Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование генетической активности пиранокумаринов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование генетической активности пиранокумаринов"

АКАДЕМИЯ НАУК АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ

РК--&7Г--

^ _ _^ На правах рукописи

' > УДК: 575.224.

ДРШАВА ЕВГЕНИЯ АЛЕКСЕЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПИРАНОКУМАРИНОВ

03.00.15—Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ьаку —1003

Работа выполнена в Институте генетики и селекции Академии Наук Азербайджанской Республики.

Научные руководители:

академик АН Азербайджанской Республики, доктор биологических наук, профессор Алекперов У. К.

доктор биологических наук Алиев А. А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Агаев Ю. М.

доктор биологических наук Агабейли Р. А.

Ведущее учреждение: Бакинский Государственный Университет им М. А. Расулзаде.

Защита состоится « 0.9 » «я- 1993 г. вчас.

на заседании Специализированного совета Д.004.20.01 по присуждению ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.15—генетика при Институте генетики и селекции Академии наук Азербайджанской Республики: 370106, г. Баку—106, пр. Азадлыг, 155.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института генетики и селекции АН Азербайджанской Республики.

Автореферат разослан «6>¥ » 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

доктор биологических наук

ОКЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ . • Актуальность теми Необходимость научных исследований и практических разработок до профилактике генетических последствий загрязнения окружающей среды вызвана высоким содержанием в биосфере генотоксичных веществ, существенным образом влияющих на качественный состав окружающей среды. Одним из реальных путей снижения последствий от контакта с существующим уровнем мутагенных ' компонентов в окружающей среде, является разработка фундаментальных и прикладных аспектов проблемы антимутагенеза (Алекперов, 1979,1984). В связи с актуальностью этой проблемы, за последнее время выявлено большое количество как.природных,, так .и синтетических антимутагенов, многие из которых рассматриваются в качество лрсфжкэтгтог':: пс.'!трат::зап;та сгтоптатг::ого ииндт^рсванного • мутагенеза (Гончарова,1974, Моссэ,1974, Алекперов,1989,Алиев, I989,Ran¡el, Alekperov, Ames et al., 1986,Shankel, 1990). Перспективу для практического использования антицутагенов определяют такие критерия, как универсальность, эффективность и физиологич-ность. Наличие у генозащитных препаратов этих свойств позволяет длительно использовать их в практических целях без побочных явлений. В настоящее время, оставлял неизменной важность указанных критериев. существенное значение приобретает наличие снрьввнх"источников дтя получения природных биологичоски активных веществ с генозащптными свойствами. В этой связи существенным образом возрос интерес к поиску новых антимутагенов из числа природных соединений, многие из которых входят в состав лекарственных, пищевых и кодовых растении и сами, в свою очередь, обладают целенаправленными фармакологическими свойствами. К числу их относятся пираиокукараны, изучению генетической активности которых, посвящена настоящая работа.

Цель и задачи исследования' Целью работы являлось изучение гено-тичсско:'. атгтизпостк нового природного соединения - кумаринового-глпкоуида сеселозида, выделенного из жабрицы горичниковидной ( sebeii peucedancidee L.. ) , а также его агликона - веществ, обладающих спазмолитической активностью.

Исследования предполагали следующие задачи: Д. Изучить гспст::чес:.7~ активность сеселозида л его агллкона па объектах, различающихся уровнем биологической организации. 2, Определить особенности - модификаций этими соединениями мутагенеза спонтанного и индуцированного факторами различавшимися по природе л механизмам мутагспногб действия. '

3. Определить возможность практического использования сосолоз::-да для снижения мутагенных эффектов некоторых средовых гоноток-сикантов.

Научная новизна работы Впервые выявлено отсутствие генотокси-ческях свойств у природного фармацевтического средства кумари-ноеого глякозида сесолозида и его агликона иа разных биологических объектах (растения: лук-батун, пшеница, скерда, араби-допсис; культура клеток человека: перевиваемые лиши клеток(ач-ниотическая оболочка человеческой плаценты), Нер2(рак шеР.ки катки) и Kel а (эпидериоидный рак гортани); лабораторные ддвот-нне: беспородные гягсгст и мыши линии СВА)и с использованном разных мутационных тестов (генные, ядерные хлоро&иьные стации, аберрации хромосом). Установлены универсальные антимутагенные свойства сеселозида в условиях индуцированного, а также вызванного старением клеток и организмов мутагенеза. Практическое значение работы Разработаны способы практического использования сеселозида для снижения мутагенных эффектов таких средовых факторов, как ионизирующая радиация, алкилируэдие соедцчения, мутагены УФ-типа и нуждающиеся в метаболической активации, лекарственные препараты, промышленный и бытовой мутаген - фтористый натрий, комплекс факторов реального космического полета и гербицид.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены' и обсуждены на Республиканской научной сессии по экспериментальному мутагенезу (Баку,1980); на Республиканской научной конференция аспирантов (Баку,1983); на 6-ом совещании "Ге-нотичеокиз последствия использования химических средств защиты растений и пути преодоления резистентности вредных организмов с учетом задач охраны окружающей среды" (Рига, 1984); на конференция молодых ученых Института ботаники АН Азерб.Республики (Баку,1934); на 4-ой Международной конференции по мутагенам среды (Стокгольм, 1985); на У съезде ОГиС Азербаг'дтана (Баку,1987); на У и У1 съездах ВОГиС им.В.И.Вавилова (Москва,1987,!,!инок.19Э2); на 13 и 19 Международных конференциях по мутагенам окружающей среды (Варна,1983,Родос,1989) и-на 20-ой (Йорк,1990); на Мак-.пународном симпозиуме по проблемам мутагенов и канцерогенов окружающей среды (Караганда,1990).

По материалам диссертации опубликовано 25 работ.

Объем, структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав,

посвященных изложению результатов и ьх обсузденив, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает ¿ы наименовании, в том числе иностранных источников. .

¡¿АТЕК1АЛ 'Л ЫЕТО'^ ИСЗЩДОВМИЯ

Объем исследовшшя, мутагенные факторы, модификаторы мутационного процесса и методы генетического анализа представлены

па рисунке I. ,■ ' • • ■ ■

'Рис, I. Объекты исследования, модификаторы г-утационного

пг.оцсося, иутагониыо ({акторы и методы гентз'гозпого агг.ишза.

Выбор объектов опрздишлся необходимостью оценки антщу-тагенного действия сесвлозида и его агликока:

а) на объектах различных видов (высшие расто;гдя: лук-батун, пшеница, снерда, аребилолсисгперэвиваомыо клетки человека ,

На а а, НеР2» млекопитающие:белые беспородные мыля и мыши линии СВА), включая модели ин виво и ин витро.

б) на объектах, контрастных по наличию систем метаболической активации (культура изолированных клеток, лабораторию животные)

в) на объектах, позволяющих регистрировать■ пачичио мутационных событий на уровне различающихся по своему формированию классов нутаций (генные, ядорные хлоро^пльные мутации и структурные перестройки хромосом в митозе и глоиозо);

Г) на объэктах разного возраста (белые беспородные мыши) и срока храповая (семсна растений) с целью определения антимутагенной активности испытываемых модификаторов при спонтанном мутагенезе.

Выбор мутагенов определялся необходимостью оценки антиг.^таген-ной активности сеселозяда и его агликона при индукции мутаций:

а)мутагенаш рааглчной природы (ионизирующая радиация, химические мутагены);

б) мутагенам!, различающимися механизмом обрззовашя, транспорта генотоксических продуктов к ДНК хромосом и механизмом формирования первичных повреждений (алкалирулдиа соединения-к-метил - N - 'нитрозомочввина и н-метил-и- нитро - н- нятрозогуанадкн, мутаген У5-г;ша ~ 4 нигроквнноллн - I - оксид; лромутаген - цлк-лофос$амзд,

г) комплексом факторов реального космического полота.

В качестве модификаторов мутационного процесса использованы: кумариновый гликозид сеселозид.выделенньД из карней жабрп-ЦЫ ГОРЙЧНИКОЕИДНОЙ ( 8езе11 реисе<1гто1ае8 Ь. К. - Го1.)(ЕаГИ-

Рис. 1 Стрхптирная формула кумарино&го

ров. Белый,IS8I), которая является эфиромасличным, кормовым и лекарственным растением (Белый, Исмаилов и др.,1986'; Corovic,

ig7<n;aivfflKOh сеселозида CCj4Hjr405), полученный путем кислотного гидролиза молекулы сеселозида. Сесело-зид и его агликон обладают спазмолитической активностью.

Условия провидения экспериментов

Эксперименты, предусмлтривазщие оценку штмутагэнного действия сеселозида и его агллкона при спонтанном мутагенезе, выполнены на семенах лука-батуна, пшеницы и скерды, хранлвших-ся в лабораторных условиях от 3-х месяцев до 2-х лот, на перо-виьйбыьк клетках человека рх, Hola и Hspg поздних пересевов, а гак'.о на белых беспородных мышах 80-ти недельного возраста. Семена растопят гш^Згроваягг на растворах гшраяокумашнов в концентрациях от 1,10"° до 100 мкг/мл. Их цитогенетическую активность анализировали в пределах первого штотического цикла на один срок í-иксации (чэрез 65 часов от начала зашчиваяия семян лука-батуна в растворах препаратов, у скерды и пшеницы - через 36 часов) и темпорально у лука-батуна с интервалом в 3 часа с 48 по 72 час. Перевиваемые клетки человека культивировали на сроде 199 с добавлением 10',? фильтрата сыворотки крупного рогатого скота " модификаторов мутационного процесса в концентрациях от I, Ю-0 до 100 мкг/мл. Старш мышам (80-ти недельного возраста) вводили пороралыю сесолознд на протяжении 7,14 и 21днои (3 дозах ог 0,75 до 7,0 мг/100 г массы веса животных.

Для Определения агти.\утагсннок активности аолытившшк мо-дя.'ккаторой па мутагенез, шщуцирошнныл иондзируюде?. радкацие", езгена скордо, лука-батуна, ппешищ и арабидолсиса облучали на усташнко "К.У.Ц - 2000" в дозах, соответственно 8,10,80 и 100 Гр; .;о,юд1Ж кочовозрелых мышей иодворгаш тотальном}' облучению на установке "РУМ-П" в дозе 3,0 Гр. Облученные семена растений-инкубировали на растворах модификаторов. Мшам сеселозид вводили (3,0 мг/IOO г масса) в одном случае в течение 14 дней до облучения, а в другом - ь течение 14 дней до, и 7 дне.": посла облучения. При испытании модификаторов в условиях химического мута-.генеза семена растений обрабатывали раствором НММ (0,2%), ШШГ (I:.C.O, 4-ECG (2,5,1o"6 !"), фтористого натрия (ТО мкг/мя)г а загс;.! до гЦдксацлй инкубировали на растворах плранокуг.мрлно». Семена араоидопоиса после мутагенной обработки в течение 18 ч. инкубировали в растворе сеселозида (1,КГ4 мкг/?дд) поело чего upo-

ращивали в пробирках в специализированной агарлзоганной среде ( Veleminoky, С,ichner, 1904 ) при непрерывном освещении лго-минесцантными лампами ЛБ-40, освещенностью 40 тыс. люкс. Кроме того, семена пшеницы предварительно в течение 12, либо 24 часов обрабатывали раствором свселозкда (1,10"'^ мкг/мл), а затем 3 ча-са"эфираном 12-19" из расчета 0,5 - 0,7 кг/га и высевали в поле. В среду культивирования клеток амниона человека при примой их обработке на 24 часа вводили сеселозид (1,10-1 мкг/мл), а затем на 24 часа 4-НХО (2,5.IO_ef.O. при об^тной - сначала 4-НХО, а затем сеселозид. Мышам линии СБА, в одном случае е.т.ед- ■ невно в течение 14 дней вводили сесолозид 3,0 мг/103 г массы, а затем фтористый натрий в дозе 1/2 ЛД-q (2 мг иона фтора/100 г массы) на 24 часа, а в другом - продолжали вводить сесолозид в течение 7 дней и после обработки животных химическим мутагеном. В другой серии опятов животным в одном случае вводили сеселозид ежедневно в течение 7 дней, а затем циклофосфашд (4 мг/100 г массы), а в другом - продол-хали вводить сесолозид в течение 5 дней и после обработки мутагеном. Для определения влияния пира-нокумаринов на гекотоксичность комплекса факторов космического полета семена растений; экспонировали на борту орбитальной станции "САЛ*ЗГ-7" на протяжении 82 и 522 дне,':, а затем после возвращения на землю инкубировали на растворах сеселозида. С целью определения особенностей механизма антилутагенного действия пира-нокумарцнов семена двухлетнего срока хранения и-облученные семена скорды подвергали ступенчатой обработке сеселозидом в течение пресинтетическоЬ (¡ази со смещением на кахдьга последовательные 3 часа, а тате с варьированием темпэратурных релхмов инкубации (5 и 25°3). Регистрацию частота аберраций хромосом в клетках меристемы корешков лука-батупа, паензцы, а также в I мейотическом делении в пыльниках и в клетках костного мозга мышей - проводили стандартным ана-телофазным методом; в клетках скерды и перевиваемых культурах клеток человека - мета^азнш методом; анализ эмбриональных деталей и хлорофилышх мутаций у арабидопсиса - по эмбрион - тесту ( Müller, 1963 ). Все цифровые данные экспериментов подвергали статистической обра-, ботке на персональной ЭЕП марта " atari SRfm " Достовер-

ность разниин ме.зду опытными и контрольными показателями определяли с прк/опзнясм критерия соответствия Пирсона и критерия Зть^дента (Рокицкий,11-73, Лакш1,1980).

- ? -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ . • • •

Ыодиаякация пиранокумарянауд .мутагенеза, возникающего .при старении кдеток л организмов

Результаты выполненного исследования показали, что не влияя на эводвдионно сформированные темпы спонтанного мутирования объектов различных видов, оба'испытывает,шх Ъиранокумарина в пределах диапазона определенные концентраций ингабируот мутагенез, возкакакпцяй при с*арёнин клеток и организмов. При этом установлено, что характер и налравгзнность цктогенетической активности сеселоэида и1.-его агдикона носит дозозавискмый характер, г эффективность антшдутагенного действия связана с'физиологи- ■ • чоскгм состоянием объектов' иазпого- срока храявиж;':'И,следовательно, с уровнем спонтанного мутирования (рио.2). Текозащгеная

Е2- ГГ^г/х¿.'¿¿гммегр ¿У*?</;-/"/ -

Рис. 2. Влияние сеселоэида в разных концентрациях, на частоту

аберраций хромосом в моркстемо-корешков семян лука-батуна разного срока хранения

активность пиранокумарадов проявляется объектнеспецифкческя в диапазоне низких концентраций, С повышением концентраций до определенного порогового уровня происходит■смена антимутагенного действия на мутагенный, что характерно для многих соединений фенолыгап природц (сл.Ьрехман,1988). Пиранокумаринк в опытах на семенах растений (таблД) и перевивае-

мых клерках человека наиболее эф|<зкт:шкы в дозе Т,10*"° --1,1 СГ3

мкг/мл, на болых беспородных мышах - 1,5 - 4,5 мг/ЮОг кассы (табл.2.). Причем, в последнем случае обнаружено возрастание

Таблица I

Модификация сесолозидом (1.Ю""1 мкг/мл) г.утационяого . процесса, вызванного старением семян различных растений

V

Объекты Срок Хранения,^* Варианты опыта Частота аберраций хромосом 4ЭА

п М * т

лук-батун 0 контроль 21 2,5 ± 0,54

+сесолозид 19 2,8 i 0.63

2,0 контроль 166 20.4 ± 1,4 0.52

+сеселозид 91 9.0 ± 0.97

пшоница 0 контроль 32 3.3 i 0.57 0.54

+соселозид 29 3.1 ± 0,57

2,0 контроль 60 7.4 ± 0,92

+СЙССЛ03ИД 33 3,4 ± 0,58

скерда 0 контроль 21 2,9 ± 0.62 0.59

+сеселозид 27 2.8 ± 0.54

контроль • 62 20.8 ± 1.46

+сеселозид 103 8,6 ± 0,81

Таблица 2

Ьлияние сеселозида на мутационный пролесс,' возникавший • при старении ылцай

Доза, мг/100 г массы Всего изучено анафаз '¡астота аберраций хромосом Р ЗОЛ

П Ы t m

контрол! 0,75 1,5 3,0 4,5 7,0 '1207 1890 1807 1675 2013 1454 62 66 51 32 67 64 5,1 ± 0,63 3,5 ± 0,39 ■2,8 £ 0,39 1,9 ± 0,33 3.3 ± 0,40 4.4 t 0,53 * 0,05 < 0,001 < 0,031 < 0,02 0,31 0,45 0,63 0,35 0,14

X2 в 14,3 при ^ = 66 эффективности антимутагенного действия лиранокумаринов с увеличением продолжительности курса их введения лабораторным гд-

еотным (7,14,21 дета).

В параллельны:.-. экспериментах,'выполненных на растительных объектах,установлено, что алгимутагеаное действие сеселозида и его аглпкона пролапется при всех сроках темпоральной фиксации ь диапазоне инкубации семян лука-батуна и ппешщи. При этом,показано, что на фоне скихзнка частоты аберраций хромосом, испытываемые пиранокумарины но оказываю? существенного влияния на соотношение б общем спектре доли отдельных типов структурных перестроек хромосом. Кх антимут&тсннсе действие не -сопряконо а де^прессией пролифэратгшной активности клеток и протекает в определенных концентрациях деие да фона стимуляции деления кле-тс~4 п?д5гуг<?я.-?ого под воздействием фактора старения. Не сопря-ноко оно такяв с из^внешиши в продолжительности клеточного цикла и в распределении клеток по фазам митоза. Бее это свидетельствует в пользу того, что зарегестрированное генозащитное действие испытанных пиранокумаринов носит истинный актимутагоц-шй характер. .......

Патогенетическая активность пиранокутаринов в условиях индуцированного мутагенеза

Л,-я выяснения генетической активности пиранокумаринов в условиях индуцированного мутагенеза в качестве мутагенов ис- " пользова!!ы ионизирующая радиация, 1.ШКГ, Ш1.5, 4-НлО и ¿[гористы: натри;:. В экспериментах на растительных объектах испытываемые ппраникумарины применялись после мутагенной обработки семян в кенцеатгац/лх, проявивших наиболее высокую антимутагенную активность при спонтанном мутагенезе. В результате установлено, что соселозид и его агликон существенным образом практически однозначно иягнбируют генотоксичность (¡акторов различной физико-химической природы в метках апикальной нарастет семян лу-ка-батупа (тайл.З). На это указыаага. фактические цифровые дан- ' ныо процентного соотношения частоты аберраций хромосом по вариантам экспериментов, а такаа показатели.вычисленных по участкам дозоют кривых относительных величин фактора эффективности антимутагенеза (ФЭА).

Близкие по значениям результаты, отраяающие. антш.утаген-ную активность пиранокумаряков мгег/мд), получены и на

других используемых растительных объектах. В частности, показатель 'актора эффективности антимутагенеза сесолоопда при его -

применении после облучения семян пшеница, скерды и арабидопси-са характерезовался высокими значениями и равнялся соответственно 0,52, 0,79 и 0,70; после обработки семян ШШГ - 0,69 и после обработки семян фтористым натрием - 0,42.

Таблица 3

Антимутагенная активность пиранокумарияов (1.Ю"4 мкг/мл) при обработке семян лука-батуна мутагенами различной 1 физико-химической природы

Варианты опыта Всего изучено анафаз Частота аберраций хромосом ФЭА

п М ± ш

контроль Облучение Обл.+сеселозид Обл.+агликон 1392 885 1593 1228 44 183 131 72 3,2 ± 0,47 17,1 ± 1,15 8,2 ± 0,6Ь" 5,8 ± 0,66* 0,52 0,70

Контроль К.М КЛ+сеселозид НЛ+агликоя 1392 909 1086 1048 . 44 86 38 38 . 3,1 ± 0,47 9,5 ± 0.87 3.5 ± 0,56' 3.6 ± 0,56 • ■ 0,63 0,62

Контроль 1392 44 3,1 ± 0,47

ЫННГ 913 130 14,2 ± 1,16

НННГ+сеселозад ШЗ 83 7,2 ± 0,75 ' 0,49

МНИГ+агдикоя 1109 ' 79 7,1 ± 0,77' 0,50

Контроль КаГ +соселозид НаГ + агликон 1218 858 1231. 1074 33 74 ■ 41 32 2,7.± 0,46 8,6'± 0,86 3,3 ±0,51' 3,2 ± 0,51' 0,62 0,63

Контроль ,4-НХО 4-НХО+сеселозид 4-НХО+агликон 812 890 ' 862 821 37 85 35 21 , 4,3 $ 0,70 9.5 ± 0,98 4 1 ± 0,67' 2.6 ± 0,56' 0,57 0,73

*Р <0,001 по отношению к мутагенному контролю

В плане определения как систем унизероачьности, так и возможности практического использования .шгранокуиаряяов весьш ва-сными предотавляигся результаты их испытания в условиях индуцированного мутагенеза на моделях кн витрэ и ин виво в опытах на клетках млекопитающих и человека. При этом, в экспериментах на культуре перевиваемых клеток установлено отсутствие зависимости антлглутагонногэ действия сеселозида от вариабельности комбинированного применения этого шраяоадиарцяа с химические

мутагеном и практически однозначная эффективность при введении

в среду культивирования клеток сеселозида до и после мутагенного воздействия (рис.З).

Рис. 3. Модификация сесе-лозидом (1 мкг/гл) геноток-сичности 4-нитро-хинолин--1-оксида (2,5.ю-5;«) в клетках амниона человека при различной ЕГ.риабзль-носги лоеладова-тельности комбинированных экспе-ршздтов

I. Контроль, 2. 4-НХО

3. сеселозид + 4-íEiO

4. 4-НХО + сеселозид

В опытах ;хв на .'.аллах линии СБА показано, что профилактическое на протяжения 14 дней ежедневное ззедениг жявот'иш сас-з-лозида (3,0 ;лг/100 г) достоверно предотвращает образование генетических изменений, возклкаэдих в клетках костного мозга их бздрсшшх костей под воздействием ионизирующей радиации (3 Гр) и '¿гористого натрия (2 кг ? 100 г). Эффективность защиты значительно возрастает, золи яспнтываегж: пирагюкумарпн вводпт-ся лщщй! и на протяжении 7 дне!! после мутагенной обработки.

Б цело.".-: представленные эксяеркмоятаяьные данные (см. рис. I) свидетельствуют о Широков, универсальности ант:шутагенного действия сеселозлда и его агликона,- которая неспецифически проявляется при спонтанной, вызвзшом старением клеток я организмов, мутагенезе и при воздействии широкой группы мутагенов различной физико-химической дрлроды. При. этом, зарегестряровано отсутствие зависимости эффективности анткмутагенного действия ис-гсткваемнзе пиранокутларанов от вида и. уровня организации биологических объектов, ov ^раас*ельноста последовательности nprv.e-не.чля их в сочетания с кутагзяемя, а та:же от класса, рззл'гча-

- 12 -

вдихся механизмом формирования классов мутаций.

Особенности антимутаганного действия пиранокумаринов при различных режимах обработки и инкубации сол-ян скещн

Установленный 5шт широкой универсальности генозащитного действия оеселозида и его агликона позволяет полигать наличие в механизма их антимутагенной активности связи с коррекцией тех или иных, ключевых этапов возникновения и становления мутаций. В соответствии с задачами. настоящей работы специальная серия экспериментов выполнена на старых, хранившихся в лабораторных условиях в течение двух лет, а также на свежих облученных семенсСх скорды при варьировании временных режимов продолжительности обработки объектов пираяокумарииамя и температурных режимов их инкубации.

Установлено, что проращивание старых семян скердо в растворах пиранокумаринав (1,10"'^ мкг/мл) в течение первых 15 часов, то есть в течение о | - ([азы приводит к снижению в клетках их апикальной меристемы частоты аберраций хромосом с 10,4 • ± 1,09 в контроле до 4,3.± 0.61 % (сеселозид) и до 3,3 ± 0,63$ (агликон) в опыте. Такое же по продолжительности воздействие, •но уде после окончания .прэсинтотической £азы, не модифицировало частоту генетических взявший, зарегистрированных а контроле. На основании полученных данных сделано заключе-ие о том, что антимутагенноо действие пиранокумаринов реализуются в пре-сиитеткческой фазе естественно синхронной популяции клоток семян скорды, С целью экспериментального обоснования данного заключения предпринята ступенчатая временная обработка антимутагенами старых семян скерды в течение в | - фазы, предусматривающая замачивание шщн' в воде в течение первых 3,6,9 и 12 часов с последующей инкубацией в антимутагенах в течение 12,9,6 и 3 часов. В-результате установлено, что наиболее зф,.октишым является вариант опыта, в котором семена скерды предварительно в течение 3 часов замачивали в воде, а потом 12 часов инкубировали на растворах пиранокумаринов (рис.4).

Выявленная закономерность"в проявлении антимутагенной активности пиранокумаринов подтверждена и в.клетках на облученных семенах скерды., При этом предусматривался двухчасовой временной интервал ступенчатой обработки и установлено, что наиболее эф-

фектино глранокумаркны ингибируют радиационно-индуцированный

мутагенез в вариантах с 2 и 4-х часовым замачиватюм семян в водэ с последующа!! 12 и 10 часовой инкубацией в растворах пя-ранокумарннов.

Из изложенного следует, «то эффективность актимутагонкого действия ссселозида и его агчикона наиболее высока на.стадии, нрзд-

шестзупасЗ синтезу д:!1С, в период, близкпл к завэрвешто нроз::н~ ?етичос1к>Л дазн, когда ит-иок&зкрупгея проиесск мб-садгку.гтр-1Гого кснтр-\ш ^устранения зсзнкк'лкх потенциальных понрс::и;з:!;:;: (Малкнозокз.';, ¡.'.ИХаЙЛОЕ И др.,1973; 1л>сЬп1к, Резепко яЦ976).

Б параллельных экспериментах установлено, что эф», скг сесз-локида проявляется в условиях инкубация семян скердн при нормальной температуре (2!3°С), тогда как в условиях тсрмокнакти-вацил (5°С) он отсутствует. Последнее указывает на ферментативную природу защиты, активность которой возрастает под влиянием сеселозида.

Лзучпине возможности практического'применоккя' сеселозида

в условиях воздействия срздовкх генотоксикзнтов

Широкая универсальность, эффективность и физиологичность

шшиутаг-'-юик кош!ентр?зц}$ сеселозида и ого агликона, то есть совокупность свойств, эпгедслякссгг пзрсгсктгау практического пшиеяеихя анггсутсгошая: средств, делает рэалькцм г.спользова-нло этих пэяролных метаболитов. лри разработке подходов, поправленных на ловкиогае усто.'.Ч-лэмти орган:.з:лов к нутювтоиу воз-

«Т

Рис.4. Характер язмоПи-

ния частоты аберраций хромосом в клетках старых сс:.'лн скердн лр:^ псздейст-вии пиранокут.-.а-ринои на различные этапы прэ-синтетическои фази

3 6 9 ц

-14-

действию факторов окружающей среда.

Способность испытываемых пиранокуыаринов ингибировать ге-нотоксичность факторов окруяаздей сроды продемонстрировала выше на высших организмах, включая мотки человока и лабораторные аивотныа, в условиях мутагензза, возникающего под воздействием фактора старения, а также классических мутагенов различной природы и механизма взаимодействия с генетическим субстратом (ионизирующая радиация; алкилирущие соединения - нитрозометилмо-чевина, матилнитрозогуанидия; мутаген УС-типа действия 4-нитро-"хвинолин - I -оксид). Наряду с перечисленными генотоксикантами пиранокумарияы испытаны и при воздействии химических веществ, используемых в промышленности, модицюю и сельском хозяйстве.Результаты экспериментов, выполненных на лабораторных животных в условиях индуцяровшшого едтагенеза представлены на примере се-селозида на рис. 5, Из.приведенных данных видно,,что испытанные яираяокумаршш способны, не только предотвращать, но и нейтрализовать образование радиавдонно-индуцированных генетических изменений, что позволяет рекомендовать их в качестве средств антиму-тагонной защиты при различных, экстремальных ситуациях, связанных с повышением естественного фона радиации.

16

л

* п

к

ь х<

Д? к

2. Облучение

3.

4'. ци/сюфосрамаэ СеселоЗид (з,опг/гоег

гмутаген ' /сутки)

(7¿леи! , гем*-

АН (Здлеи/

Рис.

5. Кодификация сеселозидбм. мутагенности средовых генотоксикантов в миелокариоцитах кушей СВА.

Принципиально важным представляются полученные данные о мо-

дифякацчи пиранокумаринами геиатоксичности фтористого натрия.

Это химическое соединение находит широкое применение как в тпх- ' нологических процессах некоторых промышленных производств - хя-мическом, деревообрабатывающем я в цветной металчургии, так и в быту - при фторировании питьевой воды, в качестве добавок в зубную пасту .при лечении кариесов зубов. Результаты выполненных экспорпмшгтоз убездшот в возможности использования пиранокумари-нов для сши-ения генетического риска от контакта с (¿/гористым натрием в производственных условиях и быту.

Практическая значимость аптимутагенного действия сесолози-да и его агликона несомненно возрастает в связи с обнаруженным их влиянием fio мутационный процесс, возникающий при воздействия лекарственного препарата ярому таг энного типа деЕствгя - цтачо-фосфачкда, химического соединения, рекомендованного к использовании в качестве системного гербицида избирательного действия в посевах зерновых культур против двудольных сорняков - эфирана 12-19, а такие при воздействии комплекса факторов реального космического полета. Эффект модификации мутагенности циклофосфами-да пр<?монотрирован в опытах на мшах СБА (рас.5.) При этом установлено, что аятимутагзшшй эффект сеселозида достигается при vví) внедокпп лабораторным глвстнил как до их мутагенной обработки ¡деклофос'^амндои, та': и после kío. хотя в последнем случав го-кога^итная активность более высока.

В у:лозгя:< воздействия эфпрана I2-IJ сеселозвд испытывала." па растительной культура, в посевах которой сн предназначен к использованию в качестве гербицида - на семенах пиеницы. В модельных экспериментах, выполненных е лабораторных условиях, установлен о, что прорэцпвашго обработанных гербицидом (0,1/0) ое-;ляк пшеницы в растворе сеселозида (I.I0-4 мкг/мл) пнгкбяруот мутагенное действие етого гог.отоксиканта и стабилизирует процессы клеточной пролиферации (сяс.6) ■. В настоящих экспериментальных условиях наличие ант::мутагенюи активности у сеселозида подтз-зрл-двю и результатами анализа моЛоткческпх клеток пыльников колосьев пшеницы, семена которой в Еоздушно - сухом состоянии инкуби-оовали в растворе сссслозкда мкг/мя) з течение 12 часов

¿ли 2-1 часов, а затем гсрсводи.ти на 0,02^ раствор (3 ч) сфирана 12-19. Рос-в этого cereña высевали в пеле. При этом установлено, что продол.сктелькость экспозадаа езкян ааеяацн в ргс?э:ро гер:»-нскумарина не атляаг на -степень аффектнвлэсти eró анмг.утргенло-

а

Г **

о

ift

I Л 3

Рис.7. Анткмутагеыцш активность сеса-лозида в мейоти-ческих клетках проростков пш9-нида при индукции мутаций эфи-ралом I2-I9 (0,02/")

I. контроль; 2.сеселозид (12 ч.); З.сэселосид (24 Ч.); 4.0'1'Лран 12-19 (3 ч.): б.свсолозид (12 ч.) + эфиран (3 ч.); б.сеседозид (24 ч.) + эфиран (3 ч.};

Рис. 6. Цитогенетичеокая

активность свселозида в митотических клетках меристемы корешков пшеницы в условиях воздействия эфарана 12-19 (О,I/O

п - г/лтоткчаская активность . v - аберрации хромосом

го действия {рис.7.).

. Широта возможного .диапазона практического применения пиранокумаринов определяется и результатагли испытан ил их на семенах растений, перенесших воздействие комплекса факторов космического полета (Аршава, Багирова, Алекперов и др.,1955).В этой серии экспериментов установлено, что проращивание сешн растений, различное по продолжительности время экспонирования на борту орбитальной станции, на растворах пиранокумаринов приводит к значительному ингибировани» мутагенности экстремальных условий.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что наряду с про-г ч;ши областями применения, испытанные пиранокумарины могут быть использованы такяо в целях ингибирования [.мутагенности лекарственных препаратов при одновременном назначении с ними (в частности циклофосфамида) и пиранокумаринов в антимутагешшх физиологических дозах; дая сохранения генофонда к чистоты видов культурных растений в зонах интенсивного применения пестицидов, а такье в целях иовшёнкя уровня эксплутационной наде.-кности рас-

тигельных объектов, используемых при создания искусственных экологических систем в условиях жизнеобеспечения на космических

аппаратах.

BUBO Д.Ы :

1. Впервые выявлено отсутствие гепотоксического эффекта у природных пиранокумаринов - кумаранового гликозида сеселозида

и его агллкона - препаратов, обладамщих спазмолитической активностью.

2. Установлено, что паранокумарянн проявляют.универсальные ан-тимутагенкые свойства при спонтанном и индуцированном мутагенезе, а также при старении клеток и организмов независимо от объекта исследования (лук-батун, пшеница, скерда, культура клеток человека, ¿ши) " методов регистрации различных классов t,мутаций (генше, ядерные хлорофильные'мутации, аберрации хромосом).

3. Выявлено, что пиранокумарины проявляют антимутагенную активность наиболее эффективно в концентрации I.IO-4 мкг/мл на растениях и в дозе 3,0 кг/100 г массы тела на лабораторных

ЛМВСТЯЫХ (МЬШИ).

4. Установлено, что при действии пиранокумаринов на растительные объекты и культивируемые клетки человека в общем спектре отсутствуй различия в соотношении доли разлкчйых типов струк-турта перестроек хромосом.

5. Актпгг/тагенкоа действие пиранокумаринов наиболее .эффективно на началкш этапе лресактетячэской казн клеточного цикла

и процесс за;циты наследственных структур носит тсмпоратурс-завясккий характер.

6. Преодоленный для борьбы с двудольными сорняками гербицид 1212 при действии яа растения проявляет мутагенные л млтодол-рессиЕНые свойства. Его мутагенное действие днгибкруется как при профилактической обработке семян, так и после воздействия гербицидом.

7. В модальных экспериментах,на «яокоплтаясзпс (мыви) разработали способы практического применения сеселозида для профилактики я нейтрализация мутагоня:;х последствий ионизирующей радиации, ттутагека УФ-типа М-нитрохвкнолин-Х-оксид), алкилнрую:;пх соэ-дакзгга? (т:?оосс:.','Г.:::л!.-.оч<!П1'на и нитрозохуаякдян) ,про.»утагена -лзкар;г2Шюго препарата, средезого хяг.шческого мутагека-Ic'opacioro натрия и комплекса ^актеров реата'ого космического

полета.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ .ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕЖ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Влияние двух новых пестицидов на цитогенетические и некоторые физиологические параметры семян Allium fistu-1овша /Амирова Ф.Д. .Алиев А.А. .Аршава Е.А.Ибрагимов '!>., Меджидов М.М.//Цитология и генетика. Киев. IS83. Т. 17.Ш. С.8-13..

2. Генетические эффекты кумаринового гликозида сеселозида /Аршава Е.А.,Багирова А.Д. .Алекперов У.К.//В сб.трудов Шестого совещания "Генетич.послед.иснользов,химических средств защиты растений и пути преодоления резистентное- . ти вредных организмов с учетом задач окр.среды"(Рига, 16-20 апреля 1984).Рига.1984.С.30-31.

3. Влияние сеселозида на уровеш» генетических повремени!: семян лука-батуна и скерды, индуцированных факторами космического полета /Аршава Е.А.»Багирова А.Д..Алекперов У.К. .Орешккн В.И. ,Нашинский А.Л.//ВШШИ.12.11.85. X'. 7898В. 12 с. . • '

4. Патогенетическая активность ~кумаринового гликозида сеселозида/ Аршава Е.А.// Генетика.М.1985.Т.ХХ1.И1.С. 1886-1889.

5. Влияние кумаринового гликозида сеселозида на различные периоды пресинтетической фазы G j./Еагирова А.Д..Аршава Е.А.//Известия АН Азерб.ССР.сер.бкол.на^к.Й I.I985. С.15-18.

6. Decreaseof mutagenic effects of the occupational genoto-xicants by antimutagens/Alekperov U.K.,Aliev A.A.,Kul-gavin A,E.,Arshava E.A.,Bagirova A.D.//Forth International conference of Environmental,StockholmiJune, 23-28, 1985).1985.P.19.

7. Антимутагенноа действие некоторых пиранокумаринов /Ар- ■ шава Е.А. //материалы У съезда ВОГиС им. Н.И.Вавилова (Москва,24-28 ноября 1987). К.1987. С.22.

8. Some mechanisms of antirr.utagenic eggecta and their practical usage /Aliev A.,Sardsrly G., Arshava E..Veliev N, Ragimova G.//in: Abstr.XY111 Ann.Meet.EEMS.Varna.1988. P. 87- '

9. Modulation of mutagenic process by natural pplyphenolee

- 19 -

/ Bagirova A.,Arshava E., Agamamedova S., Tagi-zade I. //in.: Abatr. XY111 Ann.Meet. EEM3. Varna.1988.?.85-

10. Modulation of mutageneeia with pyranocoumarines in different G1 periodn./Bagirova A.D., Arshava E.A.

// in: Abstr.XY1111. Ann.Meet. EEMS.RHODES, 1939. P.92.

11. Genetic effects of biologically active compounds from Seseli/Bagirova A.D., Arshava E.A.//in: Abstr.XX Ann. Meet. EEMS.York.T990. P.20.

12. Мутагенные эффекты гербицида 12-19 в меГозо пшеницы и модификация их сеселозидом/ Араава Е.А.//В сб."Эколо-го-генетический мониторинг состояния окружающей среды" Караганда.1990.С,13.

13. Изучение геноттпоской активности сеселозида-в опытах на белых беспородных мышах /Аршава Е.А.//В матер. У1 съезда ВОГиЗ игл.Н.Я.Бавилова.кинск. 1992.С.39.