Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым эффектом

Савватеева, Людмила Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым эффектом
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым эффектом"

На правах рукописи

Савватеева Людмила Владимировна

СОЗДАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕКА С ПОТЕНЦИАЛЬНЫМ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ЭФФЕКТОМ

Специальность 03.00.23. - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

□оза-тетев

Москва - 2007

003176788

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии Департамента здравоохранения г Москвы и на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им MB Ломоносова

Научный руководитель: член-корреспондент РАМН,

доктор химических наук, профессор Северин Сергей Евгеньевич

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,

доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич, доктор биологических наук, профессор Глухов Александр Иванович

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им академиков М М. Шемякина и Ю А. Овчинникова РАН

Защита состоится « /ft » декабря 2007 года в часов на заседании Диссертационного Совета Д 212 120 01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии имени М.В Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр Вернадского, 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им MB Ломоносова С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www rmtht га

Автореферат разослан « » ноября 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Лютик А И

Общая характеристика работы*

Актуальность проблемы. В настоящее время злокачественным новообразованиям принадлежит второе место среди заболеваний, приводящих к летальному исходу Недостаточная эффективность и избирательность существующих методов лечения рака делают крайне актуальной проблему поиска новых, более действенных и высокоспецифичных методов диагностики и противоопухолевой терапии Разработка и исследование комбинаций лекарственных средств, принадлежащих к различным классам и действующих на разные клеточные мишени, представляются перспективными в успешном лечении онкологических заболеваний

В предупреждении и элиминации развившихся опухолей большие надежды связывают с развитием иммунотерапии [Romero Р et al, 2002], которая подразумевает разработку стратегий для разрушения опухолей путем проявления противоопухолевого иммунитета Так, успешно развивается цитокиновая терапия, специфическая иммунотерапия (вакцинация), адаптивная иммунотерапия (использование опухолеспецифических Т-клеток или моноклональных антител), используется ряд антигенных систем, широко исследуются методы стимуляции гуморального и/или клеточного иммунных ответов, тестируются различные адъюванты Показано, что белки теплового шока (HSPs) играют важную роль в иммунном ответе, что дало основание использовать некоторые HSPs в качестве вакцин в иммунотерапии рака [Snvastava РК, 1998] Иммунологическое функционирование HSPs, которое получило наиболее пристальное внимание, основано на их способности перемещать антигены (в том числе опухолеспецифические) к антиген-презентирующим клеткам (АПК) Также обнаружено, что взаимодействие HSP-АПК независимо от переносимых антигенов приводит к увеличению количества костимуляторных молекул на антиген-презентирующих клетках и секреции воспалительных цитокинов, а взаимодействие HSPs с некоторыми

" В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие зав кафедрой биотехнологии МИТХТ им М В Ломоносова, академик РАМН, д х н , профессор Швец В И Активное участие в работе и руководстве диссертацией осуществляла к б н Гороховец Н В

рецепторами вызывает активацию дендритных клеток (ДК) и трансдукционных сигналов [Wallm R et al, 2002] Эти уникальные иммуностимулирующие свойства HSPs позволяют использовать их в качестве адъювантов для разработки иммунотерапевтических средств

Цели и задачи работы Целью работы явилось создание и изучение потенциала в противоопухолевой терапии рекомбинантного белка теплового

шока HSP70A1B человека и рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека (AFP3D) В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи

- клонирование и экспрессия в Е coli генных конструкций, осуществляющих биосинтез белка теплового шока HSP70A1B человека и третьего домена альфа-фетопротеина человека (AFP3D),

- разработка технологического метода получения рекомбинантных белков HSP70A1B и AFP3D,

- исследование биологической активности рекомбинантного HSP70A1B по способности взаимодействия с антигенпрезентирующими клетками,

- сравнение биологической активности рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека AFP3D с активностью природного альфа-фетопротеина человека,

- синтез цитотоксического конъюгата AFP3D с химиопрепаратом, обеспечивающего направленное воздействие на опухолевые клетки, и исследование его эффективности in vitro

Научная новизна и практическая значимость работы Сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК Е coli, позволяющие эффективно осуществлять индуцированный биосинтез белка теплового шока человека HSP70A1B и третьего домена альфа-фетопротеина человека AFP3D в клетках соответствующих штаммов-продуцентов

Разработаны высокоэффективные методы выделения исследуемых рекомбинантных белков в препаративном количестве

Исследована биологическая активность рекомбинантного HSP70A1B, а также показана его способность к связыванию и активному эндоцитозу дендритными клетками

Продемонстрирована возможность использования рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека в качестве векторной молекулы для создания противоопухолевых препаратов направленного действия за счет сохранения в AFP3D функциональной активности полноразмерной молекулы природного альфа-фетопротеина человека

Синтезирован ковалентный конъюгат рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека с таксолом, и показана высокоспецифическая цитотоксическая активность конъюгата in vitro по отношению к клеткам злокачественной опухоли

Полученные штаммы-продуценты HSP70A1B и AFP3D человека и разработанные методы их выделения могут быть использованы в области промышленной биотехнологии, а соответствующие рекомбинантные белки - в научно-исследовательских работах с последующим потенциальным применением в области практической медицины

В целом, данная работа демонстрирует роль, которую рекомбинантные белки человека HSP70A1B и AFP3D могут сыграть в противоопухолевой терапии в качестве иммуномодулятора и вектора для направленной доставки лекарственных средств соответственно, а также подчеркивает необходимость дальнейшего совершенствования систем различного механизма действия с использованием рекомбинантных белков

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (Greece, Rhodes, 2005), 19th Meeting of the European Association for Cancer Research (Budapest, Hungary, 2006), Российский Медицинский Форум «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006), International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop "New Technologies m Medicine and Expenmental Biology" (Bangkok-Pattaya, Thailand, 2007)

По материалам диссертации опубликовано 5 работ, оформлена 1 заявка на выдачу патента РФ на изобретение

Структура и объем работы. Диссертация изложена на /Р-? страницах, содержит рисунков и £ таблицы, состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающей ¿/^наименований

Содержание работы

1. Получение белка теплового шока HSP70A1B человека и третьего домена альфа-фетопротеина AFP3D в E.colL

1.1. Конструированиерекомбинантных плазмидных ДНК.

1.1.1. Клонирование гена белка теплового шока человека HSP70A1B в рЕТ-28а(+).

На основе известной последовательности мРНК HSP70 (GenBank NM 005346) человека с помощью компьютерной программы DNA-SUN была получена рестрикционная карта ДНК-последовательности HSP70 для определения отсутствующих и уникальных сайтов рестрикции По результатам анализа этих данных были подобраны и синтезированы праймеры для амплификации ДНК HSP70, соответствующей подсемейству белков теплового шока HSP70A1 Тотальную РНК выделяли из лимфоцитов человека после теплового шока Комплементарную ДНК (кДНК) гена HSPA1B человека синтезировали на мРНК с помощью обратной транскриптазы мышиного вируса лейкемии Молони (RT M-MuLV) Амплификацию кДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя две пары праймеров, в результате чего получили два перекрывающихся фрагмента ДНК HSP70A1B N-концевой фрагмент (1068 по) и С-концевой фрагмент (895 по), примерно соответствующие АТР- и пептид-связывающим доменам белка [Tsai М et al, 1994] Фрагменты клонировали по Smal-сайту в плазмиде pUC19 с последующим секвенированием Полноразмерную последовательность транслируемой области гена HSPA1B получали лигированием фрагментов по сайту PstI, находящегося в области перекрывания этих фрагментов Плазмиду pUC-HSP70AlB с нуклеотидной последовательностью, соответствующей гену HSPA1B, рестриктировали ферментами Ndel и Hindlll ДНК, соответствующую полноразмерной последовательности транслируемой области гена HSPA1B, встраивали в полилинкер коммерческого экспрессионного вектора рЕТ-28а(+) по указанным сайтам рестрикции (рис 1)

Рис. 1. Схема конструирования экспрессионной плазмиды pET-hHSP70A!B.

Данная генная конструкция позволяет при трансляции получить белок HSP70, который по аминокислотной последовательности соответствует HSP70A1B с несколькими дополнительными аминокислотами naN-конце: Met-Glv-Ser-Ser-(HisV,-Ser-Ser-Glv-IeM-Fa/-Pro-^rg-G/v-5er-His-Met-Glv-Ser (далее обозначаемый His-tag). Размер белка составляет 663 аминокислотных остатков или 72.33 кДа. Сайты узнавания и расщепления тромбином (выделены курсивом и подчеркиванием, соответственно) позволяют при необходимости удалить лишние аминокислоты. Введение С- и N- концевых сайтов рестрикции Sali и BamHl на уровне генной конструкции pET-hHSP70AlB (рис. 1) дает возможность создания гибридных (fusion) белков, имитирующих комплексы Н8Р70-антиген.

1.1.2. Клонирование фрагмента гена альфа-фетопротеина человека,

соответствующего третьему домену белка (AFP3D), в рЕТ-28а(+).

Для определения отсутствующих и уникальных сайтов рестрикции с помощью компьютерной программы DNA-SUN была получена рестрикционная карта ДНК-последовательности альфа-фетопротеина человека (AFP) на основе известной последовательности мРНК AFP человека (GenBank NM_001134). Тотальную РНК выделяли из клеток продуцирующей альфа-фетопротеин гепатоцеллюлярной карциномы человека линии HepG2. Комплементарную ДНК (кДНК) гена AFP человека синтезировали на мРНК с помощью обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц (RT AMV). Для получения рекомбинантного третьего домена AFP (AFP3D) соответствующий фрагмент гена клонировали в плазмидном векторе рЕТ-28а(+) под контролем промотора бактериофага Т7. Фрагмент ДНК, кодирующий AFP3D, получали методом ПЦР, используя в качестве матрицы кДНК альфа-фетопротеина человека. Для амплификации были использованы два олигонуклеотидных праймера: смысловой праймер 5'tttt CCA TGG GAT ACC AGG AGT TAT TG 3', содержащий сайт узнавания рестриктазой Ncol (подчеркнут), и антисмысловой праймер 5'tttt СТС GAG ААС ТСС CAA AGC AGC АС 3', содержащий сайт Xhol (подчеркнут). Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК клонировали в вектор рЕТ-28а(+) по рестрикционным сайтам Ncol-Xhol (рис. 2). Данная генная конструкция позволяет при трансляции получить белок AFP3D, который по аминокислотной последовательности соответствует третьему домену молекулы AFP с метионином на N-конце и Leu-Glu-(Hís)6 на С-конце.

His-Tag \

__-V«o 1 (Sus)

Т! promoter

PÄFP28D3

(5938Ьр)

orí

led

Рис. 2. Экспрессионная плазмидная ДНК, кодирующая рекомбинантный третий домен альфа-фетопротеина человека (AFP3D).

1.2. Экспрессия рекомбинантных генов. Очистка белков.

1.2.1. Получение рекомбинантного HSP70A1B.

Плазмидную ДНК pET-hHSP70AlB трансфицировали в клетки E.coli BL21(DE3). Выбранный по результатам секвенирования штамм-продуцент BL21(DE3)/pET-hHSP70AlB выращивали на канамицин-содержащей среде, синтез белка индуцировали добавлением изопропил-р-О-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Уровень экспрессии целевого белка (~72 кДа) составлял от 40 до 50% от общего клеточного белка, что показал электрофорез в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (рис. 3). В отличие от описанных ранее систем экспрессии HSP70A1L [Jindal S. et al., 1995], где основная масса рекомбинантного белка нарабатывалась в E.coli в виде нерастворимых телец включения, нами получен штамм, продуцирующий рекомбинантный HSP70A1B как в растворимой форме, так и в виде телец включения, причем примерно в равном соотношении (рис. 3).

