибридном белке домен AFP обладал значительно более высокими иммуНОгенными свойствами, чем при простом смешивании обеих молекул.

Высокие иммуногенные свойства гибридного белка подтвердились и в отсутствие полного адъюванта Фрейнда. Гуморальный иммунный ответ к AFP был зарегистрирован только в группе животных, иммунизированных гибридным белком IFN-AFP. хотя титр антител не превышал 1:200.

выводы

1. Предложен и экспериментально обоснован высокоэффективный способ получения библиотек мутантных генов с множественными мутациями.

В рамках исследования:

• разработаны новые методы локализованного мутагенеза 4-амино-оксибутиламином или его производным Ж-(4-аминобутокси)-дезо-ксицитидин-5'-трифосфатом. Установлено, что мутации индуцируются Ж-(4-аминобутокси)-цитозином. Модифицированный олигонукле-отид индуцирует в->А транзиции в комплементарном районе, модифицированный ДНК-дуплекс - С-*Т транзиции в одноцепочечных участках, К4-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5'-трифосфат - в-* А и С->Т транзиции;

• показано, что эффективность олигонуклеотид-направленного мутагенеза можно повысить в несколько раз путем модификации в олиго-нуклеотиде одной межнуклеотидной связи;

• выяснено, что мутагенные свойства модифицированных олиго-нуклеотидов возрастают в ряду аналогов с этилендиаминовой, лизино-вой, гексаметилендиаминовой, пирофосфатной связями;

• установлено, что изменение межнуклеотидной связи не влияет на точность репликации ДНК;

• доказано, что мутации, индуцированные модифицированными олигонуклеотидами, образуются репаративным путем;

• впервые продемонстрировано, что неспаренности, расположенные на расстоянии 6 п.о., могут репарироваться независимо друг от друга.

2. Предложена новая методология определения функционально важных остатков в белковой молекуле.

В рамках исследования:

• экспериментально обоснована возможность определения удельной активности изучаемого белка путем его объединения с белком-маркером;

• разработан метод идентификации функционально важных остатков в белковой молекуле «вычитанием» тех позиций, замены которых обнаруживаются только в активных мутантных молекулах и не встречаются в инактивированных;

• создана библиотека мутантных «2-интерферонов, анализ которой позволил установить функциональную значимость 23 остатков изучаемого цитокина;

• доказано, что в консервативных мотивах неструктурированных участков белков находятся функционально важные аминокислотные остатки;

• обосновано, что замена остатка, не приводящая к изменению активности белка, не позволяет делать вывод о его функциональном значении;

• впервые установлена важность консервативного мотива С1ЮСС), находящегося в неструктурированном участке эукариотического фактора еИР1, для осуществления белком функции терминации трансляции.

3. Впервые разработан метод получения устойчивых к протеа-зам искусственных белков заменой К11,1Ш. последовательностей в поверхностных районах молекул на вв мотив. С помощью разработанного метода созданы новые мутантные у-интерфероны:

биферон (092), В24, В38 и дельтаферон, обладающие по сравнению с исходным интерфероном высокой устойчивостью к действию трип-синоподобных протеаз, хорошей растворимостью и отсутствием образования телец включения в бактериальных клетках.

4. Сконструирован аналог у-интерферона - эсферон с антивирусной активностью на порядок более высокой, чем у прототипа.

5. На примере гибридного белка 1Р1Ч-АГР показано, чтоу-интер-ферон обеспечивает высокий уровень гуморального иммунного ответа на присоединенный к нему чужеродный фрагмент.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах

1. Frolova L.Y., TsivkovskiiR.Y., Sivolobova G.F., Oparina N.Y., Serpinsky O.I., Blinov V.M., Tatkov S.I., Kisselev L.L. Mutations in the highly conserved GGQ motif of class 1 polypeptide release factors abolish ability of human eRFl to trigger peptidyl-tRNA hydrolysis // RNA. - 1999. - 5. - P. 1014-1020.

1. KosarevI.S., TatkovS.I., Sivolobova G.F., Kochneva G.V., TsivkovskiiR., Serpinskii O.I., Khristoforov VS., VasilievA., Korpela T. Interferon gamma induces expression of receptors to recombinant alpha-fetoprotein on the surface of U-937 cells//Tumor Biology. - 1998. -19. - P. 23.

3. Lebedev L.R., Azaev M., Tumanov Y., Sizov A.A., Il'ychev A.A., Tat'kov S.I. Artificial mycobacterial particles for immunization against tuberculosis // Dokl. Biol. Sei. - 2002. - 387. - P. 488-490.

4. Petrenko V.A., Tat'kov SJ., Eroshkin A.M., Boldyrev A.N., Pozdnyakov P.I., Sivolobova G.F. Determination of primary structure of mutant genes for human leukocytic interferon alpha2 // Bioorg. Khim. -1998. -14. - P. 447-450.

5. Petrenko V.A., Tat'kov S.I., Semenova L.N., Il'ichev A.A., Pozdniakov P.I. Expression in Escherichia coli of the human leukocyte interferon alpha2 gene fused with N-terminal fragment of beta-galactosidase // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. -1988. -4.-P. 37-41.

6. Smirnova O.Y., Tat'kov S.I., Il'ichev A.A., Petrenko V.A. Introduction of random mutations in specific regions of the genome using a modified oligonucleotide // Molecular Biology. - 1992. - 26. - P. 143-147.

7. Tat'kov S.I., Sivolobova G.F., Kochneva G.V., Reshetnikov S.S., Tsivkovskii R. Y„ Serpinskii O.I. Expression of human gamma-interferon/alpha-fetoprotein hybrid gene in Escherichia coli II Molecular Biology. - 1996. - 30. - P. 780-785.

8. Tat'kovS.I., Smirnova O.Y., TsivkovskiiR„ Kochneva G.V., Kuz'micheva G.A., Khristoforov VS., Kosarev I.S., Chernykh E.R., Khonina N.A., Lebedev L.R., Da-nilenko E.D., Fadina V.A., Pustoshilova N.M., Masycheva V.l., Sandakhchiev L.S. Mutant human gamma-interferon with a truncated C-terminus and its properties // Dokl. Biochem. - 2000. - 372. - P. 112-114.

9. Tat'kovS.I., TsivkovskiiR.Y., Baturinal.I., Smirnova O.Y. Mutagenic activity of N4-(4-aminobutoxy)-2'-deoxycytidine-5'-triphosphate // Molecular Biology. -1995.-29.-P. 171-174.

10. Азаев М.Ш., Лебедев Л.P., Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Кузьмиче-ва Г.А., Боднев С.А., Донченко H.A., Татьков С.И. Получение искусственных микобактериальных частиц и исследование их иммуногенных свойств // Биотехнология. - 2004. - 4. - Р. 34-40.

11. Лебедев Л.Р., АзаевМ.Ш., Туманов Ю.В., Сизов A.A., Ильичев A.A., Татьков С.И. Искусственные микобактериальные частицы для иммунизации против туберкулеза // Докл. АН СССР. - 2002. - 387. - С. 272-275.

12. Петренко В.А., Карпенко Л.И., Татьков С.И., Смирнова О.Ю., Кузьми-чеваГ.А., Ильичев A.A. Мутагенез, индуцированный фосфотриэфирными аналогами олигонуклеотидов и направленный на места разрыва двуспиральной ДНК // Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. - 1991. - 10. -Р. 19-22.

13. Петренко В.А., Кузьмичева Г.А., Татьков С.И., Красноборов И.И., Ильичев A.A., Батурина И.И., Майстренко В.Ф., Цитович A.B., Долинная Н.Г., Ша-барова З.А. Мутагенез, направленный неприродными аналогами олигонуклеотидов. I. Участие рибонуклеотидных звеньев в репарации и репликации ДНК // Молекуляр. биология. - 1990. - 24. - С. 1332-1338.

14. Петренко В.А., Кузьмичева Г.А., Татьков С.И., Красноборов И.И., Ильичев A.A., Друца В.Л., Пурмаль A.A., Шабарова З.А. Исследование мутагенных свойств олигонуклеотидов, содержащих пирофосфатное звено, с помощью мутационной системы на основе фага М13 // Молекуляр. биология. — 1991. — 25.-С. 1539-1545.

15. Петренко В.А., Кузьмичева Г.А., Татьков С.И., Красноборов ИИ, Поздняков П.И., Ильичев A.A., Батурина ИИ, Хомов В.В. Исследование механизмов мутагенеза, направленного фосфотриэфирными аналогами олигонуклеотидов. Роль репарации в закреплении мутаций // Молекуляр. биология. -1990.-24.-С. 460-466.

16. Петренко В.А., Татьков С.И. Структурно-функциональная организация лейкоцитарного интерферона // Молекуляр. биология. — 1990. - 24. — С. 1495-1503.

П. Петренко В.А., Татьков С.И., Болдырев А.Н., Семенова Л.Н., Сиволо-боваГ.Ф., Каргинов В.А. Экспериментальная модель и возможный молекулярный механизм индуцированного делеционного мутагенеза // Докл. АН СССР. — 1996.-290.-С. 249-253.

18. Петренко В.А., Татьков С.И., Ерошкин А.М., Болдырев А.Н., Поздняков П.И., Сиволобова Г.Ф. Определение первичной структуры мутантных генов лейкоцитарного интерферона-альфа2 человека // Биоорган, химия. -1988. -14.-С. 810-814.

19 .Петренко В. А., Татьков С.И., СеменоваЛ.Н., Сиволобова Г.Ф., Болдырев А.Н., Колокольцов A.A., Ерошкин А.М., Куличков В.А. Антивирусное действие мутантных интерферонов. Новый подход к исследованию структурно-функциональной организации интерферонов // Биоорган, химия -1987. -13. -С. 259-262.

20. Смирнова О.Ю., Татьков С.И., Ильичев A.A., Петренко В.А. Введение статистических мутаций в строго определенный район генома с помощью модифицированного олигонуклеотида // Молекуляр. биология. - 1992. - 26. -С. 179-184.

21. Смирнова О.Ю., Татьков С.И., Петренко В.А., Ильичев A.A., Сандах-чиев Л.С. Мутантные гамма-интерфероны человека с измененным С-концом и их свойства // Докл. АН СССР. - 1994. - 337. - С. 405^06.

22. Татьков С.И. Исследование структурно-функциональной организации лейкоцитарного «2-интерферона методом направленного мутагенеза: Дис. ... канд. хим. наук: (03.00.04 - биохимия) / Мин-во мед. и микробиол. пром-сти СССР, Всесоюз. НИИ молекуляр. биологии. - Новосибирск, 1986. - 200 с.

23. Татьков С.И., Сиволобова Г.Ф., Кочнева Г.В., Решетников С.С., Цивков-ский Р.Ю., Серпинский О.И. Экспрессия гена гибридного белка гамма-интерферона и альфа-фетопротеина человека в клетках Е. coli II Молекуляр. биология. - 1996. - 30. - С. 1299-1306.

24. Татьков С.И., Смирнова О.Ю., Цивковская И.О., Кищенко Г.П., Ильичев A.A., Петренко В.А., СандахчиевЛ.С. Мутантный гамма-интерферон человека с повышенной антивирусной активностью // Докл. АН СССР. — 1996. -346.-С. 413-414.

25. Татьков С.И., Смирнова О.Ю., Цивковский Р.Ю., Ильичев A.A. Гамма-интерфероны человека с измененным С-концом и их свойства // Молекуляр. биология.- 1995.-29.-С. 1095-1101.

26. Татьков С.И., Цивковский Р.Ю., Батурина И.И., Смирнова О.Ю. О мутагенной активности Ш-(4-аминобутокси)-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфа-та // Молекуляр. биология. - 1995. - 29. - С. 301-307.

27. Цивковский Р.Ю., Гражданцева A.A., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Бондаренко В.Н., Константинов А.П., Татьков С.И. Изучение адъювантных свойств гамма-интерферона в составе гибридного белка ИФН-АФП // Иммунология. - 1999. - 5. - С. 30-33.

Патенты и авторские свидетельства

1. Пат. 2242245 РФ, МПК AG1K39/04. Искусственные микобактериаль-ные частицы и вакцинная противотуберкулезная композиция на их основе / М.Ш.Азаев, Л.Р.Лебедев, Г.А. Кузьмичева, С.И. Татьков. -Опубл. 20.12.04, Бюл. № 19.

2. А. с. 1250575 СССР. Рекомбинантная ДНК и способ ее получения / В.А. Петренко, С.И. Татьков, Л.Н. Семенова, A.A. Ильичев. - Опубл. 1986, Бюл. № 30.

