Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Радиочувствительность хромосом и другие цитогенетические характеристики лимфоцитов крови лиц со сбалансированными конституциональными аномалиями кариотипа

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Радиочувствительность хромосом и другие цитогенетические характеристики лимфоцитов крови лиц со сбалансированными конституциональными аномалиями кариотипа"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ РАДИОБИОЛОГИИ

УДК 616-007:575.191

ПОЛИТЫКО Анна Дмитриевна

Радиочувствительность хромосом и другие цитогенетические характеристики лимфоцитов крови лиц со сбалансированными конституциональными аномалиями кариотипа

03.00.01 - Радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1998 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте наследственных и врожденных заболеваний Министерства здравоохранения Республики Беларусь

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор медицинских наук, профессор член-корреспондент РАМН и НАН Беларуси Лазюк Г. И.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Амвросьев А.П. доктор биологических наук Моссе И.Б.

ОППОНИРУЮЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Научно-исследовательский

клинический институт радиационной медицины и эндокринологии МЗ РБ

Защита диссертации состоится " ^¿t&JLs_1998 года

в УЗ часов на заседании совета по защите диссертаций Д 01.35.01 при Институте радиобиологии НАН Беларуси (220600, г. Минск, ул. акад. Кунревича В.Ф.- 2, тел. 264-31-41).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института радиобиологии НАН Беларуси

Автореферат разослан" 1998 года.

Ученый секретарь

совета по защите диссертаций,

кандидат биологических наук

А.М. Ходосовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. В последние годы в связи со сложной экологической обстановкой резко возрос интерес исследователей и общества в целом к вопросам генетического здоровья человека, к факторам, способным влиять на генетический груз популяции. К одним из значимых компонентов этого груза относятся сбалансированные конституциональные перестройки хромосом (СКПХ).

В 70-ые годы выполнены базовые исследования частоты различных видов конституциональных аномалий хромосом (Jacobs P., et al., 1974, 1977; Evans J., et al., 1978). Установлена последовательность эволюционных преобразований кариотипа человека, частоты СКПХ в современной популяции человека могут отражать тенденции эволюционного процесса кариотипа (Dutrillaux В., 1975; Yunis J., Prakash О., 1982; Clemente I.,et al., 1990).

В настоящее время хорошо изучены состояния, связанные с изменением структуры хромосом, уточнен удельный вес хромосомной патологи в современной структуре заболеваемости и смертности (Лазюк Г., 1974, 1991; Кулешов Н., 1979; Лурье И., 1977,1984; Schinzel А., 1984; Stengel-Rutkowski S., et al., 1988); определены частоты и спектр хромосомных нарушений при умственной отсталости-(Tharapel А., Summitt R.,1977; Jacobs P., et al., 1978), нарушениях репродуктивной функции человека (Opitz J., et al., 1978; Warburton D., et al., 1980; Fryns J., et al., 1984; Boue A., et al., 1985). Обнаружены свидетельства в пользу связи конституциональных аномалий хромосом и фрагильности -сравнительно недавно описанного вида конституциональной хромосомной нестабильности (Wenger S., et al., 1995; Estor A., et al., 1995).

Фрагильность хромосом весьма продуктивно изучалась в 80-ые годы. Накоплен большой фактический материал по фрагильности аутосом у человека, произведена классификация сайтов, обнаружено совпадение сайтов фрагильности н точек разывов-воссоединений при образовании СКПХ (Estor A., et al., 1995; Wenger S., et al., 1995). Исследованы методы индукции фрагильных сайтов в различных клеточных культурах, а в последние годы в значительной мере изучена и их молекулярная конституция (Sozzi G., et al., 1995; Ohta M., et al., 1996). Неизменен интерес к фрагильности ввиду ее связи с развитием злокачественных опухолей (Gallo О., et al., 1995; Popescu N., 1995). Существуют убедительные свидетельства в пользу вовлеченности фрагильных сайтов в процессы эволюционных преобразований хромосом (Miro R., et al., 1987). Показана гомеология фрагильных

сайтов человека и высших приматов (Rönne М., 1995). Ряд авторов указывает на корреляцию фрагильных сайтов с точками локализации сестринских хроматидных обменов (Hirsch В., 1991; Tsuji Н., et al., 1991; Gaddini L„ et al., 1995).

И вместе с тем, несмотря на множество публикаций как по общим, так и по частным вопросам, касающимся генетики СКГ1Х, ряд важных медико-биологических аспектов не выяснен. Остается неизученным вопрос о радиочувствительности хромосом и в целом чувствительности генома к воздействию кластогенных факторов окружающей среды и влиянию мутагенов in vitro у индивидов с аномальным кариотипом. Эти знания исключительно важны в условиях высоких уровней загрязнения среды обитания человека химическими и физическими мутагенами и широкого применения ионизирующего излучения во многих сферах деятельности.

Можно предположить, что СКПХ способны оказывать влияние на клеточный гомеостаз, нарушать интегрированность клеточных систем, обеспечивающих стабильность генома. Вероятно, влияние СКПХ отражается на радиочувствительности хромосом у лиц-носителей. Результаты опытов на модельных биологических объектах с использованием высоких доз острого облучения (Boer Р., et al., 1977; Buul Р., et al., 1980) могут служить лишь косвенным свидетельством в пользу высказанной выше гипотезы, но не позволяют ни однозначно оценить радиочувствительность генетического аппарата у пациентов с СКПХ,. ни составить представление о ряде количественных и качественных характеристик их хромосомного статуса.