кДа М 1 2 3 4

Рис. 3. Электрофореграмма в 12% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия. Лизаты клеток штамма-продуцента E.coli BL21(DE3)/pET-hHSP70AlB: до индукции (1), после индукции ИПТГ (2); растворимая фракция (3); тельца включения (4); М-белковые маркеры молекулярной массы.

Клеточные осадки подвергали ультразвуковой дезинтеграции, осаждали центрифугированием и собирали супернатант (растворимая фракция белка), а из осадков получали тельца включения. Выделение белка HSP70A1B, проводимое из обеих фракций независимо, было основано на аффинной хроматографии с использованием иминодиацетат-сефарозы, активированной ионами никеля, что стало возможным благодаря введению в состав белка последовательности из шести остатков гистидина. Это значительно упрощает выделение рекомбинантного белка и предотвращает контаминацию DnaK -

97 66.2

бактериальным аналогом эукариотического HSP70, что особенно важно при исследовании иммунологических свойств рекомбинантных HSPs человека.

Белок HSP70A1B, находящийся в растворимой фракции, не требует рефолдинга, что дает возможность нарабатывать его без значительных затрат времени и в больших количествах - не менее 30 мг с литра бактериальной культуры. Выделенный белок из солюбилизированных гуанидинхлоридом телец включения восстанавливали Р-меркаптоэтанолом и ренатурировали последовательным диализом против буферов Е (0.1М Трис-HCl, 0.5М NaCl, 2мМ ЭДТА, рН 8.0) и F (0.05М Трис-HCl, 0.15М NaCl, рН 8.0) для удаления детергента. Выход белка составлял 10-12 мг с литра бактериальной культуры.

Чистота выделенного белка в обоих случаях составляла не менее 90% (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма препаратов рекомбинантного Н8Р70А1В в 12% ПААГ с додецилсульфатом натрия в восстанавливающих условиях. А. Выделение Н8Р70А1В из растворимой фракции: супернатант из штамма Е.соИ ВЬ21(ВЕЗ)/рЕТ-ЬШР70А1В после обработки ультразвуком (1); НВР70А1В после аффинной хроматографии на М2+-сефарозе (2). Б- Н8Р70А1В, выделенный из телец включения: суспензия телец включения после обработки ультразвуком (1); Н5Р70АШ после аффинной хроматографии на №2~-сефарозе (2); М - белковые маркеры молекулярной массы.

Соответствие очищенного белка семейству НБР70 подтверждено данными электрофореза в градиентном полиакриламидном геле (5-20%) и иммуноблота с использованием моноклональных антител к НБР70 человека (рис. 5).

Рекомбинантный Н8Р70А1В подвергали ферментативному протеолизу тромбином для удаления His-tag (см. п. 1.1.1.) с получением белка Н8Р70А1В* молекулярной массы 70.45 кДа.

кДа М 1 2 3

Рис. 5. Анализ HSP70A1B с помощью электрофореза в градиентном ПААГ (1) с последующей детекцией моноклональными антителами к HSP70 человека (2) и моноклональными антителами к MIS (Mullerian Inhibiting Substance) в качестве контроля (3); М-белковые маркеры молекулярной массы.

Подавляющая часть сведений, касающихся свойств белков теплового шока в качестве противоопухолевых вакцин, получена в экспериментах с использованием природных HSPs [Srivastava Р.К. et al., 1997]. Такие методики включают в себя накопление и гомогенизацию ткани, экстракцию целевого белка, а также фракционирование препарата с помощью нескольких хроматографических стадий. Основными недостатками получения HSPs из природных источников являются необходимость накопления опухолевых тканей, трудоемкость процесса выделения, малый конечный выход и не всегда достаточная степень чистоты и гомогенности полученных препаратов. Функции индивидуальных белков различных семейств HSPs до сих пор мало изучены, а исследование и их практическое использование требует препаративного количества высокоочищенных белков (или отдельных доменов). В связи с этим, представляется перспективным использование созданного нами высокоэффективного штамма E.coli BL21(DE3)/pET-hHSP70AlB для получения по упрощенной технологии и с высоким выходом рекомбинантного HSP70A1B человека.

1.2.2. Получение рекомбинантного AFP3D.

Для создания штамма-продуцента третьего домена альфа-фетопротеина человека рекомбинантной плазмидой pAFP28D3 были трансформированы компетентные клетки E.coli BL21(DE3), имеющие хромосомную копию гена Т7 РНК-полимеразы под контролем промотора lac UV5, индуцируемого изопропил-р-О-тиогалактопиранозидом (ИПТГ).

Синтез рекомбинантного белка тестировали методом электрофореза в присутствии Целевой белок (-27 кДа) накапливался в клетках в виде телец включения с высоким выходом (рис. 6).

кДо Ь; 1 'г 2

ОС

-15

20 2'1

Рис. 6. Экспрессия гена АРРЗЭ. Результаты электрофореза в 13% ПААГ в присутствии ББв. Суммарные белки клеток Е.соИ, трансформированных плазмидой рАРР2803: без индукции (1), индукция ИПТГ (2); тельца включения (3); М-маркеры молекулярной массы.

Выделенные тельца включения растворяли в буфере, содержащем 6М гуанидинхлорид, и подвергали очистке методом аффинной хроматографии на иминодиацетат-сефарозе, активированной ионами никеля. Связавшийся белок элюировали буфером, содержащем О.ЗМ имидазол и рефолдировали последовательным диализом относительно буферов Е (0.1М Трис-НС1, 0.5М МаС1, 2мМ ЭДТА, рН 8.0) и Р (0.01М Трис-НС1, 0.15М ЫаС1, рН 8.0). Диализованный белок концентрировали на ячейке Агтсоп, фракционировали на колонке Бирегёех™ 200, элюируя буфером Р. Бьшо выделено две фракции: фракция I соответствует димеру, фракция II - мономеру АРРЗО (рис. 7). Как видно из хроматограммы, эффективность получения мономера II достигает 40% от суммарного белка.

10 00 15.00 20.00 25.00 30.00 35,00 Время, мин

Рис. 7. Профиль ЭЛЮЦИИ суммарного белка после рефолдинга с колонки Зирегёех™ 200 (детектор 280 нм): I - димер АБРЗО, II - мономер АРРЗБ.

Для оценки гомогенности очищенных фракций белка проводили электрофорез в 13% полиакриламидном геле в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях; чистота мономера составляла не менее 98% (рис. 8).

«Дг 1 2 V 3 4

Рис. 8. Очистка рекомбинантного AFP3D человека. Результаты элеорофореза в 13% ПААГ в присутствии SDS. Препараты димерной (1, 3) и мономерной (2. 4) фракций AFP3D без восстановления (1, 2) и с восстановлением Р-меркаптоэтанолом (3, 4); М-маркеры молекулярной массы.

Следует отметить, что определяемая на электрофорезе полоса целевого мономера соответствует ~24 кДа, что не отвечает расчетной молекулярной массе - 27 кДа. Реальная масса AFP3D была определена масс-спектрометрически (MALDI-TOF). Оказалось, что около 70% белка имеет массу 27.058 кДа, а остальная часть - 27.200 кДа (рис. 9). Разница, составляющая около 150 Да, соответствует молекулярной массе N-концевого метионина, отщепляющегося в процессе клеточного биосинтеза. Конечный выход высокоочищенной мономерной формы AFP3D составил 5 мг с литра бактериальной культуры.

Intens. |arb]

1250 1000 750 500 250

27058.35

10000 25000 30000 35000 m/2

Рис. 9. MALDI-TOF-масс-спектр рекомбинантного AFP3D.

Выделение и очистка природного альфа-фетопротеина - весьма трудоемкий и дорогостоящий процесс, который требует использования моноклональных антител и значительное количество исходного материала Получение рекомбинантного альфа-фетопротеина связано со значительными трудностями ввиду его высокой молекулярной массы и наличия углеводных компонентов и внутримолекулярных дисульфидных связей В значительной мере избежать этих затруднений позволяет использование генно-инженерных конструкций, обеспечивающих продукцию не целого белка, а его биологически активных фрагментов В данной работе нами разработан технологический метод получения рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека, способного заменить использование как природного, так и рекомбинантного полноразмерного альфа-фетопротеина в качестве вектора для направленной доставки цитотоксических препаратов

2. Определение активности рекомбинантных белков.

2.1. Исследование функциональной активности НБР70А1В.

Известно, что белки теплового шока в качестве шаперонов обеспечивают стабилизацию нативной конформации различных клеточных белков, их внутриклеточную транслокацию в различные компартменты клетки, используя активный АТР-зависимый конформационный процесс [Най1 Б и е1 а1, 1996] Колориметрическим методом определили, что 1 мг рекомбинантного ШР70А1В человека (как выделенного из растворимой фракции, так и рефолдированного) гидролизует 2-4 нмоль АТР/мин при 30°С, что указывает на биологическую активность целевого продукта Также показано, что более 60% ШР70А1В (равно как и Н8Р70А1В*, не содержащий Н184а§) связывается с АОР-агарозой, т е имеет нативную конформацию АТР-связывающего домена

Помимо шаперонных функций ЕВР70 может принимать участие в развитии противоопухолевого иммунитета, обусловленного взаимодействием антигенпредставляющих клеток (АПК) с НБР70 путем рецептор-опосредованного эндоцитоза через рецепторы СБ91, СБ40, ЬОХ и некоторые

другие [Arnold-Schild D. et al, 1999]. После интернализации связанные с HSP70 экзогенные белки и пептиды (в том числе опухолеспецифические) высвобождаются из эндосом в цитоплазму, подвергаются процессингу и образуют комплексы с молекулами МНС I, обеспечивая тем самым возможность индукции специфического клеточного иммунного ответа.

Для исследования способности рекомбинантного HSP70A1B к связыванию и эндоцитозу в качестве АПК были выбраны незрелые дендритные клетки, а в качестве метода детекции - проточная цитофлуориметрия. Препараты рекомбинантных HSP70A1B и HSP70A1B*, предварительно меченные флуресцеинизотиоцианатом (FITC), инкубировали с дендритными клетками при двух температурных режимах: +4°С в присутствии азида натрия и +37°С. Известно, что при +4°С мембранные рецепторы взаимодействуют со своими лигандами, однако интернализация образующихся комплексов наблюдается только при +37°С.

Как видно по уровню флуоресценции клеток (рис. 10), происходит не только связывание HSP70A1B и HSP70A1B* со специфическими рецепторами, представленными на используемых дендритных клетках, но и очень активный процесс интернализации (эндоцитоз) белковых препаратов. При этом, судя по сопоставимым средним значениям интенсивности флуоресценции (MFI), не были выявлены существенные различия между HSP70A1B и HSP70A1B*, что подтверждает предположение об отсутствии влияния His-tag не только на конформацию АТР-связывающего домена полученного нами рекомбинантного белка, но и на его способность к связыванию и эндоцитозу АПК.

0,5 0

3,5 3 2,5 2

1,5

1 □ связывание

ЕЗ ЭНДОЦИТОЗ

Рис. 10. Связывание и эндоцитоз незрелыми дендритными клетками рекомбинантного Н8Р70А1В (20 мкг/мл), Н5Р70А1В* (без ЬПэ^, 20 мкг/мл). средняя интенсивность флуоресценции, отн.ед.

