Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Перестройки хромосом в клетках высших растений как показатель мониторинга мутагенов окружающей среды

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Перестройки хромосом в клетках высших растений как показатель мониторинга мутагенов окружающей среды"

- - л Л П

. ; 0 '1

1 о ФЕВ 1Я97

на правах рукописи

ВАРДУНИ ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА

ПЕРЕСТРОЙКИ ХРОМОСОМ В КЛЕТКАХ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ МОНИТОРИНГА МУТАГЕНОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

03. 00. 16. - Экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук •

Воронеж - 1997

Работа выполнена в лаборатории генетики экстремальных состояний Н биологии Ростовского государственного университета.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ - доктор биологических наук,

профессор Е.П.Гуськов, кандидат биологических наук, Т.П.Шкурат

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ - доктор биологических наук,

профессор А.К.Буторина, кандидат биологических наук, Н.Ю.Хлызова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Воронежская государственная

Лесотехническая Академия

Защита состоится " ———" —----1997 г_ в-------час. на заседании

диссертационного совета К 063.48.05 по защите диссертаций на соискание учено! степени кандидата биологических наук при Воронежском государственном университете.

Адрес: 394693 г.Воронеж, Университетская площадь, 1. ВГУ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Воронежского государственного университета.

„ илимлл- ,

Автореферат разослан "---------"--------------1997 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук, доцент

Î.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Современный уровень развития производитель них сил ставит человечество перед необходимостью соизмерять производственную деятельность с состоянием окружающей среды. Техногенная деятельность человека по своему планетарному значению становится сопоставимой с эффективностью естественного эволюционного процесса.

Проблемами экологической генетики занимаются многие государственные и общественные организации. В 1969 г в США создано Общество по изучении мутагенов среды (Environmental Mutagen Society - EMS). Аналогичные общества были созданы в Европе и Азии. В 1973 г. основана Международная ассодоация обществ по изучению мутагенов среды (International Association of Environmental Mutagen Societies - IAEMS). В Советском Союзе при Государственном Комитете СССР по Науке и Технике была создана специальная секция "Генетические аспекты проблемы "Человек и биосфера", которая до сих пор координирует работу многих научно-исследовательских учреждений, занимающихся изучением мутагенных факторов в окружающей среде.

Многочисленные промышленные предприятия влияют на природные и урбанизированные экосистемы, загрязняют окружающую среду, воздействуют на здоровье людей и биологические объекты как тератогены и мутагены, поэтому проблема методологии оценки генетической опасности мутагенов стоит достаточно остро. Однако существующие тест-системы довольно сложны и требуют дорогостоящего оборудования и реактивов. В этой связи в нашей работе была проведена серия экспериментов для оценки возможности использования лиственных древесных растений в качестве тест-объекта для выявления мутагенного эффекта недифференцированных факторов окружающей среды и предложен тест с использованием меристемы аачаточных листьев весенних почек.

Цели и задачи исследования. Цельи данной работы было создание долговременной тест-системы мониторинга недифференциро-

ванных мутагенов окружающей среды с использованием древесных растений.

Для достижения поставленных целей нами были сформулированы следующие задачи:

- оценка эффективности проникновения мутагенов в покоящееся почки растений с помощью радиоизотопного метода;

- оценка чувствительности меристемы зародышевых листьев к стандартным мутагенам;

- цитогенетический анализ меристемы зародышевых листьев деревьев, произрастающих в экологически-неблагоприятных районах г. Ростова-на Дону;

- сравнительный анализ предлагаемой тест-системы с используемыми ранее тестами для определения генотоксичности окружающей среды;

- анализ чувствительности меристемы различных древесных растений для оценки генотоксичности окружающей среды патрии Те-мерника;

- оценка эффективности предлагаемого теста в многолетнем мониторинге.

Научная новизна и практическая ценность работы.

^Впервые предложен метод оценки генотоксичности окружающей среды с использованием зачаточных листьев почек древесных растений. Предлагаемый нами метод позволяет, используя весенние зачаточные листья древесных форм растете!, вести последовательный многолетний генетический мониторинг уровня загрязнения участка города, анализируя в каждом районе группы одних и тех же деревьев, выбранных в качестве постоянного репера.

Предлагаемый нами метод анализа, вероятно, можно применить и для построения кривой доза - эффект в районах глобальных катастроф на основе ретроспективного синтеза ситуации. Для этого необходимо, используя один уши несколько видов многолетних растений, относящихся к различным радиотаксонам, составить карту уровня аберраций хромосом по мере удаления от центра экологической катастрофы; получать в один и тот ке сезон данные анализа на почках, срезанных с побегов разного возраста одних и тех же деревьев, что позволит сравнить различия по эффективности воздейс-

хвня мутагенов, накопившихся в период 1-5 лет; сравнить результаты модельных экспериментов на интактных видах для установления дозы мутагена и в ряде ситуаций провести высев тестерных генетически маркированных форм травянистых однолетних растений для сравнительной оценки дозы, полученной аборигеном и модельным организмом в течение сезона. Подобное сочетание результатов, полученных на природных и модельных объектах, может дать важную информацию как об уровне изначальной дозы мутагена, если она не была установлена, так и степени генетической эффективности радионуклидов.

Использунмый тест позволяет предположить наличие корреляции между результатами цитогенетического анализа и заболеваемостью населении города. В связи с этим мы сочли необходимым проанализировать распределение частот различных болезней у детей, проживающих в районах города, где на протяжении нескольких лет наблюдается повышенный уровень мутагенов в окружающей среде (структура детских болезней, по сравнению со взрослыми, более адекватно отражает влияние факторов среды на здоровье, так как дети большую часть времени проводят в районе проживания).

По данным Госсанэпиднадзора Ростовской области, на протяжении 1989-1991 гт., частота новообразований у детей регистрировалась в 2-4 случаях на 1СС0 детского населения, в 1992 г в Кировском, Октябрьском и Ворошиловском районах (центр города) их частота увеличилась более чем вдвое и составила соответственно: 8,0%; 9,2%; 7,1%. Врожденные аномалии и пороки развития у детей на протяжении 1989 и 1990 гг. регистрировали в среднем у 10 детей из 1000, независимо от места проживания ребенка. Начиная с 1991 г., число врожденных аномалий возрастает у детей проживающих в Кировском, Ленинском, Октябрьском и Советском районах более чем в 3 раза и достигает 35,7%; 43,9%; 34,0% и 31,34% соответственно (Кондратенко Т.Д., н др. 1995). Пик мутагенной активности в исследуемых районах наблюдался в 1990-1993 гг. Последующее снижение концентрации мутагенов в окружающей среде возможно произошло за счет общего спада уровня промышленного производства, связанного с экономической обстановкой в стране. Оно не отразилось на численности заболеваний у детей, существенно изменив спектр заболеваний, в связи с сохранением токсикантов, промута-генов и мутагенов з течении длительного времени в окружающей

среде, в частности, в почве.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 5-ти печатных работах.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 1-й Международной конференции "Экология города" (Ниш, Сербия, 1992), на конференции молодых ученых Ростовского госуниверситета (Ростов-на-Дону, 1993; 1995 гг.), на 3-й Международной конференции "Экология города" (Ростов-на-Дону, 1994), на конференции молодых ученых Ростовского Госпедуниверс.итета (Ростов-на-Дону, 1995),на заседании лаборатории "Генетики экстремальных состояний" и Ученого совета НИИ Биологии (Ростов-на-Дону, 1995), на Российско-Американском конгрессе "Экологическая инициатива" (Воронеж, 1998). ■

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов работы, их обсуждения, 7 выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 154 страницы основного текста, 22 таблицы, 15 рисунков, 6 гистограмм. Список цитируемой литературы включает 106 работ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были исследованы следующие виды растений: тополь дельтовидный (Populus deltoides ), ива вавилонская (Salix baby-lonica), вяз приземистый (Ulmus pumila), выращенные в совхозе "Декоративные культуры" (Ростов-на-Дону) и, согласно генеральному плану озеленения г. Ростова-на-Дону, высаженные в 1970-1990 гг. в разные районы города. Всего было проанализировано около 100 деревьев , при этом в каждой точке анализировали не менее трех деревьев.

Скорость проникновения мутагенов б почку древесного растения была оценена с помощью радиоизотопного метода. В качестве метки использовал}! тритиевун воду и симазин (2-хло-ро-4,8-бис(зтиламин)-симм-триазин(М 201.7), меченый по углероду. Появление метки в почках растений обнаруживали с помощью жид-

костного сцинтилляционного счета на сцинтилляционном спектрометре SL-3000 (Франция).

Для цитогенетического анализа в весенний период с 10 по 30 марта 1990- 1995 гг. срезали побеги деревьев с почками. Фиксацию, окрашивание и приготовление давленных препаратов осуществляли по стандартной методике (Гостимский С.А., 1974) с некоторыми модификациями. Внутрнпочечный зачаток растений фиксировали в смеси спирта и уксусной кислоты (3:1). Во всех вариантах фиксировали отдельно почки верхней и нижней частей побега. Структурные изменения хромосом учитывали анафазннм методом на временных давленных препаратах, окрашенных молочно-уксусным орсеином. В каждом варианте просматривали имеющиеся анафазы в 10-15 зачаточных листьев почек (1000 анафаз).

Цитогенетический анализ корневой меристемы фасоли (Phaseolus vulgaris) проводили по стандартной методике (Гостимский С.А., 1974).

Анализ мутагенной активности экологических проб атмосферных осадков, ила и почвы проводился по стандартной методике Эймса (Ames,1982) с метаболической активацией (для выявления промутаге-нов) и без нее. Были использованы следующие тестерные штаммы Salmonella typhimurium: TA97a, TA98, TA100, TA102. Благодаря различию в мутациях по гистидину эта батарея штаммов позволяет выявить весьма широкий спектр мутагенов с различными механизмами действия. -

Дождевые осадки фильтровали через мембранные фильтры диаметром 20мкм. В пробирки с полуобогащенным агаром вносили по 0.1мл тестируемого вещества (дождевых осадков), 0.1мл ночной культуры индикаторного штамма и 0.5мл полной ' активирующей смеси. Пробы почвы отбирались в местах произрастания изучаемых деревьев. К Юг сырого веса почвы добавляли 20 мл эксграгента и 0,5ч интенсивно перемешивали на магнитной мешалке. Затем пробы стерилизовали, последовательным фильтрованием через батареи фильтров, последний из которых имел диаметр пор 0,2мкм.

Эколого-генетический мониторинг проводился в период с 1990-1995гг. в трех различных патриях города Ростова-на-Дону.

Первая патрия была представлена центральной частью города, промышленными районами, жилыми кварталами и автомагистралями.

Вторая патрия города расположена вдоль реки Темерник, в ко-

торуш сбрасываются стоки практически всех промышленных предприятий города Ростова-на-Дону.

Третья патрия расположена за Западной частью города и представляет собой промышленную зону (пос. Чалтырь).

Результаты подвергали статистической обработке по критерию Стьюдента-Фишера.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Радиоизотопный анализ показал, что наилучшей способность ю накапливать соединения из растворов обладают деревья ивы; хорошую скорость накалления имеют вяз; наиболее инертен из рассмотренных нами видов деревьев оказался тополь. Полученные результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том что вещества со значительно большей молекулярной массой, чем у воды могут легко поступать в почки древесных форм растений.

Таблица 1

СКОРОСТЬ ПРОНИКНОВЕНИЯ ТРИТИЕВОЙ ВОДЫ Н' И СИМАЗИНА С14 В ЗАРОДЫШЕВЫЕ ПОЧКИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ДЕРЕВЬЕВ

1------ | Растения -т- "Г | Время, ч | 1 1 1 | Количество Н3 1 радиораспадов в с, Бк| С14 |

1 1 1 1 2 | 1 | 3 1 1 1 4 | 1 1

\ Ива 1 1 | 24,00 | I 48,00 | ( | 435,80^ 1063,75* I 1 | 428,58* | 1 1010,90* | | 1

1 Вяз 1 1 | 24,00 | | 48,00 | 472,18' 705,72г I 1 | 426.23* | | 674,55* | I 1

| Тополь 1.,7..и........ | 24,00 | | 48,00 | |168,00 | 20,30 40,47* 457,27* 1 I | 16,33 | | 31,53 | | 339,58* | > "

- достоверное отличие количества радцораспадов в секунду в почках данного дерева от контроля;

3.2 Цитогенетический анализ чувствительности меристемы листовых почек тополя к стандартным мутагенам НММ и ДМС.

В тестах Эймса на штамме Salmonella ТА 100 НММ оказался эффективным дозозависимым мутагеном, начиная с концентрации 0,1 % и выше, что и определило выбор дозы позитивного контроля на растениях. Цитогенетический анализ показал, что НММ в клетках меристемы зачаточных листьев увеличивает выход аберраций хромосом более чем в 10 раз и эти объекта по относительной чувствительности к воздействию вышеназванных мутагенов вполне сопоставимы.

3.3 Зколого-генетический мониторинг городской патрии Ростова-на-Дону.

Результаты анализа уровня перестроен хромосом в клетках зачаточных листьев побегов тополя, взятых в различных районах города, приведены в таблице 2.

Таблица 2

УРОВЕНЬ АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ В КЛЕТКАХ ВНУТРИПОЧЕЧНЫХ ЛИСТЬЕВ

ТОПОЛЕЙ ИЗ РАЗНЫХ РАЙОНОВ г. РОСТОВА- НА- ДОНУ 1990 г.

1 —' - - 1 |Район, предприятие 1 ! • Кол-во1 дерев.| Всего анафаз Анафаз с АХр % клеток с АХр т m ! р 1

! (Совет, р-н,зеленая з. ( 4 i 750 5 0,7 * 0,09

! (Октяб.р-н, автомаг-ль 1 3 1 400 34 6,0 ± 1,19 <0,001|

! |Первом.р-н,з."Гранит" 3 1 450 20 4,5 ± 0,94 <o,ooi!

1 1 Первом.р-н,автомаг-ль ■ 4 I 500 9 1,8 ± 0,59 >0,1 |

1 |Пролет.р-н,"Кр.Аксай" 4 I 500 11 2,2 * 0,69 <0,05 j

1 |Пролет.р-н,Мебел.$-ка 1 ,._ ._,. .. - 4 i 1 500 23 ...... 4,6 ± 0,93 <0,001| 1

Как видно из представленной таблицы 2, уровень перестроек хромосом в зародышевых листьях почек тополя достаточно объективно отражает степень загрязненности районов и может служить интегральным показателем мутагенности факторов окружающей среды.

Незначительное количество клеток с аберрациями хромосом (АХр) было зарегистрировано у растений, произрастающих в "экологически чистой" - Зеленой зоне города. В Центральной части города {Октябрьский район) через которую проходит автомагистраль с интенсивным потоком транспорта, обнаружено значительное превышение уровня аберраций хромосом в листовой меристеме тополя по сравнении! с зеленой зоной и Восточной автомагистральк города (Первомайский район). Уровень АХр в этой части города превышал контрольные значения более чем 8 раз, и в 4,7 раза уровень АХр зарегистрированный в районе Восточной автомагистрали города. У растений, находящихся вблиаи крупных промышленных предприятий, также отмечено достоверное увеличение количества аномальных анафаз по сравнению с зеленой зоной.

3.4 Сравнительный анализ предлагаемой тест-системы с используемыми ранее тестами для определения генотоксичности окружающей

сред";

Содержанке мутагенных веществ в окружающей среде городской патрни было нами оценено с помощью широко используемого для этих целей метода учета точковых мутаций у Salmonella typhimurium (тест Эйыса). Атмосферные осадки (дождь, снег) были собраны нами в период 1992-1993 гг в различные времена года. Осадки собирали одновременно во всех частях города в начале дождя (0 -Юмин) или в начале выпадения снежных осадков (0 - 20мин), т.к. первые капли дождя аккумулируют наибольшее количество веществ, находящихся в воздухе. Результаты оценки генотоксичности атмосферных осадков представлены в таблице 3.

Данные .приведенные в таблице 3, показывают значительный мутагенный эффект атмосферных осадков, выпавших в весенний период в районах Мебельной фабрики и автомагистрали Первомайского района в течении двух лет. Повышенный уровень мутагенности атмосферных осадков наблкдался в летний период в центре города. Повышение уровня мутагенности атмосферных осадков было зарегистрировано

весной 1993 г. ив Зеленой зоне. Как видно га таблицы 3, мутагенная активность в тесте Эймса зависит не только от времени года, но и от иныя недифференцированных факторов.

Таблица 3

Определение мутагенной активности атмосферных осадков в различных районах города Ростова-на-Дону.

! - iСезон, I год,Штамм 1 | ..... Зел. зона Центр автома гистр Пролет| автома-| гистр | -г Пролет| ж/масс| 1 1 Меб. ф-ка 1 |Перв.р |автома-|гистр 1 1 Перв.р) ж/м |

1 ¡ТА 100 SВесна 1992 ЦА 98 1 — + f ] 1 1 +++ +■ 1 ++ "" I

] |ТА 100 |Лето 1992 ITA 102 : ++ ■М-+ " I 1 i | _ i 1

1 (III II t 1 ITA 100 j- 1- 1 - 1 - i - 1 - 1 - 1 |Зима 1992 Iii I II ! 1 ITA 98 | - | - | - | - | - | - | - | 1 i i i i t i Ii

i ITA 100 |Весна 1993 ITA 98 i„ и ______ т-Ч* 1... .. .....(. 1 1 +++ 1++ 1 ++ ( _________ J

+ - мутагенность пробы достоверно превышает контрольную, но менее, чем в 2,5 раза, слабая мутрлеенность \ ++ - средний показатель, от 2,5 до 10 раз; +++ - сильная мутагенность, от 10 до 100 раз.

По данным городского санзпидемнадзора в центре города и Первомайских районе зарегестрировано значительное превышение ПДК по среднегодовым концентрациям пыли, оксида углерода , формальдегида, оксидов азота и свинца.

Сравнивая эффективность предложенной нами тест-системы с

используемыми стандартными тестами для определения генотоксич-ности окружающей среды можно сказать , что древесные растения адекватно оценивают уровень мутагенов в окружающей среде.

3.5 Мутагенная оценка окуружающей среды патрии р. Темерник, протекающей в черте г. Ростова-на-Дону.

Для патрии р. Темерник характерно многообразие источников поступления загрязняющих веществ и широкий их спектр. С водоба-лзнсоеой точки зрения р. Темерник может рассматриваться как сточная артерия , вбирающая в себя отходы коммунальных служб, промышленных и седьско-хозяйственных предприятий. Примерно из 90-100 тыс. метров кубических водной массы, сбрасываемой в реку Дон, 5% приходится на естественное питание (ключи, родники и т.д.), около 10% составляет Донская вода, перекачиваемая в Ростовское море из района г. Аксай, и 85% - коммунальные стоки и стоки с промышленных предприятий, сбрасываемых через канализационную сеть в районе зоопарка. По данным Облкомприроды Ростовской области большинство источников загрязнения являются нерегламен-тнровалными и практически не изученными с точки зрения химизма, т.к. большт процент промышленных отходов сливаемых в р. Темерник приходится на предприятия военно- промышленного комплекса, сливные материалы которых являются секретными данными.

Б патрии реки Темерник расположено большое количество свалок. В 1994 г. их насчитывалось около 70-ти. Промывка свалок талыми и дождевыми водами неминуемо создает прецеденты попадания в р. Темерник дополнительных масс недифференцированных загрязняющих веществ.

Также в долине реки располагаются места захоронения твердых городских отходов. Их превращение в селитебные зоны (разбивка вдоль русла реки садовых участков) приводит к созданию дополнительного антропогенного прессинга ка подземные воды, питающие р. Темерник. Опыление ядохимикатами садовых деревьев вызывает прямое негативное воздействие на водоемы и водотоки Темерника.

В патрии реки Темерник нами была проведен скрининг мутагенов окружающей среды. Уровень мутагенности составных частей экосистемы (т,е. иловые отложения, наддонная вода, речная взвесь) дан-

ной патрии был оценен о помощью следующих тест-систем: - теста Эймса, используемого для учета частоты возникновения генных мутаций; - корневой меристемы однолетних растений; - многолетних деревьев ( тополь, вяз, ива).

3.5.1 Оценка мутагенной активности речной взвеси.

В качестве независимого параллельного теста который используется как стандарт однократной оценки воздействия мутагенных факторов на эукариотические организмы для наиболее загрязненного недифференцированными мутагенами русла р. Темерник, была использована меристема корневых клеток фасоли. Фасоль проращивали в речной взвеси, взятой из различных участков р. Темерник. Обработку, Фиксацию и окрашивание материала проводили по стандартной методике (Гостимский, 1974). Пробы взвеси были взяты в следующих точках на протяжении реки: первая точка сбора материала была расположена в верховьях реки Темерник (п. Каменка). Хотя здесь отсутствуют выбросы промышленных предприятий, по данным лаборатории гидробиологии ГОШ биологии при РГУ, зарегистрировано большое количество тяжелых металлов (Си, 2п, РЬ, Мп), которые попадают в процессе постоянного стока с полей. В районе Зоопарка в Темерник начинают поступать сливы с промышленных предприятий. Их число увеличивается в районе Ботанического сада и достигает 44 в районе Железно-дорожного вокзала. Основу загрязненных вод составляет тяжелые металлы, нефтепродукты, фенолы и др. химические вещества. Контрольные растения проращивали на дистиллированной воде (табл 4).

Как видно из данных, представленных в таблице 4, во всех исследуемых точках, пробы речной взвеси индуцировали повышенный уровень аберраций хромосом в корневой меристеме фасоли. Наиболее значительное превышение уровня аберраций хромосом в корневой меристеме Фасоли было зафиксировано в районе Ботанического сада и Железнодорожного вокзала, этот уровень превышал контрольные значения в 16 и 12 раз соответственно.

Таблица 4

УРОВЕНЬ АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ В КОРНЕВОЙ МЕРИСТЕМЕ ФАСОЛИ, ВЫРАЩЕННОЙ В РЕЧНОЙ ВЗВЕСИ, ВЗЯТОЙ В РАЗЛИЧНЫХ РАЙОНАХ р. ТЕМЕРНИК

1- I Район --г-............. |Всего |анафаз 1 1------ "V ] Анафаз) 1 с Ахр | 1 1 % клеток с Ахр TIT -1 • Р 1

| контроль 1 |500 1 1 1 ! 1 ! j | 0,2 ~ 0,19

| Зоопарк 1 ¡500 1 1 ю 1 1 ] 2,0 = 0,62 <0.01 |

! Бот.сад 1 |500 1 12 I 1 1 2,4 I 0.68 <0.001 |

I Каменка 1 1500 | 1 9 1 1 I 1,8 * 0.59 <0.01 1

1 1 ! Ж/Д вокзал 1500 > > 1 1 ! 16 1 " | 3,2 - 0,73 <0.001 | 1

3.5.Е Использование теста Эймса для для определения мутагенности проб ила из исследуемых точек реки Темерник.

Пробы ила из реки Темерник были взяты е двух точках:

1. В районе зоопарка (10ы выше автомобильного моста на Змеевскую балку, у левого берега).

2. 200м ниже Железнодорожного вокзала, у правого берега. Результаты исследования представлены в таблице 5.

По результатам опыта можно заключить, что в пробе из района зоопарка много сложных органических мутагенов, а в районе автовокзала преобладают более простые по структуре агенты. В пробе из района ж/д вокзала вероятны продукты разложения веществ из района зоопарка.

Таблица 5

Мутагенная активность проб ила, взятых в р. Темерник

1- 1 | Точка 1 1 | штамм 1 ! ТА97а | ТА98 ТА 100 ТА 102 |

1 |активация | 1 : 1 |+39 I -Зэ) 1 1 I 1 +39| -з9 г +зэ 1 ^ 1 1 1 +53| -39| ; |

1 ! зоопарк ] 1 ! 1 ! «■* 1 - 1 1 [ 1 +1 + 1 + I 1 + 1 1 1 -1+1 1 1

| жел.вокзал 1 - - 1 1 1+1-1 1 1 1 1 - I -1 + 1 1 + 1 1 + 1 ++ 1 , ..!., 1

-Б "-вариант с метаболической активацией; -5'" - вариант без метаболической аишватт; + - мутагенность пробы достоверно превышает контрольную, но менее, чем в 2,5 раза, слабая мутагенность; ++- средтш показатель, от 2,5 до 10 раз; '+++ - сильная мутагенность, от 10 до 100 рва.

3.5.3 Учет хромосомных аберраций в зачаточных листьях почек древесных растений тополя, вяза и ивы - как интегральный по. казатель мутагенности окружающей среды.

Исследования проводились на протяжении 2-х лет (1994 -1995гг.) на реперных деревьях, которые произрастали на всем протяжении реки Темерник, протекающей в черте города Ростова-на Дону. В каждой зоне различные породы деревьев располагались не дальше Юм друг от друга и не далее чем 5м от воды. Контрольным был выбран участок зеленой зоны, расположенный на расстоянии 10 км от реки Темерник, на котором росли все исследунмые деревья, необходимые для наших исследований. В каждом варианте анализировалось по 3 дерева каждого вида и учитывалось по 1000 анафаз. Как видно из полученных результатов (табл. 6), у всех деревьев, произрастающих вдоль берега реки Темерник, в 1994 г. было зарегистрировано достоверное увеличение хромосомных аберраций (АХр) в меристеме почек по сравнению с контрольными растениями. Причем у тополя эти значения превышали контрольные более чем в 6 раз, у ивы более чем в 5 раз, у вяза более чем в 4 раза. Уровень АХр варьировал у тополя от 3.5% до 5.0%; у ивы от 3.8% до 5.4%; у вя-

за от 4,ОХ до 5.0%. Результаты цитогенетического анализа пред -ставлены в таблицах 6 и 7.

Достоверных различий в уровне аберраций хромосом между верхней и нижней почками всех исследованных деревьев не выявлено.

В 1995 г. танже было зарегистрировано достоверное увеличение хромосомных аберраций в меристеме почек по сравнению с контрольными растениями. Уровень аберраций хромосом на протяжении двух исследуемых лет в почках деревьев, произрастаншри вдоль реки Ге-мерник не изменился. У ивы, растущей в районе Ботанического сада он увеличился более чем в 2 раза.

Данные цитогенетического анализа показывают, что достоверные отличия не обнаружены ни между деревьями одного вида, растущих в разных районах, ни между экземплярами разных видов. Спектр распределения хромосомных перестроек у различных видов деревьев показал, что относительная частота хромосомных аберраций у деревьев контрольной зоны практически одинакова, и доля хромосомных и хро-матидных перестроек распределена равномерно. Однако, у вязов и тополей растущих в районе Каменки, более 30% аберрантных клеток имели множественными хромосомные перестройки, что сопоставимо с результатами, полученными на меристеме фасоли,

3.6 Оценка уровня мутагенов в окружающей среде промышленной патрш с. Чалтырь.

Первая точка сбора материала была расположена в Восточной части села в районе крупнейшей бензозаправочной станции, расположенной перед въездом в г. Ростов - на - Дону. Вторая точка сбора материала была расположена в Центре села, остальные в районах промышленных предприятий : Кирпичного и Асфальтового заводов.

Уровень загрязняющих веществ, выбрасываемых в атмосферу стационарными источниками и автотранспортом, расположенными в Западной промзоне (п. Чалтырь), по результатом наблюдения на постах взвешенными веществами, оксидом углерода, оксидами азота, бенз(а)лиреном выше среднего по стране.

Таблица 6

УРОВЕНЬ АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ В КЛЕТКАХ МЕРИСТЕМЫ ВНУТРИПОЧЕЧНЫХ ЛИСТЬЕВ РАСТЕНИЙ ПРОИЗРАСТАЮЩИХ ВДОЛЬ РЕКИ ТЕМЕРНИК 1994 г.

Г— т | Район -г ВИД 1 растен| 1 ---- — [ кол-во1 дерев.| i всего | анафаз| из них с Ахр Т' |% АХр I 1994 ¡ > t m | 1 i

! Контрод. | зона тополь 1 ива | вяз | 3 1 3 1 3 1 1000 | 1000 | 1000 | 5 а 16 1 i 0,5 - ! 0,8 ± 1 1,61 1 1 0,22 i 0,28 ! 0,40 | 1

1 Северн. I район тополь! ива ) вяз | ! 3 1 3 ! 3 1 1000 | 1000 i 1000 | 30 48 35 1 i 3,0 -1 4,8 ~ Í 3,5 -¡ i 0,53* i 0,68* | 0,58* | j

| Каменка тополь 1 ива | вяз | 3 I 3 I 3 | 1000 | 1000 ¡ 1000 i 40 49 45 1 4,0 i 1 4,9 - 1 4,5 -i ! 0,62* 1 0,68* ! 0,65* | i

| Зоопарк тополь| ива 1 вяз ! 3 1 3 ! 4 1000 | 1000 i 1000 i 46 54 50 I 1 4,6 = 1 5,4 - ! 5,0 -) 1 0,66* | 0,71* | 0,69* I i

| Ботанич. ! сад тополь| ива | вяз | з 1 з 1 з 1 1000 | íooo ! 1000 1 50 46 50 I i 5,0 i 1 4,6 s 1 5,0 - i 0,69* | 0,66* | 0,69' |

| Мелезно-! дорожн. | вокзал | | тополь 1 та | вяз | 1 з ! з 1 з ! 1 1000 | 1000 | 1000 | _________ 1 45 48 50 1 4,5 -I 4,8 - 1 5,0 -< 0,65* | 0,68* ! 0,69* | l

* - достоверное оттчие уровня хромосомных аберраций дерева данной зоны от контроля;

Таблица 7

УРОВЕНЬ АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ В КЛЕТКАХ МЕРИСТЕМЫ ВНУТРИПОЧЕЧНЫХ ЛИСТЬЕВ РАСТЕНИЙ ПРОИЗРАСТАЮЩИХ ВДОЛЬ РЕКИ ТЕМЕРНИК 1995 г.

1--------------г | Район вид | -г кол-во i всего | из них с i i АХр £ m 1

растен I дерев. анафаз| Ахр | 1994 1 I

| Контрол. тополь| 3 1000 J Б 1 0,6 ± 1 0,24 }

| зона ива | з • 1000 i 8 ! 0,8 - 0,28 |

вяз | 3 1000 | 16 1 1,6 - 1 0,40 | 1

| Северн. тополь| 3 1000 | 35 1 1 3,5 2 1 0,58* |

| район ива | 3 1000 [ 49 1 4,9 - 0,68" I

вяз 1 4 1000 1 30 1 3,0 = 1 0,53" | i

| Каменка тополь I 3 1000 1 42 1 1 4,2 1 1 0,64* |

ива | 3 1000 1 40 I 4,0 - 0,62' [

вяз | 4 1000 I 48 I 4,8 -1 0,68" | I

| Зоопарк тополь| 3 1000 | 45 1 1 4,5 ± 1 0,66" |

ива | 3 1000 | 54 i 5,4 ; 0,71' |

вяз | 3 1000 1 50 i 5,0 * i 0,69" | 1

| Ботанич. тополь| 3 1000 1 51 1 i 5,1 = i 0,69" |

1 сад ива | 3 1000 1 25 1 2,5 - 0,36" |

вяз | 4 1000 | 50 ! 5,0 ¿ 1 0,69" | f

| Железно- тополь| 3 1000 1 45 1 I 4,5 1 1 0,65" |

1 дорожи. ива | 3 1000 1 50 1 5,0 - 0,69* |

| вокзал 1_ вяз | , „1 3 1 1000 1 1 49 1 4,9 i 0,68" I l

- достоверное отличие уровня хромосомных аберраций дерева дайной зоны от контроля;

Средние за год концентрации в Чалтырм составили по; 5енз(а)пирену 3,6 ПДК, взвешенным веществам 2 ПДК, оксидам азота 1,3 ПДК. Содержание в воздухе диоксида серы и хлористого водорода - 5,7 ПДК, оксида углерода - 3 ПДК, диоксида азота 7,5 ПДК, эксида азота 4,7 ПДК, хлористого водорода 5,7 ПДК.

Выбросы от автотранспорта составляют 44,1" от суммарного выброса, в том числе оксида углерода - 49,9%, оксидов азота 12,6%, углеводородов 81%.

Цитогенетические исследования меристемы листовых почек деревьев тополя, произрастакшщх в пригородной патрии с. Чалтырь, проводили одновременно на 2-3 деревьях, отстоящих друг от друга на расстоянии не более 10 м. Так, достоверные отличия по отношению к зеленой зоне выявлены в районе кирпичного завода и бензозаправочной станции. Достоверных различий в уровне аберраций хромосом между деревьями, взятыми в одной точке не наблюдал)!, з то время как такие отличия регистрировались между различными частями города.

3.7 Оценка эффективности предлагаемого теста в многолетнем мониторинге.

Многолетний мониторинг оценки уровня мутагенов в окружающей среде проводился в городской патрш1 г. Ростова-на-Дону.

Как видно из таблицы 8, в которой представлены данные за последние 4 года (1990-1993 гг.), уровень перестроек хромосом в зародышевых листьях почек тополя достаточно объективно отражает степень загрязненности районов и может служить интегральным показателем мутагенности факторов окружающей среды.

Незначительное количество клеток с аберрациями хромосом было зарегистрировано у растений, отобранных в экологически чистой зоне города, при этом не было зарегестрировано достоверных отличий в уровне Ахр. в этой зоне на протяжении 4-х лет. Так в 1990 году этот уровень составил 0,7*0,09%; 8 1991 - 0,67+0,47%; в 1992 - О,5+0,39%; В 1993 - 0,6+0,15%. В остальных районах города уровень аберраций хромосом был увеличен практически вдвое, однако достоверные изменения были зарегистрированы в центре города (район ЦГБ), где уровень аберраций хромосом превышал контрольные значения более чем в 5 раз на протяжении всех лет исследования.

Так в 1990 году этот уровень составил 6,0+1.19%; в 1991 - 3.37 +0.64%;в 1992 - 2.6+0.93% И в 1993 - 3.33+0.922.

Таблица 8

УРОВЕНЬ АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ В КЛЕТКАХ ВНУТРИПОЧЕЧНЫХ ЛИСТЬЕВ ТОПОЛЯ ИЗ РАЗНЫХ РАЙОНОВ г. РОСТОВА-НА-ДОНУ (1990-1993 гг;

1 |Район, | предприятие | Кол-во дерев. ?£АХр ± Ш 1990 Шр ± га 1991 % АХр * ш 1992 %АХр аг щ 1993

1 1 (Зеленая зона | 4 0,7 ± 0,09 0,7 +0,47. 0,5 ± 0,39 0,6 ± 0,15

1 [Октябрьский 1р-н, центр Iгорода 4 6,0 ± 1,19" 3,4 ± 0,64" 2,6 + 0,93 3,3 ± 0,92

1 |Первомайский |р-н, завод |"Гранит" I 4 4,5 £ 0,94" 1,5 + 0,42 1,0 + 0,49 1,9 + 0,51

! I Первомайский )р-н,автома-|гистраль 4 1,8 ± 0,59 4,8 + 1,66" 1,3 ± 0,66 2,0 ± 0,65

1 1 Пролетарский |р-н, завод |"Кр. Аксай" • 4 2,2 + 0,69 4,2 £ 0,12" 1,1 ± 0,49 1,7 ± 0,69

- достоверное отличие уровня хромосомных аберраций дерева данной зоны от контроля;

В центральной части города через которую проходит автомагистраль с интенсивным потоком транспорта, показано значительное превышении уровня аберраций хромосом по сравнению с участком автомагистрали Первомайского района, где движение транспорта менее интенсивно. У растений, находящихся вблизи крупных промышленных

предприятий, также отмечено достоверное увеличение количества аномальных анафаз по сравнению с зеленой зоной. Значительный уровень аберраций хромосом на протяжение всех исследуемых лет зарегистрирован в районе автомагистрали, расположенной в Восточной части города и в районе Мебельной фабрики.

Следует отметить, что во всех исследованных районах, за исключением автомагистрали и центра города, аберрации хромосом были представлены в основном хроматидными фрагментами, а в наиболее загрязненных районах города регистрировали увеличение числа хромосомных мостов.

Предлагаемый метод позволяет, используя древесные формы растешй, вести последовательный многолетний мониторинг уровня загрязнения участка города, используя в каждом районе группы одних и тех же деревьев, выбранных в качестве постоянного репера.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные нами результаты оценки мутагенной активности комплексных факторов окружающей среды в различных патриях г, Ростова, показывают, что уровень аберраций хромосом в зачаточных листьях древесных растений адекватно отражает степень реального загрязнения окружающей среды веществами, которые вызывают изменения генетического аппарата соматических клеток растений.

Для мониторинга мутагенов в окружающей среде в настоящее время используют широкий спектр различных тест- систем, в том числе и на растительных объектах. В последние годы широко применяются для этих целей тест -системы с использованием растений, которые можно условно разделить на 3 основные группы:

- использование генетически чистых линий, с помощью которых оценивают эффективность индивидуальных мутагенов, в основе которых лежит анализ способности различных веществ индуцировать точ-ковые мутации;

- использование травянистых форм для анализа недифференцированных мутагенов среды, где учитываются точковые мутации, аберрации хромосом в соматических клетках и влияние факторов среды на морфогенез ;

- использование древесных растений для многолетнего мониторинга.

Первая группа тест-систем использует генетически-чистые

линии. Используемые ею объекты удобны дли проведения модельных экспериментов, но мало приемлемы для оценки недифференцированных мутагенов в окружающей среде. Полученные в этих системах данные для определенных концентрации мутагена невозможно сопоставить о оценкой эффективности стандартных мутагенов для окружающей среды. Также существенной трудностью данной группы тест-систем является то, что требуется значительное время для поддержания генетической чистоты исходного генетического материала;

Вторая группа тестов применяется для учета недифференцированных мутагенов окружающей среды в травянистых формах растений. Однако, она имеет ряд существенных недостатков. Это связано с меньшей устойчивостью травянистых форм к резким колебаниям климатических условий, которые в значительной степени усложняют анализ, маскируя возможности выделения чисто мутагенных факторов среды химической природы, и отсутствием четкой дифференцировки междувлиянием естественных и искусственных факторов среды, изменяющих анализируемые характеристики растений. Кроме того, травянистые формы растений непригодны для длительного мониторинга окружающей среды. В связи с этим для многолетнего мониторинга наиболее пригодны древесные формы растений, которые относятся к третьей группе тест-систем. Наиболее часто для генетического мониторинга используют породы хвойных деревьев, в частности, сосну обыкновенную, из-за наличия у них гаплоидного макрогаметофита (эндосперма). (Горьшина, 1991). Е то же время, сосна является эндемичным растением для многих регионов России и произрастает на песчаных почвах, в которых большое число мутагенов вымывается не задерживаясь. По этой причине она может быть универсальным объектом для многолетнего мониторинга.

В работах Погосян (Погосян B.C. и др. 1991 г.) в качестве объекта для многолетнего мониторинга было предложено использовать виноград. Этот метод оказался очень эффективным для генетического мониторинга в городских условиях Еревана, но вряд ли его ыо*но применить в городах России.

Попытки использовать меристему листьев как показатель мутагенности неоднократно предпринимали различные исследователи, однако не получили широкого применения из-за низкого митотического индекса, плохого качества окрашивания клеток, недостаточной чувствительности генетического аппарата зеленых листьев к раз-

личным воздействиям. - Вероятно, по этим причинам для анализа перестроек хромосом более широко используют модельные объекты -Меристему проростков' корней травянистых растений.

Сравнительный анализ чувствительности меристемы различных деревьев (тополь, ива, вяз), показал, что зачаточные листья разных видов древесных растений могут применятся в качестве тест-системы для оценки мутагенности окружающей среды.

Принципиальное отличие предлагаемого нами метода от перечисленных заключается в том, что впервые для мониторинга недифференцированных мутагенов окружающей среды, предложен метод анализа зародышевых листьев древесных растений, в которых в период начала весеннего тока пластических веществ оценивается суммарная мутагенность недифференцированных химических факторов, накопившихся в почве за осенне-зимний период.

В качестве следующего этапа можно предложить выделение конкретных мутагенов (соли тяжелых металлов, пестициды, фенолы и др.) и их соотношений в зонах, где растения показали наибольший уровень аберраций хромосом. Сравнивая эти данные с характером промышленных отходов близ лежащих поизводств, давать рекомендации об усилении мер по охране окружающей среды на конкретных предприятиях.

ВЫВОДЫ

1. Радиоизотопное исследование скорости проникновения трити-евой воды и симозина в листовые почки побегов различных видов древесных растений показало, что они способны накапливать химические соединения, вызывающие перестройки хромосом в меристеме.

Вещества со значительно большей молекулярной массой, чем у воды могут легко поступать в почки древесных форм растений.

2. Стандартные мутаген»: НМН и ДМС вызывают достоверное повышение уровня аберраций хромосом в меристеме зачаточных листьев древесных растений.

3. Достоверные различия в уровне аберраций хромосом между деревьями исследованных видов, взятыми в одной точке (3 дерева, отстоящих друг от друга на расстоянии не Солее 10 м) не выявлены.

4. Анализ перестроек хромосом в зачаточных листьях тополя,

взятых в различных районах натрии г. Ростова-на-Дону, показал достоверные различия в уровне аберраций хромосом. Наибольший процент зарегистрирован в центре города (6X), промышленной зоне (4,5%), наименьший- в зеленой, зоне (0,7%).

5. Сравнительный анализ чувствительности меристемы различных деревьев (тополь, ива, вяз) показал, что зачаточные листья разных видов древесных растений могут эффективно применятся в качестве тест-системы для оценки мутагенности окружающей среды.

6. Сравнительный анализ используемых нами тест-систем (тест Эймса, меристема однолетних растений , аачаточные листья древесных растений) позволяет рекомендовать метод анализа аберраций хромосом зачаточных листьев древесных растений в качестве экспресс-теста на мутагенность факторов окружающей среды.

7. Многолетний мониторинг патрии г. Ростова-на-Дону показал, что уровень перестроек хромосом в зародышевых листьях почек тополя достаточно объективно отражает степень загрязненности районов и может служить интегральным показателем мутагенности факторов окружающей среды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Guskov Е.Р., Skurat Т.P., Varduni T.V. Trees as an object for monitoring of mutagens in the urban environment. The First Int.Sei. Congress "Urban ecology", His, Yug.-1992.-P.27

Гуськов Е.Р., Шкурат Т.П., Еардуни Т.В. Тополь как объект для мониторинга мутагенов в окружающей среде // Цитология и генетика. -1993. Т. 27. N 1. С. 52.

Varduni T.V., Shkurat Т.Р., Guskov Е.Р. Mutagenic effects of urban environment on the trees // III -th International conference " Urban ecology", Rostov-on-Don -Nis, IAUE-ECOMAN.-1995. P. 42 45.

Гуськов Е.П., Вардуни T.B., Шкурат Т.П. Древесные растения как объект длительного мониторинга недифференцированных мутагенов окружающей среды // Российско-Американский конгресс "Экологическая инициатива", Воронеж, октябрь,1996.

Вардуни Т.В., Покудина И.О. Некоторые подходы к оценке ге-нотоксичности городской среды. Сб. Молодых ученых РГПУ. 1996 г. с. 31-34. jfe/-

Заказ 18 от 2.7. "1. 1996 г. Тир.100 экз. Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