В данной работе проведено комплексное исследование важнейших цитогенетических показателей, каждый из которых в отдельности является надежным критерием оценки чувствительности хромосом. Четыре критерия в совокупности, предложенные в качестве тест-системы (уровень и спектр спонтанных аберраций хромосом (АХ), количество индуцированных малыми дозами у-лучей АХ, частота и спектр индуцированных модельным химическим мутагеном in vitro хромосомных повреждений и, наконец, частота и спектр фрагильных сайтов аутосом), позволили охарактеризовать стабильность генома лиц, имеющих СКПХ. В качестве последних выбраны реципрокные и робертсоновские транслокации как наиболее часто наблюдаемые СКПХ у человека.

Связь с крупными научными программами. Данная работа - часть научных исследований, проводимых НИИ НиВЗ в соответствии с Национальной программой профилактики генетических последствий,

обусловленных катастрофой на ЧАЭС (1991-1995) (Постановление Верховного Совета Белорусской ССР № 584-X1I от 1.02.1991). Часть исследований проведена в рамках Международной программы ВОЗ по биологической дозиметрии (Великобритания, 1993-1995).

Цель исследования. Комплексная оценка устойчивости хромосом лиц с СКПХ к у-облучению и химическим мутагенам на основе применения многофакторной цитогенетической тест-системы.

Задачи исследования.

1. Исследовать радиочувствительность хромосом у лиц с СКПХ в условиях у-облучения in vitro.

2. Изучить in vivo чувствительность хромосом к мутагенным факторам радиационной и химической природы у индивидов с реципрокными и робертсоновскими транслокациями на основе учета спонтанных (фоновых) аберраций хромосом.

3. Оценить чувствительность хромосом пациентов с конституциональными сбалансированнными перестройками к воздействию мутагена тиофосфамида (ТиоТЭФ) in vitro.

4. Исследовать фрагильность аутосом лимфоцитов периферической крови лиц со сбалансированными перестройками хромосом.

Научная новизна я практическая значимость полученных результатов. На основе четырех цитогенеггических тестов впервые получены данные, позволяющие судить о повышенной чувствительности хромосом лиц с СКПХ к действию мутагенных факторов как in vivo, так и in vitro. Это положение расширяет современные представления об организации и функционировании генома человека.

Полученные данные позволяют на принципиально новом методическом уровне оценить генетический риск у лиц с аномалиями кариотипа в условиях проживания в зонах радиационного загрязнения. С необходимостью такой оценки постоянно сталкиваются врачи медико-генетических консультаций. На практике это означает, что лица со сбалансированными аномалиями кариотипа могут оказаться группой повышенного риска в условиях все более осложняющейся экологической обстановки. Возникает необходимость учитывать это в связи с потенциальной возможностью организма человека подвергаться действию кластогенных агентов окружающей среды (вредные производства, некоторые виды медикаментов, канцерогены, рентгенологическая диагностика, табакокурение и т.п.).

• Исследование фрагильности аутосом - новый метод, недостаточно применяющийся в практике цитогенетическйх лабораторий Беларуси. В

данной работе впервые исследованы частота и спектр фрагильных сайтов аутосом у лиц с СКПХ.

Использованная в работе оригинальная тест-система продемонстрировала достаточно высокую чувствительность, что позволило оценить цитогенетический статус лиц с СКПХ. Эта тест-система может быть рекомендована как вариант комплексной схемы цитогенетического обследования.

На защиту выносятся следующие основные положения диссертации:

•У лиц со сбалансированными конституциональными перестройками снижена радиорезистентность и их общая устойчивость к воздействию in vivo и in vitro мутагенов химической и физической, природы.

•Для многофакторной оценки радиорезистентности и стабильности хромосом лимфоцитов периферической крови к мутагенным факторам необходимы:

а) анализ спонтанного (фонового) уровня аберраций хромосом;

б) исследование индуцированных в эксперименте in vitro аберраций хромосом (острое у-облучение и ТиоТЭФ);

в) данные о фрагильности аутосом как нового специфического Показателя изменчивости хромосом в условиях дефицита фолатов. Личный вклад соискателя. Автором лично выполнена экспериментально-методическая часть работы, изучена литература, относящаяся к вопросу исследования, на основании полученных результатов сделаны научно обоснованные выводы, оформлена диссертационная работа. ¡9

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации доложены на 21 Цитогенетическом симпозиуме (ЧССР, Прага, 1988), 22 Цитогенетическом симпозиуме (ЧССР, Братислава, 1989), на 3 Болгарском национальном конгрессе по медицинской биологии и генетике (Варна, 1990), на Всесоюзном совещании "Функциональная морфология клетки" (С-Петербург, 1991), на 6 съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров (Горки, 1992), на Юбилейной научной конференции (Витебск, 1994), на Международном научном конгрессе молодых ученых (Гомель, 1994), на Международном семинаре "Роль эпидемиологических исследований в оценке риска при радиационных авариях" (Минск, 1995), на Германских конгрессах по генетике человека (Германия, Берлин, 1994, 1995; Геттинген, 1996; Инсбрук, 1997), на I Европейском цитогенетическом конгрессе Греция, Афины, 1997); на 7 съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров (Горки, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 2 статьи. "

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического указателе, включающего 219 работ отечественных (42) и иностранных (177) авторов, а также приложений. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 8 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Формирование групп пациентов с СКПХ проводилось из числа лиц, у которых в период с 1987 по 1996 год в Республиканском медико-генетическом центре г. Минска были выявлены указанные аномалии кариотипа. Предметом изучения явились лимфоциты периферической крови носителей реципрокных и робертсоновских транслокаций, а также индивидов группы контроля.

Анкетирование всех исследуемых индивидов согласно общепринятой анкете (Carrano A., Natarajan А., 1988) позволило исключить воздействие дополнительных кластогенных факторов среды, установило отсутствие профессиональной вредности, вирусных заболеваний, а также рентгенологического обследования в предшествующий (3 месяца) цитогенетическому исследованию период.

Лица с реципрокными транслокациями - 34 человека (10 мужчин и-24 женщины), имели уникальные сбалансированные аномалии практически всего спектра аутосом, за исключением двух случаев родных сибсов с идентичной транслокацией.

1

1 г

1 —1 - в в > t

ж\ л ш ! 1 1 :

ц- 1_t ?

1 1 J 4 6 »7 I • 10 11 It 1J 14 И 1« 17 1« 1» 20 21 22

Рис.1. Спектр вовлеченных в реципрокные транслокации аутосом и количество обследованных носителей транслокаций соответствующей аутосом ы

Носители робертсоновских транслокаций -15 женщин, спектр гранслокаций в этой группе более однороден: 5 из них имели транслокацию 13/14; у 6 была транслокация 14/21, представлены также и более редкие формы, а именно 13/15, 21/22, 22/22. Группа контроля (26 человек) состояла из 18 женщин и 8 мужчин, специально отобранных согласно требованиям анкеты (Carrano A., Natarajan А., 1988). Возрастной состав лиц с аномальным кариотипом (варьировал от 20 до 40 лет и в среднем составил 31,0 год) и контрольной группы (от 25 до 33 лет, среднее значение 30,2 года) однороден.

Предлагаемая в работе тест-система оценки цитогенетического статуса включала сравнительный анализ четырех взаимосвязанных, характеристик.

1. Частота и спектр спонтанных АХ in vivo, отражающих "фоновый" уровень мутаций. Данный цитогенетический показатель является надежным критерием оценки стабильности генома. Спонтанные АХ возникают под действием целого ряда кластогенных факторов среды и характеризуют индивидуальные устойчивость или чувствительность к мутагенам. У каждого пациента исследовано 300 метафаз первого митоза с контролем допустимой доли ( не выше 5%) метафаз второго, митоза методом дифференциальной окраски сестринских хроматид.

2. Радиочувствительность хромосом у носителей СКПХ при остром однократном у-облучении in vitro в дозах 0,25 Гр и 0,5 Гр образцов периферической крови на установке Игур-1 в Институте радиобиологии HAH Беларуси', источник излучения 157Cs (мощность дозы 0,0б2Гр/мин.) на стадии Go. Указанные дозы соизмеримы с теми, которые могут получать жители Беларуси в условиях пребывания в зонах загрязнения радионуклидами в результате аварии на ЧАЭС, поэтому результаты могут быть экстраполированы для оценок генетического риска. Осуществлялся контроль первого клеточного деления. Исследовалось 200 метафаз.

3. Частота и спектр АХ, индуцированных ТиоТЭФ на стадии Go (свежеприготовленный водный раствор в концентрации 10 мг/мл) in vitro на материале метафаз I митоза, время экспозиции - 1 час. ТиоТЭФ -модельный химический мутаген с хорошо изученными параметрами распределения хромосомных разрывов по клеткам, спектром АХ, концентрационными и экспозиционными зависимостями выхода повреждений. В анализ отбирались до 100 метафаз от каждого носителя СКПХ и в контроле,

4. Фрагильные сайты аутосом. Индуцирование фрагильности достигалось созданием дефицита фолиевой кислоты в культуральной

смеси при культивировании лимфоцитов в течение 72 часов на среде 199 и уменьшении до 5% количества сыворотки крупного рогатого скота (Sutherland G.,1977; Rao Р., et al., 1988). Это позволило наблюдать как редкие наследуемые (r-fra), так и обычные конституциональные (c-fra) фрагильные сайты. Исследовались 100 метафаз. Локализация фрагильного сайта, морфологически регистрируемого как пробел или разрыв, производилась на дифференциально окрашенных хромосомах (GTG-метод) с числом сегментов в гаплоидном наборе не менее 400 согласно Международной номенклатуре хромосом человека (ISCN, 1995).

В ряде случаев для верификации сегментов разрывов хромосом в реципрокных транслокаций использован молекулярный метод флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) (исследования проведены в лаборатории радиационной цитогенетики Вестлейк Института при Ядерном Центре (Селлафилд, Великобритания). Цитогенетический анализ, документирование данных и приготовление фотоматериалов производились с использованием компьютерной анализирующей системы "CYTOVISION" (Applied Imaging • International, Великобритания). Графическое представление результатов выполнено с использованием пакета программ Microsoft Word Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фоновые (спонтанные) аберрации хромосом у лиц с аномалиями

кариотипа

Сравнение изучаемых групп проводилось по следующим онтогенетическим показателям:

-средняя частота аберрантных клеток в каждой из трех групп; -средняя частота АХ; -спектр АХ;

-частота дицентрических и кольцевых хромосом; -частота полиплоидных клеток (здесь и далее их число не включено в количество клеток с АХ);

- влияние половой принадлежности на изучаемые характеристики. Полученные результаты помещены в табл.1. Анализ цитогенетических данных показал, что:

-в изученных группах преобладают АХ хроматидного типа (табл.1). Соотношение аберраций хромосомного и хроматидного типов таково: 1:1,7 в группе с реципрокными транслокациями, 1:1,2 - с робертсоновскими транслокациями и 1:1,6 в контроле, что соответствует

данным литературы о соотношении аберраций хромосомного и хроматидного типов в популяционных исследованиях (Севанькаев А., 1987; Bender М., 1989); ,

-частота АХ в контроле соответствует приводимым в литературе значениям для контрольных групп в мониторинговых исследованиях (Bender М„ 1989; Sevan'kaev А., 1996; Shevchenko V., et al., 1997);

- частота метафаз, имеющих АХ, значимо выше в обеих группах лиц с СКПХ (Р<0,001), чем в контроле;

- частота АХ значимо выше как у лиц с реципрокными (Р<0,001), так и с робертсоновскими транслокациями (Р<0,01) по сравнению с контролем (табл.1);

- частота дицентрических и кольцевых хромосом с ацентрическими фрагментами - общепринятый надежный индикатор радиационных повреждений хромосом. У лиц с реципрокными транслокациями этот показатель составил 0,1739±0,050%, с робертсоновскими - 0,100±0,058% и в контроле - 0,0196±0,019%, что указывает на значимое увеличение частоты дицентрических и кольцевых хромосом у лиц с СКПХ (Р<0,01);

- частота полиплоидных клеток значимо выше у носителей СКПХ (Р<0,05) (табл.1). В настоящее время признается, что этот показатель возрастает в популяциях, отягощенных давлением мутагенных факторов радиационной природы (Пилинская М. с соавт., 1991).

Таблица 1

Частота и спектр спонтанных АХ у лиц с СКПХ (%)

Группа и ее численность Кол-во изучен, клеток Количество клеток сАХ Количество АХ АХ хромосомного типа АХ хроматидного типа Полиплоидные клетки

Рецилрокные транслокации 23 человека 6900 2,99±0,21 3,1±0,21 1,13±0,!3 ),97±0,17 0,087i 0,036

Робертсонов-скне транслокации 10 человек 3000 2,5±0,29 2,53±0,29 1,20±0,20 1,43±0,22 0,133± 0,046

Контроль 17 человек 5100 1,24±0,15 1,25±0,1б 0,49±0,10 0,76±0,!2 0,0196± 0,0196

• Анализ данных в каждой из трех групп, скомбинированных по половому признаку, показал отсутствие различий обсуждаемых цитогенетических характеристик у мужчин и женщин. При соответственном сравнении с контролем сохранялось значимое

увеличение нестабильности хромосом как у мужчин с СКПХ, так и у женщин с СКПХ. Таким образом, увеличение чувствительности хромосом в группах лиц с аномальным кариотипом не коррелирует с полом индивида.

Феномен мультйаберрантных клеток

В ходе исследования спонтанных АХ обнаружены редкие цитогенетические находки - метафазы, включающие ди-, три- и полицентрические хромосомы, кольцевые хромосомы, а также множественные ацентрические фрагменты. Включение таких метафаз в общий анализ АХ приводит к искажению картины истинной радиочувствительности индивида (А\уа А, Иее1 ]., 1986).

До настоящего времени не существует ни строгого определения, ни единых количественных критериев оценки мультйаберрантных клеток. Не существует также единого мнения в отношении причин и механизмов возникновения этих сложных аберраций хромосом. Интерес к феномену резко возрос в последние годы, поскольку подобные клетки стали частой находкой у лиц, подвергшихся действию радиационных факторов среды из-за аварии на ЧАЭС. Ввиду отсутствия строгих критериев определения мультйаберрантных метафаз, данные литературы плохо- сопоставимы: указывается частота - от 4 единичных метафаз на 1500 индивидов до 1 мультиаберрантной метафазы на 100 клеток у индивида. Существует мнение, что возникновение мультйаберрантных метафаз обусловлено постоянным локальным облучением стволовых клеток предшественников лимфоцитов за счет инкорпорированных радионуклидов, возможно, СЕ-частиц (Домрачева Е. с соавт., 1991). Другая гипотеза связывает появление обсуждаемых клеток с особенностями действия малых доз ионизирующего излучения (Спитковский Д., 1992). Ряд исследователей придерживаются предположения о вирусной этиологии мультиаберрантных клеток, а также гипотезы о аномальном апоптозе как причине появления феномена (Таит .1. й а!., 1985; А\*а А., л аК, 1986; Ьагтка Л., 1996).

В нашем исследовании муяьтиаберрантные метафазы обнаружены лишь у двух индивидов с реципрокными транслокациями, а в контроле и среди лиц с робертсоновскими транслокациями этот феномен не отмечен. '

Принимая во внимание повышенную частоту спонтанных АХ, а также приводимые ниже результаты других тестов, обнаружение мультйаберрантных клеток у лиц с СКПХ может служить еще одним свидетельством повышенной чувствительности их хромосом.

Индуцированные у-облучением in vitro аберрации хромосом

Увеличение in vivo уровня спонтанных АХ и, что особенно важно, значимое увеличение количества аберраций-маркеров радиационного воздействия у лиц с СКПХ обусловило необходимость изучения у этого контингента in vitro радиочувствительности хромосом. Известно, что острое облучение in vitro лимфоцитов на стадии Go интерфазы индуцирует образование как стабильных, так и нестабильных АХ, причем соотношение этих видов АХ по крайней мере в диапазоне доз 04,07 Гр практически равно (Lucas J., et al., 1992; Straume Т., Lucas J., 1993; Tucker J., et al., 1993, Lloyd D., 1997). Поэтому анализ, нестабильных АХ, характеризующихся четкой зависимостью «доза-эффект» и близким количественным соответствием повреждений при идентичном облучении in vitro и in vivo, представлял первоочередной интерес.

Проведенное нами цитогенетическое исследование in vitro радиочувствительности у лиц с СКПХ (рис.3) позволило заключить, что:

Рис.3. Частота и спектр АХ, индуцированных у-облучением in vitro в дозах 0,25 и 0,5 Гр у лиц со сбалансированными транслокацлями

- воздействие у-лучей in vitro в дозах 0,25 и 0,5 Гр дает больший по сравнению с контролем цитогенетический эффект но всем радиозависимым показателям (общее число АХ, число метафаз с АХ, частота нестабильных АХ типа дицентрических и кольцевых хромосом;

- при дозах 0,25 и 0,5 Гр частота АХ хромосомного типа -маркеров радиационных повреждений хромосом - значимо выше (Р<0,05);

- АХ хроматидного типа, которые не связаны с воздействием радиационных факторов в опыте in vitro, не возрастают с увеличением дозы, и их количество у носителей СКПХ не отличалось от .такового в контроле;

- выбранный диапазон доз позволил обнаружить увеличение радиочувствительности хромосом лимфоцитов крови у таких лиц, что подтвердило предположение о снижении стабильности генетического аппарата у носителей сбалансированных аномалий кариотипа.

Индуцированные мутагеном ТиоТЭФ АХ у лиц с СКПХ

Механизмы действия химических мутагенов и ионизирующего излучения на хромосомный аппарат клетки принципиально отличны. Это делает необходимым изучение АХ, индуцированных ТиоТЭФ в комплексной оценке цитогенетического статуса индивидов с аномальным кариотипом.

В табл. 2 приведены данные теста на частоту in vitro индуцированных АХ, анализ которых позволил сделать следующие заключения:

- частота метафаз с аберрациями значимо выше в группах лиц с СКПХ, (Р<0,001 для лиц с реципрокными транслокациями, Р<0,01 для носителей робертсоновских транслокаций);

- выход АХ также больший у лиц с реципрокными (Р<0,001) и робертсоновскими (Р<0,01) транслокациями, чем в контроле;

- хромосомный аппарат лиц с СКПХ характеризуются более высоким (Р<0,01) выходом аберраций как хроматидного, так и хромосомного типов, чем у индивидов с нормальным кариотипом.

Обнаружено также, что частота и спектр индуцированных АХ не зависят от половой принадлежности пациентов.

Результаты теста указывают на значимое увеличение чувствительности хромосом индивидов с СКПХ к in vitro воздействию ТиоТЭФ и совпадают с результатами изучения спонтанных и индуцированных у-облучением АХ, что подтверждает тенденцию

уменьшения резистентности хромосом лимфоцитов индивидов с аномальным кариотипом к различным мутагенным воздействиям;

Таблица 2

Частота и спектр индуцированных ТиоТЭФ АХ у лиц с СКПХ (%)

Группа н ее численность Кол-во изучен, клеток Количество клеток с АХ Количество АХ АХ хромосомного типа АХ хроматид-ного типа

Рецнпрокные транслокации 17 человек 2212 12,30±0,70 12,79±0,71 5,42±0,48 7,37±0,56

1'обсртсоиовские транслокации 9 человек- 1085 II,71 ±0,98 11,89±0,98 4,70±0,64 7,19±0,78

Контроль 13 человек 1670 8,44*0,68 8,98±0,70 3,95±0,48 5,03±0,53

Фрагильность аутосом

Исследование фрагильности имело первоочередной задачей описать частоту и спектр как редких (r-fra) так и обычных (c-fra) фрагильных сайтов у лиц с СКПХ.

Обычные фрагнльные сайты. В ходе цитогенетического анализа выявлено 39 обычных и 3 редких сайта фрагильности. На рисунке 4 представлены спектр наиболее часто индуцируемых c-fra сайтов и частота наблюдений каждого из них в группах. Исследование фрагильности показало:

- в 76,2% случаев c-fra сайт морфологически проявляется как хромосомный пробел;

- наиболее часто экспрессируемыми являются сайты "FRA3B (f>a(3)(pl4), FRA16D (fra(16)(q23.2) и FRA6E (fra(6)(q26) как у лиц с СКПХ, так и в контроле, что совпадает с данными популяционных исследований (Caporossi D., et al., 1995; Sbrana I.,et a!., 1995);

- существенные различия в спектре фрагильности в изученных группах не отмечены (у лиц с реципрокными транслокациями выявлено 32 вида c-fra сайтов; в группе с робертсоновскими транслокациями - 30, и в контроле - 31 c-fra сайт); v

- ряд c-fra сайтов обнаружен только при СКПХ, но не найден в контроле (например, сайт FRA17B (fra(17)(q23) выявлен только у 6 лиц с реципрокными транслокациями);

- значительно выражена индивидуальная вариабельность частоты экспрессии с-Гга сайтов во всех группах, она существенно превосходит размах индивидуальных колебаний других изученных нами цитогенетических характеристик (например, от I до 62 с-1га у лиц с реципрокными транслокациями, а в контроле - от 1 до 31).

Эр14

1Cq23

tq2i

М<|24

4qJ1

Хр22

1q21

Рис.4. Обычные фрагильные сайты и их частота (%) у лиц с СКПХ и в контроле

Редкие фрагильные сайты. Редкий аутосомный фрагильный сайт fra(l7)(pl2) первоначально был описан в литературе как вариант нормального полиморфизма хромосомы 17 со «вторичной перетяжкой» на коротком плече (Ferguson-Smith M., et al., 1962), a позднее установлено, что он принадлежит к группе дистамицин-А-индуцируемых редких сайтов (Berger M., et al., 1985), и может быть индуцирован введением в культуру дистамицина А, бромдезоксиуридина и других добавок, а также способен проявляться спонтанно.

В нашем исследовании редкий наследуемый фрагильный сайт FRA17A с локализацией в сегменте 17р 12 выявлен у двух индивидов, один из них - носитель реципрокной транслокации, второй - из контрольной группы. Частота экспрессии в обоих случаях высока (более 50%). Обычно индивид с такой фрагильностью - случайная цитогенетическая находка ввиду отсутствия фенотипических маркеров редких фрагильных сайтов аутосом. Исключение составляет всесторонне изученный к настоящему времени синдром Х-сцепленной умственной отсталости (синдром Мартина-Белла), связанный с носительством редкого фолат-зависимого сайта FRAXA в сегменте (X)(q27.3).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные цитогенетические методы служат надежным и чувствительным инструментом оценки статуса хромосом у лиц повышенного риска. Данное исследование основано на применении комплексной тест-системы и впервые предоставило фактический материал, свидетельствующий о снижении стабильности генома у индивидов со сбалансированными аномалиями кариотипа. Наши данные указывают на уменьшение резистентности хромосом лиц с СКПХ к действию мутагенов среды, химических мутагенов in vitro, а также об уменьшении их радиорезистентности in vivo и in vitro. На практике это означает, что индивиды с СКПХ составляют группу повышенного риска в популяциях, отягощенных давлением мутагенных факторов химической и радиационной природы.

ВЫВОДЫ

1. У носителей сбалансированных структурных перестроек хромосом увеличено количество фоновых (спонтанных) аберраций хромосом, в том числе маркеров радиационных воздействий.

2. Воздействие in vitro физических (острое однократное у-облучение в дозах 0,25 и 0,5 Гр) и химических (тиофосфамид) факторов на кровь носителей сбалансированных конституциональных аномалий кариотипа индуцирует значимо большее количество аберраций хромосом, чем в контрольной группе.

3. Для лиц со сбалансированными конституциональными нарушениями кариотипа характерна нестабильность хромосом. Такие лица должны быть отнесены к группе риска в связи с повышенной чувствительностью к ионизирующей радиации и химическим мутагенам.

4: У лиц со сбалансированными конституциональными перестройками хромосом фрагильность (как по редким, так и обычным сайтам) в условиях дефицита фолатов in vitro не отличается от контроля. 5. Предложен чувствительный метод определения стабильности хромосомного аппарата - тест-система цитогенетического анализа, основанная на оценке фоновых аберраций хромосом, аберраций хромосом, индуцированных "in vitro ионизирующей радиацией и химическим мутагеном.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Polityko A. The frequency of spontaneous chromosomal aberrations in lymphocytes of patients with reciprocal translocations//2l Cytogenetic Symposium: Abs.-Prague, Czechoslovakia, 1988.-P. 17.

2. Polityko A. The frequency of chromosomal aberrations and autosomal fragility in carriers of reciprocal translocations//22 Cytogenetic Symposium: Abs.- Bratislava, Czechoslovakia, 1989. -P.39.

3. Политыко А.Д. Спонтанный уровень хромосомных аберраций н аутосомная ломкость у носителей реципрокиых транслокаций//Генетика человека и патология: Тез.докл. 1 итоговой конференции. -Томск, 1989. -С. 99.

4. Политыко А.Д. Спонтанные хромосомные аберрации у носителей робертсоновских транслокацийУ/Ш Национальный конгресс по Медицинской биологии и генетике :Тез.докл. -Варна, Болгария, 1990. -С.40.

5. Политыко А.Д. Фрагильность аутосом в лимфоцитах носителей робертсоновских транслокаций/Функциональная морфология клетки: Тез. докл. всесоюзн. совещ.//Цитология. -1991. -Т.ЗЗ. -С.97.

6. Политыко А.Д. Фрагильность аутосом и частота хромосомных аберраций в лимфоцитах носителей робертсоновских транслокации// VI Съезд Белорусского общества генетиков и селекционеров: Тез. докл.-Горки, 1992.-С. 117.

7. Политыко А.Д. Цитогенетический статус лимфоцитов крови у лиц со сбалансированными конституциональными перестройками хромосом. Спонтанный уровень хромосомных аберраций// VI Съезд ВОГИС им. Н.И.Вавилова: Тез.докл. -Минск, 1992. -С.129.

8. Политыко А.Д. Особенности реагирования хромосом у лиц-носителей сбалансированных транслокаций на действие кластогениых факторов//Молодые ученые в решении проблемы ликвидации медицинских последствий аварии на ЧАЭС: Тез.докл. международи. научн. конгресс. - Гомель, 1994. -С.42.

9. Polityko A. Cytogenetic status of balanced rearrangement carriers. Environmental clastogenic effects/Abs. of 6lh Meeting of the German Society of Human Genetics. -Duesseldorf // Medizinishe Genetik. - 1994. -V.1.-P.150.

Ю.Политыко А.Д. Цитогенетический статус лиц с конституциональными сбалансированными перестройками хромосом. Индуцированные

хромосомные аберрации//Научная юбилейная конференция, посвященная 60-летию ВМИ: Тез.док. -Витебск, 1994. -С.38.

11.Polityko A, "Rogue" cells in constitutional chromosomal rearrangement carriers / Abs. of 8lh Meeting of the German Society of Human Genetics. -Gottingen/ZMedizinishe Genetik. -1996. -V. 1. -P. 74.

12.Rumyantseva N.,Drozdovskaya N., Polityko A. Proximal deletion of chromosome 7(ql I.I->q 11.23): a new case and review/ Abs. of 8,h Meeting of the German Society of Human Genetics. -Gottingen// Medizinishe Genetik.-1996.-V.l.-P. 76.

1 З.Поли гыко А.Д. Мультиаберрантные клетки у жителей незагрязненных радионуклидами зон - носителей сбалансированных конституциональных перестроек//Десять лет после. Чернобыльской катастрофы: Тез.докд. международн. научн. конференции.-Минск,

1996. -С. 239.

Ы.Polityko A. Common fragile sites in balanced translocation carriers/Abs. of 9th Meeting of the German Society of Human Genetics. -lnnsbuck//Mcdiziniche Genetik. -1997. -V.l. -P.68.

15.Rumyantseva N.. Naumchik I., Polityko A. 18q monosomy: study of 4 children, cytogenetic and phenotype analyses/ Abs. of 9th Meeting of the German Society of Human Genetics. -Innsbruck//Mediziniche Genetik. -

1997.-V.l.-P.69.

16.Политыко А. Редкий фрагильный сайт FRA17A: цитогенетический статус лпц-нос1пслей//УП Съезд ВОГИС им. Н.И.Вавилова: Тез.докл,-Мннск, 1997. -С.100-101.

17.Polityko A. Cytogenetic study of 2 patients with rare distamycin A inducible fragile sites FRA17A at 17pl2/ Abs. Abs.l" European Cytogenet.Conference. -Atens, Greece//Cytogenet.Cell Genet. -1997. -V.77. -P. 120.

18.Rumyantseva N., Naumchik I., Polityko A. Segregation of t(6;17)(p25;q23) in family: cytogenetic and clinical aspects/ Abs. 1«

. European Cytogenet.Conference. -Atens, Greece //Cytogenet.Cell Genet.-1997. -V.77.-P. 121. '

19.Политыко АД., Лазюк Г.И. Основные цитотенетические характеристики носителей сбалансированных конституциональных перестроек хромосом/Ддравоохранение. -1998. -№ 1. -С. 16-18.

20.Политыко А.Д. Редкие фрагильные сайты у лиц со сбалансированными аномалиями кариотипаЮкологическая антропология. Ежегодн. сборник. -Минск: Белорусский комитет «Дети

Чернобыля», 1998. -С. 234-235.

РЕЗЮМЕ

Политыко Анна Дмитриевна Радиочувствительность хромосом и другие цнтогенетнческне характеристики лиц со сбалансированными конституциональными аномалиями карнотипа

Ключевые слова: аутосомы, аберрация, конституциональная сбалансированная перестройка хромосом, карнотнп,

радиочувствительность, рецилрокная гранслокация, робертсоновская транслокация, фрагильный сайт.

Объект исследований: культура лимфоцитов крови человека.

Цель работы: комплексная оценка устойчивости лиц со сбалансированными перестройками хромосом к у-облучению и химическим мутагенам на основе применения многофакторной цитогенетической тест-системы.

Методы исследований: цитогенетический анализ равномерно окрашенных хромосом, анализ дифференциально окрашенных хромосом (GTG-метод), метод дифференциально окрашенных сестринских хроматид, метод флюоресцентной in situ гибридизации (FISH). Документирование данных, приготовление фотоматериалов выполнены с использованием компьютерной автоматической системы анализа «Cytovision»(App!ied Imaging International, Великобритания).

Полученные результаты и их новизна. В работе предложена четырехфакторная тест-система оценки цитогенетического статуса, на основе которой впервые изучены основные цнтогенетнческне характеристики лиц со сбалансированными аномалиями карнотипа. Сформированы группы лиц с реципрокными (34 человека), робертсоновскими (15 человек) транслокациями и контроль( 26 человек). В этих группах исследованы чувствительность хромосом in vivo к мутагенам окружающей среды; радиочувствительность хромосом к действию острого у-облучения в дозах 0,25Гр и 0,5Гр in vitro, устойчивость к химическому мутагену, а также впервые описана фрагильность аутосом. Показана повыа^нная радиочувствительность хромосом in vivo и in vitro, а также общее снижение резистентности хромосом у лиц со сбалансированными конституциональными перестройками хромосом к мутагенным воздействиям, что дает основание выделить таких индивидов в группу риска в условиях осложненной экологической обстановки в Беларуси.

Область применения: генетика человека, радиационная медицина.

РЭЗЮМЭ Паштыка Ганна Дзмггрыеуна

Радыёадчувальнасць храмасом i ¡ншыя цытагеиетычныя характеристик лЫфацытау крыв! асоб са збалансаванылй канстытуцыянальным! анамал1ям! карыятыпу

Юпочавыя словы: ajfracoMa, аберацыя, канстытуцыянальная збалансаваная перабудова храмасом, карыятып, радыёадчувальнасць, рэцыпрокная транслакацыя, рабертсонауская транслакацыя, фрагшьны сайт.

Аб'ект доследау:- культура л^мфацытау перыферычнай крыв) чалавека.

Мэта праиы: комплексная ацэнка устойшвасщ асоб са збаласаваным1 перабудовам! храмасом да у-апраменьвання i xiMi4Hara мутагена на выснове выкарыстання чатырохкампанентнай тэст-астэмы.

Метады даследвання: цытагенетычны анал1з раунамерна афарбаваных храмасом, анал1з дыферынцыяльна афарбаваных храмасом (GTG-меггад), метад дыферынцыяльнай афарбоук1 сястрынсюх храмацщ, метад флюарысцэнтнай in situ пбрыдызацьп (FISH). Дакументаванне дадзеных, прыгатаванне фотаматэрыалау зроблены з выкарыстаннем камп'ютэрнай аутаматычнай астэмы аналгзу «Cytovision»(Applied Imaging International, Вялисабрыташя).

Атрыманыя вынЫ i ix нав1зна, У працы прапанавана чатырохкампанентная тастчйстэма ацэню дытагенетычнага статута, на аснове якой упершыню даследаваны галоуныя цытагеиетычныя характарыстьш асоб са збалансаваным! анамал!ям1 карыятыпу. Сфармфаваны групы . асоб з рзцыпрокным» (34 чалавекО, рабертсонаускш! (IS чалавек)транслакацыям! i кантроль (26 чалавек). У гэтых групах даследавана фонавая адчувальнасць храмасом in vivo да мутагенау навакольнага асяроддзя; радыёадчувальнасць храмасом да уздзеяння вострым у-алраменьваннем у дозах 0,25 Гр i 0,5 Гр in vitro, устоШпвасць да мадэльнага хЫчнага мутагена. Упершыню даследавана фрапльнасць аутасои у асоб са збалансаваныш анамашям! карыятыпу.

Паказана павял>чаная радыёадчувальнасть храмасом in vivo i in vitro, а таксама агульнае зшжэнне цытагенетычнай устойл!васш у асоб са збалансаваным( перабудовам! храмасом. Тэта дае падставу л1чыць таюх людзей групай рызым у складаных экалапчных умовах.

Галша выкарыстання: генэтыка чалавека, радояцыйная кедыцына.

SUMMARY Polityko Anna D.

Chromosome radiosensitivity and other cytogenetic characteristics of blood lymphocytes of individuals with balanced constitutional karyotype

abnormalities

Key words: autosome, aberration, constitutional balanced chromosome rearrangement, karyotype, radiosensitivity, reciprocar translocations, Robertsonian translocations, fragile site, fragility.

Object of investigations: culture of human blood lymphocytes.

Objective: complex assessing of cytogenetic resistance of individuals with constitutional balanced chromosome rearrangements to y-irradiation and chemical mutagens action using four -component tests.

Research methods: cytogenetic analysis of solid stained chromosomes, analysis of Gimsa-stained chromosomes, sister-chromatide exchange method, fluorescence in situ hybridization (FISH). Cytogenetic database and photo pictures were prepared using automated computer system «Cytovision»(Applied Imaging International, UK). .

Obtained results and their novelty. To estimate the influence of karyotype abnormalities on cytogenetic sensitivity and radiosensitivity, the groups of individuals with balanced constitutional rearrangements in their karyotypes (34 people with reciprocal translocations, 15, with Robertsonian translocations) and 26 matched control individuals were selected. Comparative studies of the frequency and the spectrum of spontaneous chromosome aberrations in vivo, chromosome aberrations induced by acute ■y-irradiation at doses of 0,25 Gy and 0,5 Gy, autosomal fragility (common and rare fragile sites), and chemical mutagen in vitro influence were carried out.

Increased sensitivity to environmental mutagens and radiosensitivity in vivo, instability to mutagenic exposure in vitro as well as rare cytogenetic findings are discussed.

Field of application: human genetics, radiological medicine.

Отпечатано в на ротапринте Управления Делами НАНБ, Минсх, лр.Ф.Скорины, 66. Подписано в печать 20.03.1998. Тираж 100 экземпляров. Заказ 445 Формат 60x84 1/16. Объем 1,5 усл. п.л.