Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание и апробация генетико-биохимической тест-системы для мониторинга мутагенности окружающей среды с использованием листьев древесных растений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мирзоян, Арсен Вячеславович

Введение 6-

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Обзор тест- систем, применяемых для выявления мутагенов и общая характеристика мутагенов окружающей среды 9

1.2. Обзор тест-систем с использованием растительных объектов для выявления мутагенов среды 18

1.3. Свободно-радикальные процессы в мутагенезе 27

1.4. Свободно-радикальные процессы и жизнедеятельность растений 35-

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1. Материал

2.1.1. Древесные растения 41

2.2. Эколого-географическая характеристика исследуемых районов г. Ростова-на-Дону 43

2.3. Суточная динамика ХЛ-ответа и накопления МДА в листьях тополя разного возраста. 44

2.4. Оценка чувствительности меристемы зачаточных листьев к стандартному мутагену- нитрозометилмочевине

2.5. Цитогенетические методы.

2.5.1. Цитогенетический анализ зародышевой меристемы листовых почек древесных растений. 45

2.6. Биохимические методы.

2.6.1. Определение содержания малонового диальдегида в листьях древесных растений. 46

2.6.2. Получение хлороформного экстракта липидов.

2.6.3. Определение общих липидов. 47

2.7. Биофизические методы.

2.7.1. Хемилюминесцентный анализ гомогенатов листьев древесных растений. 48

Глава 3. Результаты исследований.

3.1. Суточная динамика ХЛ-ответа и накопления МДА в листьях тополя разного возраста. 52

3.2. Анализ чувствительности меристемы листовых почек к нитрозометилиочевине 58

3.3. Цитогенетический анализ уровня перестроек хромосом в меристеме зачаточных листьев древесных растений в разных районах города. 68

3.4. Анализ интенсивности Н202-индуцированной люминол- зависимой хемилюминесценции гомогенатов листьев тополя из разных районов г. Ростова-на-Дону. ' 77

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание и апробация генетико-биохимической тест-системы для мониторинга мутагенности окружающей среды с использованием листьев древесных растений"

Анализ литературы, посвященной эколого-генетическим исследованиям, свидетельствует, что большая часть публикаций посвящена освещению достижений в разработке разнообразных тест-систем, необходимых для проведения мониторинговых исследований состояния среды. Эта проблема становится все более актуальной, так как интенсивно идущий процесс техногенеза обуславливает необходимость разработки принципов оперативной оценки его последствий. В региональных исследованиях, проведенных на европейской части страны, в Сибири и на Дальнем Востоке, показано, что загрязнение атмосферного воздуха можно считать ведущим параметром дифференциации территории по состоянию среды обитания (Куролап, 1998). С ростом городов и соответственно крупных промышленных центров город уже следует рассматривать как неотъемлемую часть природы. Город представляет собой уникальную концентрацию человеческой биомассы, которая находится в постоянных отношениях с городской средой. Постоянное и непрерывное существование человека в городских условиях требует создания высокочувствительных, предсказательных и сравнительно недорогих тестов для оценки уровня мутагенной активности разнообразных недифференцированных факторов окружающей среды.

Среди более чем 300 известных на сегодняшний день биологических тестов, тест-системы с использованием растительных объектов признаются одними из наиболее чувствительных для определения генотоксичности загрязнителей окружающей среды. В конце 1970-х гг., 26 основных биологических систем были приняты программой US ЕРА Genetic Toxicology для определения мутагенов, кластогенов и карциногенов в окружающей среде. Было показано, что растительные объекты уникальны в своей способности служить как показательные тест-объекты, для мониторинга генотоксикантов, существующих как в простых так и в комплексных формах (Те-НБШ Ма, 1998).

Применение большинства из существующих тестов с использованием растительных объектов сопряжено с рядом трудностей методического, методологического и экономического порядков. Ранее было предложено вести последовательный генетический мониторинг уровня загрязненности участка города с использованием весенних почек древесных растений, используя в каждом районе группы одних и тех же деревьев (Гуськов и др., 1993). Многолетний генетический мониторинг, проводимый в г. Ростове-на-Дону, показал адекватность использования меристемы весенних почек древесных растений в долгосрочном мониторинге среды. Однако, широкое применение данного метода ограничено временем (весна), необходимого для сбора материала. Эти данные носили эмпирический характер и фиксировали состояние среды по оценке уровня аберраций хромосом. В то же время получены многочисленные данные, свидетельствующие о сопряженном протекании процессов свободнорадикального переокисления липидов и изменениями в структуре ДНК, обсуждается возможность участия свободных радикалов различной природы в становлении мутационного процесса. Известно, что большая часть химических веществ способна проявлять свой мутагенный эффект посредством изменения содержания свободных радикалов и концентрации мутагенных продуктов перекисного окисления липидов. Для растений, существующих при постоянно высоких количествах кислорода, образуемого ими в ходе фотосинтеза, эта проблема стоит гораздо острее, т.к. растения часто оказываются в состоянии окислительного стресса, обусловленного образованием повышенных количеств активных форм кислорода в тех или иных структурах клетки. Факторы внешней среды оказывают постоянное влияние на состояние систем генерации активных форм кислорода и, тем самым, способствуют изменению интенсивности окислительных процессов в растительных объектах. Таким образом, анализ интенсивности свободнорадикальных процессов и процессов интенсификации перекисного окисления липидов в листьях древесных растений могут оказаться достаточно эффективной тест-системой для оценки состояния среды, т.к. в этом случае имеется возможность регистрировать и первичные повреждения, происходящие уже на биохимическом уровне. В этой связи нами была проведена серия экспериментов по созданию новой генетико-биохимической тест-системы для длительного мониторинга недифференцированных мутагенных факторов с использованием древесных растений разных видов в качестве тест-объектов.

Целью данной работы было создание генетико-биохимической тест-системы для мониторинга недифференцированных мутагенных факторов среды с использованием листьев древесных растений.

Для достижения поставленных целей нами были сформулированы следующие задачи: оценка кластогенной реакции меристемы зародышевых листьев к стандартным мутагенам. цитогенетический анализ уровня аберраций хромосом в меристеме зародышевых листьев древесных растений, произрастающих в разных районах города Ростова-на-Дону. анализ интенсивности свободнорадикальных процессов в листьях древесных растений методом индуцированной хемилюминесценции. оценка интенсивности перекисного окисления липидов по накоплению малонового диальдегида в листьях древесных растений. использование разработанной генетико-биохимической тест-системы для оценки мутагенности окружающей среды на реперных растениях.