HSP70A1B

Таким образом, представленные результаты о способности полученного нами рекомбинантного HSP70A1B человека гидролизовать АТР, связываться с рецепторами и проникать в антигенпрезентирующие клетки путем эффективного эндоцитоза, являются качественной характеристикой белка для потенциального проявления противоопухолевого иммунитета

2.2. Исследование функциональной активности AFP3D*. 2.2.1. Связывание и захват FITC-меченного AFP3D опухолевыми клетками и лимфоцитами.

На данном этапе мы исследовали способность полученного нами рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина к связыванию со специфическим рецептором AFP на поверхности опухолевых клеток человека и последующему рецептор-опосредуемому эндоцитозу Для исследования связывания клетки инкубировали с флуоресцентно-меченным AFP3D (AFP3D-FITC) при +4°С в течение часа, отмывали, фиксировали и измеряли флуоресценцию клеток на проточном цитофлуориметре Было показано, что AFP3D-FITC связывается с опухолевыми клетками (карциномами яичника линии SKOV3 и молочной железы линии MCF-7) и практически не связывается с нестимулированными лимфоцитами периферической крови (рис 11)

+4°С

-■- SKOV3 -*- MCF-7

лимфоциты

У5

0 01 01 1 концентрация AFP30, мкМ

Рис 11. Связывание АРРЗО-НТС с клетками карциномы яичника человека БКОУЗ, аденокарциномы молочной железы МСБ-7 и нормальными лимфоцитами периферической крови здоровых доноров

Эксперименты по связыванию FITC-меченого AFP3D с клетками в присутствии природного альфа-фетопротеина человека подтвердили специфичность связывания AFP3D с рецептором AFP Интенсивность

Данная часть работы проводилась при участии вне Московского НИИ медицинской экологии, к б н Г А Посыпановой

флуоресценции клеток, обработанных AFP3D-FITC (до концентрации 1 мкМ) была близка к флуоресценции клеток, обработанных AFP-FITC (рис. 12а). Для исследования специфичности связывания, клетки SKOV3 инкубировали с AFP3D-FITC в присутствии 30-кратного избытка AFP человека в течение часа при +4°С. Инкубация SKOV3 в этих условиях приводила к значительному снижению связывания AFP3D-FITC с опухолевыми клетками (рис. 126). Из рисунка видно, что природный AFP в значительной степени ингибировал связывание AFP3D-FITC с клетками. Эти данные подтверждают, что AFP3D действительно связывается с рецептором AFP на опухолевых клетках и конкурирует с AFP за сайт связывания.

-«-AFP3D -№-AFP3D+AFP -•- специфическое связывание

-1'

0.01 0.1 1 0.01 0.1 1 концентрация, мкМ концентрация, мкМ

Рис. 12. а) Сравнение связывания AFP-FITC и AFP3D-FITC с клетками карциномы яичника человека SKOV3; б) Ингибирование связывания AFP3D-FITC 30-кратным избытком AFP с клетками карциномы яичника человека SKOV3 (инкубация 1 ч, +4°С).

Исследование захвата AFP3D-FITC опухолевыми клетками и

лимфоцитами периферичекой крови человека показало, что опухолевые линии

MCF-7 и SKOV3 активно эндоцитируют AFP3D-FITC (рис. 13), причем

4л

+37°С

■-SKOV3 S-MCF-7 - лимфоциты

а-'"'

Рис. 13. Накопление АРРЗР-Р1ТС в клетках карциномы яичника человека вКОУЗ, аденокарциномы молочной железы МСР-7 и в нормальных лимфоцитах периферической крови здоровых доноров.

0.1 1 концентрация AFP3D, мкМ

особенно высоким захват был в клетках аденокарциномы яичника БКОУЗ, В лимфоцитах эндоцитоз АРРЗО-НТС практически отсутствовал. Эти данные хорошо коррелируют с полученными ранее результами по связыванию и эндоцитозу природного полноразмерного альфа-фетопротеина человека опухолевыми клетками линий МСР-7, БКОУЗ и лимфоцитами [Ницветов М.Б. и др., 2001].

Исследование препаратов клеток БКОУЗ через 24 часа после инкубации с АРРЗО-Р1ТС с помощью флуоресцентной микроскопии подтвердило, что клетки активно захватывают АРРЗО-Р1ТС (рис. 14).

а) б) в)

Рис. 14. Распределение AFP3D-FITC в клетках карциномы яичника человека линии SKOV3 после 24 ч инкубации: а) зеленая флуоресценция FITC-меченого AFP3D, б) ядро клетки, окрашенное Hoechst, с) фазовый контраст (фотография любезно предоставлена Г.А. Посыпановой).

Интересно, что в отличие от AFP-FITC, флуоресценция наблюдалась не только в цитоплазматических компартментах (эндосомах, мульти-везикулярных тельцах, комплексе Гольджи), окружающих ядро [Alava М.А. et al., 1999], но и в клеточных ядрах. По-видимому, это связано с тем, что в рекомбинатном третьем домене экспонируется на поверхность один (или более) из так называемых сигналов ядерной локализации, который маскируется в молекуле AFP вторым и первым доменами.

Способность AFP3D селективно связываться, эффективно эндоцитировать в опухолевые клетки и конкурировать с молекулами природного альфа-фетопротеина за рецептор указывает на то, что структура рецептор-связывающего участка полученного нами рекомбинантного домена белка не претерпела существенных изменений.

2.2.2. Ингибирование эстрадиол-зависимой пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 in vitro. Одним из параметров биологической активности альфа-фетопротеина является его способность ингибировать эстрадиол-индуцированный рост гормон-зависимых опухолевых клеток как in vivo, так и in vitro [Bennett J. A. et al., 1997]. Мы исследовали влияние AFP3D на Е2-активированную пролиферацию клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 in vitro. Для этого клетки MCF-7 инкубировали до достижения монослоя в среде DMEM без фенолового красного, содержащей 5% бычью сыворотку новорожденных (NBS, СЕ2<3 пг/мл). Для стимуляции пролиферации к клеткам добавляли Е2 в концентрации 10"9 М. В этих условиях через 72 часа стимуляция пролиферации клеток, оцениваемая по включению [3Н]-тимидина в ДНК, составляла в среднем 165% от контроля. При одновременном с Е2 добавлении к клеткам AFP или AFP3D в диапазоне концентраций 10"п-10"6 М включение [3Н]-тимидина значительно снижалось (117±5,85% для AFP и 120±4.8% для AFP3D) (рис, 15). Ингибирование проявлялось при низких концентрациях белков; при повышении концентрации до 10"8 М эффект исчезал.

180

I 170

b =

Л 160-

Í 150 =

S "о

I 130

I 120

-.-AFP -.-AFP3D — 10"9МЕ, 5% NBS

Рис.15. Ингибирование Е2-зависимой стимуляции пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7.

1Е-11 1Е-10 IE-9 1Е-8 1Е-7 1Е-6 концентрация,М

2.2.3. Исследование цитотоксической активности конъюгата AFP3D-Таксол.

Исследование биологической активности полученного нами рекомбинантного третьего домена AFP подтвердило, что AFP3D обладает такими важными свойствами полноразмерного AFP, как способность

связываться со специфическим рецептором AFP и ингибировать пролиферацию эстроген-зависимых клеток in vitro

Ранее было показано, что конъюгаты AFP человека с доксорубицином [Severin SE et al, 1996], и некоторыми другими противоопухолевыми лекарствами [Severin SE et al, 1997] эффективно подавляют рост опухолевых клеток как т vitro, так и in vivo Однако широкое применение AFP в качестве универсального белка-транспортера лекарственных соединений в раковые клетки ограничено тем, что выделение в достаточных для производства лекарственных препаратов количествах AFP сопряжено с технологическими трудностями

С целью изучения возможности использования рекомбинантного биологически активного AFP3D в качестве вектора для направленного транспорта химиопрепаратов нами был синтезирован конъюгат AFP3D с таксолом - цитотоксическим агентом, широко применяющимся в медицинской практике при лечении больных раком молочной железы, яичников, немелкоклеточным раком легкого

Таксол (международное название - паклитаксел, химическая формула показана на рис 16) - самый изученный представитель таксанов, фармакологическое действие которых заключается в стимуляции полимеризации клеточного белка тубулина и в образовании чрезмерного количества дефектных микротрубочек Следствием нарушения функции микротрубочкового аппарата опухолевой клетки является блокирование процесса ее деления, а также повреждение цитоскелета, приводящее к нарушению подвижности, внутриклеточного транспорта и передачи трансмембранных сигналов

В связи с этим, представляется перспективным использование рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина в качестве вектора, конъюгированного с таксолом, для направленной доставки цитотоксического препарата непосредственно в клетки опухоли

АГРЗБ

Конъюгат АРРЗО-Таксол

Рис. 16. Схема синтеза конъюгата третьего домена альфа-фетопротеина с таксолом

Конъюгат AFP3D с таксолом был получен с использованием ангидрида глутаровой кислоты для модификации таксола Схема получения конъюгата приведена на рис 16 Из литературных данных известно, что реакция таксола с ангидридами янтарной или глутаровой кислот при комнатной температуре в растворе пиридина дает С2'-монопроизводное таксола, т к именно гидроксильная группа при С2'-положении является наиболее реакционноспособной по сравнению с другими группами молекулы таксола [Deutsch HM et al, 1989] Показано также, что модификация С2'-положения молекулы не влияет на цитотоксичность таксола [Lataste Н et al, 1984] Таким образом, для осуществления синтеза не требуется предварительного введения защитных групп и специфических условий проведения реакции, что значительно упрощает и удешевляет технологию получения исследуемого конъюгата

Соотношение компонентов в конечном продукте оценивали на основе результатов фотометрического определения белка с использованием медного комплекса бицинхониновой кислоты [Wiechelman К J et al, 1988] и определения количества таксола с помощью ВЭЖХ Молярное соотношение AFP3D Таксол составило 1 1 5, т е конъюгат содержал 1-2 молекулы таксола, ковалентно связанных с одной молекулой рекомбинантного белка

Полученный конъюгат исследовали на наличие специфической цитотоксической активности (ЦТА) in vitro на культуре клеток карциномы молочной железы линии MCF-7 Конъюгат AFP3D-Tajccon проявлял дозозависимую ЦТА в отношении указанной линии опухолевых клеток, при этом ЦТА исследуемого конъюгата была сравнима с активностью конъюгата AFP-Таксол (рис 17)

Конъюгаты АРРЗО-Таксол и AFP-Таксол оказались не токсичнее свободного таксола (рис 17), что, по-видимому, связано с тем, что эффективность реализации их цитотоксического действия in vitro в значительной мере определяется количеством рецепторов векторного белка на

поверхности опухолевых клеток, различиями в сродстве вектора к его рецептору, а также скоростью рецептор-опосредованного эндоцитоза.

I MCF-7

1001С—

ICyi, мкМ ---

-■-Таксол 0.017

AFP- Таксол 0.078 -А AFP3D- Таксол 0.106

Рис. 17. Выживаемость клеток MCF-7 после их инкубации с таксолом и его конъюгатами с AFP и AFP3D.

10 100 1000 концентрация таксола, нМ

Следует учитывать, что in vivo противоопухолевые лекарственные соединения (в частности, таксол) легко проникают не только в опухолевые, но и во все типы нормальных клеток, что является причиной возникновения широкого спектра побочных эффектов. В противоположность этому, конъюгаты AFP-Таксол и АРРЗБ-Таксол будут проникать, главным образом, в опухолевые клетки, гиперэкспрессирующие рецептор альфа-фетопротеина, поэтому их цитотоксическое действие на нормальные клетки будет минимальным. Поэтому, несмотря на большие значения ЦТА конъюгатов по сравнению с ЦТА свободного таксола in vitro, преимущество конъюгатов при их терапевтическом применении in vivo представляется очевидным.

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что полученный нами рекомбинантный третий домен альфа-фетопротеина AFP3D обладает высоким векторным потенциалом (очень близким к потенциалу полноразмерной молекулы природного AFP) для доставки цитотоксических химиопрепаратов в клетки злокачественных опухолей. При этом нормальные клетки поражаются подобными препаратами в значительно меньшей степени, что дает возможность практического использования уникальных свойств AFP3D для создания новых эффективных препаратов для лечения злокачественных новообразований.

выводы

1 Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pET-hHSP70AlB, а также создан высокоэффективный штамм-продуцент Е coli BL21(DE3)/pET-hHSP70A!B, который позволяет осуществлять получение по упрощенной технологии белка теплового шока человека HSP70A1B, относящегося к шаперонному семейству HSP70

2 Продемонстрировано, что рекомбинантный HSP70A1B обладает биологической (АТР-гидролизующей) активностью, способен связываться и активно интернализоваться дендритными клетками, подтверждая свои потенциальные иммуномодулирующие свойства

3 В экспрессионной системе Е coli получен рекомбинантный фрагмент альфа-фетопротеина человека, соответствующий третьему домену белка (AFP3D) и разработан технологический метод его получения

4 Исследована биологическая активность рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека Показано, что AFP3D обладает такими важными свойствами полноразмерного AFP, как способность связываться со специфическим рецептором AFP на опухолевых клетках и ингибировать пролиферацию эстроген-зависимых клеток ш vitro

5 Синтезирован конъюгат рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека AFP3D с противоопухолевым препаратом (таксол), который обладает цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток линии MCF-7 Это дает возможность практического использования AFP3D в качестве вектора для создания новых эффективных средств направленной доставки для лечения злокачественных новообразований

Список публикаций

1 Савватеева JIB , Гороховец НВ, Черников В А Данилевский МИ, Северин СЕ Получение рекомбинантного HSP70A1B человека Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2007, №3, с 38-42

2 Гороховец НВ, Савватеева JIB. Северин ЕС, Северин СЕ Рекомбинантная плазмидная ДНК pET-hHSP70, кодирующая белок теплового шока человека HSP70, и штамм Ecoli BL21 (DE3)/pET-hHSP70-продуцент белка теплового шока человека HSP70 Заявка на выдачу патента РФ №2006140913 от 21 11 2006

3 Savvateeva L. Gorokhovets N, Makarov V, Posypanova G, Severn S Recombinant third domain of human alpha-fetoprotein selectivity and antitumor activity of conjugate with Taxol Abstracts of the XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM), Rhodes, Greece, September 24-28, 2005, p 84

4 Savvateeva L. Gorokhovets N, Posypanova G, Makarov V Recombinant domain III of human alpha-fetoprotem-new vector for antitumor drug delivery Abstracts of the 19th Meeting of the European Association for Cancer Research (EACR), Budapest, Hungary, July 1-4,2006, p 86

5 Савватеева JIB . Гороховец НВ, Черников В А Данилевский М И, Северин С Е Получение рекомбинантного HSP70 человека Тезисы докладов Российского Медицинского Форума-2006 «Фундаментальная наука и практика», Москва, 18-20 октября, 2006, с 119

6 Savvateeva LV, Gorokhovets NV, Chernikov VA, Danilevskiy MI, Severin SE Recombinant human HSP70 and its potential application m cancer immunotherapy Abstracts of the International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop "New Technologies in Medicine and Experimental Biology", Bangkok-Pattaya, Thailand, February 28-March 8, 2007, p 62

Подписано в печать 08 11 2007 г Исполнено 09 И 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 965 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Савватеева, Людмила Владимировна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ б

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Белки теплового шока

1.1. Общая характеристика HSPs

1.1.1. Молекулярная структура HSP

1.1.2. Генная регуляция и стимуляция индукции HSPs

1.1.3. Шаперонные функции HSP70 1 б

1.2. Иммуномодулирующие функции HSP

1.2.1. Рецепторы белков теплового шока

1.2.2. Активация адаптивного иммунитета

1.2.3. Активация природного иммунитета

1.3. Стратегии создания противоопухолевых вакцин на основе HSPs

2. Альфа-фетопротеин

2.1. Молекулярная структура и основные функции AFP

2.2. Мембранные рецепторы AFP

2.3. Клинический потенциал AFP и его фрагментов

2.3.1. Системы направленного транспорта лекарственных препаратов на основе AFP

2.3.2. Биологическая активность пептидных фрагментов AFP

2.3.3. AFP как регулятор роста

II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. HSP

1.1. Клонирование гена HSP70 в плазмидных векторах

1.2. Экспрессия рекомбинантного гена и очистка белка

1.3. Исследование функциональной активности HSP70A1B

2. Третий домен AFP (AFP3D)

2.1. Клонирование, экспрессия и выделение рекомбинантного AFP3D

2.2. Исследование функциональной активности AFP3D

2.2.1. Связывание и захват FITC-меченного AFP3D опухолевыми клетками и лимфоцитами

2.2.2. Ингибирование эстрадиол-зависимой пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 in vitro 61 2.3. Изучение противоопухолевого потенциала AFP3D, конъюгированного с таксолом

2.3.1. Получение конъюгата AFP3D с таксолом

2.3.2. Исследование цитотоксической активности конъюгата

AFP3D с Таксолом

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым эффектом"

Актуальность проблемы. В настоящее время злокачественным новообразованиям принадлежит второе место среди заболеваний, приводящих к летальному исходу. Недостаточная эффективность и избирательность существующих методов лечения рака делают крайне актуальной проблему поиска новых, более действенных и высокоспецифичных методов диагностики и противоопухолевой терапии. Разработка и исследование комбинаций лекарственных средств, принадлежащих к различным классам и действующих на разные клеточные мишени, представляются перспективными в успешном лечении онкологических заболеваний.

В предупреждении и элиминации развившихся опухолей большие надежды связывают с развитием иммунотерапии, которая подразумевает разработку стратегий для разрушения опухолей путем проявления противоопухолевого иммунитета. Так, успешно развивается цитокиновая терапия, специфическая иммунотерапия (вакцинация), адаптивная иммунотерапия (использование опухолеспецифических Т-клеток или моноклональпых антител), используется ряд антигенных систем, широко исследуются методы стимуляции гуморального и/или клеточного иммунных ответов, тестируются различные адъювапты. Показано, что белки теплового шока (НБРэ) играют важную роль в иммунном ответе, что дало основание использовать некоторые НБРв в качестве вакцин в иммунотерапии рака. Иммунологическое функционирование НБРв, которое получило наиболее пристальное внимание, основано на их способности перемещать антигены (в том числе опухолеспецифические) к антигенпрезентирующим клеткам (АПК), обуславливая процесс кросс-презентации. Было идентифицировано несколько рецепторов на поверхности АПК (СБ91, ШХ1, БЯ-А), обеспечивающих захват комплексов НБРэ-антиген путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Также обнаружено, что взаимодействие НБР-АПК независимо от переносимых антигенов приводит к увеличению количества ко-стимуляторных молекул на антигенпрезентирующих клетках и секреции воспалительных цитокинов, а взаимодействие НБРэ с некоторыми рецепторами (ТЬИ, СБ40) вызывает активацию дендритных клеток (ДК) и трансдукционных сигналов. Таким образом, ШРэ выступают в качестве "сигналов опасности" и активируют природный иммунный ответ, который играет важную роль в генерации опухолеспецифических цитотоксических лимфоцитов и подавлению опухоли. Эти уникальные иммуностимулирующие свойства НБРэ (способность интегрировать природный и адаптивный иммунитет) позволяют использовать их в качестве адъювантов для разработки иммунотерапевтических средств. Получение рскомбинаптных белков теплового шока человека позволяет нарабатывать их в количествах, необходимых для более детального изучения их иммуномодулирующей активности и развития исследований по созданию на их основе новых противоопухолевых вакцин.

Альтернативным подходом в решении указанной проблемы является поиск и изучение новых универсальных опухолевых маркеров, которые могли бы стать основой для создания чувствительных диагностических исследований и мишенью для разработки новых способов направленной противоопухолевой терапии. Предпочтением для выбора можно считать опухолеспецифические антигены, которые должны быть белками-рецепторами, избирательно или преимущественно представленными на опухолевых клетках. Известно, что эукариотические клетки путем эндоцитоза могут захватывать вместе с белковым вектором действующие агенты высокой эффективности и специфичности, в других условиях лишенные возможности проникать в клетку. Мишенью для направленного транспорта могут быть рецепторы онкофетальных белков, а в качестве вектора могут выступать сами онкофетальные белки. Этот путь направленной доставки предполагает включение механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза (receptor-mediated endocytosis, RME). Создание конъюгатов цитотоксических агентов и различных векторных молекул имеет большие перспективы. С помощью различных кросс-сшивающих агентов образуются ковалентные связи между молекулами белкового вектора и терапевтически активными агентами, например, цитотоксическими препаратами, применяемыми в химиотерапии. Использование механизма RME для доставки в опухолевую клетку конъюгированного цитотоксического препарата позволяет помимо задачи повышения эффективности цитотоксического действия решить проблему селективности и преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Важным элементом поиска векторного агента является подбор таких рецепторных компонентов, которые не экспрессированы на поверхности нормальных соматических клеток, но встречаются значительно чаще на мембранах опухолевых клеток. Наиболее подходящим в этой группе является альфа-фетопротеин (AFP). Физиологическая роль этого белка, главным образом, связана с транспортом жирных кислот и эстрогенов в низкодифференцированные клетки на стадии эмбрионального развития. Уровень экспрессии рецептора AFP в иепролиферирующих клетках очень низок, в то время как на поверхности опухолевых клеток различного происхождения определяется от нескольких сотен до миллиона AFP-рецепторов на клетку. Однако выделение и очистка AFP - весьма трудоемкий и дорогостоящий процесс. Более предпочтительным для адресной доставки цитотоксических агентов представляется использование рецептор-связывающего фрагмента - рекомбинаптного третьего домена AFP в качестве белкового вектора.

Исходя из этого, целью данной работы явилось создание и изучение потенциала в противоопухолевой терапии рекомбинантного белка теплового шока HSP70A1B человека и рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеииа человека (AFP3D). В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

- клонирование и экспрессия в E.coli генных конструкций, осуществляющих биосинтез белка теплового шока HSP70A1B человека и третьего домена альфа-фетопротеина человека (AFP3D);

- разработка технологического метода получения рекомбинантных белков HSP70A1B и AFP3D;

- исследование биологической активности рекомбинантного HSP70A1B по способности взаимодействия с антигенпрезентирующими клетками;

- сравнение биологической активности рекомбинантиого третьего домена альфа-фетопротеина человека AFP3D с активностью природного альфа-фетопротеипа человека;

- синтез цитотоксического конъюгата AFP3D с химиопрепаратом, обеспечивающего направленное воздействие на опухолевые клетки, и исследование его эффективности in vitro.

Научная повита и практическая значимость работы.

Сконструированы плазмидные векторы E.coli, позволяющие эффективно осуществлять индуцированный биосинтез рекомбинантного белка теплового шока человека HSP70A1B и рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека AFP3D в клетках соответствующих штаммов-продуцентов.

Разработаны высокоэффективные методы выделения исследуемых рекомбинантных белков в препаративном количестве.

Исследована биологическая активность рекомбинантного HSP70A1B, а также показана его способность к связыванию со специфическими рецепторами и активному эндоцитозу дендритными клетками.

Продемонстрирована возможность использования рекомбинантиого третьего домена альфа-фетопротеина человека в качестве векторной молекулы для создания противоопухолевых препаратов направленного действия за счет сохранения в AFP3D функциональной активности полиоразмерной молекулы природного альфа-фетопротеина человека.

Синтезирован ковалептный конъюгат рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека с таксолом, и показана высокоспецифическая цитотоксическая активность конъюгата in vitro по отношению к клеткам злокачественной опухоли.

В целохм, данная работа демонстрирует роль, которую рекомбинантные белки человека HSP70A1B и AFP3D могут сыграть в противоопухолевой терапии в качестве иммуномодулятора и вектора для направленной доставки лекарственных средств соответственно, а также подчеркивает необходимость дальнейшего совершенствования систем различного механизма действия с использованием рекомбипантных белков.

Апробация работы. Результаты работы были представлены па следующих симпозиумах и конференциях: XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (Greece, Rhodes, 2005); 19th Meeting of the European Association for Cancer Research (Budapest, Hungary, 2006); Российский Медицинский Форум «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop "New Technologies in Medicine and Experimental Biology" (Bangkok-Pattaya, Thailand, 2007).

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Савватеева, Людмила Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pET-hHSP70AlB, а также создан высокоэффективный штамм-продуцент E.coli BL21(DE3)/pET-hHSP70AlB, который позволяет осуществлять получение по упрощенной технологии белка теплового шока человека HSP70A1B, относящегося к шаперонному семейству HSP70.

2. Продемонстрировано, что рекомбинантный HSP70A1B обладает биологической (АТР-гидролизующей) активностью, способен связываться и активно интерпализоваться дендритными клетками, подтверждая свои потенциальные иммуномодулирующие свойства.

3. В экспрессионной системе E.coli получен рекомбинантный фрагмент альфа-фетопротеина человека, соответствующий третьему домену белка (AFP3D) и разработан технологический метод его получения.

4. Исследована биологическая активность рекомбипантного третьего домена альфа-фетопротеипа человека. Показано, что AFP3D обладает такими важными свойствами полноразмерного AFP, как способность связываться со специфическим рецептором AFP на опухолевых клетках и ингибировать пролиферацию эстроген-зависимых клеток in vitro.

5. Синтезирован конъюгат рекомбипантного третьего домена альфа-фетопротеина человека AFP3D с противоопухолевым препаратом (таксол), который обладает цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток линии MCF-7. Это дает возможность практического использования AFP3D в качестве вектора для создания новых эффективных средств направленной доставки для лечения злокачественных новообразований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Савватеева, Людмила Владимировна, Москва

1. Tissieres A., Mitchell Н.К., Tracy U.M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. J Mol Biol, 1974, 84(3), 389-398.

2. Benjamin I.J., McMillan D.R. Stress (heat shock) proteins: molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. CircRes., 1998, 83(2), 117-132.

3. Parsell D.A., Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins. Annu Rev Genet, 1993,27,437-496.

4. Netzer W.J., Hartl F.U. Protein folding in the cytosol: chaperonin-dependent and -independent mechanisms. Trends Biochem Sci, 1998, 23(2), 68-73.

5. Lindquist S., Kim G. Heat-shock protein 104 expression is sufficient for thermotolerance in yeast. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93(11), 5301-5306.

6. Csermely P., Schnaider Т., Soti C., Prohaszka Z., Nardai G. The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function, and clinical applications. Pharmacol Ther, 1998, 79(2), 129-168.

7. MacRae Т.Н. Structure and function of small heat shock/alpha-crystallin proteins; established concepts and emerging ideas. Cell Mol Life Sci, 2000,57(6), 899-913.

8. Todryk S.M., Melcher A.A., Dalgleish A.G., Vile R.G. Heat shock proteins refine the danger theory. Immunology, 2000, 99, 334-337.

9. Leung, S.-M., Hightower L.E. Mammalian Hsc70 and Hsp70 proteins. In: Guidebook to Molecular Chaperones and Protein Folding Catalysts. Gething, M.-J. (ed.) Oxford University Press, Sambrook & Tooze Imprint, Oxford 1997, 52-58.

10. Hunt C., Morimoto R.I. Conserved features of eukariotic hsp70 genes revealed by comparison with the nucleotide sequence of human hsp70. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82(19), 6455-6459.

11. Caplan A. J., Cyr D. M., Douglas M. G. Eukaryotic homologues of Escherichia coli dnaj: a diverse protein family that functions with hsp70 stress proteins. Mol Biol Cell, 1993, 4, 555563.

12. Jiang J, Prasad K, Lafer EM, Sousa R. Structural basis of interdomain communication in the Hsc70 chaperone. Mol Cell. 2005 Nov 23;20(4):513-24

13. Abravaya K., Phillips В., Morimoto R. I. Heat shock-induced interactions of heat shock transcription factor and the human hsp70 promotor examined by in vivo footprinting. Mol Cell Biol, 1991,11,586-592.

14. Kroeger P. E., Sarge K. D., Morimoto R. I. Mouse heat shock transcription factors 1 and 2 prefer a trimeric binding site but interact differently with the HSP70 heat shock element. Mol Cell Biol, 1993,13,3370-3383.

15. Nakai A., Tanabe M., Kawazoe Y., Inazawa J., Morimoto R. I., Nagata K. HSF4, a new member of the human heat shock factor family which lacks peptides of a transcriptional activator. Mol Cell Biol, 1997,17,469-481.

16. Blake M. J., Buckley A. R., Zhang M., Buckley D. J., Lavoi K. P. A novel heat shock response in prolactin-dependent Nb2 node lymphoma cells. J Biol Chem, 1995, 270, 2961429620.

17. Schlesinger M. J. Heat shock proteins. J Biol Chem, 1990,265, 12111-12114.

18. Kiang J. G., Carr F. E., Burns M. R., McClain D. E. HSP-72 synthesis is promoted by increase in Ca2+.i or activation of G proteins but not pHi or cAMP. Am J Physiol, 1994, 265, 104-114.

19. Heufelder A. E., Wenzel В. E., Bahn R. S. Glucocorticoids modulate the synthesis and expression of 72kDa heat shock protein in cultured Graves' retroocular Fibroblasts. Acta Endocrinol, 1993,128, 41-50.

20. Shi Y., Thomas J. The transport of proteins into the nucleus requires the 70-kilodalton heat shock protein or its cytosolic cognate. Mol Cell Biol, 1992,12,2186-2192.

21. Guidon P. Т., Hightower L. E. Purification and initial characterization of the 71-kilodalton rat heat-shock protein and its cognate as fatty acid binding proteins. Biochemistry, 1986, 25, 3231-3239.

22. Smith D. F., Toft, D. O. Steroid receptors and their associated proteins. Mol Endocrinol, 1993,7,1-11.

23. Edwards D. P., Estes P. A., Fadok V. A., Bona B. J., Onate S., Nordeen S. K., Welch W.J. Heat shock alters the composition of heteromeric steroid receptor complexes and enhances receptor activity in vivo. Biochemistry, 1992,31, 2482-2491.

24. Wainberg Z., Oliveira M., Lemer S., Tao Y., Brenner B. G. Modulation of stress protein (hsp27 and hsp70) expression in CD4+ lymphocytic cells following acute infection with human immunodeficiency virus type-1. Virology, 1997, 233, 364-373.

25. Stewart S.A., Poon В., Jowett J.B., Chen I. S. Human immunodeficiency virus type 1 Vpr induces apoptosis following cell cycle arrest. J Virol, 1997, 71, 5579-5592.

26. Ellis R. J. The molecular chaperone concept. Semin Cell Biol, 1990,1, 1-9.

27. Banecki В., Zylicz M. Real time kinetics of the DnaK/DnaJ/GrpE molecular chaperone machine action .J Biol Chem, 1996, 271, 6137-6143.

28. Buchberger A., Hestercamp S.T., Schonfeld H.J., Bukau B. Substrate shuttling between the DnaK and GroEL systems indicates a chaperone network promoting protein folding. J Mol Biol, 1996, 261,328-333.

29. Hartl F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature, 1996,381, 571-579.

30. Pierpaoli E.V., Sandmeier E., Baici A., Schonfeld H.J., Gisler S., Christen P. The power stroke of the DnaK/DnaJ/GrpE molecular chaperone system. J Mol Biol, 1997,269, 757-768.

31. Palleros D.R., Shi L., Reid K.L., Fink A.L. Hsp70-protein complexes. Complex stability and conformation of bound substrate protein. J Biol Chem, 1994, 269, 13107-13114.

32. McCarty J.S., Buchberger A., Reinstein J., Bukau B. The role of ATP in the functional cycle of the DnaK chaperone system. J Mol Biol, 1995,249, 126-137.

33. Szabo A., Langer Т., Schroder H., Flanagan J., Bukau В., Hartl F.U. The ATP hydrolysis-dependent reaction cycle of the Escherichia coli Hsp70 system DnaK, DnaJ, and GrpE. Proc Natl AcadSci. USA, 1994,91, 10345-10349.

34. Packschies L., Theyssen H., Buchberger A., Bukau В., Goody R.S., Reinstein J. GrpE accelerates nucleotide exchange of the molecular chaperone DnaK with an associative displacement mechanism. Biochemistry, 1997,36, 3417-3422.

35. Takeda S., McKay D.B. Kinetics of peptide binding to the bovine 70 kDa heat shock cognate protein, a molecular chaperone. .Biochemistry, 1996,35,4636-4644.

36. Srivastava P.K., Das M.R. Serologically unique surface antigen of a rat hepatoma is also its tumor-associated transplanta tion antigen. Int J Cancer, 1984,33,417-422.

37. Srivastava P.K., DeLeo A.B., Old L.J. Tumor rejection antigens of chemically induced sarcomas of inbred mice. Proc Natl AcadSci USA, 1986, 83,3407-3411.

38. Udono H., Levey D.L., Srivastava P.K. Cellular requirements for tumor-specific immunity elicited by heat shock proteins: tumor rejection antigen gp96 primes CD81 T cells in vivo. Proc Natl AcadSci USA, 1994, 91, 3077-3081.

39. Basu S., Srivastava P.K. Calreticulin, a peptide-binding chaperone of the endoplasmic reticulum, elicits tumor- and peptide-specific immunity. J Exp Med, 1999, 189(5), 797-802.

40. Wang X.Y., Kazim L., Repasky E.A., Subjeck J.R. Characterization of heat shock protein 110 and glucose-regulated protein 170 as cancer vaccines and the effect of fever-range hyperthermia on vaccine activity. J Immunol, 2001,166(1), 490-497.

41. Ackerman A.L., Cresswell P. Cellular mechanisms governing cross-presentation of exogenous antigens. Nat Immunol, 2004, 5(7), 678-684.

42. Przepiorka D., Srivastava P.K. Heat shock protein-peptide complexes as immunotherapy for human cancer. Mol Med Today, 1998,4(11), 478-484.

43. Chen W., Syldath U., Bellmann K., Burkart V., Kolb H. Human 60-kDa heat-shock protein: a danger signal to the innate immune system. J Immunol, 1999,162(6), 3212-3219.

44. Kol A., Lichtman A.H., Finberg R.W., Libby P., Kurt-Jones E.A. Cutting edge: heat shock protein (HSP) 60 activates the innate immune response: CD 14 is an essential receptor for HSP60 activation of mononuclear cells. J Immunol, 2000,164(1), 13-17.

45. Asea A., Kabingu E., Stevenson M.A., Calderwood S.K. HSP70 peptidembearing and peptide-negative preparations act as chaperokines. Cell Stress Chaperones, 2000, 5(5), 425431.

46. Pockley A.G. Heat shock protein as regulators of the immune response. Lancet, 2003, 362, 469-476.

47. Facciponte J.G., MacDonald I.J., Wang X.Y., Kim H., Manjili M.H., Subjeck J.R. Heat shock proteins and scavenger receptors: role in adaptive immune responses. Immunol Invest, 2005, 34(3), 325-342.

48. Basu S., Binder R.J., Ramalingam T., Srivastava P.K. CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin. Immunity, 2001,14(3), 303-313.

49. Binder R.J., Han D.K., Srivastava P.K. CD91: a receptor for heat shock protein gp96. Nat Immunol, 2000,1(2), 151-155.

50. Herz J., Strickland D.K. LRP: a multifunctional scavenger and signaling receptor. J Clin Invest, 2001,108(6), 779-784.

51. Panjwani N.N., Popova L., Srivastava P.K. Heat shock proteins gp96 and hsp70 activate the release of nitric oxide by APCs. J Immunol, 2002,168(6), 2997-3003.

52. Delneste Y., Magistrelli G., Gauchat J., Haeuw J., Aubry J., Nakamura K., Kawakami-Honda N., Goetsch L., Sawamura T., Bonnefoy J., Jeannin P. Involvement of LOX-1 in dendritic cell mediated antigen cross-presentation. Immunity, 2002,17(3), 353-362.

53. Becker T., HartI F.U., Wieland F. CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of Hsp70-peptide complexes. J Cell Biol, 2002,158(7), 1277-1285.

54. Liu B., Dai J., Zheng H., Stoilova D., Sun S., Li Z. Cell surface expression of an endoplasmic reticulum resident heat shock protein gp96 triggers MyD88-dependent systemic autoimmune diseases. Proc Natl Acad Sei USA, 2003,100(26), 15824-15829.

55. Vabulas R.M., Wagner H., Schild H. Heat shock proteins as ligands of toll-like receptors. Curr Top Microbiol Immunol, 2002, 270, 169-184.

56. Srivastava P. Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses. Annu Rev Immunol, 2002, 20, 395-425.

57. Li Z., Menoret A., Srivastava P. Roles of heat-shock proteins in antigen presentation and cross-presentation. CurrOpin Immunol, 2002,14(1), 45-51.

58. Srivastava P.K., Maki R.G. Stress-induced proteins in immune response to cancer. Curr Top Microbiol Immunol, 1991,167,109-123.

59. Amold-Schild D., Hanau D., Spehner D., Schmid C., Rammensee H.G., de la Salle H., Schild H. Cutting edge: receptormediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen-presenting cells. J Immunol, 1999,162(7), 3757-3760.

60. Wassenberg J.J., Dezfulian С., Nicchitta C.V. Receptor mediated and fluid phase pathways for internalization of the ER Hsp90 chaperone GRP94 in murine macrophages. J Cell Sci, 1999,112(13), 2167-2175.

61. Einstein M.H., Kadish A.S., Burk R.D., Kim M.Y., Wadler S., Streicher H., Goldberg G.L., Runowicz C.D. Heat shock fusion protein-based immunotherapy for treatment of cervical intraepithelial neoplasia III. Gynecol Oncol, 2007,106(3), 453-460.

62. Zheng H., Dai J., Stoilova D., Li Z. Cell surface targeting of heat shock protein gp96 induces dendritic cell maturation and antitumor immunity. J Immunol, 2001,167(12), 6731-6735.

63. Medzhitov R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat Rev Immunol, 2001,1,135-145.

64. Bausinger H., Lipsker D., Ziylan U., Manie S., Briand J.P., Cazenave J.P., Muller S., Haeuw J.F., Ravanat C., de la Salle H., Hanau D. Endotoxin-free heat-shock protein 70 fails to induce APC activation. Eur J Immunol, 2002,32(12), 3708-3713.

65. Gao В., Tsan M.F. Endotoxin contamination in recombinant human heat shock protein 70 (Hsp70) preparation is responsible for the induction of tumor necrosis factor alpha release by murine macrophages. J Biol Chem, 2003, 278(1), 174-179.

66. Gao В., Tsan M.F. Recombinant human heat shock protein 60 does not induce the release of tumor necrosis factor alpha from murine macrophages. J Biol Chem, 2003, 278(25), 2252322529.

67. Reed R.C., Berwin В., Baker J.P., Nicchitta C.V. GRP94/gp96 elicits ERK activation in murine macrophages. A role for endotoxin contamination in NF-kappa В activation and nitric oxide production. J Biol Chem, 2003, 278(34), 31853-31860.

68. Wallin R.P., Lundqvist A., More S.H., von Bonin A., Kiessling R., Ljunggren H.G. Heat-shock proteins as activators of the innate immune system. Trends Immunol, 2002, 23(3), 130135.

69. Multhoff G., Pfister K., Gehrmann M., Hantschel M., Gross C., Hafner M., Hiddemann W.A 14-mer Hsp70 peptide stimulates natural killer (NK) cell activity. Cell Stress Chaperones, 2001,6(4), 337-344.

70. Gross C., Hansch D., Gastpar R., Multhoff G. Interaction of heat shock protein 70 peptide with NK cells involves the NK receptor CD94. Biol Chem, 2003,384(2), 267-279.

71. Multhoff G., Mizzen L., Winchester C.C., Milner C.M., Wenk S., Kampinga H.H., Laumbacher B., Johnson J. Heat shock protein 70 (Hsp70) stimulates proliferation and cytolytic activity of NK cells. Exp Hematol, 1999, 27(11), 1627-1636.

72. Multhoff G., Botzler C., Jennen L., Schmidt J., Ellwart J., Issels R.D. Heat shock protein 72 on tumor cells. A recognition structure for Natural Killer cells. J Immunol, 1997, 158(9), 4341-4350.

73. Tamura Y., Peng P., Liu K., Daou M., Srivastava P.K. Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparations. Science, 1997, 278(5335), 117120.

74. Janetzki S., Palla D., Rosenhauer V., Lochs H., Lewis J.J., Srivastava P.K. Immunization of cancer patients with autologous cancer-derived hsp gp96 preparations: a pilot study. Int J Cancer, 2000, 88(2), 232-238.

75. Graner M.W., Zeng Y., Feng H., Katsanis E. Tumor-derived chaperone-rich cell lysates are effective therapeutic vaccines against a variety of cancers. Cancer Immunol Immunother, 2003,52(4), 226-234.

76. Gragerov A., Gottesman M.E. Different peptide binding specificities of hsp70 family members. JMol Biol, 1994, 241(2), 133-135.

77. Rudiger S., Germeroth L., Schneider-Mergener J., Bukau B. Substrate specificity of the DnaK chaperone determined by screening cellulose-bound peptide libraries. EMBO J, 1997, 16(7), 1501-1507.

78. Takenaka I., Leung S., McAndrew S., Brown J., Hightower L. Hsc70-binding peptides selected from a phage peptide library that resemble organellar targeting sequences. J Biol Chem, 1995,270(34), 19839-19844.

79. Moroi Y., Mayhew M., Trcka J., Hoe M.H., Takechi Y., Hartl F.U., Rothman J.E., Houghton A.N. Induction of cellular immunity by immunization with novel hybrid peptides complexed to heat shock protein 70. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(7), 3485-3490.

80. Manjili M.H., Henderson R., Wang X.Y., Chen X., Li Y., Repasky E., Kazim L., Subjeck J.R. Development of a recombinant HSP110-HER-2/neu vaccine using the chaperoning properties ofHSPllO. Cancer Res, 2002, 62(6), 1737-1742.

81. Wang X.Y., Chen X., Manjili M.H., Repasky E., Henderson R., Subjeck J.R. Targeted immunotherapy using reconstituted chaperone complexes of heat shock protein 110 and melanoma-associated antigen gplOO. Cancer Res, 2003, 63(10), 2553-2560.

82. Chen C.H., Wang T.L., Hung C.F., Pardoll D.M., Wu T.C. Boosting with recombinant vaccinia increases HPV-16 E7-specific T cell precursor frequencies of HPV-16 E7-expressing DNA vaccines. Vaccine, 2000,18(19), 2015-2022.

83. Huang X.F., Ren W., Rollins L., Pittman P., Shah M., Shen L., Gu Q., Strube R., Hu F., Chen S.Y. A broadly applicable, personalized heat shock protein-mediated oncolytic tumor vaccine. Cancer Res, 2003, 63(21), 7321-7329.

84. Peng M., Chen M., Ling N., Xu H., Qing Y., Ren H. Novel vaccines for the treatment of chronic HBV infection based on mycobacterial heat shock protein 70. Vaccine, 2006, 24(7), 887-896.

85. Hunt S. Technology evaluation: HspE7, StressGen Biotechnologies Corp. Curr Opin Mol Titer, 2001,3(4), 413-417.

86. Tatarinov Y.S. Content of embryo-specific alpha-globulin in the blood serum of the human fetus, newborn, and adult man in primary cancer of the liver. Vop Khim SSR, 1965, 11,20-24.

87. Abelev G.I. Alpha-fetoprotein in association with malignant tumors. Adv Cancer Res, 1971,14,295-357.

88. Alpert E. Human alpha-fetoprotein (AFP): Developmental biology and clinical significance.Progress in liver Diseases, Eds. Grune and Stratton, NY, 1976,5, 337-349.

89. Deutsch H.F. Chemistry and biology of alpha-fetoprotein. Adv Cancer Res, 1991, 56, 252-267.

90. Uriel J., Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin Ch. Uptake of radiolabeled alpha-fetoprotein by mouse mammary carcinoma's and its usefulness in tumor scintigraphy. Cancer Res, 1984, 44,5314-5319.

91. McLeod J.F., Cooke N.E. The vitamin D-binding protein, alpha-fetoprotein, albumin multigene family: Detection of transcripts in multiple tissues. J Biol Chem, 1989, 264, 21760-21769.

92. Lufl A.J., Lorscheider F.L. Structural analysis of human and bovine alpha-fetoprotein by election microscopy, image processing, and circular dichroism. Biochemistry, 1983, 22, 5978-5981.

93. Carter D.C., He X.M. Structure of human serum albumin. Science, 1990, 249,302-304.

94. Yang F., Luna V.J., McAnelly R.D., Neberhaus K.H., Cupples R.I., Bowman B.H. Evolutionary and structural relationships among the group specific component, albumin and alpha-fetoprotein. Nucleic Acids Res, 1985,13, 8007-8017.

95. Gutteridge J.M. Antioxidant properties of the protein caeruloplasmin, albumin, and transferrin: A study of their activity in serum and synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis. Biochem Biophys Acta, 1986, 869, 119-127.

96. Nathan C., Xie Q.W., Halbwachs-Mecarelli L., Jin W.W. Albumin inhibits neutrophil spreading and hydrogen peroxide release by blocking the shedding of DC43 (sialophorin, leukosialin). J Cell Biol, 1993,122, 243-256.

97. Constans J. Group-specific component is not only a vitamin D-binding protein. Exp Clin Immunogenet, 1992,9, 161-175.

98. Mizejewski G.J. Biological roles of alpha-fetoprotein during pregnancy and perinatal development. Exp Biol Med, 2004,229,439-463.

99. Smith C.J.P., Kelleher P.C. Alpha-fetoprotein molecular heterogeneity: physiologic correlations with normal growth, carcinogenesis and tumour growth. Biochim. Biophys Acta, 1980, 605,1-32.

100. Beborowica J. Microheterogeneity of human alpha-fetoprotein. Tumor Biol, 1988,9,3-14.

101. Takata K., Kamakura K., Satomura S., Taga H. Lectin-dependent modulation of interaction between human alpha-fetoprotein and its monoclonal antibodies. Tumor Biol, 1998,19,318-328.

102. Karamova E.R., Yazova A.K., Goussev A.I., Yakiemenko E.F., Abelev G.I. Conformational variants of human alpha-fetoprotein. Tumor Biol, 1998,19, 310-317.

103. Yakimenko E.F., Karamova E.R., Goussev A.I., Hilgers J., Abelev G.I., Yazova A.K. Epitope mapping of human alpha-fetoprotein. Tumor Biol, 1998,19, 301-309.

104. Yamashita K., Hitoi A., Tsuchida Y., Nishi S., Kobata A. Sugar chains of alpha-fetoprotein produced in human yolk sac tumour. Cancer Research, 1983,43,4691-4695.

105. Ruoslahti E., Terry W.D. Alpha-fetoprotein and serum albumin show sequence homology. Nature, 1976, 260, 804-805.

106. Wan Y.J.Y., Jimenez-Molina J.J., Chou J.Y. Fetal and variant AFPs are encoded by mRNAs that differ in sequence at the 5' end. Biochemistry, 1988, 27, 7269-7276.

107. Lemire J.M., Fausto N. Multiple alpha-fetoprotein RNAs in adult rat liver: Cell type-specific expression and differential regulation. Cancer Res, 1991, 51,4656-4664.

108. Watanabe T., Jimenez-Molina J.J., Chou J.Y. Characterization of a rat variant alpha-fetoprotein. Biochem Biophys Res Commun, 1992,185, 648-656.

109. Morinaga T., Sakai M., Wegmann T.G., Tomaoki T. AFP messenger RNA in human embryonal carcinoma grown in nude mice and cloning of its complementary DNA. Oncodev Biol Med, 1982,3,301-313.

110. Sarcione E.J., Zlotty M., Delluomo D.S., Mizejewski G.J., Jacobson H.I. Detection and measurement of alpha-fetoprotein in human breast cancer cytosol after treatment with 0.4 M potassium chloride. Cancer Res, 1983,43, 3739-3741.

111. Mizejewski G.J. The phylogeny of alpha-fetoprotein in vertebrates: Survey of biochemical and physiological data. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 1995, 5, 281-316.

112. Mizejewski G.J. An apparent dimerization motif in the third domain of alpha-fetoprotein: Molecular mimicry of the steroid/thyroid nuclear receptor superfamily. Bioessays, 1993,15, 427-432.

113. Dudich I., Tokhtamysheva N., Semenkova L., Dudich E., Hellman J., Korpela T. Isolation and structural and functional characterization of the two stable peptide fragments of human alpha-fetoprotein. Biochemistry, 1999,38, 10406-10414.

114. Seal W., Hanstein B., Brown M., Moore D.D. Inhibition of estrogen receptor action by the orphan receptor SHP (short heterodimer partner). Mol Endocrinol, 1998,12,1551-1557.

115. Resnick E.M., Schreihofer D.A., Periasamy A., Shupnik M.A. Truncated estrogen receptor product-1 suppresses estrogen receptor transactivation by dimerization with estrogen receptors and 13. J Biol Chem, 2000,275, 7158-7166.

116. Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein as a biologic response modifier: Relevance to domain and subdomain structure. Proc Soc Exp Biol Med, 1997, 215, 333-362.

117. Wu J.T., Waterhouse W.J. Identification of AFP polymers: Artifacts of the isolation procedure. Clin Chem Acta, 1982,125, 9-19.

118. Wu J.T., Knight J.A. In vitro stability of human alpha-fetoprotein. Clin Chem, 1985, 31, 1692-1697.

119. Goncharova O., Dudich E., Semenkova L., Gorbatova E., Dudich I. Synergy of alpha-fetoprotein and estradiol in suppression of tumor cell growth. Tumor Biol, 1999,20,42-52.

120. Copado M.A., Ruiz-Gutierrez V., Rodriguez-Burgos A. Fatty acids and squalene carried by alpha fetoprotein, and fetal and adult serum albumin from chicken. Comparison with these from mammals. Jprot chem, 1999,18(4), 413-424.

121. Parmelee D.C., Evenson M.A., Deutsch H.F. The presence of fatty acids in human a-fetoprotein. J Biol Chem, 1978,253,2114-2119.

122. Nagai M., Becker J.D., Deutsch H.F. The fatty acid levels of rat alpha-fetoprotein derived from fetuses, pregnancy and hepatoma sera. OncodevBiol Med, 1982,3,343-350.

123. Aoyagi Y., Ikenaka T., Ichida F. Alpha-fetoprotein as a carrier protein in plasma and its bilirubin-binding ability. Cancer Research, 1979, 39, 3571-3574.

124. Aussel C., Masseyeff R. Interaction of retinoids and bilirubin with the binding of arachidonic acid to human alpha-fetoprotein. Biochem Biophys Res Commun, 1984, 119,1122-1127.

125. Herve F., Rajkowski K.M., Martin M.T., Dessen P., Gittanova N. Drug-binding properties of rat ai-foetoprotein. Biochem J, 1984,221,401-406.

126. Lau S., Laussac J.-P., Sarcar B. Synthesis and Copper (II) binding properties of the N-terminal peptide of human a-fetoprotein. Biochem J, 1989,257, 745-750.

127. Allen S.H.G., Bennett J.A., Mizejewski G.J., Andersen T.T., Ferraris S., Jacobson H. Purification of alpha-fetoprotein from human cord serum with demonstration of its antiestrogenic activity. Biochimica Biophisica Acta, 1993,1202,135-142.

128. Chaturvedi R., Agarkar V., Sharma G.L., Sarma P.U. Purification of alpha fetoprotein from human cord blood. Prep Biochem Biotechnol, 1998, 28(4), 293-303.

129. Deutsch H.F., Taniguchi N., Evenson M.A. Isolation and properties of human a-fetoprotein from Hep G2 cell cultures. Tumor Biology, 2000, 21, 267-277.

130. Nishi S., Hirai H. Purification of human, dog and rabbit a-fetoprotein by immunoadsorbents of Sepharose coupled with anti-human a-fetoprotein. Biochim Biophys Acta, 1972,278, 293-298.

131. Taketa K., Izumi M., Ichikawa E. Distinct molecular species of human a-fetoprotein due to differential affinities to lectins. Ann New York Acad Sci, 1983, 80,61-68.

132. Uriel J., Bouillon D., Dupiers M. Affinity chromatography of human, rat and mouse alpha-fetoprotein on estradiol-sepharose adsorbents. FEBSLett, 1975,53,305-308.

133. Tatarinov Y.S., Terentiev A.A., Moldogazieva A.K., Tagirova A.K. Human alpha-fetoprotein and its purification by chromatography on immobilized estrogens. Tumor Biology, 1991,12, 125-130.

134. Tecce M.F., Terrana B. High-yield and high-degree of purification of human alpha-fetoprotein produced by adaptation of the human hepatoma cell line HepG2 in serum-free medium. Anal Biochem, 1989,169, 306-311.

135. Mizejewski G.J., Jacobson H.I. Alpha-fetoprotein as a dual regulator of growth in estrogen-responsive tissues. CRS Press Boca Raton, Florida, 1985,1, 71-82.

136. Torres J.M., Carracq N., Uriel J. Membrane proteins from lymphoblastoid cells showing cross-affinity for alpha-fetoprotein and albumin. Isolation and characterization. Biochem Biophys Acta, 1992,1159, 60-66.

137. Suzuki Y., Zeng C.Q.Y, Alpert E. Isolation and characterization of a specific alpha-fetoprotein receptor on human monocytes. J Clin Invest, 1992, 90, 1530-1536.

138. Naval J., Villacampa M.J., Goguel A.F., Uriel J. Cell type-specific receptors for AFP in a mouse T-lymphoma cell line. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82, 3301-3304.

139. Moro R., Tamaoki T., Wegmann T.G., Longnecker B.M., Laderoute M.P. Monoclonal antibodies directed against a widespread oncofetal antigen: The alpha-fetoprotein receptor. Tumor Biol, 1993,14,116-130.

140. Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C., Lampreave F., Uriel J. Alpha-fetoprotein receptors in a human breast cancer cell line. Biochem Biophys Res Commun, 1984,122,1322-1327.

141. Uriel J., Failly-Crepin C., Villacampa M.J., Pineiro A., Geuskens M. Incorporation of alpha-fetoprotein by the MCF-7 human breast cancer cell line. Tumor Biology, 1984, 5, 4146.

142. Torres J.M., Geuskens M., Uriel J. Receptor-mediated endocytosis and recycling of alpha-fetoprotein in human B-lymphoma and T-leukemia cells. Int J Cancer, 1991, 47, 110117.

143. Torres J.M., Naval J., Laborda M. Expression of alpha-fetoprotein receptors by human T-lymphocytes during blastic transformation. Mol Immunol, 1989,26, 851-857.

144. Perales J.C., Ferkol T., Beegen H., Ratnoff 0. D., Hanson R.W. Gene transfer in vivo: Sustained expression and regulation of genes introduced into the liver by receptor-targeted uptake. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91,4086-4089.

145. Aboud-Pirak E., Hurwitz E., Bellot F., Schlessinger J., Sela M. Inhibition of human tumor growth in nude mice by a conjugate doxorubicin with monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86, 3778-3781.

146. Wu G.Y. Wu C.H. Liver-directed gene delivery. Adv Drug Delivery Rev, 1993, 12, 159163.

147. Bomsel M., Mostov K. Sorting of plasma membrane proteins in epithelial cells. Curr Opin Cell Biol, 1991,3,647-650.

148. Perales J.C., Ferkol T., Molas M., Hanson R.W. An evaluation ofreceptor-mediated gene transfer using synthetic DNA-ligand complexes. Eur J Biochem, 1994,226,255-259.

149. Curiel D.T., Agarwal S., Wagner E., Gotten M. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88, 8850-8853.

150. Shimizu A., Kawashima S. Kinetic study ofinternalization and degradation of 131I-labeled follicle-stimulating hormone in mouse Sertoli cells and its relevance to other systems. J Biol Chem, 1989, 264, 13632-13635.

151. Severin S.E., Posypanova G.A., Katukov V.Y., Zhukova O.S., Vorozhtsov G.N., Kaliya O.Z., Lukyanets E.A., Severin E.S. Antitumor activity of conjugates of the oncofetal protein AFP and phthalocyanines in vitro. Biochem Mol Biol Int, 1997,43,1081-1089.

152. Stavrovskaya A.A. Cellular mechanisms of multidrug resistance of tumor cells. Biochemistry (Moscow), 2001,65(1), 95-106.

153. Peters T.J. Plasma albumin. Adv Protein Chem, 1985,37,161-188.

154. Pucci P., Sicilano R., Malorni A., Marino G., Tecce M.F., Ceccarini C., Terrana B. Human AFP primary structure: A mass spectrometry study. Biochemistry, 1991, 30, 50615066.

155. Mizejewski G.J., Dias J.A., Hauer C.R., Henrikson K.P., Gierthy J. Alpha-fetoprotein derived synthetic peptides: Assay of an estrogen-modifying regulatory segment. Mol Cell Endocrinol, 1996,118,15-23.

156. Butterstein G.M., Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein inhibits frog metamorphosis: Implications for protein motif conservation. Comp Biochem Physiol, 1999,12, 39-45.

157. Vakharia D., Mizejewski G.J. Human alpha-fetoprotein peptides bind estrogen receptor and estradiol and suppress breast cancer. Breast Cancer Res Treat, 2000,63,41-52.

158. Terentiev A.A., Tatarinov Y.S. Homology of oligopeptide sequences in primary structures of glycodelin, AFP, insulin alpha-chain, and EGF. Tumor Biol, 1999,20, 44-47.

159. Butterfield L.H., Koh A., Meng W., Vollmer C.M., Economou J.S. Generation of human t-cell responses to an HLA-A2.1-restricted peptide epitope derived from alpha-fetoprotein. Cancer Res, 1999,59,3134-3142.

160. Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein Structure and Function: Relevance to Isoforms, Epitopes, and Conformational Variants. Exp Biol Med, 2001,226(5), 377-408.

161. Wang XW, Xie H. Stimulation of tumor cell growth by alpha-fetoprotein. Int J Cancer 75:596-599,1998.

162. Greenberg F., Faucett A., Rose E., Bancalari L., Kardon N.B., Mizejewski G.J., Haddow J.E., Alpert E. Congenital deficiency of alpha-fetoprotein. Am J Obstet Gynecol, 1992, 167, 509-511.

163. Sher C., Shohat M. Congenital deficiency of AFP and Down's syndrome screening. Prenat Diag, 1997,17,884-885.

164. Semenkova L.N., Dudich E.I., Dudich I.V., Shingarova L.N., Korobko V.G. Alpha-fetoprotein as a TNF-resistance factor for human hepatocarcinoma cell line HepG2. Tumor Biol, 1997,18, 30-40.

165. Semenkova L.N., Dudich E.I., Dudich I.V. Alpha-fetoprotein-induced apoptosis of human hepatoma cells. Tumor Biol, 1998,19,261-274.

166. Semenkova L.N., Dudich E.I., Dudich I.V. AFP-mediated apoptosis is realised via Ca2+ and tyrosine-kinase independent pathways and do not require protein and RNA synthesis. Tumor Biol, 1988,19(S2), 26-28.

167. Semenkova L.N., Dudich E.I., Khromikh L.M., Gorbatova E.A. Abrogation of a-fetoprotein-induced apoptosis in tumor cells by endogenous exogenous IL-2. Eur Cytokine Network, 1998, 9,448-450.

168. Dudich I., Dudich E., Semenkova L.N., Gorbatova E.A., Shingarova L., Korobko V. Comparative study of the biological activity of TNFR55 and TNFR75-seIective TNF-cr mutants using various types of tumor cell lines. Eur Cytokine Network, 1998,9,489-493.

169. Dudich E., Semenkova L., Gorbatova E., Dudich I. Targeting modulation of the TNF-induced apoptosis in tumor cells by human alpha-fetoprotein: New approach for anticancer therapy. J Interferon Cytokine Res, 1999,19,1140-1143.

170. Dudich E., Semenkova L., Gorbatova E., Dudich I., Khromykh L., Tatulov E., Grechko G., Sukhikh G. Growth-regulative activity of human alpha-fetoprotein for different types of tumor and normal cells. Tumor Biol, 1998,19, 30-40.

171. Lobenhofer E.K., Huper G., Inglehart J.D., Marks J.R. Inhibition of mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase activity in MCF-7 cells prevents estrogen-induced mitogenesis. Cell Growth Diff, 2000,11,99-110.

172. Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein signal sequences: A proposed mechanism for subcellular localization and organelle targeting. J TheorBiol, 1995,176,103-113.

173. Torres J.M., Anel A., Uriel J. AFP-mediated uptake of fatty acids by human T-lymphocytes. J Cell Physiol, 1992,150,456-462.

174. Tsai M.Y., Wang C. Uncoupling of peptide-stimulated ATPase and clathrin-uncoating activity in deletion mutant of hsc70. J Biol Chem, 1994,269(8), 5958-5962.

175. Jindal S., Murrey P., Rosenberg S., Young R.A., Williams K.P. Human stress protein hsp70: overexpression in E.coli, purification and characterization. Biotechnology, 1995, 13, 1105-1109.

176. Macejak D., Rayfield M., Luftig R. Isolation and characterization of human HSP70 expressed in Echerichia coli. Arch Biochem Biophys, 1990,280(1), 55- 60.

177. Sonna L.A., Fujita J., Gaffin S.L., Lilly C.M. Effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. JAppl Physiol, 2002,92, 1725-1742.

178. Okudo H., Kato H., Arakaki Y., Urade R. Cooperation of ER-60 and BiP in the oxidative refolding of denatured proteins in vitro. J Biochem, 2005,138(6), 773-780.

179. Asea A., Rehli M., Kabingu E., Boch J.A., Bare O., Auron P.E., Stevenson M.A., Calderwood S.K. Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70: role of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4. J Biol Chem, 2002,277(17), 15028-15034.

180. Guerrero C.A., Bouyssounade D., Zarate S., Isa P., Lopez T., Espinosa R., Romero P., Mendez E., Lopez S., Arias C.F. Heat shock cognate protein 70 is involved in rotavirus cell entry. J Virol, 2002, 76(8), 4096-4102.

181. Panda AK. Bioprocessing of therapeutic proteins from the inclusion bodies of Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol, 2003,85,43-93.

182. Udono H., Saito T., Ogawa M., Yui Y. Hsp-antigen fusion and their use for immunization. Methods, 2004,32(1), 21-24.

183. Welch W.J., Feramisco J.R. Rapid purification of mammalian 70,000-dalton stress proteins: affinity of the proteins for nucleotides. Mol Cell Biol, 1985, 5(6), 1229-1237.

184. Peng P., Menoret A., Srivastava P.K. Purification of immunogenic heat shock protein 70-peptide complexes by ADP-affinity chromatography. J Immunol Methods, 1997, 204(1), 1321.

185. Menoret A. Purification of recombinant and endogenous HSP70s. Methods, 2004, 32(1), 7-12.

186. Hohfeld J., Minami Y., Hartl F.U. Hip, a novel cochaperone involved in the eukaryotic Hsc70/Hsp40 reaction cycle. Cell, 1995, 83(4), 589-598.

187. Boice J.A., Hightower L.E. A mutational study of the peptide-binding domain of Hsc70 guided by secondary structure prediction. J Biol Chem, 1997,272(40), 24825-24831.

188. Chang Y., Thrombin specificity. Requirement for apolar amino acids adjacent to the thrombin cleavage site of polypeptide substrate. Eur JBiochem, 1985,151(2), 217-224.

189. Segal B.H., Wang X.Y., Dennis C.G., Youn R., Repasky E.A., Manjili M.H., Subjeck J.R. Heat shock proteins as vaccine adjuvants in infections and cancer. Drug Discov Today, 2006,11,534-540.

190. Hunt S. Technology evaluation: HspE7, StressGen Biotechnologies Corp. Curr Opin Mol Ther, 2001,3(4), 413-417.

191. Chen C.H., Wang T.L., Hung C.F., Yang Y., Young R.A., Pardoll D.M., Wu T.C. Enhancement of DNA vaccine potency by linkage of antigen gene to an HSP70 gene. Cancer Res, 2000,60(4), 1035- 1042.

192. Hartl F.U., Hayer-Hartl M. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science, 2002, 295,1852-1858.

193. Udono H., Srivastava P.K. Heat shock protein 70-associated peptides elicit specific cancerimmunity .J Exp Med, 1993,178(4), 1391-1396.

194. S., Schmitz G. Lipopolysaccharide and ceramide docking to CD14 provokes ligand-specific receptor clustering in rafts. Eur J Immunol, 2001, 31,3153-3164.

195. Clark G.J., Angel N., Kato M., Lopez J.A., MacDonald K., Vuckovic S., Hart D.N. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect, 2000, 2(3), 257-272.

196. Yamamoto R., Sakamoto Т., Nishi S., Sakai M., Morinaga Т., Tamaoki, T. Expression of human alpha-fetoprotein in yeast. Life Sei., 1990,46,1679-1686.

197. Boismenu R., DuBovv M. S., Murgita R. A. Expression of domains of mouse a-fetoprotein in Escherichia coli. Life Sei., 1988, 43,673-681.

198. Boismenu R, Semeniuk D, Murgita R.A. Purification and characterization of human and mouse recombinant alpha-fetoproteins expressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif 1997,10(1), 10-26.

199. Alava M.A., IturTalde M., Lampreave F., Pineiro A. Specific uptake of alpha-fetoprotein and albumin by rat Morris 7777 hepatoma cells. Tumour Biol, 1999, 20(1), 52-64.

200. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson, H.I. Estradiol-activated alpha-fetoprotein suppressed the uterotrophic response to estrogens. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1983, 80, 2733-2737.

201. Bennett J.A., Semeniuk D.J., Jacobson H.I., Murgita R.A. Similarity between natural and recombinant human alpha-fetoprotein as inhibitors of estrogen-dependent breast cancer growth. Breast Cancer Res Treat, 1997,45(2), 169-179.

202. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Finakova G.V., Gukasova N.V., Petukhov S.P., Posypanova G.A., Skryabin K.G., Severin S.E. Antitumor activity of alpha-fetoprotein and epidermal growth factor conjugates in vitro and in vivo. Tumor Biol, 2000,21, 367-374.

203. Тюляидин С.А., Стенина М.Б. Таксаны. В книге "Новые цитостатики в терапии злокачественных опухолей" под редакцией В.А. Горбуновой, Москва, 1998, с. 97-118.

204. Deutsch H.M., Glinski J.A., Hernandez M., Haugwitz R.D., Narayanan V.L., Suffness M., Zalkow L.H. Synthesis of congeners and prodrugs. Water-soluble prodrugs of Taxol with potent antitumor activity. J Med Chem, 1989,32, 788-792.

205. Wiechelman K.J., Braun R.D., Fitzpatrick J.D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem 1988, 175(1), 231-237.

206. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolashion by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987,162,156-159.

207. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophge T4. Nature 1970,227,680-685.

208. Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies D.H., Shevach E.M., Strober W. Current protocols in immunology 1991, N.Y.: John Wiley & Sons, Inc.

209. Geladopoulos T.P., Sotiroudis T.G., Evangelopoulos A.E. A malachite green colorimetric assay for protein phosphatase activity. Anal Biochem 1991,192(1), 112-116.

210. Morinaga Т., Sakai M, Wegmann T.G., Tamaoki T. Primary structures of human a-fetoprotein and its mRNA. PNAS, 1983, 80,4604-4608.

211. Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand J Clin Lab Invest Suppl, 1968,97,9-29.

212. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65, 55-63.

Информация о работе

Савватеева, Людмила Владимировна
кандидата химических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым эффектом - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы