Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ функций гена HSM3 дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ функций гена HSM3 дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

На правах рукописи

ООЬ«'**'

ЧЕРНЕНКОВ Андрей Юрьевич

МОЛЕКУЛЯГНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИЙ ГЕНА ПБМЗ ДРОЖЖЕЙ Басскаготусеэ сег^1ае

03.02.07-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

4 ФЕВ 2013

Санкт-Петербург 2013

005049578

Работа выполнена в лаборатории генетики эукариот Отделения молекулярной и радиационной биофизики Федерального государственного бюджетного учреждения «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», г. Гатчина. - '

Научный руководитель: Королев Владимир Геннадиевич

доктор биологических наук, заведующий лабораторией генетики эукариот, руководитель Отделения молекулярной и радиационной биофизики ФГБУ «ПИЯФ», г. Гатчина.

Официальные оппоненты: Журавлёва Галина Анатольевна

доктор биологических наук, профессор, доцент кафедры генетики и селекции , Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета,

Сойдла Тыну Рихович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ведущий научный сотрудник, руководитель группы генетики митоза ФГБУН «Институт цитологии РАН», г. Санкт-Петербург.

Ведущая организация: ФГБУН «Институт общей генетики

им. Н.И. Вавилова РАН», г. Москва.

_ Защита состоится «#> ¿uvuflTZC. 20&года в ffl часов на заседании совета Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная, д.7-9, СПбГУ, Биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции тел. 8(812)328-15-90, e-mail: genetics@bio.pu.ru

С диссертацией можно ознакомиться

в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « S » 20 ¿¿года

Ученый секретарь Диссертационного совета к* доктор биологических наук —-ГОСКТамон

ОГ.ЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дрожжи являются удобным модельным объектом для изучения мутационного и репарационного процессов в клетке, а также для изучения процессов модификации и ремоделирования структуры хроматина. Еще более важен факт, что результаты, полученные в экспериментах на клетках дрожжей, могут быть экстраполированы на такой сложный организм как человеческий. Это перспективно с точки зрения того, что показана взаимосвязь многих генетических и онкологических заболеваний с изменениями структуры и укладки хроматина, а также его функций.

Ранее хроматин рассматривался как статическая структура, необходимая для упорядоченной компактизации генетического материала. Хотя упаковка ДНК и ее закрытость являются важными функциями хроматина, тем не менее, в настоящее время стало очевидным, что структурные единицы хроматина - нукпеосомы - представляют собой динамичные инструктивные частицы, участвующие практически во всех хромосомных процессах. Это достигается через высоколокальиые изменения в структуре хроматина. Свойства нуклеосом могут изменяться вследствие постгрансляционных химических модификаций входящих в их состав гистоновых белков. К модификациям гисгонов относят, к примеру, ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и другие. Модификации структуры хроматина служат для регуляции различных клеточных процессов, включая транскрипцию, репарацию, репликацию.

Комбинированное действие гнетон-модифнцирующих ферментов, действующих на определенный район хроматина, создает шаблон модификации гистонов in vivo. Существует ряд ферментов, модифицирующих гистоны, но каждый фермент обладает уникальным предпочтением к определенным сайтам и районам хромосомы. Нацеливание различных ферментов на специфический район генома является важным механизмом для создания уникальных паттернов модификации. Иногда уникальность модификации достигается комбинированным действием модификатора и демодификатора. Модификации гистонов играют значительную роль в обеспечении устойчивости клеток к агентам, повреждающим ДНК. Исследования последнего десятилетия показали, что в дополнение к белкам, которые прямо осуществляют эпзиматичсские реакции репарации ДНК, существуют факторы, которые организуют специализированные хроматинопые структуры вокруг повреждения ДНК и могут облегчать обнаружение и репарацию этих повреждений. Как хроматин-ремоделирующие, так и гистон-модифицируюнще ферменты изменяют топологию хроматина в ответ на повреждения ДНК.

В лаборатории генетики эукариот Петербургского института ядерной физики была получена коллекция мутантов hsm (от англ. high spontaneous mutagenesis), отличающихся повышенной частотой спонтанного мутагенеза. Интересным представлялось изучить функции открытых генов в процессах репарации и мутагенеза у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также установить их роль в процессах модификации структуры хроматина. Данная работа посвящена генетическому и молекулярно-биологическому анализу функций гена HSM3 и его продукта.

Цель исследования: молскулярно-гснетическими методами изучить функции гена HSM3 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В ходе исследования решались следующие задачи:

1. выяснить роль гена IISM3 в контроле различных путей репарации;

2. установить влияние мутаций в гене HSM3 на стабильность D-петли;

3. установить функции С-копцсвого домена белка Hsm3;

4. изучить взаимодействие гена HSM3 с генами, контролирующими состояние хроматина.

Научная новнзна работы. В ходе работы установлено участие гена HSM3 в системах пострепликативной и рскомбинационной репарации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Показано влияние продукта гена HSM3 на стабильность главного интермедиата указанных выше путей репарации - D-петлю. Впервые генетическими методами была установлена доменная структура белка Hsm3 и показано участие С-концевого домена данного белка в контроле спонтанного и индуцированного мутагенеза. Показано также взаимодействие гена

HSM3 с генами, контролирующими состояние хроматина, и его опосредованное влияние на пул дезоксирибонуклеотидов в клетке. Показано участие белка Hsm3 в качестве субъединицы в гистонацетилтрансферазном комплексе HAT-B/NuB4, осуществляющем ацетнлирование гистона Н4.

Теоретическая н практическая ценность работы. Проведенное в работе исследование позволило более точно охарактеризовать функции гена HSM3, а также установить его роль и роль белка Hsm3 в контроле двух важнейших процессов репарации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae-, рекомбинационной и пострсиликативной. Полученные данные позволяют также говорить о гене HSM3 как об одном из ключевых игроков в процессах модификации структуры хроматина.

Материалы и экспериментальные данные, полученные в диссертационной работе, могут бьггь использованы для чтения лекций по молекулярно-генетичсским курсам в научных и образовательных институтах.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ген HSM3 участвует в контроле гомологичной рекомбинационной и пострепликативной репарации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2. Мутации в гене HSM3 дестабилизируют D-петлю.

3. Продукт гена HSM3 имеет доменную структуру. С-концсвой домен белка Hsm3 ответственен за мутагенез.

4. Белок Hsm3 принимает участие в работе гистон ацетилтрансферазного комплекса НАТ-В / NuB4.

Личный вклад автора. Все исследования в ходе данной работы проводились лично автором, за исключением: конструирование плазмиды pFDV14 - м.н.с. ЛГЭ ОМБР ПИЯФ Фёдоров Д.В.; получение фага-помощника и установление титра фага - н.с. ЛГЭ ОМРБ ПИЯФ Евстюхина Т.Д.; секвепирование аллелей hsm3-l и hsm3::URA3 - с.н.с. ЛГЭ ОМРБ ПИЯФ Пешехонов В.Т..

Апробация работы. Работа была представлена на Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Киев, Украина, 2007); Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2009» (Москва, Россия, 2009); ХШ Международном Симпозиуме студентов-биологов Европы (Казань, Россия, 2009); III Всероссийском с международным участием Конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, Россия, 2010); I Всероссийской с международным участием Школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, Россия, 2011); IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, Россия, 2012); VI Всероссийской конференции «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2012); семинарах ОМРБ ПИЯФ (2006-2012 гг.).

Публикации. По материалам работы опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 машинописных страницах и содержит 49 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит из списка принятых сокращений, оглавления, введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», выводов, списка работ, опубликованных по теме диссертации, списка литературы, включающего 149 источников, приложений.

Финансовая поддержка работы. Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований: 04-04-48179-а, 07-04-00256-а, 12-04-01467-а, 12-04-31386-мол_а. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках ГК № 8131 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» и ГК № 11.519.11.2002 ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» с использованием оборудования ЦКП «Аналитический центр нано-и биотехнологий ГОУ СПбГПУ».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи исследования, показано научно-практическое значение работы.

1. Обюр литературы

Дана характеристика объекта исследования, обобщены современные представления о системах репарации у дрожжей Басскаготусе.^ сеге\ч51ае, рассмотрены актуальные вопросы, касающиеся структурной организации хроматина и его постгрансляционных модификаций, в частности - ацегилирования гистонов. Показан широкий спектр функций исследуемого гена и его продукта: участие в сборке протеасомного комплекса, контроль репарационных процессов, взаимодействие с белками-модификаторами структуры хроматина.

2. Материалы и методы

Приведены генотипы штаммов дрожжей ЯассИаготусез сеге\тае, а также конструкции плазмид, использованных для разрушения дрожжевых генов. Указаны составы питательных сред и условия культивирования штаммов. Описаны основные методы работы с дрожжевыми клетками, методы учета летальности и частот возникновения индуцированных и спонтанных мутаций, методы трансформации клеток, методы выделения и очистки ДНК, статистические методы обработки данных.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Характеристика мутантных аллелей гена Я5МЗ

Сконструированы мутантные аллели гена //5.Ш, установлена природа мутаций: /шиЗ-/ -мутация, затрагивающая семь нуклеотидов на С-копце гена; /¡¡тЗ::и!(ЛЗ - на С-концевом участке белка НзтЗ отсутствуют 56 аминокислот; /итЗА - полное удаление рамки гена путем вставки канамициновой кассеты; ИзтЗЦШМЗ] - наличие нлазмидпой копии гена для изучения свсрхэкспрессин белка ШтЗ под индуцибельным галактозным промотором.

3.2. Тест чувствительности к повышенной температуре мутантных аллелей гена //5М5

Был проведен анализ температурной чувствительности ((в) мутантов /¡5/яЗ-/,115тЗ::1Л1А и

/,5тЗД для учета влияния мутаций в С-концевом домене белка НйтЗ на возникновение фенотипа. При культивировании при +37(,С штаммов 1итЗ-1 и Н.'апЗ.-. иНА они не проявили чувствительности к повышенной температуре, и показатели мутагенеза и выживаемости для них статистически близки к показателям, полученным при культивировании в стандартных условиях (+30°С). В то же время мутант ЬтЗА оказался термочувствительным. Таким образом, нами было сделано заключение, что мутации в С-концевом домене не оказывают влияния на появление 15-фенотипа.

3.3. Влияние мутации в гене ШШ на спонтанный мутагенез

В Табл. I представлены данные учета скорости возникновения спонтанных мутаций канаванин-устойчивости (СЛМ3->САЫК) у мутантных аллелей гена /Л>Ш, измеренные с помощью флуктуационного теста (метод медиан Коулсона-Лн, 1949) для учета быстрого репликативного мутагенеза, и методом упорядоченного посева (ленинградский тест; метод Хромова-Борисова, 1975) для учета медленного репаративного мутагенеза.

В случае если исследуемый ген не имеет отношения к контролю любой из репарационных систем, то частоты спонтанного мутирования для исследуемого штамма, измеренные обоими методами, будут статистически совпадать. Если же ген участвует в работе систем репарации, то частоты спонтанных мутаций будут статистически различными. Данные, полученные в результате применения обоих методов к мутантам по исследуемым генам, позволяют сделать вывод о влиянии мутаций в этих генах на эффективность и скорость репарации, а также обосновать по характеру установленного взаимодействия участие исследуемого гена в контроле работы репарационных систем.

Делеция гена НБМЗ не приводит к статистически значимому изменению уровня репликативного спонтанного мутагенеза, однако уровень репаративного мутагенеза у данного мутанта был более чем в два раза выше по сравнению с клетками дикого типа. Частота репликативного спонтанного мутагенеза у мутанта А^тЗ-/ выше примерно в два раза, а

репаративного - в пять раз, по сравнению с клетками дикого типа. Частоты спонтанных мутаций у мутанта /шлЗ.\[//Ш, измеренные во флуктуационном тесте и методом упорядоченного посева, статистически совпадают с частотами спонтанного мутагенеза у мутанта И.чтЗ-1. Разницу в уровнях мутагенеза для штаммов к.<;тЗА и /итЗ-! / И.^тЗ-иКАЗ в случае упорядоченного посева можно объяснить тем, что белок ШтЗ работает в комплексе с другими белками, которые частично могут компенсировать его функции при его повреждении или отсутствии в клетке. Данные согласуются с полученными ранее в |Тс11огоуа е1 а!., 2004].

Таблица 1. Частоты возникновения спонтанных мутаций канаванин-устойчивости САГ^САМ* у штаммов ДТ, ЬзтЗ-/, /^тЗ. МИАЗ, НзтЗА,ДТ[НБМЗ] и И$тЗ[Н5МЗ]

Штамм Флуктуанионный тест, х 10"' Упорядоченный посев, х 10"'

ДТ 3,0 ±0,3 3,2 ±0,7

!шпЗ-1 5,0 ±0,3 15,8 ± 0,5

/¡¡тЗ.-.С/КАЗ 6,7 ±0,3 14,9 ±3,5

НятЗА 3,2 ± 0,3 7,4 ± 1,0

ДТрКМЗ] 7,6 ±0,3 16,8 ±2,3

11$тЗ[Н5МЗ] 66,8 ± 8,7 151,4 ± 19,7

Сверхэкспрессия химерного белка в штамме кьтЗ[ШМЗ] с полностью делегированной хромосомной копией гена НБМЗ привела к резкому увеличению темпа репликативного спонтанного мутагенеза более чем в 20 раз и репаративного мутагенеза в 50 раз. Таким образом, установлено, что С-концевой участок белка НзтЗ принимает активное участие в контроле спонтанного мутагенеза у дрожжей Засскаготусех сегехЫае. При этом наблюдается строгая зависимость мутаторного эффекта от количества белка. 3.4. Влияние мутаций НшЗ на выживаемость клеток при УФ облучении

Из данных, приведенных на Рис. I, видно, что полная делеция гена ЯУШ и мутации, затрагивающие только С-конец этого гена, не сказываются в заметной степени на резистентности клеток к УФ лучам. В случае сверхэкспрессии белка ШтЗ значения выживаемости для всех изученных штаммов (ДТ, IитЗ-1, /¡.™Л::(/ЙЛ, /итЗА, ДТ[Н5МЗ] и ИзтЗЩНЗМЗ]) статистически не отличались от представленных на Рис. 1. Нами было подмечено лишь незначительное снижение скорости роста штаммов ДТГШМЗ/ и ¿.мгЗД/ЖМЗу.

Доза УФ, Дж/м2

Рисунок I. Выживаемость под воздействием УФ лучей у штаммов: (-■-) - ДТ, (-♦-) - к.чтЗ-1 (-•-) - кшЗ::1Л1А и (-А-) -

3.5. Роль мутаций /ктЗ в УФ индуцированном мутагенезе

Наибольшим уровнем УФ индуцированного мутагенеза (Рис. 2) отличались штаммы с полной делецней гена ЬтЗА и мутацией /шлЗ-/. Клетки штамма ИмпЗ::11ЯАЗ показали промежуточный уровень УФ мутагенеза: выше, чем у дикого типа, но ниже, чем у ЬтЗ-1 и ИътЗА.

Рисунок 2. Частота мутаций по пяти локусам АОЕ4-АПЕ8, индуцированных УФ лучами, у штаммов: (-■-) - ДТ, (-♦-) - А<гтЗ-1, (-•-) - кктЗ::иЯА н (- А.-) - 1ктЗА

Частоты УФ индуцнрованного мутагенеза для штамма дикого типа, как содержащего плазмиду с геном //5,Ш, так и без нее, статистически не отличались. Частоты УФ индуцированных мутаций у штаммов ИхтЗА и ЬхтЗА[И$МЗ] статистически значимо выше, чем у штамма дикою типа. Сверхэкспрессия белка НэтЗ в штамме /шлЗД/ЖЛ/З/ полностью подавляла повышенный УФ мутагенез, обусловленный делеционной мутацией 1итЗА (Рис. 3).

Рисунок 3. Частота мутаций по пяти локусам ЛОЕ4-ЛйЕ8, индуцированных УФ лучами, у штаммов: (-■-) - ДТ, (-□-) - ДТ (сверхэкспрессия), (-•-) - ДТ[НЗМЗ], (-о-) -ДТ[Н5МЗ] (сверхэкспрессия), (-А-) - /шиЗД, (-Д-) - ЬтЗА (сверхэкспрессия), (-♦-) - ЬхтЗАЦЯМЗ], (-0-) -/итЗДда>М37 (сверхэкспрессия)

3.6. Качественный тест чувствительности к повышенной температуре мутантных

аллелей гена HSM3

Был проведен анализ температурной чувствительности (ts) мутантов hsm3-I, hsm3::URA и hsm3A для учета влияния мутаций в С-концевом домене белка Hsm3 на возникновение ts-фенотипа. При культивировании при +37°С штаммов hsm3-l и hsm3::URA они не проявили чувствительности к повышенной температуре, и показатели мутагенеза и выживаемости для них статистически близки к показателям, полученным при культивировании в стандартных условиях (+30 С). В то же время мутант hsm3A оказался термочувствительным. Таким образом, нами было сделано заключение, что мутации в С-концевом домене не оказывают влияния на ts-фенотип.

3.7. Участие белка Hsm3 в репарационных процессах у дрожжей Saccharomyces cerevislae

Было изучено взаимодействие мутаций hsm3 с мутациями в ключевых генах системы

нуклеотидной эксцизионной репарации (NER): radl, rad2, rad4 и radl4. Для указанных выше одиночных мутантов и полученных двойных мутантов, содержащих мутацию hsm3, были поставлены опыты по учету УФ-индуцированного мутагенеза и выживаемости штаммов при УФ облучении, также была поставлена серия опытов по учету спонтанных мутаций канаванин-усгойчивости в процессе быстрого репликативного (флуктуационный тест) и медленного репаративного (упорядоченный посев) мутагенеза. Результаты согласуются с данными, полученными ранее [Fedorova et al., 2004]. Также было изучено взаимодействие мутаций hsm3 с мутациями в ключевых генах системы коррекции ошибочно спаренных оснований (КОСО) у дрожжей: pmsl и msh2. Данные по учету выживаемости, УФ-индуцированного и спонтанного мутагенеза согласуются с данными, полученными в [Fedorova et al., 2004].

3.8. Взаимодействие гена HSM3 с генами, контролирующими пострепликативную

репарацию у дрожжей Saccharomyces cerevislae

Начальный этап пострепликативной репарации (ПРР) контролируется ферментативным комплексом Rad6-RadI8. Далее процесс разделяют на четыре ветви. Одна из них контролируется геном RAD30, который кодирует полимеразу Polri - уникальную среди эукариотических полимераз по своей способности осуществлять эффективный и безошибочный синтез через повреждения (TLS); инактивация Polt] в клетках дрожжей приводит к повышенному УФ мутагенезу. Вторая ветвь ПРР контролируется геном REV3, который кодирует каталитическую субъединицу ДНК полимеразы Pol!;, осуществляющую ошибочный обход повреждений, что, как правило, сопровождается мутагенезом. Третья ветвь ПРР, контролируемая генами RAD5, MMS2 и UBC13, обеспечивает обход повреждения, временно переключая синтез с поврежденной нити на сестринскую хроматиду. Этот процесс может происходить путем изомеризации репликативной вилки, генерируемой белком Rad5. Ген SRS2 был открыт как супрессор УФ чувствительности мутантов radö и radl8. Геликаза Srs2 играет важную роль в создании субстратов для белка Rad5. Четвертая ветвь - рскомбинационная репарация, контролируемая генами эпистатической группы RAD52.

Штаммы rev3, radl8 и srs2 проявили высокую чувствительность к летальному действию УФ лучей, мутант mms2 показал промежуточную чувствительность. Двойные мутанты rev3hsm3, radl8hsm3. mms2hsm3, srs2hsm3 сохраняют высокий уровень УФ чувствительности, свойственный одиночным радиочувствительным мутантам. Однако следует отметить, что введение мутации hsm3, как правило, слабо повышает устойчивость двойных мутантов.

Наличие неповрежденного гена REV3 абсолютно необходимо для возникновения УФ индуцированных мутаций. Из данных, представленных на Рис. 4, следует, что индуцированный мутагенез практически отсутствует у штамма rev3. Такой же низкий уровень мутагенеза наблюдался у двойного мутанта rev3hsm3. Таким образом, можно утверждать, что гены HSM3 и REV3 работают на одном пути пострепликационной репарации. Эпистатический (по rev3) характер взаимодействия между данными мутациями позволил выдвинуть предположение о том, что мутации hsm3 ухудшают эффективность работы безошибочного пути пострепликативной репарации, направляя предмутационные интермедиаты на склонный к ошибкам путь синтеза через повреждения (TLS).

л

Доза УФ, Дж/м"

Рисунок 4. (А) Выживаемость и (Б) мутагенез но 5 Л£>£-локусам под действием УФ лучей у штаммов: (-и-)-ДГ, (-П-) - !итЗ-1, (-Д-)-гсуЗД, (-^-)-!тпЗ-1гсчвА

Для подтверждения данного предположения мы дополнительно исследовали взаимодействие мутаций ИхтЗ с мутациями по генам, контролирующим безошибочный путь пострепликативной репарации - .чгх2, гш11Н и ттз2. В экспериментах мы наблюдали эпистатический характер взаимодействия между мутациями АхтЗ и каждой из перечисленных выше мутаций.

У штамма тт.<;2 наблюдался УФ индуцированный мутагенез значительно ниже, чем у 1г.шЗ, близкий к уровшо штамма дикого типа (Рис. 5). Уровень мутагенеза для двойного мутанта ттз2кшЗ статистически совпадал с уровнем мутагенеза одиночного мутанта ттз2.

Б

Рисунок 5. (А) Выживаемость и (Б) мутагенез по 5 ЛО£-локусам под действием УФ лучей у штаммов: (-■-) - ДТ, (-•-) - кчтЗ-1, (-Д-) - ттз2А, (-•*-)- ЬтЗ-1ттз2А

Уровень мутагенеза у двойного мутанта лг^А^/иЗ был ниже, чем у обоих одиночных мутантов (Рис. 6). Это позволило выдвинуть предположение, что наряду с геном НЯМЗ на Л/Ш.5-зависимой ветви ПРР может принимать участие система коррекции ошибочно спаренных оснований (мисматч-репарация).

Ген РМ31 играет ключевую роль в мисматч-репарации у дрожжей; при введении мутации рш! в двойной мутант УФ индуцированный мутагенез у тройного мутанта повысился

до уровня мутагенеза одиночного мутанта что говорит об участии системы КОСО в процессе репарации в качестве компенсирующей системы.

Б

ю -

Доза УФ, Дж/м!

Рисунок 6. (А) Выживаемость и (Б) мутагенез по 5 Л£>£-локусам под действием УФ лучей у штаммов: (-■-) -ДТ, (- А-) - /итЗ-/, (-•-) - ж2А, (-Д-) - li.sm3-lsr.42A, (-о-) - 1ктЗ-Ьгз2Аргт1А

3.9. Взаимодействие гена ИБМЗ с генами, контролирующими гомологичную рекомбинацнонную репарацию у дрожжей Яасс/шготусез сегеуШе О-пспш возникают в виде репарационных интермеднатов как в 11А06-, так и КЛ052-контролирусмых путях репарации, которые функционируют независимо друг от друга. В последнем случае это происходит в процессе репарации двунитевых разрывов (ДНР) ДНК. Ключевой стадией в гомологичной рекомбинации является обмен нитями ДНК, который обычно происходит при внедрении филамента, образованного на однонитевой ДНК белком Яас151, в дуплексную ДНК. Продукты генов ХН32, 11А052, 1Ы054 и ряда других генов энистатической группы ЯА052 способствуют эффективному протеканию этой стадии. Делеция ключевых генов этой эпистатической группы приводит к небольшому увеличению

чувствительности клеток к УФ лучам и слабому снижению эффективности пострепликативной репарации.

Л

Б

Рисунок 7. (А) Выживаемость и (Б) мутагенез по 5 ЛПЕ-локусам под действием УФ лучей у штаммов: (-■-) -ДГ, (-•-) - ИзтЗ-1, (-о-) - ттз4\ (-►-)- 1итЗ-1тгт4Ь

После УФ облучения клеток двунитевые разрывы (ДНР) ДНК могут возникать при процессинге остановленной или блокированной на поврежденной матрице репликативной вилки. Показано, что эндонуклеазой, которая может индуцировать такие ДНР ДНК, является комплекс Ми581-Мтз4. В мутанте тт.<;4 часть блокированных репликативных вилок будет приводить к летальным событиям, в то же время ДНР не будут образовываться и, как следствие, не будут возникать субстраты для действия белка НэтЗ. В результате уровень УФ индуцированного мутагенеза в штаммах дикого типа, одиночном тпи4 и двойном ИзтЗтгт4

должны быть примерно одинаковыми, что и наблюдалось в эксперименте (Рис: 7). Одиночный мутант ЬтЗ имел высокий УФ индуцированный мутагенез. Уровень мутагенеза при всех дозах у двойного мутанта ЬтЗ-1тт4Д практически идентичен таковому у штамма дикого типа, в то время как при больших дозах одиночный мутант тт.^А показал уровень мутагенеза промежуточный между уровнями штамма дикого типа и одиночного мутанта к>тЗ-1.

Л

« ■ 1 ■ ' - *_._1-1-1—

О 20 40 60 80 100 120

Доза УФ, Дж/М2

Б

Рисунок 8. (А) Выживаемость и (Б) мутагенез но 5 Л£>£-локусам под действием УФ лучей у штаммов: (-■-) - ДТ, (-•-) - /¡лтЗ-/, (-о-) - АлтЗД, (-Д-) - хп2А, (-Ч-) - ЬтЗ-1хг^2А, (-►-)- к5тЗАхг$2А

В то же время концы ДНР являются субстратами для белкового комплекса МЮС, в состав которого входят продукты трех генов МШ11(ЮЮ58), КЛ050, ХЯ32. Комплекс обеспечивает инициацию гомологичной рскомбинационной репарации. Инактивация любого из трех генов

белкового комплекса MRX блокирует инициацию репарации ДНР по механизму гомологичной рекомбинации. Следовательно, в мутанте xrs2 образование D-петель, инициированных репарацией ДНР, не будет происходить, так как не возникнут субстраты для действия белка Hsm3.

Мутация xrs2 не изменяла уровень мутагенеза по сравнению со штаммом дикого типа. Мутагенез у двойного мутанта xrs2hsm3 сравним с мутагенезом штаммов xrs2 и дикого типа. Таким образом, в этом случае мы наблюдаем эпистатическое взаимодействие генов (Рис. 5), при котором функция гена XRS2 осуществляется на более раннем этапе по сравнению с геном HSM3. Как видно из Рис. 8, мутация xrs2 полностью блокирует ffiA/3-зависимый мутагенез. На основании представленных данных можно сделать, вывод, что /Ш«-зависимый мутагенез является следствием репарации ДНР ДНК, возникших в процессе разрешения блокированной вилки репликации.

В Табл. 2 приведены частоты возникновения спонтанных мутаций канаванин-устойчивости, измеренные методом упорядоченного посева и с помощью флуктуационного теста, для исследованных мутантов. Из данных Табл. 2 видно, что уровень репликативного мутагенеза у двойных мутантов снижен, в то время как уровень репаративного мутагенеза у них повышенный по сравнению с одиночным мутантом xrs2A.

Таблица 2. Учет влияния мутаций hsm3-l и hsm3A на спонтанный мутагенез канаванин-устойчивости (CAN ->CANR) при взаимодействии с мутацией xrs2A

Штамм Упорядоченный посев, x 10"7 Флуктуационный тест, x 10'7

ДТ 3,6 ±0,6 3,4 ±0,8

hsm3-l 15,8 ±0,4 5,0 ±0,3

hsm3A 7,4 ± 1,0 3,2 ± 0,3

xrs2A 56,3 ± 5,7 34,1 ±4,1

hsm3-!xrs2A 89,9 ± 7,5 25,6 ±3,1

hsm3Axrs2A 79,8 ± 5,6 21,2 ±4,0

В результате процесса деградации 5'-концов ДНР, инициированного комплексом MRX, образуются З'-однонитевые «хвосты» ДНК, которые могут использоваться белком Rad5 в безошибочной ветви пострепликативной репарации и белком Rad51 в рекомбинационной репарации. Оба эти белка формируют D-петли в сестринской хроматиде. Основную роль в безошибочной ветви ПРР играет субпуть, контролируемый Rad5p, в то время как RadSlp обеспечивает лишь небольшую часть репарационных событий. Полученные нами данные показывают, что разрушение в мутанте hsm3 генов RAD51. RAD52 и RAD54 слабо снижает уровень ЯШЗ-зависимого мутагенеза (Рис. 9). По-видимому, остальная часть этого мутагенеза в штамме hsm3rad5l обеспечивается Rad5p-3aBHCHMbiM субпугсм ПРР.

Продукты генов RAD51, RAD52 и RAD54 работают на более поздних, чем продукт гена XRS2, этапах рекомбинационной репарации. Белки RadSI, Rad52 и Rad54 являются ключевыми в гомологичной рекомбинационной репарации. Мутации rad51, rad52 и rad54 показали одинаковый тип взаимодействия с мутацией hsm3; для иллюстрации использованы результаты по изучению взаимодействия мутаций hsm3 и radSI. На Рис. 9 представлен УФ-индуцированный мутагенез для штамма дикого типа, мутантов radSI и hsm3, а также двойного мутанта rad51hsm3. Мутагенез у мутанта rad51 был несколько выше, чем у штамма дикого типа, но ниже, чем у мутанта hsm3, а мутагенез у двойного мутанта rad5Ihsm3 имел промежуточный уровень: ниже, чем у hsm3, и выше, чем у radSI. Таким образом, в эксперименте мы наблюдали частичное подавление HSM3-зависимого мутагенеза, в отличие от полного подавления при комбинации мутаций hsm3 и xrs2. Такой же тип взаимодействия наблюдали в случае УФ индуцированного мутагенеза в сериях опытов с двойными мутантами hsm3rad52 и hsm3rad54.

Б

Рисунок 9. (А) Выживаемость и (Б) мутагенез по 5 /ШЕ-локусам под действием УФ лучей у штаммов: (-■-) - ДТ, (-•-) - кчтЗ-!, (-о-) - /шиЗД, (-Д-) - га<ШД (-•*-) - >1зтЗ-1гас151А, (-►-)- кчтЗА>-ас151А

В Табл. 3 приведены данные по учету возникновения спонтанных мутаций канаванин-усгойчивости методом упорядоченного посева и флуктуационным тестом для исследованных мутаций.

Мы наблюдали эпистатический характер взаимодействия мутаций ИхтЗ и текШ Д, что позволило говорить о совместной работе генов ЯАР51 и НЗМЗ на пути гомологичной рекомбинационной репарации.

Таблица 3. Учет влияния мутаций ИзтЗ-1 и hsm3A на спонтанный мутагенез устойчивости (CAN ->CANR) при взаимодействии с мутацией rad5 1А

Штамм Флуюуационный тест, x 10"7 Упорядоченный посев, x Ю"7

ДТ 3,4 ± 0,8 3,6 ± 0,6

hsm3-l 5,0 ± 0,3 15,8 ±0,4

hsm3& 3,2 ± 0,3 7,4 ± 1,0

rad5IA 32,1 ±5,1 60,3 ± 4,9

hsm3-lrad51A 30,3 ± 4,0 53,2 ±2,7

hsm3Arad51A 36,4 ± 4,2 77,1 ± 8,0

3.10. Взаимодействие гена HSM3 с генами, контролирующими стабильность D-петли

Продукт гена МРН1 обладает геликазной активностью и функционирует в процессе как образования, так и разрушения D-петель. Мутация mphl инактивирует основную геликазу разрушающую структуру D-петли, чем способствует стабилизации последней. В отличие от Mphlp, белковый комплекс Shul стабилизирует вновь образованные D-пегли.

Доза УФ, Дж/м"

40

Доза УФ, Дж/м"

Рисунок 10. (А) Мутагенез по 5 ЛО£-локусам под действием УФ лучей для штаммов: (-■-) - дг, (-•-) - ¡ьчтЗ, (-Д-) - трМ, (-□-) - ЬитЗтр\х1\ (Б) Мутагенез по 5 Л£)£-локусам под действием УФ лучей для штаммов: (-■-) -ДТ, (-•-) - /шлЗ, (-Д-) - ¡Ии1, (-□-) -

Двойной мутант ИзтЗтрЫ показал уровень мутагенеза, промежуточный между уровнями УФ индуцированного мутагенеза у одиночных мутантов кчтЗ и трИ1 (Рис. 10А), т.е. мы наблюдали частичное подавление ЖШ-зависимого мутагенеза. В случае комбинации мутаций ЛотЗ и ¡Ьи1 взаимодействие носило эпистатический характер, и мы наблюдали полное

подавление Я5Ш-зависимого мутагенеза в двойном мутанте И.чтЗзИи! (Рис. 10Б): уровень мутагенеза для него совпадал с уровнем мутагенеза у одиночного мутшгга .■¡Ни!. Таким образом, можно заключить, что мутации )итЗ влияют на стабильность Э-пстли.

Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что мутация И.чтЗ дестабилизирует ключевой субстрат обоих путей репарации (пострепликативной и гомологичной рскомбинационной) - Э-петли, что приводит к резкому повышепшо роли ошибочной ветви ПРР (ЯеуЗ-путь) и, как следствие, значительному повышению уровня УФ индуцированного мутагенеза в клетках мутанта А.утЗ.

3.11. Взаимодействие гена НШЗ с генами, контролирующими состояние хроматина

А

' ■ ■ ■ '_._1-.-1-1-1—

О 20 40 60 80 100 120

Доза УФ, Дж/м!

Б

100 -

Доза УФ, Дж/м

Рисунок 11. (А) Выживаемость и (Б) мутагенез по 5 Л£>£-локусам под действием УФ лучей у штаммов: (-■-) - ДТ, (-•-) - >ппгЗ-1, (-о-) - /ит5Д, (-Д-) - ЬайД, (-•*-) - ИэтЗ-НгаНА,

В начале 2012 года [Takaji et al., 2012] была установлена пространственная структура белка Hsm3, и показано его взаимодействие с субъединицей Rptl протеасомного комплекса, за которое ответственны N-концевая и центральная части Hsm3p. Точковые мутации (как и полная деления гена), затрагивающие аминокислоты серединной части белка, влияют на его шаперо1шую функцию, что выражается в появлении ts-фенотипа. Проведенный нами анализ различных мутантных аллелей гена HSM3 (п.3.2.) выявил, что мутации в С-концевом домене белка Hsm3 не проявляют ts-фенотипа, что говорит об отсутствии влияния на сборку протеасомного комплекса. Таким образом, С-концевой домен белка Hsm3 ответственен только за контроль индуцированного и спонтанного мутагенеза. Следовательно, можно сделать вывод о многофункциональности Hsm3p, обоснованной его мультидоменной структурой.

Нами было выдвинуто предположение, что функцией Hsm3p является его участие в качестве субъединицы в работе гистон ацетилтрансферазного комплекса HAT-B/Nub4. Предположение основывалось на том, что для всех субъединиц комплекса HAT-B/Nub4 (Hatl, Hat2 и Hin) показано соосаждспие с Hsm3p. Белок Hsm3 присоединяется к комплексу НАТ-В в цитоплазме, т.к. в структуре белка отсутствует транспортный домен и не показано наличие специфического переносчика для Hsm3p. Затем Hsm3p транспортируется в ядро в составе комплекса НАТ-В. Основная функция комплекса НАТ-В - ацетилирование по 5 и 12 положениям лизина ядерного и новосинтезированного цитоплазматического гистона Н4, причем для ацетшшрования необходимо присутствие положительно заряженных аминокислот в положениях 8 и 16 гистона НЗ. Ацетилирование гистонов необходимо, в частности, после их синтеза в цитоплазме для последующего переноса в ядро, где они встраиваются в структуру хроматина при репликации.

Нами было предпринято исследование влияния комбинации мутаций hsm3 и hatl А на спонтанный и индуцированный мутагенез с целью генетического подтверждения их совместной работы. Частоты УФ индуцированного мутагенеза у штаммов hsm3-l и hsm3A статистически близки и статистически значимо выше, чем у штамма дикого типа. Одиночный мутант hatl А показал частоты мутагенеза в 2-3 раза ниже, чем у штамма дикого типа. Двойные мутанты hsm3-lhatlA и hsm3AhatlA показали частоты мутагенеза, статистически не отличимые от одиночного мутанта hatlA. Нами показано, что в случае УФ индуцированного мутагенеза наблюдается практически полное подавление ЯХШ-зависимого мутагенеза (Рис. 11), что говорит о ключевой роли Hatlp и вспомогательной - Hsm3p - в работе гистон ацетилтрансферазного комплекса.

В случае спонтанного мутагенеза (Табл. 4) мы наблюдали отсутствие влияния на быстрый репликативный мутагенез, однако hatl А проявил тенденцию к подавлению медленного репаративного мутагенеза в комбинации с мутацией hsm3, что хорошо согласуется с подавлением HSM3-зависимого репаративного мутагенеза при УФ облучении.

Таблица 4. ^ Частоты возникновения спонтанных мутаций канаванин-устойчивости (CAN ->CAN ) при взаимодействии мутаций hsm3-l и hsm3A с мутацией hatl А

ШТАММ Упорядоченный посев, x 10"7 Флуктуационный тест, x 10"7

ДТ 3,6 ± 0,8 3,4 ± 0,5

hsm3-l 49,0 ±5,1 5,0 ±0,3

hsm3A 54,7 ±6,3 3,9 ± 0,4

hatlA 27,1 ±4,1 4,1 ±0,7

hsm3AhatlA 23,3 ± 5,7 4,1 ±0,3

hsm3-lhatIA 24,8 ± 4,3 3,9 ±0,5

Сходное поведение мутанта ка11А также отмечалось нами при исследовании взаимодействия мутаций ИаЧА и пн11 А\ мы наблюдали подавление ЛЛ01-зависимого мутагенеза (Рис. 12) в комбинации с мутацией ИаЧА. Ключевым моментом является образование пика мутагенеза в начальный момент времени и постепенное снижение уровня

мутагенеза в двойном мутанте гаЛ/ДАяГ/Д до уровня одиночного мутанта Д что может быть объяснено пониженной концентрацией дезоксирибонуклеотидов на фоне дополнительных стрессовых условий в виде отключения системы репарации ЫЕЯ.

Л

Б

Рисунок 12. (А) Выживаемость и (Б) мутагенез по 5 Л£>£-локусам под действием УФ лучей у штаммов: (-■-) ~ДТ, (-•-) - Ш1Д, (- А-) - гас11А, (-Д-) - На11Лгас11 Д

Мутант гай] сильно чувствителен к действию УФ-облучения, а полная деления гас11Л приводит к выключению эндонуклеазной активности комплекса ЫЕР1, что, в свою очередь, делает невозможным удаление из структуры ДНК поврежденного участка в механизме №11. На Рис. 12 отчетливо виден «пик» мутагенеза у двойного мутанта /га//Дга<1/Д который можно объяснить изменением уровня дезоксирибонуклеотидов в клетке: при малых дозах облучения повышение уровня мутагенеза связано с изначально высоким уровнем дезоксирибонуклеотидов

при прохождении процесса быстрой пострепликативной репарации. Снижение уровня мутагенеза с увеличением дозы обусловлено как падением уровня дезоксирибонуклеотидов в связи с их расходованием на начальном этапе репарации, так и повышением точности и увеличением времени, необходимого для репарации. 3.12. Качественный тест чувствительности к гидроксимочевине

Из данных литературы [Тэарошпа е1 Ы., 2011] известно, что на стабильность и скорость процессирования Э-петли влияет концентрация (пул) свободных дезоксирибонуклеотидов, которую контролирует рибонуклеотидредуктаза (ЯЫЯ). В случае недостатка дезоксирибонуклеотидов скорость процессинга О-пстли снижена, и равновесие смещено в сторону ее дестабилизации. Известно также, что гены, контролирующие структуру хроматина, также контролируют и активность/транскрипцию 1ШК. Можно предполагать, что ген ШМЗ оказывает влияние на пул дезоксирибонуклеотидов опосредовано: нами проведен качественный тест на чувствительность исследуемых мутантов (дикого типа и различных аллелей Я5МЗ) к гидроксимочевине (ГМ) - препарату, ингибирующему работу ЮЧЯ, и, как следствие, снижающему пул дезоксирибонуклеотидов. В случае обработки штаммов ГМ, а также при создании дополнительного стресса (облучение УФ после обработки ГМ) мы качественно наблюдали за скоростью их роста, что позволило нам выдвинуть предположение о влиянии мутаций /итЗ на пул дезоксирибонуклеотидов.

В случае обработки штаммов ГМ без облучения УФ (Рис. 13, правая часть) мы наблюдали гораздо лучший рост мутантов, несущих лишь частичные повреждения (hsm3-l и hsm3::URA), чем в случае штамма дикого типа или при полной делении гена HSM3 (hsm3A). Можно предполагать, что точечные мутации приводят к повышению уровня дезоксирибонуклеотидов, что в свою очередь приводит к повышению уровня спонтанного рспликативного мутагенеза и выживаемости, что хорошо согласуется с данными литературы [Tsapomna et al., 2011]. В случае дополнительного стресса (облучения УФ) картина менялась (Рис. 13, левая часть)-, известно, что УФ облучение инициирует интенсивность работы RNR в 4-8 раз; таким образом, при сохраняющейся медленной скорости роста всех штаммов штаммы hsm3-l и hsm3::URA растут гораздо хуже, чем штаммы дикого типа и hsm3A Таким образом, мы можем заключить, что Hsm3p может оказывать влияние на пул дезоксирибонуклеотидов.

Дополнительно качественный тест чувствительности к ГМ / ГМ+УФ был проведен нами для штамма, несущего мутацию hatlA: полученные данные дают косвенное подтверждение совместной работы Hsm3 и HatI: мутации hsm3A и hall А ведут себя сходно как в случае обработки только ГМ, так и в случае дополнительного стресса при УФ облучении (Рис. 13).

Рисунок 13. Качественный тест чувствительности штаммов ДТ'йзтЗ-К ЬятЗ::1Л1Л, ИзтЗА и ИаНА к ГМ (правая часть рисунка) и ГМ с одновременным облучением УФ (левая часть рисунка).

выводы

1. Ген HSM3 участвует в контроле поегрепликативной и гомологичной рекомбинационной репарации у дрожжей Soccharomyces cerevisiae.

2. Мутации в гене 1ISM3 дестабилизируют ключевой интермсдиат обоих указанных путей репарации - D-петлн, что приводит к резкому повышению роли репарационного пути, склонного к ошибкам.

3. С-концевой домен белка Hsm3 ответственен за контроль индуцированного и спонтанного мутагенеза.

4. Белок Iism3 участвует в работе гистон-ацстилтрапсферазного комплекса НАТ-В / NuB4.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ковальцова С.В., Чепненков A.IO., Королёв В.Г.. Репарация цис-платиновых аддуктов ДНК в мутантах по генам, контролирующим спонтанный и индуцированный мутагенез у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. - Генетика, 2007. - Т. 43, №1. - С. 100-104.

2. Чепиенкоп АЛО., Иванова С.В., Ковальцова С.В., Грачёва Л.М., Пешехонов В.Т., Фёдорова И.В., Королев В.Г.. Генетический анализ доменной структуры белка Hsm3 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. - Генетика, 2010. - Т. 46, №6. - С. 742-749.

3. Чепненков АЛО.. Грачёва Л.М., Евстюхнна Т.А., Ковальцова С.В., Пешехонов В.Т., Федорова И.В., Королев В.Г.. Взаимодействие гена HSM3 с генами эпистатической группы RAD6 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. - Генетика, 2012. - Т. 48, №2. - С. 160167.

4. Чепненков АЛО- Федоров Д.В., Грачёва Л.М., Евстюхина Т.А., Ковальцова С.В., Пешехонов В.Т., Фёдорова И.В., Королёв В.Г.. Взаимодействие гена HSM3 с генами, инициирующими гомологичную рекомбннацпонную репарацию у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. - Генетика, 2012. - Т. 48, №3. - С. 333-339.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Fedorova I.V., Kovaltzova S.V., Gracheva L.M. el at. Requirement of HSM3 gene for spontaneous mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae. - Mutat. Res., 2004. - V. 554. - P. 67-75.

2. Takagi K., Kim S., Yukii H. et al. Structural basis for specific recognition of Rptlp, an ATPase subunit of the 26S proteasome, by the proteasome-dedicatcd chaperone Hsm3p. -J. Biol. Chem., 2012. - V. 287. - P. 12172-12182.

3. Tsaponina 0„ Barsoum E„ Astrom S.U. et al. Ixrl is required for the expression of the ribonucleotide reductase Rnrl and maintenance of dNTP pools. - PLoS Gen., 2011. - V. 7, lss.5. -el 002061.

Отпечатало в типографии ФГБУ «ПИЯФ»

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 16, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 24.01.2013 г.