3. А. с. 1219647 СССР. Способ получения лейкоцитарного интерферона / В.А. Петренко, С.И. Татьков, Л.Н. Семенова, A.A. Ильичев, Г.А. Мизенко, В.В. Зорин, ИВ. Тимофеев. -Заявл. 1985; Опубл. 1986, Бюл. № 11.

4. Пат. 2105813 РФ. Мутантный ген ИФН Л10, кодирующий полипептид с активностью ylFN человека, рекомбинантная плазмида PIF Д10, обеспечивающая экспрессию гена ИФН А10 в Е. coli и штамм Е. coli, продуцирующий полипептид А10, обладающий активностью ylFN человека / С.И. Татьков, A.A. Ильичев, О.Ю. Смирнова, А.И. Закабунин; ГНЦ ВБ «Вектор» . - Заявл. 12.10.95; Опубл. 28.02.98.

5. Заявка 5067904 РФ. Мутантный ген S54, кодирующий полипептид с активностью гамма-интерферона человека, рекомбинантная плазмида pS54, обеспечивающая экспрессию гена S54 в Е. coli и штамм Е. coli - продуцент полипептида, обладающего активностью гамма-интерферона человека / С. И. Татъков, О.Ю. Смирнова, Г.П. Кищенко, В.А. Петренко. - Заявл. 20.08.92; Полож. решение ГНЦ ВБ «Вектор» 28.07.94 .

Тезисы или статьи в сборниках конференций

1. Petrenko V.A., Kuzmicheva G.A., Karpenko L.I., TatkovS.I., IlyichevA.A. Investigation of mutagenic properties of oligonucleotide analogues // Synthetic oligonucleotides: problems and frontiers of practical application (Moscow, USSR, June 23-30, 1991). -M., 1991. - P. 96.

2. Petrenko V.A., Kuzmicheva G.A., Karpenko L.I., Tatkov S.I., Ilyichev A.A. Mutagenic properties of oligonucleotides with modified sugar-phosphate backbone // Nucleic Acids Symp. Ser. - Oxford, 1991. - 24. - P. 213-214.

3. Petrenko V.A., Tatkov S.I., Smirnova O.Y., Il'ichev A.A. Effect of some amino acid substitutions on human leucocyte interferon antiviral activity // Proceedings of the seventh international symposium on metabolism and enzymology of nucleic acids including gene and protein engineering (Bratislava, Chechoslovakia, Held at Smolenice castle, November 26-30, 1990) / Balan (ed.); Organized by the institute of molecular biology, Slovak Academy of Sciences.-Bratislava, 1990.-P. 89-96.

4. TatkovS.I., Smirnova O.Y., Illarionov B.A., Ilyichev A.A., Petrenko V.A. An efficient method for localized mutagenesis // Nucleic Acids Symp. Ser. - Oxford, 1991.-24.-P. 254.

5. Tatkov S.I., Smirnova O.Y., Ilyichev A.A., Kishchenko G.P., Kolokoltsov A.A., Maistrenko V.F., Zakabunin A.I., Petrenko V.A. The influence of some amino acid residues on the stability and biological properties of human immune interferons // Medical biotechnology. Immunization and AIDS: Intern, conf. (Leningrad). -Leningrad, 1991.-P. 32.

6. Петренко B.A., Кузъмичева Г.А., Татъков С.И. Исследование мутагенных свойств модифицированных олигонуклеотидов // Всесоюз. совещ. по НК-дуплексам: Сб. тез. - Киев, 1989.

7. Петренко В.А., Семенова Л.Н., Сиволобова Г.Ф., Татъков С.И., Болдырев А.Н., Киприянов С.М. Локализованный мутагенез клонированных генов // Достижения микробиологии — практике: Тез. докл. VIII съезда Всесоюз. мик-робиол. о-ва. - Алма-Ата, 1985. - С. 58.

8. Петренко В.А., Татъков С.И., Семенова Л.Н. Ген лейкоцитарного альфа2-интерферона, сцепленный в фазе с альфа-донорным пептидом бэта-га-лактозидазы, экспрессирует белок, обеспечивающий альфа-комплементацию бэта-галактозидазной активности // Гибридные плазмиды и экспрессия плаз-мидных генов: Тез. докл. 9-го Всесоюз. совещ. по программе «Плазмида». -М., 1984.-С. 52.

9. Петренко В.А., Татъков С.И., Семенова Л.Н., Сиволобова Г.Ф.. Карги-нов В.А. Гибридная ДНК M13mp9:M13mpB - удобная мутационная модель

для отработки условий локализованного мутагенеза. Локализованный мутагенез, индуцированный нитритом // Гибридные плазмиды и экспрессия плаз-мидных генов: Тез. докл. 9-го Всесоюз. совещ. по программе «Плазмида». -М., 1984.-С. 195.

10.ПетренкоВ.А., Татьков С.И., СеменоваЛ.Н., СиволобоваГ.Ф., Карги-нов В.А., Болдырев А.Н. Экспериментальная модель и возможный молекулярный механизм индуцированного мутагенеза // Тез. докл. X Всесоюз. совещ. по программе «Плазмида». - Пущино-на-Оке, 1985. — С. 127-128.

11.ПетренкоВ.А., Татьков С.И., Семенова JI.H., СиволобоваГ.Ф., Поздняков П.И., Болдырев А.Н., Мизенко Г.А., Тимофеев И.В., Колокольцов A.A. Изучение лейкоцитарного интерферона с помощью локализованного мутагенеза // Тез. докл. X Всесоюз. совещ. по программе «Плазмида». - Пущино-на-Оке, 1985.-С. 128-129.

М.Петренко В. А., Татьков С.И., Сиволобова Г. Ф., Семенова Л.Н., Поздняков П.И., Болдырев А.Н., Каргинов В.А., Мизенко Г.А., Тимофеев И.В., Ильичев A.A. Исследование структурно-функциональной организации лейкоцитарного альфа2-интерферона человека методами локализованного мутагенеза // Интерферон-85: Тез. докл. Всесоюз. конф. «Итоги и перспективы теоретических и практических (клинических) исследований по проблеме интерферона». - Тбилиси, 1985. - С. 136.

13. Петренко В.А., Татьков С.И., Смирнова О.Ю., Ильичев A.A. Белковая инженерия интерферонов — путь к созданию новых биологически активных веществ. Исследование структурно-функциональной организации лейкоцитарного интерферона с помощью направленного мутагенеза // Новые направления биотехнологии / Под ред. A.A. Баева; Центр биологических исследований АН СССР. - Пущино, 1988. - С. 103.

14. Смирнова О.Ю., Татьков С.И., Ильичев A.A., Петренко В.А. Получение мутантных гамма-интерферонов с измененным С-концом и их свойства // Тез. докл. I Всесоюз. конф. «Геном человека-90». - М., 1990. - С. 136-137.

15. Смирнова О.Ю., Татьков С.И., Ильичев A.A., Петренко В.А. Получение мутантных гамма-интерферонов с измененным С-концом и их свойства // Современные аспекты применения интерферонов и других иммуномодулято-ров: Сб. науч. тр. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. -М., 1990.-С. 114.

16. Татьков С.И., Кувшинов В.Н., Комарских М.Е., Головин С.Я., Миненко-ва О. О., Смирнова О.Ю„ Ерошкин A.M., Фомин В.И., Ильичев A.A., Петренко В.А., Грановский H.H. Конструирование вакцины нового поколения против вируса гепатита В // Новые направления биотехнологии (2-4 октября 1990, Пущино) / Ред. A.A. Баев; Академия наук СССР, Науч. центр биологических исследований, Науч. совет по проблемам биотехнологии, Ин-т биохимии и физиологии микроорганизмов. - Пущино, 1990. - С. 68.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Татьков, Сергей Иванович

Введение.

Глава 1. Молекулярная эволюция белковых молекул.

1.1. Введение.

1.2. Естественная эволюция белков.

1.2.1. Эволюция гомологичных белков.

1.3. Искусственная эволюция белков.

1.3.1. Пересортировка ДНК (DNA shuffling) или рекомбинация ДНК in vitro.

1.3.2. Рекомбинация ДНК in vivo.

1.3.3. Методы диверсификации генов локализованным мутагенезом

1.3.4. Селекция белков in vitro.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание искусственных белков методами направленного мутагенеза"

К настоящему времени белки нашли широкое применение в различных отраслях промышленности, медицине и для научных исследований. Поскольку белки используются, как правило, в условиях, отличных от тех, в которых они обычно функционируют, одной из актуальных задач является направленное изменение специфичности их действия, активности, стабильности, или, как в случае белковых вакцин, иммуногенности [1-5].

Для создания новых белков или изменения свойств уже существующих, используется целый ряд методов. Наиболее важными являются методы проб и ошибок, направленного мутагенеза [6] и управляемой эволюции [3, 5, 7-9]. Метод проб и ошибок использует статистический мутагенез для получения библиотек мутантных молекул [10-14], среди которых проводится поиск белков с необходимыми свойствами. Использование перетасовки генов [15-20] улучшило результативность метода, позволило в ряде случаев существенно повысить активности биокатализаторов (Williams et al, 2004). Ещё в первых работах Фершта с соавторам [21-23] было показано, что знание структурно-функциональной организации белка позволяет направленным мутагенезом получать молекулы с нужными свойствами. Результативность такого подхода весьма высока, поскольку при его использовании поиск целевых белков проводится среди ограниченного числа вариантов. Однако, расшифровка структурно-функциональной организации белка является очень сложной задачей, которая для многих молекул не решена до сих пор. С 1997 года начал активно развиваться метод управляемой эволюции белков [4, 24-27]. Для его реализации необходимо установить химическую или физическую связь между геном и продуктом его экспрессии. Для таких целей в настоящее время широко используется любой из вариантов дисплея. Затем проводится дивергенция гена методами статистического мутагенеза, и среди полученной библиотеки отбираются нужные варианты с помощью соответствующих методов селекции.

Цель настоящего исследования - разработка рациональной методологии направленного изменения белков и её применение для получения мутантных у-интерферонов. Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

• Создать эффективные методы направленного мутагенеза

• Обосновать стратегии применения статистического мутагенеза для картирования функциональных районов белковой молекулы

• Разработать стратегии получения стабильных белков направленным мутагенезом по нефункциональным районам молекул

• Создать методы усиления иммуногенных свойств белков путем слияния с тестируемого белка с у-интерфероном

Научная новизна. Предложена рациональная методология получения искусственных белков, основанная на знании их структурно-функциональной и доменной организации. Основными направлениями при её реализации являются: сокращение числа остатков лизина, аргинина в нефункциональных участках, введение дополнительных связей между субъединицами белковой молекулы, междоменное слияние. В рамках предложенной методологии разработаны эффективные методы локализованного мутагенеза и стратегия определения структурно-функциональной организации белка, основанная на использовании библиотек мутантных генов с множественными мутациями, полученными либо в результате локализованного мутагенеза по всему гену, либо по консервативным последовательностям в неструктурированных участках белковой молекулы.

Для лейкоцитарного и иммунного интерферонов показана возможность получения вариантов белков с новыми свойствами путем междоменного слияния. Доказано, что слияние доменов у-интерферона и слабоиммуногенного альфа-фетопротеина человека (AFP) приводит к стимуляции высокого уровня гуморального ответа на AFP.

Впервые экспериментально доказано, что высокая мутагенность 4-аминооксибутиламина обусловлена его взаимодействием с остатками цитозина в ДНК и устойчивостью модифицированного цитозина к ферментам репарации. В результате реакции образуется К4-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин, способный индуцировать С~>Т транзиции. Синтезирован новый мутаген N4-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5'-трифосфат, который включается при синтезе ДНК in vitro как вместо dCTP, так и dTTP. В первом случае индуцируются G->A, а в во втором - A^G транзиции. Разработаны три варианта локализованного мутагенеза с использованием 4-аминооксибутиламина: введение G-^А транзиций в район, комплементарный модифицированному олигонуклеотиду; введение С^Т транзиций в одноцепочечные участки ДНК дуплексов обработкой их аминооксибутиламином; введение G^A и A-^G транзиций при включении К4-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5'-трифосфата в ходе синтеза ДНК in vitro. Предложенные методы локализованного мутагенеза были использованы для получения библиотек мутантных генов а2-и у-интерферонов человека, содержащих мутации как по всей длине гена, так и в отдельных его районах.

Впервые исследованы мутагенные свойства олигонуклеотидов, содержащих пирофосфатное, фосфамидное (этилендиамин, 2,6-диаминогексановая кислота, гексаметилендиамин) звено. Индуцируемые мутации предопределены нуклеотидной последовательностью олигонуклеотида, но присутствие в его структуре пирофосфатного или гексаметилендиаминового звена наиболее сильно (в несколько раз) повышает выход мутантов. Доказано, что мутации возникают в ходе репарации промежуточного гетеродуплекса ДНК, включающего олигонуклеотид-мутаген.

Аналоги у-интерферона - дельтаферон , эсферон, а также биферон -обладают протеолитической стабильностью, высокой активностью, на их основе разрабатываются новые иммуномодулирующие лекарственные препараты.

Созданные методы локализованного мутагенеза 4-аминооксибутиламином и К4-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5трифосфатом могут использоваться везде, где требуется получить мутантные микроорганизмы, гены или белки.

Предложенная методология создания искусственных белков может быть положена в основу конструирования новых ферментов, цитокинов и других белковых молекул. Например, принцип повышения протеолитической стабильности молекул путем сокращения числа остатков лизина, аргинина в

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Татьков, Сергей Иванович

Выводы

В рамках исследования:

• разработаны новые методы локализованного мутагенеза 4-аминооксибутиламином или его производным К4-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5'-трифосфатом. Установлено, что мутации индуцируются К4-(4-аминобутокси)-цитозином. Модифицированный олигонуклеотид индуцирует G->A транзиции в комплементарном районе, модифицированный ДНК - дуплекс - С->Т транзиции в одноцепочечных участках, К4-(4-аминобутокси)-дезоксицитидин-5'-трифосфат - G->A и С->Т транзиции;

• показано, что эффективность олигонуклеотид-направленного мутагенеза можно повысить в несколько раз путем модификации в олигонуклеотиде одной межнуклеотидной связи;

• выяснено, что мутагенные свойства модифицированных олигонуклеотидов возрастают в ряду аналогов с этилендиаминовой, лизиновой, гексаметилендиаминовой, пирофосфатной связями;

• установлено, что изменение межнуклеотидной связи не влияет на точность репликации ДНК;

• впервые продемонстрировано, что неспаренности, расположенные на расстоянии 6 и.о., могут репарироваться независимо друг от друга.

2. Предложена новая методология определения функционально важных остатков в белковой молекуле.

254

В рамках исследования:

• создана библиотека мутантных а2-интерферонов, анализ которой позволил установить функциональную значимость 23 остатков изучаемого цитокина;

• впервые установлена важность консервативного мотива GRGGQ, находящегося в неструктурированном участке эукариотического фактора eRFl, для осуществления белком функции терминации трансляции.

3. Впервые разработан метод получения устойчивых к протеазам искусственных белков заменой KR, RR последовательностей в поверхностных районах молекул на GS мотив. С помощью разработанного метода созданы новые мутантные у-интерфероны: биферон (D92), В24, В38, и дельтаферон, обладающие по сравнению с исходным интерфероном высокой устойчивостью к действию трипсиноподобных протеаз, хорошей растворимостью и отсутствием образования телец включения в бактериальных клетках.

256

Благодарности

На разных этапах в работе принимали участие О.Ю. Смирнова, Р.Ю. Цивковский, M.LLI. Азаев, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ; а также Н.Н. Карпышев, A.M. Ерошкин, Г.П. Кищенко, В.А. Куличков, Г.А. Кузьмичева, J1.H. Семенова, Г.Ф. Сиволобова, П.И. Поздняков, Г.В. Кочнева, А.А. Гражданцева, О.И. Серпинский, В.М. Блинов, А.Н. Болдырев, Л.И. Карпенко, А.И. Закабунин, Л.Р. Лебедев, В.И. Масычева, Е.Д. Даниленко, В.А. Иванисенко и другие сотрудники ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" - автор приносит им искреннюю благодарность.

Особую признательность автор выражает д.б.н. профессору В.А. Петренко, который был инициатором исследования структурно-функциональной организации лейкоцитарного интерферона, уделял много внимания развитию работы на всех ее последующих этапах; а также академику РАН профессору Л.Л. Киселеву и д.б.н. Л.Ю. Фроловой, которые привлекли внимание автора к проблеме структурно-функциональной организации эукариотического фактора терминации трансляции, предоставили возможность работы с этим белком, впервые выделенного ими, и всесторонне исследовали свойства полученных мутантных факторов терминации, наконец, сыграли решающую роль в подготовке результатов работы к публикации.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Татьков, Сергей Иванович, Кольцово

1. Загребельный, С.Н., Управляемая эволюция как подход к созданию высокоэффективных биокатализаторов. Успехи химии, 2005. 74(3): р. с. 307-320.

2. Wang, T.W., et al., Mutant library construction in directed molecular evolution: Casting a wider net. Molecular Biotechnology, 2006. 34(1): p. 55-68.

3. Kong, R., L. Niu, and J. Yuan, Directed evolution of enzymes in vitro and the application in the synthesis of chiral organic compounds. Progress in Chemistry, 2006. 18(2-3): p. 349-354.

4. Vamvaca, K., et al., Simultaneous optimization of enzyme activity and quaternary structure by directed evolution. Protein Science, 2005.14(8): p. 2103-2114.

5. Holmberg, R.C., A.A. Henry, and F.E. Romesberg, Directed evolution of novel polymerases. Biomolecular Engineering, 2005. 22(1-3): p. 39-49. Smith, M., Synthetic DNA and Biology. Nobel Lecture, December 8, 1993, Chemistry, 1993: p. 119-136.

6. Cochran, J.R., et al., Improved mutants from directed evolution are biased to orthologous substitutions. Protein Engineering, Design and Selection, 2006. 19(6): p. 245-253.

7. MolUSBCniX)fH H04957: p. 369-374.

8. Stemmer, W.P.C., DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994. 91: p. 10747-10751.

9. Giver, L. and F.H. Arnold, Combinatorial protein design by in vitro recombination. Curr Opin ChemBiol, 1998. 2(3): p. 335-8.

10. Kolkman, J.A. and W.P. Stemmer, Directed evolution of proteins by exon shuffling. Nat Biotechnol, 2001. 19(5): p. 423-8. Whalen, R.G., et al., DNA shuffling and vaccines. Curr Opin Mol Ther, 2001.3(1): p. 31-6.

11. Douthwaite, J. and L. Jermutus, Exploiting directed evolution for the discovery of biologicals. Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2006. 9(2): p. 269-275.

12. Yan, X. and Z. Xu, Ribo some-display technology: applications for directed evolution of functional proteins. Drug Discovery Today, 2006. 11(19-20): p. 911-916.

13. Williams, G.J., A.S. Nelson, and A. Berry, Directed evolution of enzymes for biocatalysis and the life sciences. Cellular and Molecular Life Sciences, 2004. 61(24): p. 3034-3046.

14. Rothe, A., R.J. Hosse, and B.E. Power, Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert Opinion on Biological Therapy, 2006. 6(2): p. 177-187.

15. Щульц, Г. и P. Ширмер, Принципы структурной организации белков, ed. Е.М. Попов. 1982, Москва: Мир. 354.

16. Tillier, E.R. and T.W. Lui, Using multiple interdependency to separate functional from phylogenetic correlations in protein alignments. Bioinformatics, 2003.19(6): p. 750-5.

17. Saraf, M.C., G.L. Moore, and C.D. Maranas, Using multiple sequence correlation analysis to characterize functionally important protein regions. Protein Eng, 2003.16(6): p. 397-406.

18. Afonnikov, D.A. and N.A. Koichanov, The conserved characteristics of DNA-binding domains belonging to the homeodomain class that are associated with coadaptive substitutions of amino acid residues. Dokl Biochem Biophys, 2001. 380: p. 352-5.

19. Andreeva, A. and A.G. Murzin, Evolution ofprotein fold in the presence of functional constraints. Current Opinion in Structural Biology, 2006. 16(3): p. 399-408.

20. Hoecker, В., J. Claren, and R. Sterner, Mimicking enzyme evolution bygenerating new (alpha/beta)8-barrels from (alpha/beta)4-half-barrels

21. PNAS, 2004 101(47): p. 16448-16453.

22. Gerlt, J.A. and P.C. Babbitt, Nat. Struct. Biol., 2001. 8: p. 5-7.1.ng, D., et al., Structural evidence for evolution of the beta/alpha barrelscaffold by gene duplication andfusion Science, 2000. 289: p. 1546-1550.

23. Jurgens, С., et al., Directed evolution of a (beta alpha) 8-barr el enzyme to catalyze related reactions in two different metabolic pathways. Proc Natl Acad Sci USA, 2000. 97(18): p. 9925-30.

24. Cavalier-Smith, Т., Origins of the machinery of recombination and sex. Heredity, 2002. 88(2): p. 125-41.

25. Wang, P.L., Creating hybrid genes by homologous recombination. Dis Markers, 2000. 16(1-2): p. 3-13.

26. Sappington, T.W. and A.S. Raikhel, Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors. Insect Biochem Mol Biol, 1998. 28(5-6): p. 277-300.

27. Kalderon, D., et al., Deletion loop mutagenesis: a novel methodfor the construction of point mutations using deletion mutants. Nucleic Acids Res, 1982 10(17): p. p. 5161-5171.

28. Singh, M., S. Heaphy, and M.J. Gait, Oligonucleotide-directedmis incorporation mutagenesis on single-stranded DNA templates. Protein

29. Eng, 1986 1(1): p. p. 75-76

30. Zakour, R.A., E.A. James, and L.A. Loeb, Site specific mutagenesis: insertion of single noncomplementary nucleotides at specified sites by error-directed DNA polymerization. Nucleic Acids Res, 1984 12 (16): p. p. 66156628.

31. Abarzua, P. and K.J. Marians, Enzymatic techniques for the isolation of random single-base substitutions in vitro at high fre-quency. Proc Natl Acad Sci USA, 1984 81(7): p. p. 2030-2034.

32. Dixon, L., J. Jiricny, and T. Hohn, Oligonucleotide directed mutagenesis of cauliflower mosaic virus DNA using a repair-resistant nucleoside analogue: identification of an agnogene initiation codon. Gene, 1986 41(2-3): p. p. 225-231

33. Hayatsu, H., Bisulfite modification of nucleic acids and their constituents.

34. Prog.Nucleic Acid Res Mol Biol, 1976.16: p. 75-124.

35. Grunau, C., S.J. Clark, and A. Rosenthal, Bisulfite genomic sequencing:systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids

36. Res 2001 .Jul. 1 ;29.( 13):E65.-5., 2001. 29: p. E65-E65.1.ugh, J., et al., Bisulfite-induced cytosine deamination rates in E. coli

37. SSB.DNA complexes. Mutat.Res 2001.Jul.l;478.(l-2):191.-7., 2001. 478: p.191.197.

38. Strauss, B.S., et al., The role of DNA polymerase in base substitution mutagenesis on non-instructional templates. Biochimie, 1982 64 (8-9): p. p. 829-838

39. Moore, P.D., et al., Effect of acetylated and deacetylated 2-aminofluorene adducts on in vitro DNA synthesis. Proc Natl Acad Sci USA, 1982 79 (23): p. p. 7166-7170

40. Moore, P.D., et al., Interactions between DNA polymerase and aminofluorene adducts that affect the recognition and possibly the mutagenicity of the lesions. Biochimie, 1982 64 (8-9): p. p. 757-762.

41. Moore, P.D., S.D. Rabkin, and B.S. Strauss, In vitro replication of mutagen-damaged DNA: sites of termination. Basic Life Sci, 1982 20: p. p. 179-197

42. Dodson, L.A., et al., Mutagenesis of bacteriophage T7 in vitro by incorporation of 06-methylguanine during DNA synthesis. Proc Natl Acad Sci USA, 1982 79 (23): p. p. 7440-7444

43. Topal, M.D., Mutagenesis by incorporation of alkylated nucleotides. Basic Life Sci, 1985 31 p. p. 339-351

44. Chambers, R.W., et al., UvrA and recA mutations inhibit a site-specific transition produced by a single 06- methylguanine in gene G of bacteriophage phi XI74. Proc Natl Acad Sci USA, 1985 82 (21): p. p. 7173-7177

45. Sowers, L.C., et al., Base pairing and mutagenesis: observation of a protonated base pair between 2-aminopurine and cytosine in an oligonucleotide by proton NMR. Proc Natl Acad Sci USA, 1986 83 (15): p. p5434-8.

46. Abdul-Masih, M.T. and M.J. Bessman, Biochemical studies on the mutagen, 6-N-hydroxylaminopurine. Synthesis of the deoxynucleoside triphosphate and its incorporation into DNA in vitro. J Biol Chem, 1986 261 (5): p. p. 2020-2026

47. Pavlov, Y.I., et al., Base analog N6-hydroxylaminopurine mutagenesis in Escherichia coli: genetic control and molecular specificity. Mutat.Res, 1996. 357: p. 1-15.

48. Inoue, M., et al., Induction of chromosomal gene mutations in Escherichia coli by direct incorporation of oxidatively damaged nucleotides. New evaluation method for mutagenesis by damaged DNA precursors in vivo. J Biol Chem., 1998.273:p. 11069-11074.

49. Kamiya, H. and H. Kasai, Substitution and deletion mutations induced by 2-hydroxyadenine in Escherichia coli: effects of sequence contexts in leading and lagging strands. 1997. 25(2): p. 304-310.

50. Kamiya, H., H. Maki, and H. Kasai, Two DNA polymerases of Escherichia coli display distinct misinsertion specificities for 2-hydroxy-dATP during DNA synthesis. Biochemistry 2000.Aug 8;39.(31.):9508.-13., 2000. 39: p. 9508-9513.

51. Kamiya, H. and H. Kasai, 2-Hydroxy-dATP is incorporated opposite G by Escherichia coli DNA polymerase III resulting in high mutagenicity. Nucleic Acids Res 2000.Apr 1;28.(7.): 1640.-6., 2000. 28: p. 1640-1646.

52. Sledziewska-Gojska, E. and С. Janion, Effect of proofreading and dam-instructed mismatch repair systems on N4-hydroxycytidine-induced mutagenesis. Mol Gen Genet, 1982 186 (3): p. p.411-418

53. Negishi, K., et al., Ambiguous incorporation ofN4-aminodeoxycytidine 5-triphosphate to DNA synthesized in vitro. Nucleic Acids Symp.Ser, 1985: p. 237-239.

54. Negishi, K., et al., Mutagenesis by N4-aminocytidine: induction of AT to GC transition and its molecular mechanism. Biochemistry, 1985 24(25): p. p. 7273-7278

55. Negishi, K., et al., In vitro mutagenesis by incorporation of N4-aminodeoxycytidine 5'-triphosphate. Nucleic Acids Symp.Ser., 1988: p. 3336.

56. Negishi, K., et al., Mutagenic nucleoside analog N4-aminocytidine: metabolism, incorporation into DNA, and mutagenesis in Escherichia coli. J Bacterid, 1988.170: p. 5257-5262.

57. Negishi, K, Molecular mechanism of N4-aminocytidine mutagenesis., Yakugaku Zasshi, 1990.110: p. 293-303.

58. Negishi, K., et al. The mechanism of mutation induction by a hydrogen bond ambivalent, bicyclic N4-oxy-2'-deoxycytidine in Escherichia coli. Nucleic Acids Res, 1997. 25: p. 1548-1552.

59. Hatahet, Z, A.A. Purmal, and S.S. Wallace, A novel methodfor site specific introduction of single model oxidative DNA lesions into oligodeoxyribonucleotides. Nucleic Acids Res, 1993. 21: p. 1563-1568.

60. Purmal, A.A, et al. Enzymatic Processing of Uracil Glycol, a Major Oxidative Product of DNA Cytosine. 1998. 273(16): p. 10026-10035.

61. Purmal, A.A, Y.W. Kow, and S.S. Wallace, Major oxidative products of cytosine, 5-hydroxycytosine and 5-hydroxyuracil, exhibit sequence context-dependent mispairing in vitro. Nucleic Acids Res, 1994. 22: p. 72-78.

62. Feig, D.I, L.C. Sowers, and L.A. Loeb, Reverse chemical mutagenesis: identification of the mutagenic lesions resulting from reactive oxygenspecies-mediated damage to DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1994. 91: p. 6609-6613.

63. Fujikawa, К., H. Kamiya, and H. Kasai, The mutations induced by oxidatively damaged nucleotides, 5-formyl-dUTP and 5-hydroxy-dCTP, in Escherichia coli. Nucleic Acids Res, 1998. 26: p. 4582-4587.

64. Boiteux, S. and J. Laval, Mutagenesis by alkylating agents: coding properties for DNA polymerase ofpoly (dC) template containing 3-methylcytosine. Biochimie, 1982 64 (8-9): p. p637-41

65. Topal, M.D., C.A. Hutchison, III, and M.S. Baker, DNA precursors in chemical mutagenesis: a novel application of DNA sequencing. Nature, 1982. 298: p. 863-865.

66. Preston, B.D., B. Singer, and L.A. Loeb, Comparison of the relative mutagenicities of O-alkylthymines site-specifically incorporated into phi X174 DNA. J Biol Chem, 1987 262 (28): p. pi 3821-7

67. Preston, B.D., B. Singer, and L.A. Loeb, Mutagenic potential of 04-methylthymine in vivo determined by an enzymatic approach to site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA, 1986 83 (22): p. p. 8501-8505

68. Kunkel, T.A., J.D. Roberts, and R.A. Zakour, Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection. Methods Enzymol., 1987. 154: p. 367-382.

69. Kunkel, T.A., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A, 1985. 82(2): p. p. 488-492

70. Hofer, B. and B. Kuhlein, A high efficiency methodfor site-directed mutagenesis with any plasmid. Gene, 1989. 84: p. 153-157.

71. Mazin, A.V., et al., Site-directed insertion of long single-stranded DNA fragments into plasmid DNA. DNA Cell Biol, 1990. 9: p. 63-69.

72. Bhat, K.S., Generation of a plasmid vector for deletion cloning by rapid multiple site-directed mutagenesis. Gene, 1993. 134: p. 83-87.

73. Hofer, B. and B. Kuhlein, Site-specific mutagenesis inplasmids: a gapped circle method. Methods Enzymol., 1993. 217: p. 173-189.

74. Kaslow, D.C. and D.J. Rawlings, Introducing restriction sites into double-stranded plasmid DNA. Methods Enzymol., 1993. 217: p. 295-301.

75. Olsen, D.B., J.R. Sayers, and F. Eckstein, Site-directed mutagenesis of single-stranded and double-stranded DNA by phosphorothioate approach Methods Enzymol., 1993. 217: p. 189-217.

76. Viville, S., Double-stranded DNA site-directed mutagenesis. Methods Mol Biol, 1996. 57: p. 87-95.

77. Viville, S., Site-directed mutagenesis using a double-stranded DNA template. Methods Mol Biol, 1994. 31: p. 57-65.

78. Worrall, A.F., Site-directed mutagenesis by the cassette method. Methods Mol Biol, 1994.30: p. 199-210.

79. Gao, Q.S. and S. Paul, Site-directed mutagenesis of antibody-variable regions. Methods Mol Biol, 1995. 51: p. 319-327.

80. Braman, J., С. Papworth, and A. Greener, Site-directed mutagenesis using double-strandedplasmid DNA templates. Methods Mol Biol, 1996. 57: p. 31-44.

81. Lai, D. and S. Pestka, A simple method for site-directed mutagenesis with double-stranded plasmid DNA. Methods Mol Biol, 1996. 57: p. 75-85.

82. Lai, D., X. Zhu, and S. Pestka, A simple and efficient method for site-directed mutagenesis with double-stranded plasmid DNA. Nucleic Acids Res, 1993. 21: p. 3977-3980.

83. Zhu, L., In vitro site-directed mutagenesis using the unique restriction site elimination (USE) method. Methods Mol Biol, 1996. 57: p. 13-29.

84. Zhu, L. and A.E. Holtz, A universal nested deletion method using an arbitrary primer and elimination of a unique restriction site. Methods Mol Biol, 1996. 57: p. 119-137.

85. Bohnsack, R.N., Site-directed mutagenesis using positive antibiotic selection. Mol Biotechnol., 1997. 7: p. 181-188.

86. Ishii, T.M., et al., Site-directed mutagenesis. Methods Enzymol., 1998. 293: p. 53-71.

87. Unger, M.W., S.Y. Liu, and D.E. Rancourt, Transplacement mutagenesis: a novel in situ mutagenesis system using phage-plasmid recombination. Nucleic Acids Res, 1999. 27: p. 1480-1484.

88. Kim, Y.G. and S. Maas, Multiple site-directed mutagenesis in vitro. Methods Mol Biol 2002;182.:29.-36., 2002. 182: p. 29-36.

89. Autret, N. and A. Charbit, Lessons from signature-tagged mutagenesis on the infectious mechanisms of pathogenic bacteria. FEMS Microbiol Rev 2005.Sep.;29.(4):703.-17.Epub.2004.Nov.26., 2005. 29: p. 703-717.

90. Lehoux, D.E. and R.C. Levesque, PCR screening in signature-tagged mutagenesis of essential genes. Methods Mol Biol 2002;192.:225.-34., 2002. 192: p. 225-234.

91. С arter, P., Improved oligonucleotide-directed m utagenesis using MI 3 vectors. Methods Enzymol., 1987.154: p. 382-403.

92. Ford, C.F. and M.M. Smith, Use of an oligonucleotide probe to detect transplacement of an amber mutation into a yeast histone H3 gene. Gene, 1985 37 (1-3): p. p. 45-52

93. Hobden, A.N., et al., Ml 3 clones carrying point mutations: identification by solution hybridization. Anal Biochem, 1985 144 (1): p. p. 75-78

94. Wood, W.I., et al., Base composition-independent hybridization in tetramethylammonium chloride: a methodfor oligonucleotide screening of highly complex gene libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 1985 82 (6): p. p.1585-1588

95. Norrander, J., T. Kempe, and J. Messing, Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene, 1983 26 (1): p.p. 101-106.

96. Zoller, M.J. and M. Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis ofDNA fragment cloned into M13 vectors. Methods in Enzymology, 1983. 100: p. 468-500.

97. Traboni, C., et al., A general method to select for Ml 3 clones carrying base pair substitution mutants constructed in vitro. Nucleic Acids Res, 1983. 11 (12): p. p. 4229-4239.

98. Sollazzo, M., R. Frank, and G. Cesareni, High-level expression of RNAs and proteins: the use of oligonucleotides for the precise fusion of coding-to-regulatory sequences. Gene, 1985. 37(1-3): p. p. 199-206

99. Lorenzetti, R., et al., Plasmid pFCE4: a new system of Escherichia coli expression-modification vectors. Gene, 1985. 39 (1): p. p. 85-87.

100. Dalbadie-McFarland, G., et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis as a general and powerful method for studies ofprotein function. Proc Natl Acad Sci USA, 1982. 79 (21): p. p, 6409-6413.

101. Kalderon, D., et al., Sequence requirements for nuclear location of simian virus 40 large-Tantigen. Nature, 1984. 311 (5981): p. p. 33-38.

102. Chiang, L.W., I. Kovari, and M.M. Howe, Mutagenic oligonucleotide-directed PCR amplification (Mod-PCR): an efficient method for generating random base substitution mutations in a DNA sequence element. PCR Methods Appl., 1993. 2: p. 210-217.

103. Kim, S.J., et al., Random changes of amino acid residues with expected frequency by saturated point mutagenesis. Mol Cells 2000.Apr 30.;10(2):232.-5., 2000. 10: p. 232-235.

104. Airaksinen, A. and T. Hovi, Modified base compositions at degenerate positions of a mutagenic oligonucleotide enhance randomness in site-saturation mutagenesis. Nucleic Acids Res, 1998. 26: p. 576-581.

105. Larson, G.P., et al., Saccharomyces cerevisiae actin—Escherichia coli lacZ gene fusions: synthetic oligonucleotide-mediated deletion of the 309 base pair intervening sequence in the actin gene. Gene, 1983. 22 (1): p. p. 31-39.

106. West, D.K., et al., Cloning and expression of an intron-deleted phage T4 td gene. J Biol Chem, 1986. 261 (29): p. p. 13446-13450

107. Adelman, J.P., et al., In vitro deletional mutagenesis for bacterial production of the 20,000-dalton form of human pi-tuitary growth hormone. DNA, 1983 2 (3): p. p. 183-193.

108. Osinga, K.A., et al., In vitro site-directed mutagenesis with synthetic DNA oligonucleotides yields unexpected deletions and insertions at high frequency. Nucleic Acids Res, 1983.11 (24): p. p. 8595-8608.

109. Livak, K.J. and E.A. Whitehorn, Half-site editing: an in vitro mutagenesis procedure for truncating a DNA fragment and introducing a new restriction site. Anal Biochem, 1986.152 (1): p. p. 66-73

110. Su, T.Z. and M.R. el-Gewely, A multisite-directed mutagenesis using T7 DNA polymerase: application for reconstructing a mammalian gene. Gene, 1988. 69(1): p. p. 81-89

111. Doyle, C., J. Sambrook, and M.J. Gething, Analysis of progressive deletions of the transmembrane and cytoplasmic domains of influenza hemagglutinin. J Cell Biol, 1986. 103 (4): p. p. 1193-204.

112. Miles, J.S. and J.R. Guest, Subgenes expressing single lipoyl domains of the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coll Biochem J, 1987. 245 (3): p. p. 869-874

113. Saraswat, L.D., et al., Deletion mutants as probes for localizing regions of submit interaction in cAMP-dependentprotein kinase. J Biol Chem, 1988. 263 (34): p. p. 18241-18246

114. Wells, J.A., M. Vasser, and D.B. Powers, Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene, 1985. 34(2-3): p. p. 315-323

115. Ecker, D .J., et al., Chemical synthesis and expression of a cassette adapted ubiquitin gene. J Biol Chem, 1987. 262 (8): p. p. 3524-3527.

116. Stone, J.C., et al., P21-ras effector domain mutants constructed by "cassette" mutagenesis. Mol Cell Biol, 1988. 8 (8): p. p. 3565-3569

117. Murray, R., et al., Random oligonucleotide mutagenesis: application to a large protein coding sequence of a major histocompatibility complex class I gene, H-2DP. Nucleic Acids Res, 1988. 16(20): p. p. 9761-9773

118. Weisemann, J.M. and G.M. Weinstock, Mutations at the cysteine codons of the recA gene of Escherichia coll DNA, 1988. 7 (6): p. p389-98

119. Петренко, B.A., и др., Производные ДНК фага М13, содержащие фрагмент гена бэта-галактозидазы удобная мутационная система для исследования направленного олигонуклеотидами мутагенеза. Биоорганическая Химия, 1986. 12 (12): р. с. 1612-1624

120. Zoller, M.J. and М. Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA. Nucleic Acids Res, 1982. 10: p. 6487-6500.

121. Almouzni, G., S. Mousseron-Grall, and M. Mechali, Oligonucleotide site-directed mutagenesis in Xenopus egg extracts. Nucleic Acids Res, 1988. 16(17): p. p. 8525-8539

122. Wallace, R.B., et al., Oligonucleotide directed mutagenesis of the human beta-globin gene: a general methodfor producing specific point mutations in cloned DNA. Nucleic Acids Res, 1981. 9: p. 3647-3656.

123. Zarucki-Schulz, Т., et al., Point mutagenesis of the ovalbumin gene promoter sequence and its effect on in vitro transcription. J Biol Chem, 1982 257 (18): p. p. 11070-11077.

124. Ефимов, В. А., и др., Эффективный метод олигонуклеотид-направленного мутагенеза фрагментов ДНК. Биоорганическая Химия 1985. 11 (5): р. с. 621-627.

125. Efimov, V.A., et al., Convenient modification of the method for oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis of cloned DNA. FEBS Lett., 1985. 181: p. 407-411.

126. Nakamaye, K.L. and F. Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its appli-cation to oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 1986. 14 (24): p. p. 9679-9698.

127. Sayers, J.R., W. Schmidt, and F. Eckstein, 5'-3' exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 1988. 16 (3): p. p. 791-802

128. Sayers, J.R., et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide. Nucleic Acids Res, 1988. 16(3): p. p. 803-814

129. Palermo, D.P. and G.F. Hess, Use of lambda exonuclease for efficient oligonucleotide-mediated site-directed deletion and point mutation of double-stranded DNA. DNA, 1987. 6(3): p. p. 273-279

130. Mandecki, W., Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a methodfor site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA, 1986. 83 (19): p. p. 7177-7181.

131. Cline, S. W., M. Yarns, and P. Wier, Construction of a systematic set of tRNA mutants by ligation of synthetic oligonucleotides into defined single-stranded gaps. DNA, 1986. 5(1): p. p. 37-51

132. Norris, K., et al., Efficient site-directed mutagenesis by simultaneous use of two primers. Nucleic Acids Res, 1983. 11(15): p. p. 5103-5112.

133. Sims, P.F., et al., A modified two primer approach to oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis. Biochimie, 1985. 67 (7-8): p. p. 841-847

134. Zoller, M.J. and M. Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template. DNA, 1984. 3(6): p. p. 479-488

135. Schold, M., et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis usingplasmid DNA templates and two primers. DNA, 1984. 3 (6): p. p. 469-477

136. Chang, G.J., B.J. Johnson, and D.W. Trent, Site-specific oligonucleotide-directed mutagenesis using T4 DNA polymerase. DNA, 1988. 7 (3): p. p. 211-217.

137. Петренко, B.A., и др., Эффективность замены ДНК-полимеразы А ДНК-полимеразой IЕ. coli в олигонуклеотиднаправленном мутагенезе. Биоорган, химия, 1987(3): р. р. 344-349

138. Петренко, В.А., и др., Мутагенез, направленный фосфотриэирными аналогами олигонуклеотидов. Биоорган, химия, 1986.12(2): р. 289-292.

139. Петренко, В.А., и др., Сайт-локализоеанный мутагенез, направляемый фосфотриэфирными аналогами олигонуклеотидов. Биоорганическая Химия, 1986.12(8): р. с. 1088-1100.

140. Petrenko, V.A., et al., Mutagenesis directed by phosphotriester analogues of oligonucleotides: a way to site-specific mutagenesis in vivo. FEBS Lett., 1988. 238: p. 109-112.

141. Kramer, W., K. Schughart, and H.J. Fritz, Directed mutagenesis of DNA cloned in filamentous phage: influence of hemimethylated GATC sites on marker recovery from restriction fragments. Nucleic Acids Res, 1982. 10 (20): p. p. 6475-6485.

142. Marmenout, A., et al., Oligonucleotide directed mutagenesis: selection of mutants by hemimethylation of GATC-sequences. Mol Gen Genet, 1984. 195 (1-2): p. p. 126-133

143. Traboni, C., G. Ciliberto, and R. Cortese, A novel method for site-directed mutagenesis: its application to an eukaryotic tRNAPro gene promoter. EMBO J, 1982 1(4): p. p. 415-420.

144. Guatelli, J.C., T.R. Gingeras, and D.D. Richman, Nucleic acid amplification in vitro: detection of sequences with low copy numbers and application to diagnosis of human immunodeficiency virus type 1 infection. Clin Microbiol Rev, 1989. 2: p. 217-226.

145. Ito, W., H. Ishiguro, and Y. Kurosawa, A general method for introducing a series of mutations into cloned DNA using the polymerase chain reaction. Gene, 1991. 102: p. 67-70.

146. Kuipers, O.P., H.J. Boot, and W.M. de Vos, Improved site-directed mutagenesis method usingPCR. Nucleic Acids Res, 1991. 19: p. 4558.

147. Vandenbroeck, K., et al., Engineering by PCR-based exon amplification of the genomic porcine interferon-gamma DNA for expression in Escherichia coli. Вiochem.Вiophys.Res Commun., 1991.180: p. 1408-1415.

148. Marini, F., Ill, A. Naeem, and J.N. Lapeyre, An efficient 1-tube PCR method for internal site-directed mutagenesis of large amplified molecules. Nucleic Acids Res, 1993. 21: p. 2277-2278.

149. Morrison, H.G. and R.C. Desrosiers, A PCR-based strategy for extensive mutagenesis of a target DNA sequence. BioTechniques, 1993. 14: p. 454457.

150. Pauls, T.L. and M.W. Berchtold, Efficient complementary DNA amplification and expression using polymerase chain reaction technology. Methods Enzymol., 1993. 217: p. 102-122.

151. Zhao, L.J., Q.X. Zhang, and R. Padmanabhan, Polymerase chain reaction-based point mutagenesis protocol. Methods Enzymol., 1993. 217: p. 218227.

152. Steinberg, R.A. and K.B. Gorman, A high-yield methodfor site-directed mutagenesis using polymerase chain reaction and three primers. Anal.Biochem., 1994. 219: p. 155-157.

153. Vallejo, A.N., R.J. Pogulis, and L.R. Pease, In vitro synthesis of novel genes: mutagenesis and recombination by PCR. PCR Methods Appl., 1994. 4: p. S123-S130.

154. Weiner, M.P, et al. Site-directed mutagenesis of double-stranded DNA by the polymerase chain reaction. Gene, 1994. 151: p. 119-123.

155. Weiner, M.P. and G.L. Costa, Rapid PCR site-directed mutagenesis. PCR Methods Appl, 1994. 4: p. S131-S136.

156. Weiner, M.P, et al, A method for the site-directed mono- and multi-mutagenesis of double-stranded DNA. Gene, 1993.126: p. 35-41.

157. Boles, E. and T. Miosga, A rapid and highly efficient method for PCR-based site-directed mutagenesis using only one new primer. Curr.Genet, 1995. 28: p. 197-198.

158. Liang, Q, L. Chen, and A.J. Fulco, An efficient and optimized PCR method with high fidelity for site-directed mutagenesis. PCR Methods Appl, 1995. 4: p. 269-274.

159. Rashtchian, A, Novel methods for cloning and engineering genes using the polymerase chain reaction. Curr.Opin.Biotechnol, 1995. 6: p. 30-36.

160. Chouljenko, V, et al. Efficient long-PCR site-specific mutagenesis of a high GC template. BioTechniques, 1996. 21: p. 472-8,480.

161. Costa, G.L, et al. Site-directed mutagenesis using a rapid PCR-based method. Methods Mol Biol, 1996. 57: p. 239-248.

162. Barik, S, Mutagenesis and gene fusion by megaprimer PCR. Methods Mol Biol, 1997.67: p. 173-182.

163. Iwahana, H. and M. Itakura, An end-trimming method and its application to amplify adjacent cDNA and genomic DNA fragments by PCR. Methods Mol Biol, 1997. 67: p. 247-260.

164. Jones, D.H. and S.C. Winistorfer, Recombination and site-directed mutagenesis using recombination PCR. Methods Mol Biol, 1997. 67: p. 131140.

165. Michael, S.F, Thermostable ligase-mediated incorporation of mutagenic oligonucleotides during PCR amplification. Methods Mol Biol, 1997. 67: p. 189-195.

166. Picard, V. and S.C. Bock, Rapid and efficient one-tube PCR-based mutagenesis method. Methods Mol Biol, 1997. 67: p. 183-188.

167. Pons, J, et al, PCR site-directed mutagenesis using Pyrococcus sp GB-D polymerase coupled to a rapid screening procedure. Application to a beta-glucanase gene. Methods Mol Biol, 1997. 67: p. 209-218.

168. Pont-Kingdon, G, Creation of chimeric junctions, deletions, and insertions by PCR. Methods Mol Biol, 1997. 67: p. 167-172.

169. Testori, A. and P. Sollitti, Cloning unmodified PCR products using engineeredXcml restriction sites in a portable cassette. Methods Mol Biol, 1997. 67: p. 89-100.

170. Kirsch, R.D. and E. Joly, An improved PCR-mutagenesis strategy for two-site mutagenesis or sequence swapping between related genes. Nucleic Acids Res, 1998. 26: p. 1848-1850.

171. Brons-Poulsen, J., J. Nohr, and L.K. Larsen, Megaprimer method for polymerase chain reaction-mediated generation of specific mutations in DNA. Methods Mol Biol 2002;182.:71.-6., 2002.182: p. 71-76.

172. Jeltsch, A. and T. Lanio, Site-directed mutagenesis by polymerase chain reaction. Methods Mol Biol 2002; 182.:85.-94., 2002.182: p. 85-94.

173. Lardelli, M., Nonspecific, nested suppression PCR methodfor isolation of unknown flanking DNA ("cold-start method"). Methods Mol Biol 2002;192.:285.-912002. 192: p. 285-291.

174. Mo, Q., et al., An improved PCR-based megaprimer methodfor site-directed mutagenesis. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi.2002 Feb;19.(l):68.-71., 2002.19: p. 68-71.

175. Nazar, R.N., P.D. Abeyrathne, and R.V. Intine, Polymerase chain reaction-mediated mutagenesis in sequences resistant to homogeneous amplification. Methods Mol Biol 2002;182.:117.-26., 2002. 182: p. 117-126.

176. Wang, W. and B.A. Malcolm, Two-stage polymerase chain reaction protocol allowing introduction of multiple mutations, deletions, and insertions, using QuikChange site-directed mutagenesis. Methods Mol Biol 2002;182.:37.-43., 2002.182: p. 37-43.

177. Jones, D.H. and S.C. Winistorfer, Recombination and site-directed mutagenesis using recombination PCR. Methods Mol Biol 2003;226:517.-24., 2003. 226: p. 517-524.

178. Nohr, J. and K. Kristiansen, Site-directed mutagenesis. Methods Mol Biol 2003;232.:127.-31., 2003. 232: p. 127-131.

179. Dietrich, J., et al., PCR performance of the highly thermostable proofreading B-type DNA polymerase from Pyrococcus abyssi. FEMS Microbiol Lett, 2002. 217(1): p. 89 94

180. Ling, M. and B.H. Robinson, A one-step polymerase chain reaction site-directed mutagenesis method for large gene-cassettes with high efficiency, yield, and fidelity. Anal. Biochem., 1995. 230: p. 167-172.

181. Cline, J, J.C. Braman, and H. H.H., PCR fidelity ofpfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res, 1996. 24(18): p. 3546 -3551

182. Keohavong, P, et al. Predominant mutations induced by the Thermococcus litoralis, vent DNA polymerase during DNA amplification in vitro. PCR Methods Appl, 1993 2(4): p. 288 292.

183. Huang, H. and P. Keohavong, Fidelity and predominant mutations produced by deep vent wild-type and exonuclease-deficient DNA polymerases during in vitro DNA amplification. DNA Cell Biol, 1996. 15(7): p. 589 94

184. Barnes, W.M, The fidelity ofTaq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminal deletion. Gene, 1992 112(1): p. 29 -35.

185. Patrushev, L.I, et al, Cloning of the gene for thermostable Thermus aquaticus YT1 DNA polymerase and its expression in Escherichia coli.[Article in Russian]. Mol Biol (Mosk), L993 27(5): p. 1 LOO 1112.

186. Jin, С., et al., Cloning and over expression of thermostable DNA polymerase gene in Escherichia coli. Chin J Biotechnol., 1995. 11(3): p. 185 191.

187. Smirnov, I.V., et al., Synthesis of a highly active recombinant Thermus aquaticus His6-DNA-polymerase in Escherichia coli cells and a rapid method of purifying it. [Article in Russian]. Bioorg Khim., 1995 21(5): p. 396-398.

188. Wilhelm, J., A. Pingoud, and M. Hahn, Comparison between Taq DNA polymerase and its Stojfel fragment for quantitative real-time PCR with hybridization probes. Biotechniques, 2001 30(5): p. 1052-6, 1058, 1060.

189. Dabrowski, S. and J. Kur, Recombinant His-taggedDNA polymerase. II. Cloning and purification of Thermus aquaticus recombinant DNA polymerase (Stoffelfragment). Acta Biochim Pol., 1998. 45(3): p. 661 667.

190. Reetz, M.T. and K.E. Jaeger, Overexpression, immobilization and biotechnological application of Pseudomonas lipases. Chem Phys Lipids, 1998. 93(1-2): p. 3-14.

191. Young, L. and Q. Dong, TAMS technology for simple and efficient in vitro site-directed mutagenesis and mutant screening. Nucleic Acids Res 2003 Feb l;31.(3):ell., 2003. 31:p. ell.

192. Williams, D.L., et al., Contribution of rpoB Mutations to Development of Rifamycin Cross-Resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents And Chemotherapy, 1998. 42(7): p. 1853-1857.

193. Hu, R., et al., Human IFN-alphaprotein engineering: the amino acid residues at positions 86 and 90 are important for antiproliferative activity. J Immunol 2001.Aug l;167.(3):1482.-9., 2001. 167: p. 1482-1489.

194. Hu, R., et al., Human IFN-a Protein Engineering: The Amino Acid Residues at Positions 86 and 90 Are Important for Antiproliferative Activity. 2001. 167: p. 1482-1489.

195. Leemhuis, H., et al., New genotype-phenotype linkages for directed evolution offunctional proteins. Current Opinion in Structural Biology, 2005. 15(4): p. 472-478.

196. Kenan, D.J., W.J. Strittmatter, and J.R. Burke, Phage Display Screening for Peptides that Inhibit Polyglutamine Aggregation, in Methods in Enzymology. 2006. p. 253-273.

197. Dufner, P., L. Jermutus, and R.R. Minter, Harnessing phage and ribosome display for antibody optimisation. Trends in Biotechnology, 2006. 24(11): p. 523-529.

198. Makela, A.R. and C. Oker-Blom, BaculovirusDisplay: A Multifunctional Technology for Gene Delivery and Eukaryotic Library Development, in Advances in Virus Research. 2006. p. 91-112.

199. Muranaka, N., Т. Hohsaka, and M. Sisido, Four-base codon mediated mRNA display to construct peptide libraries that contain multiple nonnatural amino acids. Nucleic Acids Research, 2006. 34(1).

200. Horisawa, K., et al., In vitro selection of Jun-associatedproteins using mRNA display. Nucleic Acids Res, 2004. 32(21): p. el69.

201. Thom, G., et al., Probing a protein-protein interaction by in vitro evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006.103(20): p. 7619-7624.

202. Mattheakis, L.C., R.R. Bhatt, and W.J. Dower, An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 1994. 91(19): p. 9022-6.

203. Schimmele, В., N. Gra?fe, and A. Plu?ckthun, Ribosome display of mammalian receptor domains. Protein Engineering, Design and Selection, 2005. 18(6): p. 285-294.

204. Takahashi, F., et al., Activity-based in vitro selection ofT4 DNA ligase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005.336(3): p. 987-993.

205. Hanes, J. and A. Pluckthun, In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(10): p. 4937-42.

206. He, M. and F. Khan, Ribosome display: Next-generation display technologies for production of antibodies in vitro. Expert Review of Proteomics, 2005. 2(3): p. 421-430.

207. Miller, O.J., et al., Directed evolution by in vitro compartmentalization. Nature Methods, 2006. 3(7): p. 561-570.

208. Aharoni, A., A.D. Griffiths, and D.S. Tawfik, High-throughput screens and selections of enzyme-encoding genes. Current Opinion in Chemical Biology, 2005.9(2): p. 210-216.

209. Sunami, Т., et al., Femtoliter compartment in liposomes for in vitro selection of proteins. Analytical Biochemistry, 2006. 357(1): p. 128-136.

210. Miller, O.J., et al., Directed evolution by in vitro compartmentalization. Nature Methods, 2006. 3(7): p. 561 570.

211. Takahashi, K., et al., Non-destructive on-chip cell sorting system with realtime microscopic image processing Journal of Nanobiotechnology, 2004. 2(5): p. 1-8.

212. Sverdlov, E.D., et al., Trp operon induction during the expression in E.coli of two IFN-g sequences. FEBS Lett., 1987. 212: p. 233-236.

213. Адаричев, В. и Г. Дымшиц, Получение ДНК, несущей алифатические аминогруппы, и использование ее флуоресцентного производного в качестве зонда при молекулярной гибридизации. Биоорганическая Химия, 1987. 13: р. 1066-1069.

214. Gillam, С. and G. Tener, N4-(6-aminohexyl)cytidine and -deoxycytidine nucleotides can be used to label DNA. Analytical biochemistry, 1986.157: p. 199-207.

215. Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, Molecular cloning. A laboratory manual. 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory. 1989, N.Y.

216. Gershoni, J.M. and G.E. Palade, Protein blotting: principles and applications. Anal. Biochem., 1983. 131: p. 1-15.

217. Миллер, Д., Эксперименты в молекулярной генетике. 1976, М.: Мир. 436

218. Morinaga, Т., et al., Primary structures of human alpha-fetoprotein and its mRNA. Proc. Natl. Acal. Sci. USA., 1983. 80: p. 4604-4608.

219. Хоробрых, B.B., A.B. Пронин, и А.Ф. Киркин, Иммунология, 1983(3): р. 76-79.

220. Birnboim, Н.С. and J. Doly, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Acids Res., 1979. 7: p. 15131523.

221. Lin, T.-C., R.E. Webster, and W. Koningsberg, Isolation and characterization of the С and D proteins coded by gene IX and gene YI in the filamentous bacteriophage fl andf2. J. Biol. Chem. , 1980. 255: p. 10331-10337.

222. Краев, A.C., Простая система клонирования в фаге М13 и секвенирование ДНК с терминаторами. Молекулярная биология, 1988. 22(5): р. 1164-1198.

223. Остерман, JI.A., Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). 1981, М.: "Наука". 285.

224. Sanger, F., et al., Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequensing. J. Mol. Biol., 1980.143(2): p. 161-168.

225. Maxam, A.M. and W. Gilbert, Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. Methods Enzymol., 1980. 65: p. 499-527.

226. Laemmly, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-685.

227. Vesterberg, O., Staining ofprotein zones after isoelectric focusing in polyacrilamidgels. Biochim. Biophys. Acta., 1971. 243: p. 345-348.

228. Поляков, И.В. и Н.С. Соколова, Практическое пособие по медицинской статистике. 1975, JL: Медицина. 175.

229. Guo, Н.Н., J. Choe, and L.A. Loeb, Protein tolerance to random amino acid change. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(25): p. 9205-10.

230. Петренко, В.А., и др., Получение мутантных генов лейкоцитарного а-2 интерферона человека методом локализованного мутагенеза.

231. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1985. 8: р. 3844.

232. Петренко, В.А., и др., Изучение лейкоцитарного интерферона с помощью локализованного мутагенеза, in В сб.: Тезисы докладов X Всесоюзного совещания по программе "Плазмида". 1985: Пущино-на-Оке. р. с.128-129.

233. Петренко, В.А., и др., Способ получения лейкоцитарного интерферона, in АС. СССР№1219647, 1985, Бюл. №11, 1986. 1985:.

234. Петренко, В.А., и др., Локализованный мутагенез клонированных генов, in Достижения микробиологии практике: Тезисы YIII съезда Всесоюзного микробиологического общества. 1985: Алма-Ата. р. С.58.

235. Budowsky, E.I., The mechanism of mutagenic action ofhydroxylamine. Progr. Nucl. Acids Res. Mol. Biol., 1976. 16: p. 125-188.

236. Будовский, Э.И., и др., Мол. биол., 1968. 2: р. 329-338.

237. Будовский, Э.И., и др., Мол. биол., 1968. 2: р. 321-328.

238. Budowsky, Е., Е. Sverdlov, and Т. Spasokukotskaya, Functional activity and specificity of cytidine triphospahte modified with hydroxylamine and O-methyl-hydroxylamine. Biochem. Biophys. Acta., 1972. 287: p. 195-210.

239. Flavel, R., et al., Site-directed mutagenesis: generation of an extracistronic mutation in bacteriophage QH RNA J. Mol. Biol., 1974. 89: p. 255-272.

240. Muller, W., et al., Site-directed mutagenesis in DNA: generation of point mutation in cloned -globin complementary DNA at position corresponding to amino acids 121 to 123. J. Mol. Biol., 1978. 124: p. 343-358.

241. Бреслер, C.E., и др., Генетика, 1983. 19: p. 1397-1403.

242. Петренко, В.А. и Г.В. Спирин, Продукты взаимодействия цитидиловой кислоты с О-д-аминооксибутилгидроксшамином. Мол.биол., 1982. 16: р. 644-647.

243. Петренко, В.А., В.А. Гусев, и JI.H. Семенова, Инактивация и мутагенез фага Я под действием О-метилгидроксшамина и OS-аминооксибутилгидроксиламина. . Мол. биол., 1982. 16: р. 637-643.

244. Гусев, В.А., и др., Модификация операторно-промоторного участка ДНК фага Я в составе специфического комплекса с РНК-полимеразой Е. coli. Докл. АН СССР, 1981. 260: р. 753-756.

245. Zoller, M.J. and М. Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragment cloned into Ml3 vectors. Methods in Enzymology, 1983. 100: p. 468-500.

246. Петренко, B.A., и др., Антивирусное действие мутантных интерферонов. Новый подход к исследованию структурнофункциональной организации интерфероное. Биоорганическая Химия, 1987. 13: р. 259-262.

247. Petrenko, V.A, et al. Determination ofprimary structure of mutant genes for human leukocytic interferon alpha2. Bioorg Khim, 1988.14(6, Part 1): p. 447-450.

248. Sverdlov, E.D, et al, Trp operon induction during the expression in E.coli of two IFN-g sequences. FEBS Lett, 1987. 212: p. 233-236.

249. Gillam, C. and G. Tener, N4-(6-aminohexyl)cytidine and -deoxycytidine nucleotides can be used to label DNA. Analytical biochemistry, 1986.157: p. 199-207.

250. Brown, D, M. Hewlins, and P. Schell, The tautomeric state ofN4-hydroxy N4-aminocytosine derivatives. Journal of the Chemical Society (C), 1968: p. 1925-1929.

251. Петренко, В .А, и др. Мутагенез, направленный фосфотриэирными аналогами олигонуклеотидов. Биоорган, химия, 1986.12(2): р. 289-292.

252. Петренко, В.А, и др, Сайт-локализованный мутагенез, направляемый фосфотриэфирными аналогами олигонуклеотидов. Биоорганическая Химия, 1986. 12(8): р. с. 1088-1100.

253. Петренко, В .А, и др. Мутагенные свойства фосфотриэфирных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов. Молекуляр. биология, 1988. 22(5): р. 1226-1237.

254. Петренко, В.А, Направленная реконструкция генетического материала: Дисс. на соискание ученой степени д-ра хим. наук. . 1988, НИКТИ БАВ НПО "Вектор": Новосибирск, р. 322с.

255. Пурмаль, А. А, В Л. Друца, и З.А. Шабарова, Новый тип модификации ДНК. Направленное введение 3'-5'пирофосфатных межнуклеотидных связей. Биоорганическая Химия, 1984.10(3): р. 394-400.

256. Готтих, М.Б, Модификация концевых фосфатных групп олигонуклеотидов в водной среде: Дис. канд. хим. наук. 1989, МГУ: Москва, р. 130.

257. Петренко, В.А, и др. Мутагенез, индуцированный фосфотриэфирными аналогами олигонуклеотидов и направленный на места разрыва двуспиральной ДНК. Молекуляр. генетика, микробиол. и вирусол, 1991(10): р. 19-22.

258. Петренко, В.А, и др. Исследование мутагенных свойств олигонуклеотидов, содержащих пирофосфатное звено, с помощью мутационной системы на основе фага Ml3. Молекуляр. биология, 1991. 25(6): р. 1539-1545.

259. Петренко, В.А, и др. Мутагенез, направленный неприродными аналогами олигонуклеотидов. I. Участие рибонуклеотидных звеньев в репарации и репликации ДНК. Молекуляр. биология, 1990. 24(5): р. 1332-1338.

260. Петренко, В.А, и др. Исследование механизмов мутагенеза, направленного фосфотриэфирными аналогами олигонуклеотидов. Роль репарации в закреплении мутаций. Молекуляр. биология, 1990. 24(2): р. 460-466.

261. Sanger, F, et al. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequensing. J. Mol. Biol, 1980.143(2): p. 161-168.

262. Friedberg, E.C, The molecular biology of nucleotide excision repair of DNA: recent progress. J. Cell. Sci. Suppl, 1987. 6: p. 1-23.

263. Walker, G.C, Inducible DNA repair systems. Ann. Rev. Biochem, 1985. 54: p. 425-458.

264. Radman, M. and R. Wagner, Mismatch repair in Escherichia coli. Ann. Rev. Biochem, 1986. 55: p. 523-538.

265. Wagner, R. and M. Radman, Mismatch repair and recombination in E. coli. Cell, 1987. 50(4): p. 621-626.

266. Pukkila, P.J, et al. Effects of high levels of DNA adenine methylation on methyl-directed repair in E.coli. Genetics, 1983. 104: p. 571-582.

267. Lu, A.-L, Influence of GATC sequence on E.coli DNA mismatch repair in vivo. J. Bacterid, 1987. 169(3): p. 1254-1259.

268. Lu, A.-L. and D.-J. Chang, A novel nucleotide excision repair for the conversion of an A/G mismatch to G/C base pair. Cell, 1988. 54: p. 805-812.

269. Lu, A.-L, et al. Repair of DNA base-pair mismatches in extracts of E.coli. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 1984. 49: p. 589-596.

270. Dohet, С., R. Wagner, and M. Radman, Methyl-directed repair offrameshift mutation in heteroduplex DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1985. 82(10): p. 503-508.

271. Su, S.-S., et al., Mispair specificity of methyl-directed DNA mismatch correction in vitro. J. Biol. Chem., 1988. 263: p. 6829-6835.

272. Fishel, R.A. and R. Kolonder, Gene conversion in E.coli.// Cellular responses to DNA damage, ed. R. Alan. 1983, New York: Liss., Inc.,. 309324.

273. Fishel, R.A., E.C. Siegel, and R. Kolonder, Gene conversion in E.coli: resolution ofheteroallelic mismatched nucleotides by co-repair. J. Mol. Biol., 1986. 188: p. 147-157.

274. Lieb, M., E. Allen, and D. Read, Very short patch mismatch repair in phage lambda: repair sites and length of repair tracts. Genetics, 1986. 114(14): p. 1041-1060.

275. Lieb, M., Specific mismatch correction in bacteriophage lambda crosses by very short patch repair. Mol. Gen. Genet., 1983. 191: p. 118-125.

276. Lieb, M., Recombination in the lambda repressor gene: evidence that very short patch (VSP) mismatch correction restores a specific sequence. Mol. Gen. Genet., 1983.199: p. 465-470.

277. Reyes, A. A. and R. Akeson, Generation of multiple independent substitution mutants by M13 in vitro mutagenesis using a single mutagenic oligonucleotide. DNA, 1988. 7(8): p. 579-584.

278. Шехтер, И.И., и др., Сайт-направленный мутагенез вурацил-репарационной системе. Получение мутантных форм интерферона -alpha2 человека Молекуляр. биология, 1991. 25(1): р. 151-153.

279. Manavalan, P. and P.D. Johnston, Prediction structure type for human leucocyte interferon subtype A from circular dichroism. FEBS Lett., 1984. 175(2): p. 227-230.

280. Wetzel, R., H.L. Levine, and D.A. Estell. Structure-function studies on human alpha inteferon. in Chemistry and biology of interferons: relationship to therapeutics. 1982. N.York: Academic Press.

281. Sternberg, M.J.E. and F.E. Cohen, The prediction of the secondary and tertiary structures of interferon from four homologous amino acid sequences. Int. J. Biol. Macromol., 1982. 4: p. 137-144.

282. Lydon, N.B., et al., Immunochemical mapping of -a2 interferon. Biochemistry, 1985. 24: p. 4131-4141.

283. Ohno, M., et al. Preparation and antigenecity of the C-terminal fragments of human leucocyte interferons a.2 and al/1 Peptides. 1982. . in Proc. 17. Eur. Peptide Symp., Praque. Aug. 29-Sept. 3. 1982: Berlin, New York. 1983.

284. Zoon, К., D. Zur Nedden, and H. Arnheiter, Specific binding of human interferon to a high affinity cell surface binding site on bovine kidney cells. The Journal of biological chemistry, 1982. 257(9): p. 4695-4697.

285. Leist, T. and R.M. Thomas, Synthesis andphysicochemical characterization of major fragments of human leukocyte interferon al. . Biochemistry, 1984. 23(12): p. 2541-2546.

286. Arnheiter, N., R.M. Thomas, and T. Leist, Physicochemical and antigenic properties of synthetic fragments of human leukocyte interferon. Nature, 1981.294(5838): p. 278-280.

287. Stewart, W.E., et al., Interferoids: in vitro and in vivo conversation of native interferon's to lower molecular weight forms. . Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1978. 75: p. 4814-4818.

288. Casadaban, M.J. and J. Chou, In vivo formation of gene fusions encoding hybrid Я-galactosidase proteins in one step with a transposable Mu-Lac transducing phage. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1984. 81: p. 535-539.

289. Welply, J.K., A.V. Fowler, and I. Zabin, Я -Galctosidase a -complementation. J. Biol. Chem., 1981. 256: p. 6804-6810.

290. Miller, F.D. and C.L. Hershberger, A quantitative -galctosidase -complementation assay for fusion proteins containing human insulin B-chainpeptides. Gene, 1984. 29: p. 247-250.

291. Миллер, Д., Эксперименты в молекулярной генетике. 1976, М.: Мир. 436

292. Петренко, В.А., и др., Определение первичной структуры мутантных генов лейкоцитарного интерферона альфа2 человека Биоорганическая Химия, 1988.14(6): р. 810-814.

293. Петренко, В.А. и С.И. Татьков, Структурно-функциональная организация лейкоцитарного интерферона. Молекулярная биология, 1990. 24(6): р. 1495-1503.

294. Levy, W.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1981. 78: p. 6186-6190.

295. Arnheiter, H, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1983. 80: p. 2539-2543.

296. De Chiara, T.M., F. Erlitz, and S.J. Tarnowski, Methods Enzymol., 1986. 119: p. 403-415.

297. Овчинников, Ю.А., и др., Мол. биол., 1984. 18: р. 48-59.

298. Weber, Н., et al., EMBO J., 1987. 6: p. 591-598.

299. Shorts, L.H., et al., Characterization ofN-terminal interferon tau mutants: P26L affords enhanced activity and lack of toxicity. Exp Biol Med (Maywood.) 2004.Feb;229.(2): 194.-202., 2004. 229: p. 194-202.

300. Wang, Y.X., et al., Distinct domains of IFNalpha mediate immune and analgesic effects respectively. J Neuroimmunol.2000.Aug 1;108.(l-2):64.-7., 2000. 108: p. 64-67.

301. Di Marco, S., et al., Mutational analysis of the structure-function relationship in interferon-alpha. Biochem.Biophys.Res Commun., 1994. 202: p. 1445-1451.

302. Korn, A.P., D.R. Rose, and E.N. Fish, Three-dimensional model of a human interferon-alpha consensus sequence. J Interferon Res, 1994. 14: p. 1-9.

303. Kontsek, P., et al., Immunodominant structures in the aminoterminalportion of human interferon alpha 1. Mol Immunol, 1992. 29: p. 863-870.

304. Hu, R., et al., Protein engineering of interferon alphas. Methods Mol Med 2005.;116.:69.-80., 2005. 116: p. 69-80.

305. Jarpe, M.A., et al., Predicted structural motif of IFN tau. Protein Eng, 1994. 7: p. 863-867.

306. Pontzer, C.H., et al., Structure/function studies with interferon tau: evidence for multiple active sites. J Interferon Res, 1994. 14:p. 133-141.

307. Viscomi, G.C., Structure-activity of type I interferons. Biotherapy, 1997. 10: p. 59-86.

308. Oritani, K. and Y. Kanakura, IFN-zetaf limitin: a member of type I IFN with mild lympho-myelosuppression. J Cell Mol Med 2005.Apr-Jun;9(2):244.-54., 2005. 9: p. 244-254.

309. Kawamoto, S., et al., A new interferon, limitin, displays equivalent immunomodulatory and antitumor activities without myelosuppressive properties as compared with interferon-alpha. Exp Hematol.2004.Sep.;32.(9):797.-805., 2004. 32: p. 797-805.

310. Bekisz, J., et al., Human interferons alpha, beta and omega. Growth Factors 2004.Dec.;22.(4):243.-51., 2004. 22: p. 243-251.

311. Mitsui, Y, et al. Structural, functional and evolutionary implications of the three-dimensional crystal structure of murine interferon-beta. Pharmacol.Ther, 1993. 58: p. 93-132.

312. Roisman, L.C, et al. Mutational analysis of the 1FNAR1 binding site on !FNalpha2 reveals the architecture of a weak ligand-receptor binding-site. J Mol Biol 2005.0ct.21;353.(2):271.-81, 2005. 353: p. 271-281.

313. Chill, J.H, et al. The human interferon receptor: NMR-based modeling, mapping of the IFN-alpha 2 binding site, and observed ligand-induced tightening. Biochemistry 2002 Mar, 2002. 41: p. 3575-3585.

314. Cutrone, E.C. and J. A. Langer, Identification of critical residues in bovine IFNAR-1 responsible for interferon binding. J Biol Chem.2001.May.l8;276.(20.):17140.-8.Epub.2001.Feb 7, 2001. 276: p. 17140-17148.

315. Roisman, L.C, et al. Structure of the interferon-receptor complex determined by distance constraints from double-mutant cycles and flexible docking. Proc Natl Acad Sci U S A 200l.Nov.6.;98.(23): 13231.-6, 2001. 98: p. 13231-13236.

316. Lewerenz, M, K.E. Mogensen, and G. Uze, Shared receptor components but distinct complexes for alpha and beta interferons. J Mol Biol, 1998. 282: p. 585-599.

317. Waine, G.J, et al. Structure-function study of the region encompassing residues 26-40 of human interferon-alpha 4: identification of residues important for antiviral and antiproliferative activities. J Interferon Res, 1992. 12: p. 43-48.

318. Hu, R, et al, Mutation of LoopAB in HuIFN lc/86D and enhancement of antiviral activity., Zhonghua Shi Yan.He.Lin.Chuang.Bing.Du Xue Za Zhi.2002 Jun;16(2): 132.-5, 2002. 16:p. 132-135.

319. Kontsekova, E, et al. Structural andfunctional heterogeneity of the amino-terminal receptor-binding domain of human interferon-alpha 2. Int J Biol Macromol, 1999. 24: p. 11-14.

320. Dolgikh, D.A, et al. Protein engineering of de novo protein with predesigned structure and activity. Appl.Biochem.Biotechnol, 1996. 61: p. 85-96.

321. Chertkova, R.V, et al, Synthetic proteins with antiviral properties of alpha-intetferons. Iskusstvennye belki, vosproizvodiashchie protivovirusnyesvoistva alpha-interferonov. Bioorg Khim.2003 May.-Jun;29.(3):258.-68., 2003. 29: p. 258-268.

322. Morozova-Roche, L.A., et al., Fibrillation of carrier protein albebetin and its biologically active constructs. Multiple oligomeric intermediates and pathways. Biochemistry 2004.Aug 3;43.(30.):9610.-9., 2004. 43: p. 96109619.

323. Tsilinskis, E.E., N.G. Ievinia, and G.I. Chipens, Structure and organization of class I interferon molecules. Struktura i organizatsiia molekul interferonov I klassa. Ukr.Biokhim.Zh., 1993. 65: p. 13-17.

324. Chipens, G., et al., Polarins: a novel group of immunologically active peptides. Immunol Res, 1986. 5: p. 314-327.

325. Hu, R., et al., Human IFN-alpha protein engineering: the amino acid residues at positions 86 and 90 are important for antiproliferative activity. J Immunol 2001.Aug l;167.(3):1482.-9., 2001. 167: p. 1482-1489.

326. Scolnick, E., et al., Release factors differing in specificity for termination codons. Proc Natl Acad Sci USA 1968. 61: p. 768-774.

327. Frolova, L., et al., A highly conserved eukaryotic protein family possessing properties ofpolypeptide chain release factor Nature, 1994. 372: p. 701703.

328. Nakamura, Y. and K. Ito, How proteins read the stop codon and terminate translation. Genes Cells 1998. 3: p. 265-278.

329. Kisselev, L.L. and L.Y. Frolova, Termination of translation in eukaryotes. Biochem Cell Biol, 1995. 73: p. 1079-1086.

330. Merkulova, T.I., et al., C-terminal domains of human translation termination factors eRFl and eRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Lett, 1999. 443: p. 41-47.

331. Grenett, H.E., P. Bounelis, and G.M. Fuller, Identification of a human cDNA with high homology to yeast omnipotent suppressor 45. Gene, 1992. 110: p. 239-243.

332. Frolova, L.Y., et al., Functional expression of eukaryotic polypeptide chain release factors 1 and 3 by means of baculovirus/insect cells and complex formation between the factors Eur J Biochem, 1998. 256: p. 36-44.

333. Tate, W.P. and C.T. Caskey, Termination of protein synthesis in Ribosomes and protein synthesis: A practical approach, G. Speding, Editor. 1990, IRL Press: Oxford, p. 81-100.

334. Frolova, L., et al, Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA, 1996. 2: p. 334-341.

335. Zhouravleva, G, et al. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRFl and eRF3. EMBO J 1995. 14: p. 4065-4072.

336. Sverdlov, E.D, et al, Trp operon induction during the expression in E.coli of two IFN-g sequences. FEBS Lett, 1987. 212: p. 233-236.

337. De Maeyer, E. and J. Maeyer-Guignard, lnterferon-gamma. Curr.Opin.Immuno1, 1992. 4: p. 321-326.

338. Kitano, K, et al. Intracellular degradation of recombinant proteins in relation to their location in Escherichia coli cells. Journal of Biotechnology, 1987. 5: p. 77-86.

339. Vandenbroeck, K. and A. Billiau, lnterferon-gamma is a target for binding and folding by both Escherichia coli chaperone model systems GroEL/GroES andDnaK/DnaJ/GrpE. Biochimie, 1998. 80: p. 729-737.

340. Vijay-Kumar, S, et al. Crystallization and preliminary X-ray investigation of a recombinant form of human gamma-interferon. J. Biol. Chem, 1987. 262 (10): p. 4804-4805.

341. Grzesiek, S, et al, H, вС and I5NNMR backbone assignment and secondary structure of human interferon- y. Biochemistry, 1992. 31(35): p. 8180-8190.

342. Ealick, S.E, et al. Three-dimensional structure of recombinant human interferon-gamma. Science, 1991. 252 (5006): p. 698-702.

343. Lord, S.C, et al. Functional domains of human interferon gamma probed with antipeptide antibodies. Mol Immunol, 1989. 26: p. 637-640.

344. Langer, J.A, et al. Radiation inactivation of human gamma-interferon: cellular activation requires two dimers. Proc Natl Acad Sci USA, 1994. 91: p. 5818-5822.

345. Fountoulakis, M, et al, Stoichiometry of interaction between interferon gamma and its receptor. Eur J Biochem, 1992. 208: p. 781-787.

346. Sareneva, T, et al, N-glycosylation of human interferon-gamma: glycans at Asn-25 are critical for protease resistance. Biochem. J, 1995. 308 ( Pt 1): p. 9-14.

347. Arakawa, T, et al. Structure and activity of glycosylated human interferon-gamma. J Interferon Res, 1986. 6: p. 687-695.

348. Littman, S.J., R. Devos, and C. Baglioni, Binding of unglycosylatedand glycosylated human recombinant interferon-gamma to cellular receptors. J Interferon Res, 1985. 5: p. 471-476.

349. Lundell, D., et al., Importance of the loop connecting A and В helices of human interferon-gamma in recognition by interferon-gamma receptor. J Biol Chem., 1994. 269: p. 16159-16162.

350. Hsu, Y.R., et al., Structure and activity of recombinant human interferon-gamma analogs. J Interferon Res, 1986. 6: p. 663-670.

351. Lundell, D.L. and S.K. Narula, Structural elements required for receptor recognition of human interferon-gamma. Pharmacol.Ther., 1994. 64: p. 121.

352. Caruso, A., et al., A monoclonal antibody to the NH2-terminal segment of human IFN-gamma selectively interferes with the antiproliferative activity of the lymphokine. J Immunol, 1993.150: p. 1029-1035.

353. Caruso, A., et al., Inhibition of the biological activity of human interferon-gamma by antipeptide antibodies. J Interferon Res, 1992. 12: p. 49-54.

354. Nacheva, G., et al., Human interferon gamma: significance of the C-terminal flexible domain for its biological activity. Arch.Biochem.Biophys.2003 May.l;413.(l):91.-8., 2003.413: p. 91-98.

355. Lundell, D., et al., The carboxyl-terminal region of human interferon gamma is important for biological activity: mutagenic and NMR analysis. Protein Eng, 1991.4: p. 335-341.

356. Arakawa, Т., et al., Role of polycationic C-terminalportion in the structure and activity of recombinant human interferon-gamma. J Biol Chem., 1986. 261: p. 8534-8539.

357. Schein, C.H. and M. Haugg, Deletions at the C-terminus of interferon gamma reduce RNA binding and activation of double-stranded-RNA cleavage by bovine seminal ribonuclease. Biochem.J, 1995. 307 ( Pt 1): p. 123-127.

358. Nickolson, H„ W. Becktel, and B. Matthews, Nature, 1988. 336(6200): p. 651-656.

359. Татьков, С.И., и др., Мутантный гамма-интерферон человека с повышенной антивирусной активностью Доклады Академии Наук, 1996. 346(3): р. 413-414.

360. Pechenov, S.E., et al., Methods for preparation of recombinant cytokine proteins V. mutant analogues of human interferon-gamma with higher stability and activity. Protein Expr.Purif.2002 Mar.;24.(2):173.-80., 2002. 24: p. 173-180.

361. Michalski, W.P., et al., Recombinant chicken IFN-gamma expressed in Escherichia coli: analysis of C-terminal truncation and effect on biologic activity. J Interferon Cytokine Res, 1999. 19: p. 383-392.

362. Смирнова, О.Ю., и др., Мутантные гамма-интерфероны человека с измененным С-концом и их свойства Доклады Академии Наук, 1994. 337(3): р. 405-406.

363. Татьков, С.И., и др., Гамма-интерфероны человека с измененным С-концом и их свойства. Молекулярная биология, 1995. 29: р. 1095-1101.

364. Lortat-Jacob, H. and J.A. Grimaud, Interferon-gamma C-terminal function: new working hypothesis. Heparan sulfate and heparin, new targets for IFN-gamma, protect, relax the cytokine and regulate its activity. Cell Mol Biol, 1991. 37: p. 253-260.

365. Tat'kov, S.I., et al., Mutant human gamma-interferon with a truncated C-terminus and its properties. Dokl Biochem, 2000. 372(1-6): p. 112-4.

366. Lebedev, L.R., et al., Artificial mycobacterial particles for immunization against tuberculosis. Dokl Biol Sci, 2002. 387: p. 488-90.

367. Азаев, М.Ш., и др., Получение искусственных микобактериальных частиц и исследование их иммуногенных свойств. Биотехнология, 2004(4): р. 34-40.

368. Азаев, М.Ш., и др., Искусственные микобактериалъные частицы и вакцинная противотуберкулезная композиция на их основе, in Патент №2242245, кл. МПК AG1K39/04, опубл. БИ№19 от 20.12.04 г. 2003: РФ.

369. Heath, A.W., Cytokines as immunological adjuvants. Pharm. Biotechnol., 1995. 6: p. 645-658.

370. Nakamura, M., et al., Effect of IFN on the immune response in vivo and on gene expression in vitro. . Nature, 1984. 307: p. 381.

371. Pighetti, G.M. and L.M. Sordillo, Specific immune responses of dairy cattle after primary inoculation with recombinant bovine interferon-gamma as an adjuvant when vaccinating against mastitis. . Am. J. Vet. Res., 1996. 57: p. 819-824.

372. Murray, P.J., A. Aldovini, and R.A. Young, Manipulation and potentiation of antimycobacterial immunity using recombinant bacille Calmette-Guerin strain that secrete cytokines. . Proc. Natl. Acad. Sci., 1996. 93: p. 934-939.

373. Playfair, J.H.L. and J.B. De Souza, Recombinant gamma interferon is a potent adjuvant for a malaria vaccine in mice. Clin. Exp. Immunol., 1987. 67: p. 5-10.

374. Heath, A.W. and J.H.L. Playfair, Conjugation of interferon-gamma to antigen enhances its adjuvanticity. . Immunology, 1990. 71: p. 454-456.

375. Maecker, H.T., et al., DNA vaccination with cytokine fusion constructs biases the immune response to ovalbumin. . Vaccine, 1997. 15: p. 16871696.

376. Deutsch, H.F., Chemistry and biology of a-fetoprotein. . Adv. Cancer Res., 1991. 56: p. 253-312.

377. Yang, F., et al., Evolutionary and structural relationships among the group-specific component, albumin and alfa-fetoprotein. Nucleic Acids Res., 1985. 13: p. 8007-8017.

378. Mizejewski, G.J., a-Fetoprotein as a biologic response modifier: relevance to domain and subdomain structure. Proceedings of Society for Exprimental Biology and Medicine., 1997. 215: p. 333-362.

379. Nishi, S., et al., Localization of the estrogen-binding site of a-fetoprotein in the chimeric human-rat proteins. . Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1991. 88: p. 3102-3105.

380. Aussel, C. and R. Masseyeff, Human a-fetoprotein fatty acid interactions. . Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983.115: p. 38-45.

381. Beide, C.B., M. Nagai, and H.F. Deutsch, Human a-fetoprotein: fluorescense studies on binding and proximity relationships for fatty acids and bilirubin. J. Biol. Chem., 1979. 254: p. 12609-12614.

382. Mizejewski, G.J., An apparent dimerization motif in the third domain of alpha-fetoprotein: molecular mimicry of the steroid/thyroid nuclear receptor superfamily. . BioEssay., 1993.15: p. 427-432.

383. Gibbs, P.E., et al., Structure, polymorphism, and novel repeated DNA elements revealed by a complete sequence of the human alpha-fetoprotein gene. . Biochemistry, 1987. 26: p. 1332-1343.

384. Morinaga, Т., et al., Primary structures of human alpha-fetoprotein and its mRNA. Proc. Natl. Acal. Sci. USA., 1983. 80: p. 4604-4608.

385. Arakawa, Т., et al., Reversibility of Acid Denaturation of Recombinant Interferon-gamma. Biopolymers, 1990. 29(6-7): p. 1065-1068.

386. Giavedoni, L.D., et al., Vaccinia virus recombinants expressing chimeric proteins of human immunodeficiency virus and yinterferon are attenuated for nude mice Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992. 89: p. 3409-3413.

387. Kosarev, I.S., et al., Interferon gamma induces expression of receptors to recombinant alpha-fetoprotein on the surface of U-937 cells. Tumor Biology, 1998. 19(S2): p. P23.

388. Цивковский, Р.Ю., и др., Изучение адъювантных свойств гамма-интерферона в составе гибридного белка ИФН-АФП. Иммунология, 1999(5): р. 30- 33.

Информация о работе

Татьков, Сергей Иванович
доктора биологических наук
Кольцово, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Создание искусственных белков методами направленного мутагенеза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Создание искусственных белков методами направленного мутагенеза ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание искусственных белков методами направленного мутагенеза"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Татьков, Сергей Иванович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание искусственных белков методами направленного мутагенеза"

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Татьков, Сергей Иванович

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Татьков, Сергей Иванович, Кольцово

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание искусственных белков методами направленного мутагенеза
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология