Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание и характеристика трансгенных форм томатов (Lycopersicon esculentum M. ), экспрессирующих ген дефензина редьки Rs-AFP2

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Парашина, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Использование генетической инженерии для защиты растений от биотического стресса - проблемы и перспективы.

1.2. Защитные реакции растения в ответ на биотический стресс.

1.3. Роль дефензинов в защитной системе растений.

1.4. Принципы и методы генетической инженерии растений.

1.5. Факторы, влияющие на эффективность агробактериальной трансформации.

1.6. Характеристика томата как объекта генетической инженерии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение белка из семян редьки и проверка его активности.

3.2. Культивирование и морфогенез in vitro различных сортов томата.

3.3. Оптимизация методики трансформации томата.

3.4. Анализ полученных регенерантов.

3.4.1. ПЦР-анализ.

3.4.2. Подтверждение экспрессии встроенного гена.

3.4.3. Фенотипическиеособенности регенерантов.

3.4.4. Анализ устойчивости трансгенных растений томата с геном дефензина rs.

3.4.4.1. Взаимодействие растительных белковых экстрактов с патогенами.

3.4.4.2. Проверка устойчивости на изолированных листьях и целых растениях.

3.5. Изучение передачи гена rs при вегетативном и семенном размножении трансгенных растений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание и характеристика трансгенных форм томатов (Lycopersicon esculentum M. ), экспрессирующих ген дефензина редьки Rs-AFP2"

В настоящее время томат (Lycopersicon escnlentum Mill) является важнейшей овощной сельскохозяйственной культурой, лидирующей по объему производства в мире. При этом значительная часть сортов томата остается уязвимой для поражения различными грибными заболеваниями, среди которых весьма ощутимый урон наносят фитофтороз, мучнистая роса, фузариозное увядание, альтернариозная пятнистость и др .

Получение растений, устойчивых к бактериальным и грибным патогенам является непростой задачей для генетиков и селекционеров ввиду участия многих генов во взаимодействии растение- патоген. Кроме того, одним из главных недостатков традиционной селекции сортов на устойчивость является часто встречающееся при половой гибридизации сцепление с данным локусом резистентности нежелательных генов, снижающих хозяйственную ценность селекционного материала.

Использование методов генной инженерии позволяет вводить в растение чужеродный ген без значительного изменения генома растения-реципиента. При переносе в растение гетерологичных генов, способных ингибировать развитие патогена, во многих случаях сохраняется их экспрессия в новом генетическом окружении, а иногда даже может наблюдаться ее активизация по сравнению с растением-источником данного гена [Whitham et al., 1996].

Хорошая генетическая изученность томата делает его удобным объектом для у генноинженерных манипуляций с целью повышения устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам, а также улучшения качества плодов, агротехнических характеристик и т.д.

Большинство известных до настоящего времени защитных генов растений кодируют устойчивость лишь к ограниченному кругу патогенов и являются неэффективными для других возбудителей болезней. В этой связи представляет особый интерес группа генов так называемых пептидных антибиотиков или дефензинов- коротких цистеинсодержащих белков широкого фунгицидного 6 действия [Broekaert et al., 1995], обнаруженных в семенах и вегетативных органах различных растений. Одной из наиболее активных групп этого класса белков являются дефензины из семян редьки, введение которых в модельные растения табака приводило к значительному сокращению площади поражения листьев патогеном Alternaria longipes [Terras et al., 1995].

Однако, до настоящего времени известно единичное число работ [Epple et al.,1997], касающихся создания растений, несущих гены пептидных антибиотиков. Поэтому использование генов растительных дефензинов для создания устойчивых к патогенам растений является новой, привлекательной областью приложения метода генной инженерии растений, имеющей как большое научное, так и практическое значение.

В связи со всем вышеизложенным в настоящей работе была поставлена цель создать трансгенные растения томата, экспрессирующие ген дефензина редьки Rs-AFP2 (далее- ген rs) и охарактеризовать их.

Исходя из этого предстояло решить следующие задачи:

1. Ввести в культуру in vitro различные сорта томата, изучить их способность к морфогенезу и отобрать для дальнейшей работы сорта с высоким регенерационным потенциалом.

2. Оптимизировать методику трансформации для используемых в работе сортов томата.

3. Получить трансгенные растения, экспрессирующие ген дефензина редьки и охарактеризовать их.

4. Разработать методику оценки экспрессии белка дефензина по его фунгицидной активности.

5. Проанализировать устойчивость полученных трансгенных растений к заболеваниям, вызываемым патогенными грибами. 7

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Парашина, Елена Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Изучены морфогенетические характеристики различных типов эксплантов у разных сортов томата, что позволило разработать высокоэффективные методы регенерации томата в культуре in vitro.

2. Оптимизирована методика агробактериальной трансформации и получены трансгенные растения томата, экспрессирующие ген дефензина редьки rs. Показана передача гена при семенном и вегетативном размножении.

3. Показана сравнительно высокая эффективность трансформации при использовании векторной конструкции нового типа pK22rs, превышающая в ряде случаев эффективность стандартных векторных систем. Поэтому эта конструкция может быть рекомендована для трансформации не только различных сортов томата, но и других видов растений.

4. Разработан способ оценки экспрессии гена дефензина в растениях по степени ингибирования прорастания спор грибов в жидкой среде in vitro белковыми экстрактами из трансгенных растений.

5. Трансгенные растения томата показали повышенную по сравнению с контролем устойчивость к альтернариозу, фузариозу и мучнистой росе. У трансгенных растений было отмечено также значительное запаздывание в развитии инфекционного процесса при поражении фитофторозом.

6. Полученные в работе результаты указывают на перспективность использования гена rs дефензина редьки для создания трансгенных форм растений с повышенной устойчивостью к заболеваниям, вызываемым фитопатогенными грибами.

81

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С открытием в начале 90-х годов растительных дефензинов, обладающих широкой фунгицидной активностью, к ним было привлечено пристальное внимание многих исследователей [Broekaert et al., 1995] с целью изучения как их свойств и механизма действия, так и возможностей использования их для повышения устойчивости растений к заболеваниям, вызываемым различными видами фитопатогенов. Были выделены и клонированы гены дефензинов редьки [Tenas et al., 1995], амаранта [De Bolle et al., 1993], астровых [Osbom et al., 1995] и сделаны попытки получить трансгенные растения с этими генами.

Однако, до настоящего времени в литературе имеется весьма ограниченное число работ, в которых в растительный геном вводят гены белков дефензинов [Carmona et al., 1993; Epple et al., 1997] и практически отсутствуют работы, описывающие использование генов дефензинов редьки для трансформации культурных растений.

Известно, что введение в растительный геном гетерологичных генов устойчивости к стрессовым факторам, в том числе к болезням, в некоторых случаях дает значительный положительный эффект [Whitham et al, 1996].

Поэтому в задачу настоящего исследования входило создать трансгенные растения томата, экспрессирующие ген дефензина редьки и выяснить перспективность использования этого класса генов для повышения устойчивости растений к патогенам.

Работа проводилась с агротехнически важными отечественными сортами томата Lycopersicon esculentum Mill, часть из которых ранее не вводилась в культуру in vitro.

Изучение морфогенетических характеристик различных типов эксплантов у нескольких сортов томата позволило выбрать для экспериментов наиболее морфогенетически активные типы эксплантов и разработать эффективные методики регенерации растений томата этих сортов в культуре in vitro, которые затем были использованы для получения трансгенных регенерантов.

Разработанная методика трансформации показала хорошую эффективность на различных отечественных сортах томата. Среди факторов, влияющих на

77 трансформацию эксплантов, ключевую роль играли концентрация агробактерий и время кокультивирования. Использование сильно разведенной культуры агробактерий при увеличении времени и понижении температуры кокультивирования значительно увеличивало эффективность и упрощало методику трансформации томата.

При трансформации томата были использованы различные векторные конструкции, в том числе конструкция нового тина рН22Кпео на основе плазмиды ЯБРЮЮ. Последняя показала высокую эффективность трансформации, которая в ряде случаев была значительно выше, чем при использовании стандартных бинарных векторов. Такие же результаты были получены при трансформации вектором рК22г8 груши [Долгов, 1999]. Поэтому векторная конструкция нового поколения рН22Кпео может быть рекомендована для трансформации не только различных сортов томата, но, по-видимому, и многих других видов растений.

Фенотипические отклонения, отмеченные у некоторых из трансгенных растений, говорят о необходимости разработки высокоэффективных методов регенерации, чтобы сократить до минимума культивирование в условиях т уйго.

У трансгенных растений наблюдали различную экспрессию целевого гена устойчивости, которая была показана с помощью имунноферментного анализа, а также на биологическом уровне- при сравнении действия экстрактов белка из трансгенных и нетрансгенных растений на прорастание суспензии спор патогенных грибов.

Трансгенные растения с геном дефензина редьки Г5 характеризовались более высокой устойчивостью к альтернариозной пятнистости, фузариозному увяданию и мучнистой росе, чем контрольные растения. Причем, показано, что в ряде случаев уровень такой устойчивости в определенной степени связан с уровнем экспрессии белка Я8-АРР2.

В случае фитофтороза задержка в развитии инфекционного процесса у трансгенных растений позволила им, в отличие от контрольных растений, в условиях высокой инфекционной нагрузки все же сформировать урожай.

78

Возможно, что различия в степени устойчивости трансгенных растений к различным патогенам могут быть связаны с биологическими особенностями самих патогенов, а также с различием в механизмах их действия на растения.

Таким образом, результаты, полученные в итоге проделанной работы, подтверждают возможность использования гена га дефензина редьки и векторной конструкции рК22гз с целью создания растений, обладающих повышенной устойчивостью к широкому спектру фитопатогенных грибов. Хотя в настоящей работе не проверялась устойчивость трансгенных растений к патогенным бактериям, однако существующие данные о белке Кэ-АРР2 [Вгоекаей е1 а1.,1993] предполагают несомненную перспективность исследований и в этом направлении.

80

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Парашина, Елена Владимировна, Москва

1. Безденежных М.Е. Использование культуры in vitro для получения дигаплоидных линий озимой мягкой пшеницы, устойчивых к токсинам Fusarium graminearum.il Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда. М. 1997. С. 358-359.

2. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в селекционном процессе.// Состояние и развитие сельскохозяйственной биотехнологии. Мат. Всесоюзн. Конф. Москва. 1986.

3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе.//М. ФБК-ПРЕСС. 1999.

4. Внучкова В.А. Изучение условий выращивания каллуса томата в пересадочной культуре и его цитологическая характеристика.// Культура клеток растений : Тр. Всесоюзн. Конф. Киев. 1975.

5. Дементьева М.И. Фитопатология.// М. Колос. 1970.

6. Долгов C.B. и др. Повышение устойчивости культурных злаков к фитопатогенам при введении в них генов растительных дефензинов.// Мат. 15-го конгр. EUCARPIA. 1999 г.

7. Дреппер Дж., Скотт Р. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство.// М. Мир. 1991. С.245-248.

8. Егоров И.С. Основы учения об антибиотиках.// М. Высшая школа. 1979.

9. Жук И.П., Рассоха С.Р. Регенерация и отбор соматических клонов томата на устойчивость к ВТМ.// Доклады РАСХН. 1990. С. 19-21.

10. Методы экспериментальной микологии. Под ред. В. И. Билай.// Киев. Наукова думка. 1982. С.486-487.

11. Муромцев Г.С. Достижения и перспективы исследований по биотехнологии сельскохозяйственных растений.// Сельскохозяйственная биология. 1996. №5. С.3-8.

12. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция.// Киев: Наукова Думка. 1990.

13. Современные методы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. Методические рекомендации.// M. МСХА. 1988. С 59.

14. Стройков Ю.М. Методы создания инфекционных фонов при оценке растений на устойчивость к болезням.// M. ТСХА. 1986. 32 С.

15. Узбекова C.B. Получение и анализ трансгенных растений, вырабатывающих инсектицидные белки.// Автореф.канд.дисс. 1994.

16. Уралец Л.И. Культура in vitro завязей томатов.// Физиология и биохимия культурных растений. 1980. Т. 12. С.523-528.

17. Уралец Л.И. Получение гибридных семян томатов опылением пестиков in vitro.II Физиология и биохимия культурных растений. 1981. Т.13. С.77-80.

18. Шарова А.П., Давыдова Ю.В., Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А. Использование сомоклональной изменчивости и индуцированного мутагенеза в создании устойчивого к фитофторозу картофеля.// Биотехнология. 1996.№7. С. 18-22.

19. Agharbaoui Z., Greer A.F., Tabaeizadeh Z. Transformation of the wild tomato1.copersicon chilense dun. by Agrobacterium tnmefaciens.il Plant Cell Reports. 1995. V. 15. P. 102-105.

20. An G., Ebert P.R., Mitra A. ,Ha S.B. Binary vectors.// Plant molecular biology manual. Ed. Gelvin S.B, Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dodrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. P.1-19.

21. Bartoszewski G.; Malepszy S.; Niemirowicz-Szczytt K. Shoot regeneration from a cotyledon fragment culture in selected forms of the tomato (Lycopersicon esculentum Mill.).//J. appl. Genet. 1996. V.37. P. 101-104.

22. Behki R.M., Lesley S.M. In vitro plant regeneration from leaf explants of Lycopersicon esculentum (tomato).//Can. J. Bot. 1976. V. 54. P. 2409-2414.

23. Bevan M.V. Binary agrobacterium vectors for plant transformation.// Nucl. Acids Res. 1984. V.22. P. 8711-8712.

24. Bevins C.L., Zasloff M. Peptides from frog skin.// Ann. Rev. Biochem. 1990. V.59. P.395-414.

25. Bohlmann H. The role of thionins in plant protection.// Crit. Rev. Plant Sci. 1995. V. 13. P. 1-16.

26. Boman H.G., Hultmark D. Cell free immunity in insects.// Annu. Rev. Microbiol. 1987. V.41. P.103-126.

27. Bowles D.J. Defence-related proteins in higher plants.// Annu. Rev. Biochem. 1990. V.59. P. 873-907.

28. Bradley D.J., Kjellbom P., Lamb C.J. Elicitor- and wounded oxidative cross-linking of a proline-rich plant cell wall protein: a novel, rapid defense response.// Cell. 1992. V.70. P.21-30.

29. Broekaert W.F.,Terras F.R.G., Cammue B.P.A., Osbom R.W, Vanderleyden J.// Biocidal Proteins. Great Britain. WO 93/05153.-1993.85

30. Broekaert W.F.Terras F.R.G., Cammue B.P.A., Osbom R.W, Vanderleyden J. An automated quantative assay for fungal growth inhibition.// FEMs Microbiology Letters. 1990. V. 69. P.55-61.

31. Broglie K., Chut I., Holliday M., Cresssman R., Biddle P. Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solani.ll Science. 1991. V.254. P. 1194-1197.

32. Bushnell W.R. and Rowell J.B. Suppressors of defense reactions: A model for roles in specifity.//Phytopathology. 1981. V.71. P. 1012-1014.

33. Carmona M.J., Molina A., Fernandez J.A., Lopez-Fando J.J., Garcia-Olmedo F. Expression of the alpha-thionin gene from barley in tobacco confers enhanced resistance to bacterial pathogens.// Plant J. 1993. V.3. P.457-62.

34. Charles M.Rick. The Tomato.// Sci. Amer. 1978. V.239. P.67-76.

35. Chen Z., Silva H. and Klessig D.F. Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid.// Science. 1993. V.262. P. 1883-1886.

36. Collinge D.B., Kraggh K.M., Mikkelsen J.D., Nielsen K.K., Rasmussen U. , Vad K. Plant chitinases.// Plant J. 1993. V.3. P.31-40.

37. Cuozzo M., O'Connel K.M., Kaniewski W., Fang R.-X. Viral protection in transgenic plants expressing mosaic virus coat protein or its antisense RNA.// Bio/Technol. 1988. V.6. P.549-557

38. De Samblanx G.W., Goderis I.J. Mutational analysis of a plant defensin from radish (Rathanns sativus L.) reveals two adjacent sites important for antifungal activity.// J. of Biological Chemistry. 1997. V.272. №2. P.1171-1179.86

39. Durbin R.D. and Uchytil T.F. A survey of plant insensitivity to tentoxin.// Phytopathology. 1977. V.67. P.602-603.

40. During K., Porsh P., Fladuiig M. and Lorz H. Can lysozymes mediate antibacterial resistance in plants?.// Plant Mol Biol 1993 . V.23. P.209-214.

41. Durman S., Menendez A., Godeas A. Evaluation of Trichoderma spp. as antagonist of Rhizoctonia solani in vitro and as biocontrol of greenhouse tomato plants.// Rev Argent Microbiol 1999. V.31. P.3-8.

42. Ebel J. and Cosio E.G. Elicitors of plant defense responses.// Int. Rev. Cytol. 1994. V. 148. P.l-36.

43. Edwards K., Johnstone C., Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PGR analysis.// Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 1349.

44. Epple P., Apel K., Bohlmann H. Overexpression of an endogenous thionin enhances resistance of Arabidopsis against Fusarium oxysporum.il. Plant Cell. 1997. Vol.9. P. 509-520.

45. Eshed Y. Zamir A. A genomic library of Lycopersicon penelli in L. esculentum : a tool fine mapping genes.// Euphytica . 1994. V.79. P. 175-179.

46. Fant F., Santos L., Vranken W. The solution structure by H-NMR of Rs-AFPl, a plant antifungal protein from radish seeds.// Abstracts of the 12th European Experimental NMR conference. 1994. P.247.

47. Filatti J.J., Kiser J et al. Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens vector.// Biotechnology.-1987.-V.5.-№7.-P.726-730.

48. Flavell R.B. Inactivation of gene expression in plants as a consequence of specific sequence duplication.// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1994 . V.91. P.3490-3496.

49. Flor H.H. Host-parasite interactions in flax rust- its genetics and other implications.// Phytopathology .1955. V.45. P.680-685.87

50. Flor H.H. Current status of the gene-for-gene concept.// Ann. Rev. Phytopathol. 1971. V.9. P.275-296.

51. Fiy J., Bamason A., Horsch R.B. Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens.// Plant cell Reports. 1987. V. 6. P.321-325.

52. Gaffney T. , Friedrich L., Vemooij B. Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance.// Science. 1993. V.261. P.754-756.

53. Garbe T.R., Barathi J., Bamini S., Zhang Y., Abou-Zeid C., Tang D., Mukherjee R., Young D.B. Transformation of mycobacterial species using hygromycin resistance as selectable marker.//Microbiology. 1994 . V.140 . P. 133-138.

54. Gavazzi G., Tonelli C., Todesco G. Soinaclonal variation versus chemically induced mutagenesis in tomato (Lycopersicon esculentum L.).// Theoret. appl. Genet. 1987. V.74. P. 733-738.

55. Giovannucci E. RESPONSE: Re: Tomatoes, Tomato-based Products, Lycopene, and Prostate Cancer: Review of the Epidemiologic Literature.// J. Natl. Cancer Inst. 1999. V.91. P. 1331 A-11331.

56. Gray J., Picton S., Shabbeer J., Schuch W., Grierson D. Molecular biology of fruit ripening and its manipulation with antisense genes .// Plant Mol Biol 1992. V. 19. P.6987.

57. Grierson D., Fray R. Control of ripening in transgenic tomatoes.// Euphytica. 1994. V.79. P.251-263.

58. Bendahmane M., Gronenbom B. Engineering resistance against tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) using antisense RNA.// Plant Mol. Biol. 1997. V.33. P.351-357.

59. Gresshoff P.M., Doy C.H. Development and differentiation of haploid Lycopersicon esculentum (tomato).// Planta. 1972. V. 107. P. 161-170.

60. Gunay A. L., Rao P. S. In vitro plant regeneration from hypocotyl and cotyledon explants of red pepper (Capsicum).// Plant Sci. Lett. 1978. V. 11. P.365-372.88

61. Gunay A. L., Rao P. S. In vitro propagation of hybrid tomato plants (Lycopersicon esculentum L.) using hypocotyl and cotyledon explants.// Ann. Bot. 1980. V.45. P. 205207.

62. Haberlandt G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber.// Akad. Wiss. Wien. Math.- naturw. 1902. Bd. III. 69-92.

63. Hachlbrock K. ,Scheel D., Logemann E. et al. Oligopeptide elicitor-mediated defense gene activation in cultured parsley cells.// EMBO J. 1995. V.12. P. 1735-1744.

64. Hain R., Stabel P., Czemilofsky A., Steinbis H., Herera-Estrela L., Shell J. Uptake, integration, expresion and genetic transmission gene by plant protoplasts.// Mol. Gen. Genet. 1985. V.199. P. 161-168.

65. Halliwell B. and Gutteridge J.M.C. Role of free radicals and catalytic metallions in human disease: an overview.// Methods Enzymol. 1990. V. 186. P. 1-85.

66. Hammond-Kosak K.E., Jones J.D.G. Resistance Gene-Dependent Plant Defense Responses. // Plant Cell. 1996. V. 8. P.1773-1791.

67. Hanfrey C. Lea Senescence in Brassica napus: Expression of Genes Encoding Pathogenesis-related Proteins.// Plant Mol. Biol. 1996 . V.30. P.597-609.

68. Harrison B., Mayo M., Baulcmbe D. Vims resistance in transgenic tobacco plants that express cucumber mosaic virus Satellit RNA.//Nature. 1987. V.328. P.799-802.

69. Heath M.C. reaction of nonsucsepts to fungal pathogens.// Ann. Rev. Phytopathol. 1980. V. 18. P.211-236.

70. Herman E.B., Haas G.J. Shoot formation in tissue cultures of tomato.// Z. Pflanzenphysiol. 1978. V.89. P.467-470.

71. Herrera-Estrella L. , Simpson J.// World J. Microbiol. Biotechnol. 1995. V.U. P. 383392.

72. Hoffmann J.A., Hetru C. Insect defensins: inducible antibacterial pepetides.// Immunol. Todav. 1992. V.13. P.411-415.

73. Hoisington D., Khairallah M., Reeves T. et al. Plant genetic resources: what can they contribute toward increased crop productivity? // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. V.96 . P5937-5943.

74. Horsh R.B., Fry J.B., Hoffmann N.L. A simple and general method for transferring genes into plants.//Science. 1985. V.227. P.1229-123i.89

75. Jongedijk E., Tigelaar H., Roekel J.S.C.van, Bres-Vloemans S.A., Dekker I., Elzen P.J.M.van den. Synergistic activity of chitinases and beta-l,3-glucanases enhances fungal resistance in transgenic tomato plants.// Euphytica. 1995. Vol.85. P. 173-180.

76. Jones D. A., Thomas C.M., Hammond-Kosack K.E., Balint-Kurti P.J., Jones J.D.G. Isolation of the tomato C/-9gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging.//Science. 1994. V.266. P.789-793.

77. Kartha K.K., Gamborg O.L., Shyluk J.P. , Costabel F. Morphogenetic investigations on in vitro leaf cultures of tomato( Lycopersicon esculentum Mill cv. S turf ire) and high frequency plant regeneration.// Z. Pflanzenphysiol. 1976. V.77. P. 292-301.

78. Kartha K.K., Champoux S., Gatnborg O.L., Oahl K. In vitro propagation of tomato by shoot apical meristem culture.// J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1977. V.102. P.346-349.

79. Keen N.T. Specific recognition in gene-for-gene host-parasit systems.// Adv. Plant Pathol. 1982. V.l. P.35-82.

80. Keen N.T. Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen interactions.// Ann. Rev. Genet. 1990. V. 24. P. 447-463.

81. Keppler L.D. and Novacky A. Involvement of membrane lipid peroxidation in the development of a bacterially induced hypersensitive reaction.// 1986. Phytopathology. V.76. P. 104-108.

82. Klee H., Horsh R., Rogers S. Agrobacterium- mediated plant transformation and it's further application to plant biology.//Ann. Rev. Plant Physiol. 1987. V.38. P.467-486.

83. Knogge W. Fungal infection to plants.// Plant Cell. 1996. V.8. P. 1711 -1722.

84. Koomeef M., Jongsma M. et al. Transformation of tomato.// Plant Molecular Biol. 1987. P. 169-178.

85. Levine A., Tenhaketi R., Dixon R., Lamb C. H202from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response.// Cell. 1994. V.79. P.583-593.

86. Liu D., Raghothama K. G., Hasegawa P. et al. Osmotin overexpression in potato delays development of disease symptoms.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V.91. P. 18881892.

87. Malehom D.E., Borgmeyer J.R., Smith C.E., Shah D.M. Characterization and expression of an antifungal zeamatin-like protein (Zip) gene from Zea mays.// Plant Physiol. 1994. V.106. P. 1471-1548.

88. Mane E. Fusicoccin: a tool in plant physiology.// Ann. Rev. Plant Physiol. 1979. V.30. P.273-288.

89. Martineau B., Summerfelt K.R. , Adams D.F., Devema J.W. Production of high solid tomatoes through molecular modification of levels of the plant grouth regulator cytokinin.//Bio/Technology. 1995. V.120. P. 250.

90. Matzke A.J., Matzke M.A.// Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes.// Curr. Opin. Plant Biol. 1998. V.l. P. 142-148.91

91. McCormic S., Niedermeyer J. Leaf Disk Transformation of Cultivated Tomato.// Plant Cell Reports. 1986. V.5. P.81-84.

92. McGarvey P.B., Hammond J., Dienelt M.M. et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes.// Biotechnology. 1995. V.13. P. 1484-1487.

93. Mendgen K and Deising H. Infection structures of fungal plant pathogens- a cytological and physiological evaluation.//New Phytol. 1993. V.124. P. 192-213.

94. Monsanto Company. Molecular approaches to insect resistance in plants.// Eur. Congr. Biotechnol. 1990.5 Meet. P.912.

95. Moreno M., Segura A., Garsia-Olmedo F. Pseudothionin a potato peptide active against potato pathogens.// Eur. J. Biochem. 1994. V.223. P. 135-139.

96. Motoyoshi F., Ugaki M. Production of transgenic tomato plants with specific TMV. resistance.// JARQ. 1993. V. 27. P. 122-125.

97. Mourgues F., Brisset M.-N. and Chevreau E. Strategies to improve plant resistance to bacterial diseases through genetic engineering.// Trends in Biotechnol. 1998. V.16. P.203-210.

98. Mullins M.G. Some physiological and genetic aspects of plant propagation .// N.Z. agr. Sc. 1984. V. 18. P. 176-180.

99. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures// Physiol. Plant. 1962. V. 15. P.473-497.

100. Nap J.P., Bijvoet J., Stiekema W.J. Biosafety of kanamycin-resistant transgenic plants.// Transgenic Res. 1992 . V.6. P.239-249.

101. Norelli J.L., Aldwinckle H.S., Destefano-Beltran L., Jaynes J.M. Transgenic 'Mailing 26' apple expressing the attacin E gene has increased resistance to Erwinia amylovora.// Euphytica. 1994. Vol. 77 P. 123-128 .

102. Oecking C., Eckerskorn C.,Weiler E.W. 1994. The fusicoccin receptor of plants is a member of the 14-3-3 superfamily of eukariotic regulatory proteins.// FEBS Lett. 1994. V.352. P.163-166.92

103. Ohana P. Benziman M. and Delmer D.P. Stimulation of callose synthesis in vivo correlates with changes in intracellular distribution of the callose synthase activator 0-furfuryl-p- glucoside.// Plant Physiol. 1993. V.101. P. 187-191.

104. Oldroyd G.E.D., Brian J.S. Genetically engineered broad-spectrum disease resistance in tomato.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95 P. 10300-10305.

105. Osboni R.W., De Samblanx G.W., Goderis I.J .Isolation and characterisation of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae./I FEBS Lett. 1995.

106. Osborn A.E. Prerfomed antimicrobial compounds and plant defense against fungal attack.// Plant Cell. 1996. V.8. P. 1821-1831.

107. Ow D., Jacobs J., Howell S. Functional regions of the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter determined by use of the firefly luciferase gene as a reporter of promoter activity.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.84. p.4870-4874.

108. Padmanabhan V., Paddoak E.F., Sharp W.R. Plantlet formation from Lycopersicon esculentum leaf callus.//Can. J. Bot. 1974. V.52. P. 1429-1432.

109. Peng M.and Kuc J. Peroxidase-generated hydrogen peroxide as a source of antifungal activity in vitro and on tobacco leaf disks.// Phytopathology. 1992. V.82. P.696-699.

110. Promega Protocols and Application Guide. Second edition.// Madison. USA. 1991. C.262-265.

111. Raskin I. Salicylate, a new plant hormone.// Plant Physiol. 1992. V.99. P. 799-803.

112. Rajnchapel-Messai J. Les organismes genetiquement modifies prennent la cle des champs .// Biofutur. 1988. V. 74. P. 20-29

113. Rhodes C., Piercr D., Mettler I., Mascarenhas D., Detmer J. Genetically transformed maize plants from protoplasts.// Science. 1988. V.240. P. 204-207.

114. Ricci P. ,Bonnet P., Pemollet J.C. Structure and activity of proteins from pathogenic fungi Phytophthora eliciting necrosis and acquired resistance in tobacco.// Evr. J. Biochem. 1989. V.183. P.555-563.

115. Ryals J.A., Neuenschwander U.H., Willits M.G.,Molina A., Steiner H.-Y.,Hunt M.D. Systemic acquired resistance.//Plant Cell. 1996. V.8. P. 1809-1819.93

116. Saccardo F., Ancora G., Sree Ramulu K. Transfer of useful characters from Lycopersicon peruvanum to L. esculentum.il In : Genet, and bred. Tomato: Proc. Mut. Eucarpiatomato workgroup. Montfavet. 1981. P. 235-242.

117. Savenkova M.I. , Mueller D.M and Heinecke J. A. Tyrosyl radical generated by myeloperoxidase is a physiological catalyst for the initiation of lipid peroxidation in low density lipoprotein.//J. Biol.Chem. 1994. V.269. P. 20394-20400.

118. Schutze R.; Wieczorrek G.// Investigations into tomato tissue cultures.// Arch. Zuchtungsforsch. 1987. V. 17. P. 117-126.

119. Schutze R., Wieczorrek G. Plant regeneration in plated callus primary suspensions of the of the cultivated tomato Lycopersicon esculentum Mill. cv. "Nadja" in dependence on phytohormone content.// Arch. Zuchtungsforsch, 1987 .V. 17. P. 185-190.

120. Sela-Buurlage M.B., Ponstein A.S., Bres-Vloemans S.A. et al. Only specific tobacco (Nicotiana tabacum) chitinases and (3-1,3-glucanases exhibit antifungal activity.// Plant Physiol. 1993. V.101. P.857-863.

121. Shade R.E., Schroeder H.E., Pueyo J.J., Tabe L.M., Murdock L.L., Hoggins T.J.V., Chrispeels M.J. Transgenic pea seeds expressing the a-amylase inhibitor of the common bean are resistant to bruchid beetles.// Biotechnology. 1994. V.12. P. 793-796.

122. Shahin E.A., Spivey R. A single dominant gene for fusarium wilt resistance in protoplast- derived tomato plants.// Theor. And Appl. Genet. 1986. V.73. P. 164-169.

123. Shirashi T., Saitoh K., Kim H.M., Kato T., Tahara M.,.Yamada T., Oku H., Ichinose Y. Two suppressors, supprescins A and B, secreted by a pea pathogen, MycosphaerelJa pinodes.ll Plant Cell Physiol. 1992. V.33. P.663-667.

124. Showalter A.M. Structure and function of plant cell wall proteins.// Plant Cell. 1993. V.5. P.9-23.

125. Somssich I.E., Bollmann J., Hahlbrock K., Kombrink E., Schulz W. Differential early activation of defense-related genes in elicitor-treated parsley cells.// Plant Mol. Biol. 1989. V.12. P.227-234.

126. Stachel S.E., Messens E., Van Montagu M. and Zambryski P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer Agrobacterium tumefaciens .11 Nature. 1985. V. 318. P. 624-629.94

127. Stark D., Beachy R. Protection against potyvirus infection in transgenic plants: evidence for broad spectrum resistance.// Bio/Technol. 1989. V.7. P.274-276.

128. Stommel J R., Tousignant M.E., Wai T., Pasini R., Kaper J.M. Viral satellite RNA expression in transgenic tomato confers field tolerance to cucumber mosaic vims.// Plant Dis. 1998. V.82. P. 391-396.

129. Susarenko A.J. The role of lypoxygenase in resistance to plants to infection.// In Lypoxygenase and lipoxygenase pathway enzymes. G.J. Piazz. ed.(Champaign IL:AOCS Press). P. 176-197.

130. Tal M., Dehan K., Heikin H. Moiphogenetic potential of cultured leaf sections of cultivated and wild species of tomato.// 1977. Ann. Bot. V.41. P.937-941.

131. Taylor I.B., Al-Kummer M.K. The formation of complex hybrids between Lycopersicon esculentum and L. peruvanum , and their potential use in promoting interspecific gene tr ansfer.// Theor and Appl. Genet. 1982. V. 61. P. 59-64.

132. Terras F.R.G., Torrekens S., Osbom R.W., Van Leuven F., Rees S.B., Vanderleyden J., Cammue B. P. A., Broekaert W.F. A new family of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicaceae species.// FEBS Lett. 1993. V. 316. P.233-240.

133. Terras F. R.G., Eggermont K., Broekart W.F. Small Cysteine-Rich Antifungal Proteins from Radish: Their Role in Host Defense.// Plant Cell. 1995. V.7. P.573-588.

134. Terras F.R., Penninckx I. A., Goderis I.J., Broekaert W.F. Evidence that the role of plant defensins in radish defense responses is independent of salicylic acid.//. Planta. 1998. V.206. P. 117-124.

135. Thevissen K., Ghasi A., Osbom R.W. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins//J. Biological Chemistry. 1996. V.271. P.15018-15025.

136. Thomas B.R., Pratt D. Efficient hybridisation between Lycopersicon esculentum and L. peruvanum via embryo callus. Theor. And Appl. Genet. 1981. V. 62. P. 215-219.95

137. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from acrilxdamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P.4350-4354.

138. Walton J.D. Host-selective toxins- agents of compatibility.// Plant Cell. 1996. V.8. P.1723-1733.

139. Wang G.L., Song W.Y., Ruan D.L., Sideris S. and Ronald P.C. The cloned gene, Xa21, confers resistance to multiple Xanlhomonas oryzae pv. oryzae isolates in transgenic plants.// Mol Plant Microbe Interact 1996 . V.9. P.850-855.

140. Whitham S., McCormick S., Baker B. The N gene of tobacco confers resistance to tobacco mosaic virus in transgenic tomato.// Proc Natl Acad Sci U S A 1996 V.93. P. 8776-8781.

141. Wightman F.// Biosynthesis of auxins in tomato shoots.// Biochem. Soc. Symp. 1973. V.38. P.247-275.

142. Wu G., Shortt B.J., Lawrence E.B. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H202-generating glucose oxidase in transgenic potato plants.// Plant Cell. 1995. V.7. P.1357-1368.

143. Zambryski P., Joos H., Genetello C., Leemans J., Van Montagu M., Shell J. Ti-plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without of their normal regeneration capacity.//EM BO J. 1983. V.2. P.2143-2150.

144. Zhang Z.; Coyne D.P.; Mitra A. Factors affecting agrobacterium-mediated transformation .//J. Am Soc. Hortic. Sc., 1997. V.122. P.3-8.

145. Zhu Q., Maher E.A., Masoud S., Dixon R.A., Lamb C.J. Enhanced protection against fungal attack by constiturtive coexpression of chitinase and glucanase genes in ft-ansgenic tobacco.// Bio/Technology. 1994.12. P.807-812.