Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание химиотерапевтических противоопухолевых систем направленного действия с использованием белковых факторов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Создание химиотерапевтических противоопухолевых систем направленного действия с использованием белковых факторов"

На правах рукописи

РГБ од

1с ар.? 2ао:

Луценко Сергей Викторович

СОЗДАНИЕ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СИСТЕМ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БЕЛКОВЫХ ВЕКТОРОВ

Специальность: 03. 00. 04. - «биохимия»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва

2000

Работа выполнена в отделе биохимии Московского научно-исследовательского института медицинской экологии.

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Северин С.Е. Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Жданов Р.И. доктор биологических наук, профессор Карелин A.A. доктор биологических наук, профессор Киселев В.И.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им.

Защита состоится «*£» fi^yгсч eJ- 2000 г. на заседании Диссертационного совета Д.171.02.01. при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН.

Автореферат разослан --¿ayíi-i а- 2000 г. Ученый секретарь Диссертационного совета,

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

РАН.

кандидат биологических наук

Актуальность проблемы.

Одной из важнейших задач современного естествознания является поиск путей и возможностей проведения регуляторных сигналов для осуществления целенаправленного воздействия на физиологические процессы, протекающие в живой клетке. В качестве таких путей нами рассматривалась система мессенджеров, реализующая каскадное усиление внешнего сигнала и рецепторопосредованный эндоцитоз - механизм селективного концентрирования и поглощения специфических лигандов. Посредством согласованного действия систем мессенджеров реализуется регуляция ключевых внутриклеточных процессов. При взаимодействии первичных мессенджеров с соответствующими рецепторами, под действием сопряженных с рецептором ферментативных систем, внутриклеточный уровень вторичных мессенджеров изменяется, что приводит к запуску регуляторных ферментных каскадов, основными звеньями которых являются ферменты, модифицирующие соответствующие субстраты, что в конечном итоге приводит к определенным физиологическим реакциям. Одним из ключевых ферментов, играющих важную роль в передаче трансмембранного сигнала, но до настоящего времени недостаточно изученным, является Са37кальмодулинзависимая протеинкиназа П (ПКЛ), опосредующая регуляторное действие Са2+ на внутриклеточные процессы. Основным физиологическим субстратом ПКП является синапсин I - белок, ассоциированый с цитоплазматической поверхностью синаптических везикул нервных окончаний, участвующий в процессах нейросекреции и возникновении ряда заболеваний нервной системы. Изучение свойств и роли ПКП в процессах клеточной пролиферации, секреции нейротрансмиттеров, функционировании цигоскелета, гликолизе, опухолевом росте и патологических нарушениях нервной системы представляется актуальным. Разъяснение значения фосфорилирования синапсина I и взаимодействия белка с элементами цитоскелета создает основу для более детального понимания механизма нейросекреции. Исследование физиологической роли ПКП и ее субстратов позволяет не только определить место данного фермента в системе регуляции клеточной активности, но и расширить представления о возможности избирательной регуляции внутриклеточных процессов на уровне вторичных мессенджеров и на стадии химической модификации субстрата активированными ферментными системами.

Помимо системы мессенджеров, перспективным путем избирательного воздействия на внутриклеточные процессы является рецепторопосредованный эндоцитоз - общий механизм переноса в клетки эукариот биологически активных веществ. С использованием эндоцитоза может быть осуществлен избирательный транспорт в клетку-мишень химически связанных с физиологическими лигандами различных модуляторов клеточной активности, в том числе и лекарственных препаратов. Избирательность транспорта при этом достигается за счет способности лиганда (вектора) к высокоаффинному связыванию со специфическими рецепторами, экспрессированными только/или преимущественно на клетках-мишенях. Для практического применения векторы должны отвечать ряду требований, к числу

которых относятся: доступность в препаративных количествах, стабильность, сохранение высокого сродства к рецептору после химической модификации. В полной мере этим требованиям отвечают эпидермальный фактор роста (ЭФР), аномально высокий уровень экспрессии рецепторов которого отмечается в клетках опухолей эпителиального происхождения, и онкофетальный белок альфа-фегопротеин (АФП), рецепторы которого экспрессируются практически всеми типами раковых клеток, но отсутствуют на клетках нормальных тканей. Поэтому ЭФР и АФП были использованы нами для создания систем направленного действия, предполагающих наличие специфического рецептора и коваленгно связанных векторного белка и модулятора клеточной активности. Подобные системы могут найти применение в различных областях медицины для изучения возможностей направленного влияния на физиологические процессы и повышения эффективности действия известных химиотерапевтических средств при лечении целого ряда заболеваний, включая онкологические. В настоящее время фундаментальной проблемой практической онкологии является высокая токсичность и низкая избирательность действия противоопухолевых препаратов известных классов. Применение систем направленного транспорта с использованием моноклональных антител в качестве векторов не оправдало надежд на их высокую терапевтическую активность. Создание противоопухолевых систем направленного действия с использованием физиологических векторов (АФП и ЭФР) для избирательного транспорта широко применяемых в клинической практике химиопрепаратов — порфиринов, антрациклиновых антибиотиков и растительных алкалоидов - в опухолевые клетки призвано послужить решению задачи повышения терапевтической эффективности химиопрепаратов за счет снижения токсичности и увеличения избирательности их действия. Сравнительное исследование в модельных экспериментах in vitro и in vivo уровня противоопухолевой активности полученных систем направленного действия позволяет оценить возможности их применения в области практической онкологии. Изучение динамики накопления и внутриклеточного распределения химиопрепаратов, доставляемых в клетку в составе систем направленного действия, имеет существенное теоретическое и прикладное значение, поскольку позволяет прояснить механизм их цитотоксического действия и наметить пути повышения его эффективности.

В настоящее время масштабное исследование биологических функций и возможностей применения в медицине целого ряда белков, особенно факторов роста и цитокинов, ограничено из-за их труднодоступное™ в препаративных количествах из природных источников. В связи с этим представляется безусловно актуальной задача разработки с использованием генно-инженерных подходов методов экспрессии, получения и характеристики биологически активных рекомбинаитных белков, в частности ЭФР и интерлейкинов 3 и 4, обладающих значительным потенциалом для использования в различных областях медицины.

Пелью диссертационного исследования явилось исследование путей проведения клеточных регуляторных сигналов (системы Са2+, реализующей каскадное усиление внешнего сигнала посредством активации ПКП, модифицирующей синапсин I, и системы рецепторопосредованного зндоцигоза — механизма селективного концентрирования и поглощения специфических лигандов) на предмет определения возможностей избирательного влияния на физиологические процессы, протекающие в клетке; создание эффективных терапевтических систем направленного действия и оценка перспективности их последующего клинического использования; получение с использованием генно-инженерных подходов препаративных количеств векторных белков - потенциальных компонентов систем направленного действия.

Для достижения поставленной цели были сформулированы и выполнены следующие основные задачи:

1. Выделить ПКП и синапсин I и исследовать физико-химические свойства белков, субстратную специфичность ПКП, а также регуляторное влияние автофосфорилирования, фосфолипидов и жирных кислот на активность фермента.

2. Исследовать регуляторное влияние ПКП на процесс гликолиза.

3. Провести сравнительное исследование кальмодулинсвязывающих центров ПКП и других кальмодулинзависимых ферментов, направленное на выявление гомологичных участков.

4. Определить возможности взаимодействия синапсина I с элементами цитоскелета и регуляторного влияния фосфорилирования на этот процесс.

5. Обобщить полученные данные и определить роль фосфорилирования синапсина I в регуляции нейросекреции и возможности направленного контроля за избирательностью прохождения регуляторного сигнала на стадии химической модификации субстрата активированными ферментными системами.

6. Осуществить синтез эффективных систем направленного действия (СНД), включающих противоопухолевые химиопрепараты (фталоцианины, хлорины, антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды) и векторные белки (чЭФР, рецегтгорсвязывающий фрагмент чЭФР (чЭФРФР) и чАФП). Исследовать свойства, динамику поступления, внутриклеточного распределения и возможности терапевтического применения полученных СНД.

7. Изучить возможности снижения лекарственной устойчивости опухолевых клеток к химиопрепаратам при использовании СНД.

8. Создать генно-инженерные штаммы-продуценты белков человека (чЭФР, чИЛ-З и чИЛ-4) и разработать эффективные методы выделения и ренатурации, позволяющие получать рекомбинантные белки в препаративных количествах для использования в качестве компонентов СНД и применения в области медицины.

Научная новизпа н теоретическая ценность полученных результатов заключается в фундаментальном значении теоретических выводов, следующих из диссертации.

Значительно дополнены имеющиеся сведения о физико-химические свойствах ПКП и ее субстрата синапсина I, субстратной специфичности ПКП, регуляторном влиянии автофосфорилирования на активность фермента.

Впервые исследовано регуляторное действие продуктов липидного обмена в отношении ПКП. Показано игибнрукнцее действие фосфолипидов и жирных кислот на активность ПКП и активацию фермента кальмодулином.

Впервые обнаружено наличие в структуре кальмодулинзависимых ферментов (ПКП, киназы фосфорилазы и фосфодиэстеразы сАМР) и синапсина I гомологичных кальмодулинсвязывающих участков, что отражает структурно-функциональную консервативность кальмодулинзависимых регуляторных механизмов.

Впервые продемонстрировано регуляторное влияние ПКП на процесс гликолиза, посредством активации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД).

Обнаружена способность белка цитоскелета тубулина к связыванию с синапсином I - основным белком внешней поверхности синаптических везикул. Впервые показано значительное снижение аффинности взаимодействия синапсина с тубулином при фосфорилировании синапсина I протеинкиназами.

Исходя из полученных данных сформулирована гипотеза о ключевой роли фосфорилирования синапсина I в регуляции нейросекреции, наглядно иллюстрирующая чрезвычайную сложность избирательного проведения однонаправленного регуляторного сигнала на стадии химической модификации субстрата активированными ферментными системами. Предложен гипотетический механизм нейросекреции, основанный на регуляторной роли фосфорилирования синапсина I различными протеинкиназами.

Впервые показана возможность использования рецепторсвязывающего фрагмента чЭФР (чЭФРФР) в качестве вектора для создания высокоэффективной системы направленного транспорта ДР в опухолевые клетки.

Разработаны оптимальные схемы получения эффективных противоопухолевых СНД, включающих фталоцианины, хлорины, антрациклиновые антибиотики, растительные алкалоиды и векторные белки (чЭФР, чЭФРФР (в случае ДР) и чАФП). Противоопухолевая активность полученных систем значительно превышает активность соответствующих свободных химиопрепаратов.

Продемонстрирована возможность значительного снижения лекарственной устойчивости опухолевых клеток к антрациклиновым антибиотикам при использовании систем направленного действия.

Впервые исследована динамика накопления и внутриклеточное распределение антрациклинов, доставляемых в опухолевые клетки в составе СНД с использованием ЭФР в качестве белкового вектора. Полученные данные проливают свет на механизм цитотоксического действия СНД и позволяют наметить пути увеличения их противоопухолевой активности.

Установлено, что при поступлении антрациклинов в клетки MCF-7Wt и MCF-7AdrR в составе СНД, уровень их внутриклеточной деградации заметно снижается.

На основе сконструированных плазмид Е. coli, позволяющих осуществить эффективную экспрессию синтетических генов ЭФР, ИЛ-3 и ИЛ-4 человека в условиях конститутивного и индуцированного биосинтеза белка, получены штаммы-продуценты Е. coli.

Разработаны простые и эффективные методы выделения и ренатурации рекомбинантных чЭФР, чИЛ-3, чИЛ-4, позволяющие получать биологически активные белки.

Практическая ценность результатов проведенной работы определяется тем, что:

- Разработанные эффективные методы получения чрезвычайно лабильного фермента ПКП и синапсина I, позволяющие значительно сократить время выделения и увеличить выход целевых белков, могут найти применение при проведении фундаментальных исследований в области энзиматической регуляции клеточной активности.

- Разработанные противоопухолевые СНД на основе химиопрепаратов различных классов и физиологических белковых векторов, наряду с оптимизированными методами их получения и тестирования, могут быть использованы для дальнейших исследований в области практической онкологии.

- Применение рецепторсвязывающего фрагмента ЭФР в качестве молекулярного вектора позволяет, наряду с увеличением стабильности и эффективности действия, достичь значительного снижения стоимости СНД.

Использованные при конструировании плазмид подходы, позволяющие осуществлять эффективную экспрессию синтетических генов чЭФР, чИЛ-3 и чИЛ-4, могут применяться в области генетической инженерии и биотехнологии для получения штаммов - продуцентов различных рекомбинантных белков.

- Полученные штаммы - продуценты Е. coli чЭФР, чИЛ-3 и чИЛ-4 и разработанные методы очистки и ренатурации рекомбинантных белков могу быть использованы в области промышленной биотехнологии, а полученные рекомбинантные белки как для научно-исследовательских работ, так и в области практической медицины.

- В процессе разработки практических основ технологии получения рекомбинантных белков на основе генно-инженерных подходов оформлен патент на изобретение.

Апробация диссертационной работы. Результаты исследований доложены на симпозиуме "Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных реакций", Рязань, 1985; симпозиуме "Химия и биохимия пептидно-белковых гормонов", Суздаль, 1985; симпозиуме "Фундаментальные достижения нейрохимии -медицине", Горький, 1987; симпозиуме по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987; VII симпозиуме "Химия белков и пептидов", Таллин, 1987; VI симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных

реакций", Петрозаводск, 1988; V советско-швейцарском симпозиуме «Биологические мембраны: структура и функции», Рига, 1988; Bayev memorial conference, Cobiotec-RAN, Moscow, Russia, 1996; The XXTV Meeting of the ISOBM, San Diego, Calif. USA, 1996; втором съезде биохимического общества РАН, Москва, Пущино, 1997; The XXVth Anniversary Meeting of the ISOBM, Montreux. Switzerland, 1997; International Conferences New Anticancer Agents, Athens, Greece, 1997; VIII конференции «Новые направления биотехнологии» РАН, Москва, 1997; The XXVI Meeting of ISOBM, Umea, Sweden, 1998; lO^NCA-EORTC symposium on new drugs in cancer therapy, Amsterdam, Netherlandes, 1998; 15й meeting European association for cancer research, Stockholm, Sweden, 1998; Fourth European congress of pharmaceutical sciences, Milan, Italy, 1998; VI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1999; 27th Meeting of the ISOBM, Kyoto, Japan, 1999; II съезде биофизиков России, Москва, 1999; The 17Л Meeting of the International Academy of Tumour Marker Oncology, Hong Kong, 2000.

Структура и объем диссертации. Структура диссертации традиционна. Она содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, общие выводы и указатель цитируемой литературы.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ПКП - ключевой фермент со сложной системой регуляции активности, опосредующий регуляторное действие Са2+ в отношении процессов нейросекреции и гликолиза.

2. Ряд кальмодулинзависимых ферментов и синапсин I, содержат в своей структуре консервативные иммунологически подобные кальмодулинсвязывающие последовательности.

3. Избирательная регуляция внутриклеточных процессов на уровне вторичных мессенджеров и стадии химической модификации субстрата активированными ферментными системами является трудноосуществимой из-за тесной взаимосвязи и сложной организации взаиморегуляции как системы вторичных мессенджеров, так и фермент-субстратных систем.

4. Противоопухолевые системы направленного транспорта фталоцианинов, хлоринов, антрациклиновых антибиотиков и растительных алкалоидов, полученные путем химического синтеза с использованием чЭФР и чАФП в качестве векторных молекул, позволяют снизить клеточную резистентность и проявляют противоопухолевую активность, значительно превышающую активность свободных химиопрепаратов.

5. Рецепторопосредованный эвдоцитоз является механизмом, позволяющим осуществлять модулирование клеточной активности или селективное элиминирование клеток-мишеней при использовании систем направленного действия.

6. Сконструированные генно-инженерным путем плазмиды, несущие синтетические гены чЭФР, чИЛ-3 и ИЛ-4 позволяют осуществлять эффективную экспрессию

целевых белков в клетках штаммов-продуцентов. Разработанные методы очистки и ренатурации позволяют получать в препаративных количествах биологически активные рекомбинантные белки человека.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Роль ПКН и синапсина I в регуляции клеточной активности

В связи с ключевой ролью ПКП и ее субстрата - синапсина I (С1) в системе внутриклеточной передачи регуляторного сигнала, данные белки рассматривались нами в качестве потенциальных мишеней направленного изменения физиологических функций клетки. Для изучения возможностей избирательного влияния на внутриклеточные процессы на уровне фосфорилирования субстратов активированными протеинкиназами на первом этапе нами были разработаны эффективные методы выделения ПКП и С1 и изучены их некоторые физико-химические и биологические свойства.

Выделение и изучение некоторых физико-химических и кинетических свойств ПКП из мозга крысы.

В связи с чрезвычайной лабильностью и низким выходом ПКП при использовании ранее описанных методов, для выделения фермента нами была разработана усовершенствованная схема, последовательно включающая ионообменную хроматографию, осаждение сульфатом аммония, гель-фильтрацию и аффинную хроматографию. После аффинной хроматографии на кальмодулин-сефарозе был

получен препарат фермента в близком

В

кДа г

94 68

45

25

1 2

i г

Рис. 1. Электрофорез препарата ПКП (А); связывание субъединиц ПКП с 1а1-меченым кальмодулином в присутствии 1 мМ СаС12 (Б, 1) и 0,5 мМ ЭГТА (Б, 2); автофосфорилирование ПКП в присутствии 1 мМ СаС12 (В, 1) и 0,5 мМ ЭГТА (В, 2). А - окраска кумасси С-250; Б, В - авторадиограммы. Электрофорез проводили в 10%ПААГ.

к гомогенному состоянии (рис. 1), очищенный в 334 раза, с выходом 11% и удельной активностью 7,25 мкмоль фосфата/мин ■ мг. Использование представленного метода выделения позволило увеличить выход нативного, высокоочищенного фермента и значительно сократить время его выделения.

Недостаточность и противоречивость имеющихся в литературе сведений о физико-химических и кинетических свойствах фермента вызвало необходимость их дополнительного исследования. По нашим данным молекулярная масса ПКН,

определенная методом гель-

фильтрации, составила 600 кДа, радиус Стокса - 95,5 А. Фермент состоит из двух типов субъединиц - а и |3 с молекулярными массами 50 и 60 кДа, соответственно (рис. 1, А). Количественное соотношение а : р составило 3 1, по данным денситометрического сканирования. Полученные результаты указывают на то, что фермент представляет собой олигомер, состоящий из 9 а и 3 р- субъединиц. Крупный размер молекулы, наряду со сложностью структурной организации, по-видимому, и обуславливают значительную лабильность ПКП.

По кинетическим характеристикам, а именно по сродству ПКП к синапсину I (К„ = 0,4 мкМ), АТФ (Км =5 мкМ) и константе активации кальмодулином (К» = 100 нМ), выделенный нами фермент аналогичен описанной ранее, но недостаточно охарактеризованной ПКП ((Згеег^агс! Р. е1 а!., 1991).

Пути регуляции активности ПКН Исследование кальмодулинсвязывающих свойств ПКП.

Одним из путей регуляции активности ПКП является модулирующее действие комплекса Са2+-кальмодулин, осуществляемое при изменении уровня внутриклеточного Са2+. Поскольку степень активации фермента во многом определяется характером его взаимодействия с регуляторным белком, мы исследовали кальмодулинсвязывающие свойства фермента. Оказалось, что как а, так и (3 -субъединицы ПКП имеют свой кальмодулинсвязывающий участок и связывают кальмодулин Са2'-зависимым образом (рис. 1, Б, ] и 2), что указывает на сложный характер регуляции активности фермента. Известно, что кальмодулинзависимые ферменты помимо чувствительности к модулятору, характеризующимуся эволюционной консервативностью структуры, проявляют определенное сходство в регуляторных свойствах, таких как способность к активации в результате ограниченного протеолиза или изменение активности под действием жирных кислот и липидов. На основании этого мы предположили наличие консервативного элемента в кальмодулинсвязывающем центре ПКП и других кальмодулинзависимых ферментах. Для экспериментальной проверки нашей гипотезы были использованы моноклональные антитела клона Р5 (МА-К5) против кальмодулинсвязывающепо участка Са2+-АТФазы из эритроцитарных мембран.

Как видно из табл. 1, антитела МА-Б5 кросс-реактивны по отношению ко всем

Таблица 1. Радиоиммуноанализ взаимодействия различных белков с МА-Р5

Белки Радиоактивность,

ияи/мин-мг'Ш'

ПКП 139,7+0,03

Киназа фосфорилазы 166,4+0.04

Фосфодиэстераза сАМР 170,8+0,02

сАМР-зависимая протеинкиназа 30,0+0,09

пкс 32,0+0,12

Кальмодулин 24,5+0,03

Бычий сывороточный альбумин 25,8+0,07

исследуемым кальмодулинзависимым ферментам. Ферменты и белки не регулируемые кальмодулином, практически не взаимодействовали с антителами. Результаты радиоиммуноанализа были подтверждены с помощью иммуноблотгинга. Кроме способности к связыванию с ПКП, МА-К5 значительно снижают чувствительность ПКП к активирующему действию кальмодулина, не влияя при этом на базальную активность фермента (табл. 2). Добавление антител к препаратам киназы фосфорилазы и фосфодиэстеразы практически не влияло на степень их активации кальмодулином. Небольшое (до 30%) снижение активности ферментов наблюдалось лишь при относительно высоких концентрациях МА-Б5 (более 10"5 М) и, по-видимому, обусловлено неспецифическим действием антител.

Ингибирующее действие антител на активность ПКП свидетельствует о возможности локализации исследуемой антигенной детерминанты либо в кальмодулинсвязывающем центре фермента, либо на участке сопряжения активного и аллостерического центров. Согласно кривым активации фермента кальмодулином как в отсутствие, так и в присутствии различных концентраций МА-Р5, приведенным ка рис. 2, внесение антител в реакционную смесь приводит к увеличению эффективной

Таблица 2. Влияние МА-Р5 на активность кальмодулинзависимьгх ферментов

Фермент •• • • '• Активность, имп/мнн .....

■ баэальиая ";'. в присутствии СаМ :

■ - МА-Г5 ; • Ч>1Л-1'5 - .МЛ-К5 -; ■•+* МА-Г5 :

ПКП 2600 2750 48600* 3210*

Фосфодиэстераза сАМР 1800 1920 31810 27100

Киназа фосфорилазы 4850 5100 15330 12750

*р<0,05

ъ

Рис, 2. Зависимость скорости фосфорилирования С1 ПКП от концентрации кальмодулина (1) в присутствии 10"' М (2), 108 М (3), 10'7 М (4), 1(Г4 М МА-Б5. Приведены средние значения трех независимых экспериментов.

Рис. 3. Зависимость скорости фосфорилирования С1 ПКП от концентрации кальмодулина в присутствии 10 ' М (2), Ю"8 М (3), 10'7 М (4), 106 М МА-Р5. Данные представлены в координатах Лайнуивера-Бэрка.

Таблица 3. Влияние кальмодулина на связывание \1A-F5

Фермент •' ? Радиоактивность, нмп'мин-мг белка 103. Уменьшение связывании, %

^■г^ейи--; + СаМ

ПКП 235* 124* 47

Киназа фосфорилазы 166 164 -

Фосфодиэстераза сАМР 170 174 -

*р<0,05

константы активации ПКП кальмодулином и уменьшению максимальной скорости реакции. Кинетический анализ ингибирующего эффекта МА-И5 в координатах Лайнуивера-Бэрка указывает на смешанный тип ингибирования (рис. 3). Ухудшение сродства ПК11 к кальмодулину, по-видимому, связано с конкуренцией активатора и МА-Р5, что свидетельствует о локализации антигенного участка в кальмодулинсвязывакнцем центре молекулы ПКП. В пользу этого предположения свидетельствуют и результаты радиоиммунного анализа взаимодействия \1A-F5 с ПКП в присутствии активатора (табл. 3). При концентрации 10"4 М Са2+ и 10'8М кальмодулина происходит экранирование исследуемой антигенной детерминанты ПКИ комплексом Са2+/кальмодулин. В противоположность этому, характер связывания МА-Б5 с киназой фосфорилазы и фосфодиэстеразой сАМР не зависит от присутствия или отсутствия активатора.

Полученные результаты указывают на то, что исследованные кальмодулинзависимые ферменты содержат в своей структуре сходные по антигенным свойствам участки. В молекуле ПКП обнаруженная детерминанта расположена в центре связывания кальмодулина, чем объясняется ингибиторный эффект МА-Р5. Киназа фосфорилазы и фосфодиэстераза сАМР, обладая способностью к взаимодействию с антителами, оказались практически нечувствительными к действию МА-Р5, что указывает на существенное отличие механизмов регуляции активности этих ферментов, по-видимому, связанное с различным строением кальмодулинсвязываюгцих центров.

Роль автофосфорилирования в регуляции активности ПКП

Исследование возможности регуляции активности ПКП в результате автофосфорилирования продемонстрировало способность ПКП к автофосфорилировангао, причем как а-, так и (3-субъединицы фермента подвергаются Са2+/кальмодулинзависимому фосфорилированию (рис. 1, В, 1 и 2). Результатом автофосфорилирования фермента является шестикратное увеличение активности, не регулируемой комплексом Са2+/калъмодулин, двукратное уменьшение способности к связыванию кальмодулина и, как следствие, более чем двукратное снижение уровня Са2+/кальмодулинзависимого фосфорилирования С1. Таким образом, автофосфорилирование ПКП может являться механизмом сохранения высокого уровня активности ПКП после отмены стимулирующего сигнала Са2+, Повышенный, независимый от Са + уровень активности фермента, по-видимому, поддерживается до момента увеличения активности клеточных фосфатаз, возвращающих фермент к

первоначальному состоянию. Вероятно, что процессы автофосфорилирования -дефосфорилирования являются механизмами регуляции активности ПКП in vivo.

Регуляция активности ПКП жирными кислотами и фосфолипидами

Действие ряда биологически активных соединений на клеточном уровне реализуется через усиление метаболизма мембранных фосфолипидов, что приводит к кратковременному повышению внутриклеточной концентрации диацилглицеридов и жирных кислот, участвующих в регуляции активности ряда ферментов, включая и кальмодулинзависимые. В этой связи представляло интерес исследование возможностей регуляторного действия фосфолипидов и жирных кислот в отношении ПКП. Как видно из табл. 4, жирные кислоты и фосфолипиды оказывают практически

Таблица 4. Влияние жирных кислот и фосфолипидов на базальную активность ПК11

Ингибитор % от банальной активное™ ПКИ

- ; : -С.." ■ + Са" ......

Стеариновая кислота 50,2 47,5

Олеиновая кислота 60,8 59,8

Линоленовая кислота 80,1 70,9

Фосфатидилсерин 40,3 38,2

Фосфатидилинозит 48,5 45,5

0,5

независимое от Са + ингибирующее действие на активность ПКП, причем наибольший ингибирующий эффект вызывают фосфатидилсерин, фосфатидилинозит и стеариновая кислота. Нами также было исследовано влияние жирных кислот и

фосфолипидов на активацию ПКП кальмодулином. Для выяснения механизма ингибирования была изучена кинетика активации ПКП кальмодулином в присутствии различных концентраций стеариновой кислоты (рис. 4). При увеличении концентрации стеариновой кислоты от 10"5 до 10"4 М наблюдалось двукратное уменьшение максимальной скорости реакции и незначительное уменьшение сродства фермента к активатору. Аналогичные результаты были получены при исследовании ингибирующего действия

фосфатидилсерина. По-видимому, молекулы липидов, связываясь с

10 20 30 40 [кальмодулян] мкМ

Рис.

4. Зависимость фосфорилирования CI концентрации калъмодулина

IГ1-5 *

скорости ПКП от (1) в

присутствии 10Г4 М(2), 1(Г М (3), 10л М (4) стеариновой кислоты. Данные

представлены в координатах Лайнуивера-Бэрка.

гидрофобным участком молекулы ПКП, комплементарным _ кальмодулину, препятствуют образованию активного комплекса Са2+-кальмодулин-фермент и блокируют кальциевую регуляцию фермента.

Полученные результаты подтверждают возможность существования пути регуляции активности кальмодулинзависимых ферментов, альтернативного тому, который основан на активирующем действии жирных кислот и фосфолипидов, описанному ранее (Тапака Т. & а1., 1980). Наряду с литературными данными о регуляторной роли диацилглицеридов и жирных кислот в отношении аденилатциклазы стриатума (Северин С.Е. и др., 1983), Са2'- АТФазы ОГщзН V, ег а!., 1981), фосфодюстеразы цАМФ и киназы легких цепей миозина (Тапака Т. а а1, 1980), полученные нами результаты позволяют предположить, что система метаболизма фосфолипидов может взаимодействовать с системами Саг+ и цАМФ посредством изменения активности ключевых ферментов этих систем.

Роль ПКН в эюииатической регуляции клеточной активности

На первом этапе исследования роли ПКП в физиологических процессах, протекающих в клетке и возможностей их направленного изменения, мы изучили субстратную специфичность фермента. ПКП проявляла широкую субстратную специфичность, причем лучшим субстратом оказался С1 (Км = 0,4 мкМ). Ряд субстратов ПКП выглядит следующим образом: С1 (100%), ГАФД (25%), тубулин (25%), легкие цепи миозина (20%), гистон НЗ (18%), фосвитин (10%). Скорости фосфоршшрования фосфорилазы В, фибриногена и гисгона Ш были значительно ниже. Широкая субстратная специфичность фермента может отражать его важную роль в регуляции целого ряда внутриклеточных физиологических процессов.

Выделение и изучение некоторых физико-химических свойств С1

В связи с недостаточностью имеющихся в литературе сведений о свойствах и функциях основного физиологического субстрата ПКП - С1, мы предложили модифицированный метод выделения белка и изучили некоторые его свойства. В качестве источника С1 нами впервые был использован головной мозг человека. При выделении белка согласно предложенной нами схеме была последовательно использована кислотная экстракция белка из нейрональных мембран, а также адсорбционная, катионообменная и высокоэффективная жидкостная хроматография (носители: оксиапатит, СМ-52 и ТЭК й-2000 соответственно). После

заключительной стадии очистки, бьи получен С1 в состоянии, близком к гомогенному по данным ДСН-электрофореза (рис. 5, 5). Использование предложенной нами модифицированной методики позволило значительно сократить время выделения и увеличить выход С1 (до 6 мг из 70 г мозга). Исследование свойств белка показало, что по данным ДСН - электрофореза С1 состоит из двух полипептидов - синапсина 1а и 16 - с молекулярными массами 80 и 77 кДа, соответственно (рис. 5, 5), а соотношение полипептидов составляет 1:2. Молекулярная масса С1 по данным гель-фильтрации

1 2 3 4 5

Рис. 5. Электрофорез препаратов СХ на различных стадиях очистки. 1 - экстракт (рН 3,0), 2 - супернатант (рН 6,0), 3 -элюат с оксиапатита, 4 - элюат с СМ-52, 5 - элюат с Т8К-0-2000 SW. Электрофорез проводили в 12% ПААГ.

составляет 75 кДа, а радиус Стокса - 40 А. Значения молекулярной массы, полученные с помощью электрофореза и гель-фильтрации, практически совпадают, что свидетельствует о существовании С1 в виде смеси синапсина 1а и 16, а не в виде комплекса этих полипептидов. Изучение стехиометрии

фосфорилирования С1 ПКП и каталитической субъединицей сАМР-зависимой протеинкиназы (ПКА) показало, что они включают в 1 моль С1 2 моля 32Р1 и 1 моль 32Р1, соответственно.

пируваткиназы (Soderling T.R. et гликолитический фермент ГАФД

97

Фосфорилирование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) ПКП

Одной из ключевых функций ПКП является регуляция метаболизма углеводов посредством модуляции активности гликогенсинтетазы (Payne М.Е. et al., 1980) и

al., 1986). Нами впервые показано, что также является субстратом ПКП. Из исследованных протеинкиназ - сАМР-зависимой, киназы фосфорилазы, казеинкиназы I и П, ПКС - только казеинкиназа I и ПКС фосфорилируют ГАФД, причем оба фермента включают ОД М фосфата в моль тетрамера дегидрогеназы. Существенно более значительное включение фосфата наблюдается под действием ПКП - до 1 моль фосфата на моль тетрамера дегидрогеназы с молекулярной массой 144 кДа. Как видно из рис. б, ПКП включает 32Pi в субъединицы ГАФД (полипептиды с молекулярной массой 36 кДа). Препарат ГАФД не содержал примесей кальмодулинзависимых протеинкиназ, поскольку в отсутствие ПКП фосфорилирования не

68

43

31

Рис. 6. Авторадиограмма

фосфорилирования ГАФД ПКП в присутствии Са2+ (1), CaJt и кальмодулина (2), ЭГТА (3), в отсутствии ПКП в присутствии Са2* и кальмодулина (4), в присутствии ЭГТА (5).

наблюдалось (рис. 6, 4). Не было также фосфорипирования ГАФД при инкубации с ПКП в присутствии ЭГТА (рис. 6, 3). При инкубации ГАФД с ПКП в присутствии Саг+ наблюдалось включение 32P¡ в субъединицы фермента (рис. 6, 1), которое пятикратно стимулировалось

добавлением кальмодулина (рис. 6, 2). При исследовании зависимости скорости фосфорипирования от концентрации ГАФД обнаружено, что кальмодулин не влияет на Км (1 мкМ), но увеличивает скорость реакции (рис. 7). Приведенные данные

свидетельствуют о двух путях

фосфорилирования ГАФД ПКП - медленном, осуществляемом в присутствии Caí+, и быстром, осуществляемом в присутствии комплекса Са2+/кальмодулин. Особый интерес представляло изучение влияния фосфорилирования на активность ГАФД. Для получения фосфоформы ГАФД фермент инкубировали с ПКП, Са2+, кальмодулином и АТФ. В качестве контрольного эксперимента проводили инкубацию в тех же условиях, но без АТФ. Оказалось, что активность фосфоформы ГАФД (48 ед/мг белка) примерно в два раза превышала активность дефосфоформы (23 ед/мг белка). Вероятно, что модификация молекулы ГАФД путем фосфорилирования ПКП может регулировать активность фермента in vivo, а также влиять на характер взаимодействия фермента с различными клеточными белками. На основе вышеизложенных фактов можно предположить, что процессы кальмодулинзависимого фосфорилирования и дефосфорилирования за счет активации белковых фосфатаз могут участвовать в регуляции гликолиза.

Связывание CI с тубулином и кальмодулином.

Несмотря на имеющиеся в литературе данные о взаимодействии синаптических везикул с цитоскелетом, полученные с помощью электронной микроскопий (Bird М.М. et al, 1976), механизм этого взаимодействия до настоящего времени остается неясным. В связи с этим мы исследовали возможность связывания тубулина с CI и влияние фосфорилирования последнего на этот процесс. На рис. 8 (4) представлена авторадиограмма связывания CI с ]2'1 - меченым тубулином. Процесс связывания характеризуется константой диссоциации 4х10"7 М (рис. 9) и не снимается 0,02%-ным твином 20 или 1 М хлоридом натрия, что может свидетельствовать о специфичности связывания белков. Для изучения влияния фосфорилирования CI на его связывание с тубулином белок фосфорилировали по различным сайтам, используя ПКП и ПКА. При этом были получены различные фосфоформы CI. Как видно

[ГАФД]"', мк.М '

Рис. 7. Зависимость скорости фосфорилирования ГАФД ПК11 от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Бэрка. Фосфорилированяе ГАФД проводили в присутствии кальмодулина (1) и без него (2).

0,3

0,2-

0,1-

0,0-1

0,4 0,8 1,2

Связанный тубулви, моль / моль ошапснна I

Рис. 9. Связывание ,251-меченого тубулина с С1 (координаты Скэтчарда). Для связывания использовали С1 (7,5 мкг/мл) и различные концентрации тубулина (1-20 мкг/мл).

из табл. 5, связывание тубулина с фосфоформами С1 характеризуется значительно более высокими значениями Кл чем связывание с дефосфоформой. Полученные данные подтверждают, что через С1, ассоциированный с

цитоплазматической поверхностью синаптических везикул, может осуществляться связывание везикул с цитоскелетом. Можно предположить, что регуляция связывания везикул с цитоскелетом осуществляется посредством фосфорилирования С1ПКП и ПКА. Использование кальмодулин-сефарозы для очистки С1 (ОкаЬе Т. е1 а1., 1987) позволило предположить наличие кальмодулинсвязывающего центра в молекуле белка. Как видно из рис. 8 (.2), С1 связывает 1251-меченый кальмодулин в присутствии Са2+, причем это взаимодействие не снимается 0,02%-ным Твином 20 или 1 М хлоридом натрия. В присутствии ЭГТА связывания не наблюдается (рис. 8, 3). Процесс связывания С1 с кальмодулином характеризуется константой диссоциации 1,7x1с)"6 М.

Таблица 5. Связывание тубулина с дефосфо- и фосфоформами С1

1-2 3 4 5

Рис. 8. Связывание С1 с различными белками. После электрофореза С1 был элекгрофоретически перенесен на нитроцеллюлозную мембрану, которая инкубировалась в буферном растворе с последующим окрашиванием белка без добавок (1), в присутствии 1И1-меченого калыиодулина и 1 мМ СаСЬ (2), 1251-меченого кальмодулина и 0,5 мМ ЭГТА (3), 1251-меченого тубулина (4), МА-Р5 (5). I - окрашивание амидо-черным; 2, 3, 4 -авторадиограммы; 5 - окрашивание диаминобензидином.

: ФормыС1 ■ •' ".'••'• :. Константа диссоциации, мк.М

Дефосфоформа Фосфоформа (сайт 1) Фосфоформа (сайты 2,3) Фосфоформа (сайты 1,2,3) 0,4+0,023 1,2+0,011 2,4+0,031 2,9+0,029

Нами было показано, что кальмодулинсвязывающие центры Са2+-АТФазы и ПКП

иммунологически подобны. Представляло интерес вьиснить, присутствует ли аналогичный участок в молекуле С1. С помощью МА-Р5 было подтверждено, что С1 содержит в своей структуре подобный кальмодулинсвязывающий участок (рис. 8, 5). Физиологическое значение связывания С1 с кальмодулином может залючаться в регуляции его фосфорилирования кнназами, отличными от ПКП.

Фосфорнлирование С1 протеинкиназой С (ШСС)

С помощью авторадиографии нами было показано, что оба полипептида С1 фосфорилируются ПКС только в присутствии Са2+ и фосфатидилсерина (рис. 10, 2). В отсутствие любого из активаторов фосфорилирования не наблюдалось (рис. 10, 3 и 4). При изучении кинетики данного процесса нами было установлено, что Кт по отношению к С1 составляет 0,25 мкМ. Близкие значения Кт описаны для С1 в случае его фосфорилирования Са2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназой I и ПКА (<3тее^аг<1 Р. & а1., 1987). С помощью исчерпывающего протеолиза С1 коллагеназой и авторадиографии нами обнаружено, что сайт фосфорилирования С1 ПКС расположен в чувствительном к коллагеназе домене молекулы белка (рис. 11, 3). Аналогичные результаты получены для ПКП (рис. 11, 4). В случае фосфорилирования ПКА 32Р-меченый фосфат включался в полипептид, устойчивый к действию коллагеназы (рис. 11, 5). Изучение стехиометрии фосфорилирования показало, что в молекуле С1 присутствуют 2 сайта фосфорилирования ПКП и по одному сайту - ПКС и ПКА

Иигибировакие фосфорилирования С1 ПКС кальмодулином

Поскольку активаторы ПКС - фосфолипиды и жирные кислоты - способны ингибировать Са2+/кальмодулин-зависимую активность ПКП при фосфорилирования

кДа-

кДа

94

68

68

45

45

Ч

• 25

12 3 4

25

1 2 3 4 5

Рис. 10, Электрофореграмма С1 (1); авторадиограмма фосфорилирования С1 ПКС в присутствии Са2+ и ФС (2), в присутствии Са2+ и отсутствие ФС (3), в присутствии ФС и отсутствие Са2+ (4).

Рис. 11. Электрофореграмма С1 (I), С1 после протеолиза коллагеназой (2); авторадиограмма фосфорилирования С1 ПКС (3), ПКП (4), ПКА (5).

1

2

3

4

С1, представляло интерес исследовать действие кальмодулина - активатора ПК11 - на процесс фосфорилирования синапсина ПКС. На рис. 12 представлена зависимость скорости фосфорилирования С1 ПКС от концентрации С1 в присутствии

различных

концентраций

Рис. 12. Зависимость скорости фосфорилирования С1 ПКС от концентрации субстрата в отсутствие кальмодулина (1), в присутствии 0,1 мкМ (2), 1 мкМ (3) и 10 мкМ (4) кальмодулина.

-4

-2 0 2 4

1/[ганаисив I], мкМ '

кальмодулина. При практически неизменной максимальной скорости реакции фосфорилирования величина Кт по отношению к синапсину возрастает в 3-4 раза. Подобный тип ингибирования может объясняться как взаимодействием кальмодулина с С1, так и его влиянием на фермент.

Проведенное исследование свидетельствует о сложной структурно - функциональной организации системы ПЕСП и С! Очевидно, что исследуемые белки являются ключевыми единицами регуляторных цепей, опосредующих действие вторичных мессенджеров на целый комплекс важнейших физиологических функций клетки. Поскольку функциональная связь между всеми известными вторичными мессенджерами очень тесна, на их уровне, или уровне системы ПКП - С1, добиться высокой степени избирательности прохождения регуляторного сигнала в клетке представляется затруднительным.

Исходя из полученных нами и литературных данных (Огее^агс! Р. & а1., 1986) мы сформулировали гипотезу о ключевой роли фосфорилирования С1 различными протеинкиназами в регуляции нейросекреции, на основании которой предлагаем гипотетический механизм процесса нейросекреции, наглядно иллюстрирующий невозможность или чрезвычайную сложность направленного контроля за избирательностью прохождения регуляторного сигнала на стадии химической модификации субстрата активированными ферментными системами (рис. 13). Сигналом к запуску механизма нейросекреции служит деполяризация мембраны аксона и кратковременное повышение внутриклеточного уровня Са2+ в нервном окончании. Са2+ может активировать как ПКС, так и ПКП (после связывания с кальмодулином). Активированные протеинкяназы фосфорилируют С1 по соответствующим сайтам. При этом системы данных ферментов взаимодействуют посредством сложных взаиморегулирующих процессов. Кроме того, активность каждого из ферментов может модулироваться Са2+-зависимым автофосфорилированием. В результате фосфорилирования элонгированного домена С1 ПКП и/или ПКС происходит диссоциация синалтических везикул от элементов цитоскелета и транслокация к специфическим участкам пресинаптической мембраны,

IV. Диссошыщш

У.ДвффЯии

о о [Эьюииго?

Постсииаптическая - мембрана

¡УЦ.Рздвитие иостсинм^

Рис. 13. Гипотетическая модель регуляции нейросекреции посредством фосфорилирования синапсина I (С1) (Р - сайты фосфорилирования глобулярного (А) и элонгировакного (Б) доменов С1, МТ - микротрубочки, МФ - микрофиламенты, НФ - нейрофиламенты).

где в результате экзоцитоза происходит освобождение нейротрансмитгеров. Для полного освобождения С1 от цитоскелега и рециклирования в везикулы необходимо также участие ПКА, фосфорилирующей С1 по сайту, расположенному в глобулярном домене. По-видимому, согласованное фосфорилирование - дефосфорилирование С1 и специфических белков цитоскелега обеспечивает тонкую регуляцию процессов транслокации везикул и нейросекреции. Как видно из рис. 13, возможность избирательной регуляции прохождения внешнего стимулирующего сигнала в рассматриваемом случае представляется проблематичной, поскольку в процессе регуляции участвуют как минимум три протеинкиназы, характеризующиеся определенной системой регуляции собственной активности и оказывающие сложные взаиморегулирующие действия на этот процесс. Несмотря на это, разъяснение механизма нейросекреции представляет не только теоретический, но и практический интерес, поскольку расширяет представления о механизме действия лекарственных средств, мишенью которых являются процессы синаптической передачи импульсов, и позволяет наметить пути более осмысленного воздействия на процессы регуляции клеточной активности.

Таким образом, для избирательного воздействия на клеточные физиологические процессы необходим принципиально иной, строго направленный механизм проведения регуляторного сигнала или доставки биологически активного вещества внутрь клетки. В качестве такого механизма может быть использован рецепторопосредованный эндоцитоз, принцип которого послужил основой при создании и биологических испытаниях противоопухолевых препаратов направленного действия.

Создание химиотерапевтических противоопухолевых систем направленного действия с использованием белковых векторов.

Задачей данного этапа исследований являлось определение возможностей реализации подхода, рассматривающего рецепторопосредованный эндоцитоз в качестве универсального механизма, позволяющего доставлять в клетку-мишень различные эффекторы с помощью физиологических лигандов и, таким образом, оказывать целенаправленное влияние на внутриклеточные процессы. Для практического выполнения поставленной задачи в качестве модели нами были использованы опухолевые клетки человека и химиопрепараты, широко исследуемые и применяемые в области практической онкологии. В качестве физиологических лигандов мы использовали белки разных классов - ЭФР и АФП, наиболее полно отвечающие критериям, предъявляемым к векторным молекулам (стабильность, доступность, высокий уровень рецепторов на клетках-мишенях и др.). Выбор области исследования продиктован большим практическим значением химиотерапии злокачественных новообразований и повышения ее эффективности в медицине.

Получение систем направленного действия (СНД) на основе ЭФР (СНДэфр) и АФП (СНДафп) и химиотсрапевтических противоопухолевых препаратов (ХП).

СНДэфр и -афп, включающие ФЦ(А1), ФЦ(Со) и ВК, получали методом прямого синтеза без использования спейсеров, а СНДэфр и -афп, включающие хлорины (ХЛ рб и ХЛ ее), ДР, КМ и ВБ - при помощи бифункционального реагента 1-этил-З-(Здиметиламинопропил)-карбодиимида (ЭДК). СНДэфрфр, включающую ДР, синтезировали с использованием глутарового альдегида в качестве кросс-линкера. Очистку препаратов проводили с помощью гель-фильтрации и ОФ ВЭЖХ на колонках с сефадексом 0-25 и рВопйорак Си, соответственно. Концентрацию .ХП в составе СНД определяли спектрофотометрически при Х=ббЗ нм для ХЛ рс, Я=690 нм для ХЛ еб, ФЦ(А1), ФЦ(Со) и Х=450 нм для ДР и КМ. Мольные соотношения векторный белок:ХП в СНДэфр и -афп составляли 1:1 и 1:4, соответственно; в случае СНДэфр (ХЛ рб) и (ХЛ е«) - 1:2; СНДэфрфр (ДР) - 1:1. Относительно высокое содержание ХП в СНДафп обусловлено более значительной молекулярной массой белка (-70 кДа) по сравнению с ЭФР (6,045 кДа). Увеличение содержания ХП в СНДэфр может привести к снижению сродства векторной молекулы к рецептору и сказаться на эффективности внутриклеточной интернализации СНД.

Цитотоксическая активность противоопухолевых СНДэфр и СНДафп-Для оценки цитотоксической активности (ЦГА) СНДэфр в качестве модели использовали опухолевые клетки человека линии МСР-7м, несущие на поверхности рецепторы ЭФР. Сравнительное исследование ЦГА СНДафп и свободных ХП, входящих в их состав, проводили на опухолевых клетках человека линии ООБ, обладающих способностью к эффективному связыванию и внутриклеточному

Табл. 6. Цитотоксическая активность свободных и входящих в состав СНДэфр химиотерапевтических препаратов в отношении опухолевых клеток карциномы молочной железы человека линии МСР-7"1 (приведены средние значения 1Си по трем экспериментам)

Препарат 1С.Ч] свободного ' 1С59СНД,мкМ , ПСД*

препарата, мкМ

Фталоцианины

ФЦ(А1) 2,5 0,91 2,8

ФЦ(Со) 2,8 0,18 15,6

Хлорины

ХЛр6 3,0 0,60 5,0

ХЛ е6 1,6 1,52 1,1

Антвациклины

ДР 0Д8 0,045 4,0

КМ 0,03 0,007 4,3

Алкалоиды

ВБ 0,0071 0,0017 4,2

ВК 0,0084 0,002 4,2

♦Показатель соотношения доз (ПСД) представляет собой отношение значений 1Сз> свободных и входящих в состав СНД химиопрепаратов.

накоплению АФП (Белоусова Ю.В., 1997). Результаты исследования ЦТА СНД н свободных ХП приведены в табл. 6 и 7.

Сравнительное исследование ЦТА свободных и входящих в состав СНД фталоцианинов и хлоринов.

Механизм активации ФЦ, используемых для фотодинамической (ФЦ(А1)) и каталитической, или темновой (ФЦ(Со)) терапии может быть различным. Для активации ФЦ(А1), также как и ХП, клетки облучали светом соответствующей длины волны (Van Hillegersberg R. et al., 1994). ФД(Со) активировали добавлением в клеточную среду аскорбиновой кислоты (Novodaiova G.N. et al., 1996). Сравнительное изучение ЦТА свободных и входящих в состав СНД ФЦ показало, что ЦТА СНД, включающих как ФЦ(А1), так и ФЦ(Со) заметно превышала активность свободных ФЦ причем наибольшую ЦТА проявляй СЩЦфп, включающая ФЦ(Со). При включении в состав как СНДэфр, так и СНДдфп, ХЛ практически не терял первоначальной ЦТА, а активность XJ1 рв значительно возрастала. Представленные данные наглядно иллюстрируют преимущество векторной доставки ФЦ и XJ1 в опухолевые клетки, позволяющей увеличить цитотоксичность препаратов.

ЦТА свободных и входящих в состав СНД антрациклиновых антибиотиков.

Как видно из табл. б и 7, за исключением СНДм>п, включающей КМ, ЦТА антрациклиновых антибиотиков может бьгть существенно увеличена за счет их векторной доставки в опухолевые клетки. Наибольшую ЦТА проявляли антрациклиновые антибиотики, входящие в состав СНДэфр.

Табл. 7. Цитотоксическая активность свободных и входящих в состав СНДафп химиотерапевтических препаратов в отношении клеток Т-клеточной лямфомы человека линии (^Ов (приведены средние значения ГСго по трем экспериментам)

Препарат 1Сч> свободного препарата, мкМ ICS»CIW, MI«M ПСД*

Фталоцианины ФЦ(А1) ФЦ(Со) 1,50 12,2 0,3 2,4 5.0 5.1

Хлорины ХЛр« ХЛ е0 0,55 0,12 0,12 0,19 4,6 0,63

Антпациклины др км 0,68 1,25 0,29 0,96 2,3 1,3

Алкалоиды ВБ 0,022 0,0025 8,8

♦Показатель соотношения доз (ПСД) представляет собой отношение значений ГС;» свободных и входящих в состав СНД химиопрепаратоа.

ЦТА свободных и входящих в состав СНД растительных алкалоидов.

ЦГА СНД , включающих ВБ и ВК, превышала активность свободных алкалоидов в отношении клеток исследуемых линий как минимум в 4 раза (табл. б, 7). Наибольшей эффективностью циготоксического действия отличалась СНДдфп, включающая ВБ, ЦТА которой превышала активность свободного ВБ более чем в 8 раз. Как видно из табл. 8, использование АФП в качестве вектора позволяет увеличить ЦТА всех исследуемых препаратов (за исключением ХЛ еб) при наиболее значительном ОУ ЦТА ДР и ВБ, входящих в состав СНД. В случае СНДэфр также возможно значительное увеличение ЦТА практически всех исследуемых препаратов, причем эффективность действия СНД варьирует в зависимости от индивидуальной чувствительности опухолевых клеток к действию цитотоксических агентов (табл. 8). При применении СНДэфр и СЩЦфц, включающих ХЛ се, а также СНДдфц, включающей КМ, увеличения ЦТА химиопрепаратов не наблюдалось, однако, даже в таких ситуациях при использовании in vivo, можно ожидать достижения более высокой терапевтической эффективности СНД по сравнению со свободными веществами, благодаря снижению их токсичности и избирательному транспорту в опухоли.

Представленные результаты исследования векторных возможностей ЭФР и АФП наглядно демонстрируют, что оба белка могут быть успешно использованы в СНД для рецепторопосредованного транспорта в опухолевые клетки различных химиопрепаратов. При применении СНД ЦТА препаратов, поступающих в клетки в процессе рецепторопосредованного эндоцитоза, в большинстве случаев, значительно превышает активность свободных химиопрепаратов, попадающих в клетку в

Табл. 8. Относительное увеличение ЦТА химиотерапевтических препаратов при их векторном транспорте в опухолевые клетки человека

Препарат ОУЩА\(%)

СНД,до> C1UW

Фталоцианипы ФЦ(А1) ФЦ(Со) 63,6 93,6 80,0 80,3

Хлорины ХЛр* ХЛе« 80,0 5,0 78,2

Антрациклины ДР КМ 75,0 76,7 57,4 23,2

Алкалоиды ВБ ВК 76.1 76.2 88,6

*ОУ ЦГА - отношение разности значений 1С5» свободного и входящего в состав СНД химиопрепарата к значению 1С50 свободного химиопрепарата, выраженное в процентах.

результате диффузии (табл. 8). В зависимости от механизма действия препарата, адресно доставляемого в клетку с помощью векторов, могут быть целенаправленно вызваны эффекты, модулирующие клеточную активность. Таким образом, подход к химиотерапии, предусматривающий использование рецепторопосредованного эндоцитоза для транспорта в клетку-мишень СНД, включающих физиологический лиганд и химиопрепарат, представляется чрезвычайно перспективным.

Сравнительное исследование ЦТА, динамики накопления п внутриклеточного распределения свободных и входящих в состав СНДэфр антрациклиновых антибиотиков

ЦТА свободных и входящих в состав СНДэфр антрациклинов.

Для сравнительного исследования ЦТА накопления и внутриклеточной компартментализации свободных и химически связанных с векторным белком антрациклинов мы провели испытание ЦТА СНДэфр, включающих ДР и КМ и свободных антибиотиков в отношении чувствительных и резистентных

(МСР-7Л1№) к действию антрациклинов опухолевых клеток. ЦТА СНДэфр, включающих ДР и КМ, превышала активность свободных антибиотиков в отношении клеток МСР-7т примерно в 4 раза (рис. 14, 15), и в 2 раза в отношении МСР-7ААЕ (рис. 16,17). При этом цитотоксичность антибиотиков в составе СНДэфр в отношении клеток МСР-7Л' была примерно в 2 раза выше, чем в отношении МСР-7Л<№ В связи с тем, что уровень ЦТА исследуемых СНД, также как и свободных химиопрепаратов во многом определяется скоростью и характером поступления препаратов в клетку (пассивная диффузия и рецептор-опосредованный эндоцитоз), их компартментализацией, а также эффективностью действия механизмов клеточной резистентности, мы провели исследование закономерностей поступления, накопления

1ДР1, аМ

Рис. 14. Цитотоксическая активность свободного и входящего в состав СНДэот1 ДР в отношении клеток карциномы молочной железы человека линии МСР-7т.

¡км], нМ

Рис. 15. Цитотоксическая активность свободного и входящего в состав СНДэфг КМ в отношении клеток карциномы молочной железы человека линии МСР-7Ч<.

Рис. 16. Цитотоксическая активность свободного и входящего в состав СНДэфр ДР в отношении клеток карциномы молочной железы человека линии МСР-

уЛ<!гЛ

[КМ], мкМ

Рис. 17. Цитотоксическая активность свободного и входящего в состав СНДэфр КМ в отношении клеток карциномы молочной железы человека линии \1CF-

и внутриклеточного распределения химиопрепаратов на примере антрациклиновых антибиотиков. Перенос ДР и КМ в составе СНД и в свободном виде в клетки контролировали, используя флуоресцентные свойства этих антибиотиков (7. возбуждения = 473 нм, X эмиссии = 556 нм). Следует отметить, что интеркаляция ДР (КМ) в ДНК приводит к тушению их собственной флуоресценции. Клетки инкубировали с СНДэфр или свободными ДР и КМ 2 ч в питательной среде, затем собирали центрифугированием, измеряли флуоресценцию супернатанта, быстро промывали ФСБ с 0,1% БСА, суспендировали в растворе ФСБ и измеряли флуоресценцию суспензии клеток, соответствующую количеству ДР (КМ) в цитоплазме и на мембранах клеток. Затем клетки лизировали, добавляя к суспензии 10% раствор ДСН до его конечной концентрации 0,2%, инкубировали 2 мин при 37 С и измеряли флуоресценцию лизатов, отражающую общее содержание антибиотика в клетках. Количество антрациклина, интерхалировавшего в ДНК, в ядрах клеток определяли по разности флуоресценции препаратов в присутствии ДСН и без него. Количество распавшегося ДР (КМ) определяли по разности значений флуоресценции препарата в лизатах в начале инкубации и после ее завершения.

Накопление свободных и входящих в состав СНДэфр антрациклинов в чувствительных и резистентных опухолевых клетках

Данные по накоплению свободных и входящих в состав СНДэфр антрациклинов в чувствительных и резистентных клетках приведены в табл. 9,10. Как видно из табл. 9, уровень накопления ДР как клетками МС?-7т, так и МСР-7А|№ при его поступлении в составе СНДэфр заметно превышает уровень накопления свободного ДР. При этом уровень накопления ДР в клетках МСБ-7т и МСК-7алк при инкубации с СНДэфр существенно не различался (табл. 9). Очевидно, что при рецептор-опосредованном

Таблица 9. Содержание ДР в клетках и среде инкубации по отношению к его исходному количеству в среде через 2 ч инкубации клеток МС¥-7т и МСР-7А|1гК со свободным н входящим в состав СЩЗэ«Р ДР

Клеточная: 'культура - , Препарат "V Содержание ДР,%

(Слетки - Среда Распад

МСР-?™ да сщыид?) 29,7 40,1 60,1 52,4 10,2 7,5

МСР-7А<"* ДР СНДэфр (ДР) 15,2 36,6 68,5 55,3 16,3 8,1

зндоцитозе комплекса ЭФР-ДР эффективность действия механизма, определяющего резистентность клеток к ДР, заметно снижена. Содержание свободного ДР в клетках МСБ-7т оказалось в 1,95 раза выше, чем в МСР-7А1г11. Низкое содержание ДР в резистентных клетках может быть обусловлено внутриклеточной деградацией антибиотика, а также механизмом, обеспечивающим его выведение из клетки (Сергеева Н.С. и др., 1996).

Представленные данные свидетельствуют о том, что рецепторопосредованный эндоцитоз, заложенный в основу СНД в качестве механизма транспорта, является более действенным средством доставки ДР в клетки МСР-7, чем диффузия свободного ДР через клеточную мембрану по градиенту концентрации. Высокий уровень накопления химиопрепарата резистентными клетками, обусловленный действием СНД, может служить объяснением заметного снижения клеточной резистентности.

Исследование накопления КМ в клетках показало, что наибольшее количество антибиотика регистрировалось в клетках МСГ-?1"' при их инкубации со свободным КМ, тогда как в клетках МСР-7А|1гК его уровень был заметно ниже (табл. 10). Уровни накопления КМ, связанного в СНД с ЭФР, в клетках МСБ-7Ш и МСР-7Л|!г1!, так же, как и в случае ДР, характеризовались близкими значениями.

Известно, что в антрациклины в клетке подвергаются деградации с образованием нефлуоресцирующих продуктов (ТпПол ТА., 1991). Как видно из табл. 9, 10, уровень деградации антрациклинов, доставляемых ЭФР в клетки МСР-7^'' и МСР-7А4К, был более чем в 2 раза ниже (в случае СНДэфр (ДР) в клетках МСР-7ТО в 1,4 раза) уровней деградации свободных ДР и КМ.

Таблица 10. Содержание КМ в клетках и среде инкубации по отношению к его исходному количеству в среде через 2 ч инкубации клеток МСР-7ТО и МС¥-1МтЯ со свободным и входящим в состав СНДзфр КМ

Клеточная ; Препарат ...... Содержание КМ. %

культура . Клетки Среда Распад

МСР-7™ КМ СНДэфр (КМ) 45.2 35.75 40.8 57.75 14 6.5

мср_7Л<1г1! км СНДэфр (КМ) 36.75 34.2 45.75 58.3 17.5 7.5

Уровни накопления свободного КМ как в клетках МСБ-7да, так и МСР-7Л1М-превышали уровни ДР в 1,5 и 2,4 раза, соответственно. Уровни накопления антибиотиков, поступивших в клетки исследуемых линий в составе СНДэфр, характеризовались близкими значениями (табл. 9, 10). По-видимому, уровень накопления антрациклинов, доставляемых в клетки ЭФР, определяется количеством рецепторов ЭФР на поверхности клеток, аффинностью лиганда к рецептору и, в конечном итоге, эффективностью рецепторопосредованного эндоцитоза. Природа антрациклинов и действие механизмов клеточной резистентности в данном случае имеют меньшее значение.

Накопление свободных и входящих в состав СНДэфр антрациклинов в ядрах чувствительных и резистентных опухолевых клеток.

Результаты исследования динамики и уровня накопления свободных и входящих в состав СНДэфр антрациклинов в ядрах клеток приведены на рис. 18, 19 и в табл. 11. Как видно из табл. 11, с наибольшими скоростями происходило полумаксимальное накопление свободных ДР и КМ, причем скорость накопления антибиотиков в ядрах клеток МСЕ-7ТО была выше, чем в МСР-7А<№ КМ и ДР, входящие в состав СНДэфр, также накапливались в ядрах клеток МСР-7№ с более высокой скоростью, чем в МСР-уааж скорости накопления свободного и входящего в состав СНДэфр КМ были выше, чем в случае препаратов ДР, что, по-видимому, обусловлено более высокой полярностью молекулы КМ (Skovsgaard Т. ег а1., 1982). Различия в скоростях накопления свободных и входящих в состав СНДэфр антрациклинов определяются как природой антибиотиков и путем их транслокации в клетку, так и особенностями внутриклеточной компартментализации. Свободные антрациклины быстро проникают в клетку в результате пассивной диффузии 1М. й а1., 1985). Антрациклины,

входящие в состав СНДэфр, попадают в клетку в результате рецепторопосредованного эндоцитоза, протекающего с более низкой скоростью (МШ^Иат М.С. И а1., 1983; Ш^егН.Т., 1983).

Рис. 18. Тушение флуоресценции ДР при инкубации опухолевых клеток карциномы молочной железы человека линий МСР-7ТО (А) и МСР-7"гК (Б) с СНДэФР (ДР) и свободным ДР.

Таблица 11. Накопление свободных и входящих в состав СНД»«р антрациклинов в ядрах чувствительных и резистентных опухолевых клеток.

препарат.. , яр СВД™>(ДР) KM . СНДэфр (KM)

11Í2*. мин MCF-7WI 17+0,6 38+0,8 4,2+0,1 22+0,4

MCF-7AdrR 36+0,7 46+1,1 8,5+0,3 25+0,6

С**, мкЛШО* кл MCF-7W* 0,538+0,010 0,616+0,018 0,768+0,015 0,500+0,015

MCF-7A<lrH 0,257+0,012 0,543+0,019 0,551+0,016 0,458+0,013

* Un - время полумаксимального накопления антибиотика в ядрах опухолевых клеток.

** С - концентрация связанного с ядром антрациклина, определенная в условиях

стационарного состояния.

Как видно на рис. 18, 19, кривые насыщения ядер клеток свободными и входящими в состав СНДэфр антрациклинами достигают плато лишь после 2 ч инкубации, за исключением свободного КМ (насыщение клеток МСК-7А'1 и МСР-7А11гК антибиотиком достигается через 30 и 50 мин, соответственно). Очевидно, что скорость поступления препаратов антрациклинов в клетку складывается из скоростей проникновения антрациклинов через плазматическую мембрану, внутриклеточной компартментализации и транслокации антибиотиков в ядро.

Как видно из табл. 11, уровень накопления ДР, входящего в состав СНДэфр, в ядрах клеток МСР-7^' и МСР-7АЛК превышает уровень свободного антибиотика. В случае препаратов КМ, напротив, уровень свободного антибиотика в ядрах клеток исследуемых линий превышал уровень КМ, доставляемого в клетки ЭФР. По-видимому, различие в уровнях накопления ДР и КМ связано с более высокой проницаемостью клеток для КМ и низкой эффективностью его выброса из клетки насосом Р170, Уровни накопления свободных ДР и КМ в ядрах клеток МСР-7'ЛЧ были заметно выше, чем в МСР-7Л4г1г, что может служить одним из объяснений резистентности клеток к цитотоксическому действию антибиотиков. Уровни

Рис. 19. Тушение флуоресценции КМ при инкубации опухолевых клеток карциномы молочной железы человека линий МСР-7™ (А) и МСР-?^'" (Б) с СНДэфр (КМ) и свободным КМ.

накопления антрациклинов в составе СНДэфр в ядрах клеток MCF-7wt и MCP-7AdrR существенно не различались, т.е. не зависели от чувствительности клеток (табл. 11), что может служить объяснением высокой ЦТА антрациклинов в отношении резистентных клеток при применении СНД.

Результаты исследования распределения свободных и входящих в состав СНДэфр антрациклинов между цитоплазмой и ядром опухолевых клеток приведены в табл. 12, 13. При поступлении в клетки как свободные, так и входящие в состав СНДэфр антрациклины преимущественно локализуются в ядрах клеток MCF-7. При этом распределение свободных антрациклинов между ядром и цитоплазмой клеток MCF-7WI и MCF-7AdrR существенно различается. Так, соотношение содержания свободного ДР в ядерной и цитоплазматической фракциях клеток MCF-7wt и MCF-7AdrR составило 9,0 и 5,7 соответственно (для КМ соотношение составило 5,7 и 3,0). Таким образом, по сравнению с клетками MCF-7%t, относительный уровень свободных ДР и КМ в ядрах клеток MCF-7AdrR снижается, а в цитоплазме возрастает, что, очевидно, вызвано действием механизма клеточной резистентности (Сергеева Н.С. и др., 1996), препятствующего поступлению антрациклинов в ядро. Поскольку интеркаляция антрациклинов между парами оснований ДНК рассматривается в качестве основного пути проявления их цитотоксической активности (Liu L.F. et al., 1983), внутриклеточные механизмы, обуславливающие низкое содержание ДР и КМ в ядрах резистентных клеток, вероятно, могут быть определяющими в отношении устойчивости клеток к действию антибиотиков. В противоположность свободным антрацикпинам, соотношение содержания ДР, входящего в состав СНДэфр, в ядерной и цитоплазматической фракциях клеток MCF-7Wl и MCF-7AdrR составило 3,3 и 2,8 соответственно (для КМ соотношение составило 2,3 и 2,0). То есть, при поступлении антрациклинов в клетку в составе СНДэфр их содержание в ядре (табл. 11), а также уровень их относительного распределения (табл. 12, 13) практически не зависят от чувствительности клеток к антибиотикам, что может свидетельствовать о низкой эффективности действия механизма клеточной резистентности в отношении СНД. Таким образом, особая привлекательность использования СНД в качестве терапевтических средств связана с возможностью значительного снижения или полного преодоления множественной лекарственной устойчивости, условием которого является дальнейшее их совершенствование.

Таблица 12. Распределение ДР между ядром и цитоплазмой клеток МСР-7 через 2 ч инкубации с ДР и СНДэфр (ДР)

Линия клеток '.' Содержание ДР, %

; Ядро Г.- . -Цитоплазма

MCF-7W1 ДР сщьфг (ДР) 90 77 10 23

MCJ:_7,urR ДР СНДэфр (ДР) 85 74 15 26

Таблица 13. Распределение КМ между ядром и цитоплазмой клеток МСР-7 через 2 ч инкубации с КМ и СНДэфр (КМ)

Линия клеток Препарат Содержание КМ, %

Ядро ::.' : ; Цитоплазма :

МСР-7т КМ СНДэфр (КМ) 85 70 15 30

мср_7ам КМ СНД-з*,р (КМ) 75 67 25 33

Представленные данные свидетельствуют о значительных различиях в скоростях, уровнях накопления и внутриклеточного распределения свободных и входящих в состав СНДэфр антрациклинов. Очевидно, что этими различиями во многом определяется более высокая ЦГА СНД в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток по сравнению со свободными антрациклинами.

Использование СНД для преодоления лекарственной резистентности опухолевых клеток

Одной из главных причин, существенно ограничивающих эффективность противоопухолевой химиотерапии является первичная и приобретенная резистентность опухолевых клеток к лекарственным препаратам. Для увеличения терапевтической эффективности СНД за счет совершенствования их векторного компонента мы провели сравнительное исследование векторных возможностей ЭФР и его рецепторсвязывающего фрагмента (ЭФРФР). Ранее было показано, что рецепторсвязывающий участок ЭФР локализован в области последовательности молекулы ЭФР, включающей аминокислотные остатки с 21 по 31, и отвечает структуре Н-МУТЕАЦЖУАС-ОН (Котопуа А. ег а!., 1984). Для того, чтобы

определить, взаимодействует ли ЭФРФР с рецептором ЭФР, мы предварительно исследовали его биологическую активность. Как видно на рис. 20, ЭФРФР, также как и ЭФР, проявлял дозозависимый

пролиферативный эффект в отношении фибробластов мыши линии МНЗТЗ. Хотя уровень стимуляции

пролиферации фибробластов ЭФРФР был несколько ниже, чем стимулирующий эффект ЭФР, полученный результат свидетельствует о выраженной биологической активности исследуемого пептида.

копцгатрацня, вМ

Рис. 20. Влияние ЭФР и его пептидного фрагмента ЭФРФР на пролиферацию фибробластов мыши линии Х1Н ЗТЗ.

Для изучения возможности транспорта ДР в опухолевые клетки с помощью ЭФРФР мы синтезировали СНДэфрфр (ДР) и СНДэфр (ДР) путем ковалентного связывания ЭФР и его фрагмента с ДР с использованием глугарового альдегида в качестве кросс-линкера (мольное соотношение вехтор:ДР в препаратах составило 1:1), Результаты сравнительного изучения ЦТА СНДэфрфр (ДР), СНДэфр (ДР) и свободного ДР в отношении чувствительных (MCF-7wt) к резистентных (MCF-7AdlR) к ДР клеточных линий приведены на рис. 21. Как видно на рис. 21, А, ЦТА СНДэфрфр (ДР) в отношении чувствительных клеток MCF-7Wt значительно превышала как активность свободного ДР (в 23,4 раза), так и активность СНДэфр (ДР) (в 8,8 раза). В случае резистентных клеток ЦТА СНДэфрфр (ДР) превышала активность свободного ДР в 12,3 раза, а активность СНДэфр (ДР) в 2,3 раза (рис. 21, Б). По-видимому, высокая ЦТА СНДэфрфр определяется эффективностью интернализации и спецификой внутриклеточного распределения конъюгата.

Таким образом, обе исследуемые СНД проявляют значительно более высокую ЦТА чем свободный ДР, в отношении как чувствительных, так и резистентных клеток. При этом применение СНД значительно повышает чувствительность резистентных клеток к ДР, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных лекарственных средств. Представленные результаты свидетельствуют также о больших потенциальных возможностях использования ЭФРФР в качестве эффективного вектора для транспорта химиопрепаратов к опухолевым клеткам. К очевидным преимуществам ЭФРФР по сравнению с другими векторами относятся стабильность, доступность в препаративных количествах и относительно низкая стоимость производства.

100-

1с,, >м

-о-др 58.6

-0-снд,.,(др) 21.9 •д-снд„„,(др) z5

— 10

100

юоо

[ДР], НМ

100

80

60

40

20-

1 мкМ —ДР 3.7

-0-СНД,.,С'0') 0.7

л-д

од

10

100

[ДР], мкМ

Рис. 21. Цитотоксическая активность свободного и входящего в состав СНДэфр и .эфрфр ДР в отношении клеток карциномы молочной железы человека линий МСР-7™ (А) и МСР-7'"гЕ

(Б).

Исследование противоопухолевом активности СНДэфр и _афп » включающих фталоцианины, аитрациклиновые антибиотики п растительные алкалоиды in vivo.

Сравнительное исследование противоопухолевой активности свободных и входящих в состав СНД цитотоксических препаратов проводили на моделях перевиваемых солидных опухолей мышей с использованием клеток мышиного лейкоза линии Р388 (мыши DBA/2) и мышиной меланомы В16 (мыши С57В1/6). Нами были использованы разные модели опухолей для изучения векторных возможностей исследуемых белков, поскольку ранее было показано, что АФП эффективно доставляет химиопрепараты в клетки линии Р388 (Severin S.E. et al., 1996), а ЭФР в клетки линии В16 (Луценко C.B. и др., 1998). Препараты вводились 1 раз в 4 дня, всего 3 инъекции, начиная со 2 дня после прививки опухоли, в дозах (по химиопрепарату) 0,2 мг/кг в случае ФЦ(Со), ВБ и ВК, и 0,14 мг/кг в случае ДР и КМ. Через 1 ч после каждого введения препаратов ФЦ(Со) животные получали внутримышечно аскорбиновую кислоту в дозе 0,46 мг/кг. Объём опухоли вычисляли по формуле V=a2xbx7i/6, где а - короткий, b - длинный диаметр опухоли. Относительный размер опухоли (ОРО) вычисляли на день, предшествовавший началу гибели контрольных животных, по формуле ОРО = Оп/КхЮО%, где Оп - средний объем опухолей в опытной группе, К - средний объем опухолей у контрольных животных. Увеличение средней продолжительности жизни (УСПЖ) леченых животных относительно контрольных рассчитывали по формуле: УСПЖ = (Т/С-1)х100%, где Т - средняя продолжительность жизни (СПЖ) леченых животных в днях, С - СПЖ для контрольных животных. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Противоопухолевая активность свободного и входящего в состав СНДэфр и _афи ФЦ(Со) in vivo.

В экспериментах in vivo использовали ФД(Со), поскольку данный препарат, в отличие от ФЦ(А1) и ХД может бьггь активирован при введении в клеточную среду и органы аскорбиновой кислоты в отсутствие источника света (Novodarova G.N. et al, 1996), что значительно упрощает постановку эксперимента. Как видно из табл. 14, терапевтическое применение свободного ФЦ(Со) не приводило к ингибированию роста опухолей, в то время как лечение животных препаратом СНДафп (ФЦ(Со)) вызывало значительное замедление роста опухолей. При этом величина ингибирования роста опухолей достигала 30% на день начала гибели контроля. При применении ФЦ(Со) и СНДэфр (ФЦ(Со)) ингибирование роста опухолей отмечалось лишь в последнем случае и достигало более значительного уровня (44%) (табл. 15). Как видно из табл. 14, 15, лечение животных как СНДафп (ФЦ(Со)), так и СНДэфр (ФЦ(Со)) оказывало значительный позитивный эффект в отношении УСПЖ животных. Представленные данные свидетельствуют о возможности успешного использования ЭФР и АФП для направленного транспорта фталоцианинов к опухолевым клеткам-мишеням в составе СНД.

Противоопухолевая активность свободных и входящих в состав СПДэфр и _афп антрациклиновых антибиотиков in vivo.

При лечении животных как свободным, так и входящим в состав СЩЦфп ДР наблюдалось ингибирование роста опухолей (табл. 14). При этом препарат СНДафп (ДР) оказывал более сильное супрессивное действие в отношении опухолей - средний размер опухолей в группе, получавшей ДР, входящий в состав СНДдфп, был примерно в 3 раза меньше, чем в группе, получавшей ДР. Наиболее значительное УСПЖ также наблюдалось в группе животных, получавших препарат СНДафп (ДР) (табл. 14). В группах животных, получавших свободный и входящий в состав СНДэфр ДР, наблюдалось заметное ингибирование опухолевого роста (табл. 15). При этом относительный размер опухолей у животных, получавших препарат СНДэфр (ДР), к 40 дню после прививки опухоли оказался примерно в 1,7 раза меньше, чем у животных, получавших свободный ДР, и в 3,4 раза меньше, чем в контроле. Кроме того, в отличие от свободного ДР, внутривенное введение препарата СНДэфр (ДР) приводило к 20% УСПЖ по сравнению с контролем (табл. 15).

Исследование влияния свободного и входящего в состав СНДдфп КМ на рост опухолей показало, что свободный КМ обладал менее выраженным ингибирующим действием по сравнению с СНДдфп (КМ). Средний размер опухолей у животных, получавших препарат СНДафп (КМ), оказался примерно в 1,5 раза меньше, чем у животных, получавших свободный КМ, и в 1,9 раза меньше, чем в контрольной группе. Применение СНДафп (КМ), в отличие от свободного КМ, также приводило к заметному УСПЖ животных (табл. 14).

Сравнительное исследование противоопухолевой активности КМ и СНДэфр (КМ) показало, что КМ слабо ингибировал рост опухолей в сравнении с контролем, тогда как ингибирующее действие СНДэфр (КМ) оказалось значительным (относительный размер опухолей составлял 48,2%) (табл.15). Эффект от применения СНДэфр (КМ) в

Таблица 14. Противоопухолевая активность свободных и входящих в состав СНДафп химиопрепаратов в отношении солидных опухолей мышиного лейкоза линии Р388

Препарат ОРО*, % : от контроля СПЖ, дня ;.-'*- УСПЖ,%

контроль ФЦ(Со) СЦЩфп (ФЦ(Со)) 100 103 70 18,5+0,3 19,1+1,1 26,5+0,2 0 3,2 43,2

контроль ДР CHJWfflP) 100 37.3 12.4 27,7+0,3 32,6+1,5 42,2+16,3 0 17,6 59,6

контроль КМ СНДафп (КМ) 100 81,2 53,4 20,5+0,3 21,7+0,4 25,7+1,5 0 5,9 25,4

контроль ВБ СНДдфп (ВБ) 100 32 9 7,0+1,5 9,7+1,5 13,2+1,6 0 38,6 88,6

отношении УСПЖ животных также оказался существенно выше эффекта свободного КМ.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что терапевтическая активность антрациклиновых антибиотиков может быть значительно повышена за счет их адресной доставки к опухолевым клеткам-мишеням в составе СНДэфр и .афп-

Противоопухолевая активность свободных и входящих в состав СНДэфр и _афп растительных алкалоидов.

Исследование влияния СНДд.фп (ВБ) на развитие солидных опухолей показало, что как свободный, так и входящий в состав СНДафп ВБ оказывали ингибирующее действие на рост опухолей (табл. 14). При этом относительный размер опухолей у животных, получавших препарат СНДафп (ВБ), оказался в 3,6 раза меньше, чем у животных, получавших свободный ВБ, и в 11,1 раза меньше, чем в контроле. Терапевтическое применение СНДдфп (ВБ) приводило к наибольшему УСПЖ животных (88,6%) по сравнению со всеми исследуемыми СНДэфр и -афп с химиопрепаратами (табл. 14,15).

Исследование влияния свободного и входящего в состав СНДэфр ВБ показало, что препарат СНДэфр (ВБ) обладал более выраженным ингибирующим действием, чем свободный ВБ (табл. 15). Относительный размер опухолей у животных, подвергшихся терапии СНДэф? (ВБ), оказался в 1,6 раза меньше, чем у животных, получавших ВБ, и более чем в 2 раза меньше, чем в контроле. При лечении животных препаратом СНДэфр (ВБ) УСПЖ животных достигало 27%, тогда как свободный ВБ в

Таблица 15. Противоопухолевая активность свободных и входящих в состав СНДэфр химиопрепаратов в отношении солидных опухолей мышиной меланомы линии В16.

Препарат ОГО*,% : от контроля : ч снж,лнн УСИЖ,%

контроль 100 35,6+1,0 0

ФЦ(Со) 113 36,2+2,5 1,7

СНДэфр (ФЦ(Со)) 56 45,9+2,9 28,9

контроль 100 35,9+0,7 0

ДР 58,5 32,6+1,5 -9,0

СНДэфр (ДР) 29,8 42,8+2,1 20,2

контроль 100 30,9+4,8 0

КМ 88,9 32,5+7,1 5,2

СНДэфр (КМ) 48,2 39,4+2,1 27,5

контроль 100 36,1+4,0 0

ВБ 77 35,8+2,6 -0,5

СНДэфр (ВБ) 48 45,4+3,4 27,5

контроль 100 36,1+4,0 0

ВК 49,2 36,6+2,3 1,4

СНДэфр (ВК) 30,7 47,3+2,9 31,0

используемых дозах практически не оказывал влияния на продолжительность жизни животных (табл. 15). Аналогичное противоопухолевое действие вызывало применение СНДэфр (ВК) (табл. 15). Относительный размер опухолей у животных, подвергшихся терапии СНДэфр (ВК) оказался в 1,6 раза меньше, чем у животных, получавших свободный ВК, и более чем в 3 раза меньше, чем у контрольных животных. УСПЖ при терапии СНДэфр (ВК) достигало 31%, тогда как применение свободного ВК практически не влияло на продолжительность жизни животных. Представленные данные позволяют заключить, что АФП и ЭФР могут быть успешно использованы в качестве векторов для адресной доставки противоопухолевых препаратов к клеткам-мишеням. На основе данных белков могут быть созданы эффективные противоопухолевые СНД с цитотоксическими веществами различных классов. Противоопухолевая активность СНДэфр и -афп с фталоцианинами, антрациклиновыми антибиотиками и растительными алкалоидами значительно превышает активность свободных цитотоксических препаратов. По нашему мнению применение СНД для лечения резистентных к химиотерапевтическим препаратам опухолей могло бы значительно повысить эффективность терапии за счет преодоления резистентности опухолевых клеток и снижения терапевтических доз препаратов. Кроме того, многих побочных эффектов, вызываемых ХП, например высокой кардиотоксичности ДР, можно было бы избежать при применении СНД за счет адресной доставки химиопрепаратов к клеткам-мишеням. Для достижения максимальной терапевтической эффективности разработанных нами СНД необходимо их дальнейшее совершенствование наряду с подбором наиболее уязвимых к терапии опухолей и поиском оптимальных схем лечебного применения препаратов.

Разработка методов получения человеческих ЭФР, Ш1-3 и 4 с использованием генно-инженерных подходов

В настоящее время факторы роста и цитокины рассматриваются в качестве перспективных терапевтических средств для использования в экспериментальной и практической областях медицины. Для обеспечения возможностей научных исследований и рентабельного практического применения нами разработаны подходы к получению в препаративных количествах рекомбинантных человеческих ЭФР, ИЛ-3 и 4 с использованием в качестве продуцентов штаммов Escherichia Coli, несущих синтетические гены целевых белков.

Получение рекомбинантного ЭФР человека.

Для создания штамма-продуцента рекомбинантного чЭФР использовали ген белка, полученный ранее путем химико-ферментативного синтеза с учетом наиболее часто используемых в Е. coli кодонов (Ажаев А В. и др., 1988). Синтетический ген чЭФР, содержащий 165 нуклеогидных пар (53 кодона аминокислот и 2 стоп-кодона) и имеющий «липкие концы» сайтов рестриктаз EcoRI (5') и ВатШ (3'), был клонирован в составе pUC18 (БатчиковаН.В. и др., 1989). При этом ген чЭФР оказывался в рамке

PsA &-

мРН

140

SaulA 40 Psß

tmmm

лццер OmpF

SatßA.

Вектор

pUC18delRI / PstVDamm

Т4-яягаза

AACGCTGCAGAA

TTGCGACGTCTT риС18аеШ-&кЗА/ЛЯ «40»

Sau\

L

AACGCTGCA

ZC^C

TTGCG ^Фрагмент Елеиова

Sau3A

i

TTGCG

Олигонукпеотид (II), Т4-лига$а

Sau3

3 AACGCGAATTC __kw.w.'.WAV'mH____

TTGCGCTTAAG pUC18delHl-Äm3 hlEcöfü «40»

Beicrop pUC 1 ViicoKJPstl

Фрагмент PstI-Sau3A «140»

Фрагмент Sau3A-EcoRI «40»

SaulA EcoRl

Т4-лигаза риС18-ОшрР(ЛФ£со!И)

Рис. 22. Схема конструирования плазмиды рШЛв-ОтрР/РБЦ/ЕсоШ: из фрагмента РкА-РвЯ гена ошрр. Заштрихована последовательность, кодирующая лидерный пептид ОтрР; пунктиром обозначена ДНК векторных плазмид.

считывания ß-галакгозидазы, и плазмида риС18/ЭФР кодирует чЭФР в составе гибридного белка с 5 аминокислотными остатками ß-галактозидазы на N-конце молекулы. В клетках Е. coli JM105, трансформированных полученной плазмидой, выращенных в присутствии индуктора (IPTG), целевой продукт не обнаруживался, что, вероятно, обусловлено известной нестабильностью чужеродного белка в клетках Е. coli при его продукции в цитоплазму. Поскольку стабильность чужеродных

полипептидов в клетках Е. coli может быть повышена за счет выведения целевого продукта из зоны действия цитоплазматических протеиназ, т.е. путем секреции в периплазматическое пространство или культуральную среду, мы осуществили экспрессию гена чЭФР в составе секреционных векторов, содержащих ген лидерного пептида белка OmpF, одного из основных белков внешней мембраны Е. coli (Ostrow К. S. et al., 1986).

Нуклеотидная последовательность гена ompF известна (Heyde M. et al., 1987). Участок, кодирующий 5'- конец OmpF мРНК от старта транскрипции до места стыка кодонов лидерного пептида и зрелой части белка, находится в составе Pstl-Pstl-фрагменга (180 п.о.) этого гена. Таким образом, легко осуществляется стыковка чужеродного гена с геном лидерного пептида OmpF и всего гибридного гена под контроль сильного регулируемого промотора Е. coli, который более удобен в работе по сравнению с промотором OmpF. Указанный фрагмент был выделен нами из хромосомы Е. coli штамма СбОО. Далее дистальный (по ходу трансляции) сайт Pstl был заменен нами на сайт EcoRI (плазмвда pUC18-OmpF (Pstl/EcoRJ)) (рис. 22) так, чтобы при последующем лигировании по сайту EcoRI синтетический ген попадал в рамку считывания лидерного пептида OmpF. При этом первый кодон гена чЭФР точно стыкуется с последним кодоном гена лидерного пептида. В качестве вектора использована плазмида pKKD, содержащая промотор Ptac, полилинкерный участок и терминатор транскрипции гена тгпВ. Плазмида рВТ-ЭФР получена трехкомпонентным лигирозанием фрагмента Pstl-EcoRI (участок гена OmpF), фрагмента EcoRI-Hindin из pUClS-ЭФР (ген чЭФР) и векторного фрагмента Pstl-HindlH из pKKD (рис. 23). Штамм Е. coli JM105, трансформированный плазмидой рВТ-ЭФР, выращивали в условиях индукции tac-промотора в минимальной среде. В качестве контроля использовали штамм JM105, трансформированный плазмидой pKKD. Как видно на рис. 24, в препарате, полученном из клеток, содержащих плазмццу рВТ-ЭФР, присутствует дополнительная полоса полипептида (бкДа), соответствующая чЭФР. По данным иммуноферментного анализа, проводимого с помощью поликлональных антител к чЭФР, продукция чЭФР в периплазму клеток штамма 1М105/рВТ-ЭФР составляет 3,5-4,5 мг/л бактериальной культуры. Очевидно, что гибридный белок-предшественник, кодируемый плазмидой рВТ-ЭФР, правильно процессируется сигнальной пеггтидазой Е. coli, несмотря на изменение сайта процессинга по сравнению с OmpF. Чтобы проверить, влияет ли такое изменение на эффективность отщепления лидерного пептида, была сконструирована плазмида pBTN-ЭФР, отличающаяся от исходной наличием последовательности, кодирующей 12 аминокислотных остатков N-концевой части зрелого OmpF и дипептид -LysLys-между этой последовательностью и чЭФР (рис. 23). В этой конструкции сайт процессинга сигнальной пептидазой соответствует природному, а дипептид -LysLys-предусмотрен как сайт протеолитического расщепления при выделении целевого продукта из гибридного белка.

Рис. 23. Схема конструирования плазмид pBT-hEGF, pBTN-hEGF и серии pBT-(hEGF)„, где п=2-4. Указаны сайты рестрикгаз: R - EcoRl, M - Smal. В - ВашШ, S - Sali, Р - PsÜ, H -HindIII, X - Xhol. Светлые прямоугольники - участки, соответствующие гену ompF; заштрихованные - участки, соответствующие гену hEGF. Зачерненный участок соответствует 12 кодонам N-концевой части зрелого OmpF. Указано положение промотора (Pi,c или Р^) и области терминации транскрипции гена rrnB (Т).

Штамм JM105, трансформированный плазмидой pBTN-ЭФР, выращивали в тех же условиях, что и JM105/рВТ-ЭФР, вьщеляли и анализировали периплазматическую фракцию. Препарат содержал белок с молекулярной массой (~8 кДа),

соответствующей теоретической для правильно процессированного

гибридного белка OmpF-LysLys-ЭФР, что было подтверждено результатами иммуноферментного анализа. Уровень продуктивности полученного штамма составлял 10-12 мг ЭФР из I л бактериальной культуры. Таким образом, изменение сайта процессинга в области начала зрелого белка, а именно замена собственной последовательности OrapF на чужеродную чЭФР, приводит к более чем двукратному снижению уровня секреции рекомбинантного продукта. Несмотря на повышенный, по сравнению с ЛМ105/рВТ-ЭФР, уровень секреции, штамм JM105/рВТ]\'-ЭФР не выгоден для получения чЭФР, из-за секреции в периплазму гибридного белка OmpF-ЭФР, требующего дополнительных стадий по его расщеплению и выделению целевого продукта. Плазмида рВТ-ЭФР, в которой ген лидерного пептида белка OmpF точно состыкован с геном чЭФР, более перспективна в биотехнологическом плане, причем повышение выхода целевого белка может быть достигнуто за счет увеличения числа копий рекомбинантного гена. Была сконструирована серия плазмид рВТ-(ЭФР)п, где п=2-4. Для этого фрагмент Xhol-Sall плазмиды рВТ-ЭФР клонировали по сайту ресгриктазы Sali в эту же плазмиду (рис. 23), затем тот же фрагмент Xhol-Sall аналогично - в плазмиду рВТ-(ЭФР)2 и.т.д. В этих конструкциях с tac-промотора должны синтезироваться полицистронные мРНК, в которых каждый цистрон будет транслироваться независимо.

Из клеток Е. coli JM105, трансформированных плазмидами этой серии, выделяли периплазматические фракции и анализировали их с помощью иммуноферментного

Таблица 16. Продукция ЭФР в периплазму и культуральнуто среду

¡Штамм-иродуцент Продукция ЭФР, mi/л культуры

периплазма ' " среда

Ш105/рВТ-ЭФР 3,5-4,5 1,0-2,0

JM 105/рВТ-(ЭФР)2 9,5-10,5 3,0-3,5

Ш105/рВТ-(ЭФР)3 10,0-11,0 5,0-5,5

1М105/рВТ-(ЭФР)4 9,0-10,0 6,0-7,0

JM105/pBTN-3®P 10,0-12,0 1,5-2,0

— 6,4

1 23 4 5

Рис. 24. Элеетрофореграммы

периплазматичсской фракции белков в 15% ДСН-ПААГ. 1 - штамм JM105/pKKD; 2 - JM105/pBT-hEGF; 3 - JM105/pBT-(hEGF)2; 4 - JMI05/pBT-(hEGF)3; 5 -JM105/pBT-(hEGF)4.

!¡

кДа

-17,Z

— 14,6

— Ь.1

-6}Ч

i

аиализа. Как видно из табл. 16, при дупликации рекомбинантного гена количество чЭФР в периплазме возрастает и остается на том же уровне при 3 и 4 копиях гена, причем этот уровень несколько ниже наблюдаемого в Ш105/рВТК-ЭФР. Увеличение числа копий гена, однако, приводит к повышению экскреции чЭФР в культур альную среду. Штамм-продуцент Ш105/рВТ-(ЭФР)2

использовали для препаративного выделения чЭФР. Нами была предложена эффективная схема чередования стадий процесса очистки: получение препарата периплазмы (рис. 25, 2), кислотное осаждение балластных белков (рис. 25, 3), ОФ хроматография на колонке с Оау1$11 Си (рис. 25, 4), ОФ ВЭЖХ на колонке с цВоп(1орак Си (рис. 25, 5). Представленный метод выделения позволяет в короткие сроки и с высоким выходом (70%) получить до 7 мг высокоочищенного (> 98% чистоты) чЭФР из 1 л бактериальной культуры. Результаты 25 циклов ^концевого аминокислотного секвенирования согласуются с известной последовательностью чЭФР. Рекомбшгантный чЭФР обладал выраженной биологической активностью в тесте на раскрытие глаз новорожденных мышей (ОЬ§а1 Н. е1 а1, 1989).

Рис. 25. Электрофорез препаратов чЭФР на различных стадиях очистки: 1 - клеточный лизат; 2 - псриплазматическая фракция; 3 - осадок после инкубации при рН 3,0; 4 -элюат с Оахагй Си; 5 - элюат с цВопёорак С,„.

Экспрессия гена чИЛ-3 в Е. coli под контролем промотора Р УШ фага fd и усилителя трансляции гена 10 фага Т7

Ранее было показано наличие лидерных участков мРНК, выступающих в роли активаторов инициации трансляции и предшествующих генам основных белков оболочки фагов, отличающихся особенно высоким уровнем экспрессии (Mahajna J. et al., 1986; McCarthy J.E. et al., 1986). Такого рода участки были обнаружены в структуре генома фага Т7 (ген 10) (Olins P.O. et al., 1988). Лидерная последовательность гена 10 (основного белка оболочки) фага Т7, способная увеличивать уровень экспрессии в 50-500 раз и была использована нами для повышения уровня экспрессии чужеродных генов в E.coli. Данная последовательность была выделена и изучена в качестве усилителя трансляции (translational enhancer, TREN) после клонирования MlaI/NdeI-фрагмента ДНК фага Т7 (нуклеотиды 2287722965) (Dunn J.J. et al., 1983). Для исследования потенциала TREN в усилении

pFPCPIO

150 200 280

.. .АТАСАААТСТССОТТОТАСТТГОТТТСОСОС'ГТООТАТААТСОСТОООООТСАЛАОАТОА.. .TTAATCGAAACTT P SO

300

CCTCATOAAAAAOTGTTrAGTCCTCAAAGCCTCCOTA№COTTOCTACCCTCOTTCCOATC^TOTcmCCK:TOCTO MCS MCS

390 BamHI Pstl EcoRI 440

AGOGTGAC^ATCCpOCAAAAGCCGATCtn'GCAGAATrCGCrGCCAAOOCQATGCCCGATCCGAATTAGCGGCCTT SD MCS

560 580 610 Bgin

Т.. .АСЮТОАТАААСССАТАСААТТАААСЮСТССТТТТСОАСССТГГПТтТСАОАТТТГ.. .TTTAGATCTCCCCAG

T

770 TCAA...

pTRENl

А В

BamHI Sphl Xbal_ _EcoRV_EcoRI

...GCG ¡GATCCGCATGCTCTAGAAAATAATTTTGTrTAACj tITTAAOAAOGAOATATCATAAT0 AATTC... 390 410 450

...CGCTAO рСОТАЮАОАТСТПТАТ^ 1алаАСАААТТОАААТТСГГССТСТА| tTAGTATTACTTAAl С...

CD E

pTREN2

F G

BamHI Sphl _ _ Xbal

...GCGGATCCGCATG ICTTCOAAATTAATACGACTCACTATAGGGl lAGACCACAACGGnTCCCTl CTAGA...

430

...CGCCTAGGC fcTACOAAGCrrTAArTATOCTGAi |GTOATATCCCTCTOOTOTTOCCAAAOOOAOATC| T... H I

Рис. 26. Частичная структура плазмид и схема сборки искусственных генов TREN. Указаны сайты рестрикгаз, номера нуклеотидов в плазмиде, участки промотора (Р), терминатора (Т), MCS, связывания рибосомы (SD), терминирующие и инициирующие кодоны.

экспрессии чИЛ-3 был осуществлен химико-ферментативный синтез проксимальной его части (до сайта рестриктазы Xbal) и всего TREN (Ажаев A.B., Гуревич А.И. и др., 1990) и проведено клонирование их в многокопийной плазмиде pFPCPIO. Частичная структура плазмиды pFPCPIO приведена на рис. 26. Полилинкеру в плазмиде предшествуют регуляторные участки гена 8 (fpep) фага fd - сильный промотор и эффективно транслируемый ген лидерного пептида, который может служить в качестве своеобразной MCS (мини-цистронная последовательность); вслед за полилинкером нет транслируемых участков и через 150 нуклеотидов находится эффективный терминатор транскрипции.

Для клонирования проксимальной части гена TREN1 расщплялась pFPCPIO рестриктазами ВатШ и EcoKI. Схема сборки в полученном таким образом векторе искусственного гена TREN1 из пяти олигонуклеотидов А - Е (фосфорилированных В, С и D и нефосфорилированных А и Е) приведена на рис. 26. В результате клонирования была получена плазмида pTRENl, которая была использована, с одной стороны, для проверки способности проксимальной части гена TKEN1 усиливать трансляцию, а с другой - для достройки дистальной части гена TREN. Сборку этой

4>st

4sl

Рис. 27. Схематическое строение плазмид рКРСРЮ, pFP10IL3, серии pTRJEN и их производных. Указано положение сайтов рестриетаз (В - BamHI, RI - EcoRI, RV - EcoRV, S -SphI, X - Xbal, H - HindlII, Bgl - BglII, Psí - PstI), промотора (P) и терминатора (T) транскрипции, последовательностей SD и TREN и генов Ыа и ¡13.

части искусственного гена из четырех олигонуклеотидов F - I проводили в векторе, полученном из pTRENl путем расщепления рестрикгазами SphI и Xbal. В результате клонирования получена плазмида pTREN2.

Отбор клонов с плазмидами pTRENl и pTREN2 проводили путем гибридизации колоний с мечеными олигонуклеотидами С и G и рестриктного анализа (рестриктазы ВашШ, SphI, Xbal, EcoRV, EcoRI). Структура гена TREN доказана секвенированием BamHI/EcoRI фрагмента.

Для выяснения влияния элементов структуры TREN на эффективность трансляции мы сопоставили уровни экспрессии одного и того же гена, клонированного в плазмидах, структура которых различалась лишь в области, непосредственно предшествующей старту трансляции. Для создания штамма-продуцента нами был использован искусственный ген чИЛ-3 (113), клонированный в BamHI/EcoRI-векторе, полученном из плазмиды pFPCPlO. Структура образовавшейся плазмиды pFP10IL3 доказана рестриктным анализом и секвенированием нуклеотидной последовательности искусственного гена (фрагмент BamHI/EcoRI).

Фрагмент EcoRV/Bgin, содержащий ген Í13, мы лигировали с EcoRV/BglII-векторами, полученными из плазмид pTRENl и pTREN2, и клонировали образовавшиеся плазмиды рТЕНЬЗ и pTE2IL3, в которых гену ИЗ непосредственно предшествует соответственно проксимальная часть или вся последовательность TREN. Структура плазмид была доказана рестриктным анализом и секвенированием соответствующих XbaI/HindIH-фрагментов.

Строение полученных плазмид, содержащих различные последовательности TREN,

приведено на рис. 27. Влияние структуры участка, предшествующего SD, на

эффективность трансляции наглядно демонстрирует сравнение уровней экспрессии гена ¡13 в приведенных выше различных конструкциях (рис. 28). Как видно на рис. 28, уровень экспрессии гена ¡13, клонированного в плазмиде pFPCPIO, не содержащей участка TEEN, очень низок (рис. 28, 1, 2) и несколько повышается под действием проксимальной части TREN в плазмиде pTElIL3 (рис. 28, 3). В то же время введение полной структуры TREN приводит к резкому возрастанию синтеза чИЛ-3 с плазмидой pTE2IL3 (рис. 28, 4). Таким образом, для усиления экспрессии чИЛ-3, по-видимому, необходимо наличие всей последовательности TREN.

Представляется вероятным, что на усиление трансляции оказывает наибольшее влияние структура находящегося перед сайтом Xbal участка, в состав которого входит дополнительная последовательность SD. В результате проделанной работы нами была получена генно-инженерная конструкция, характеризующаяся высоким уровнем экспрессии в Е. coli искусственного гена чИЛ-3, клонированного в плазмиде pTE2IL3. При этом транскрипция гена осуществлялась под контролем сильного промотора (PVni ) и терминатора фага fd, а трансляция - с помощью усилителя трансляции гена 10 фага Т7.

г-

Рис. 28. Гель-электрофорез лизатов клеток E.coli НВ101, несущих плазмиды с геном ¡13: 1 - pFPCPIO; 2 - pFPCP10IL3; 3 -pTElIL3; 4 - pTE2IL3.

Системы экспрессии в Е. coli рекомбинантного чИЛ-3.

При разработке биотехнологических методов получения рекомбинантных белков важное значение имеет выбор оптимального сочетания генно-инженерной конструкции экспрессионной плазмиды и несущего ее штамма бактериальных клеток. В связи с этим мы провели сравнительное изучение уровня синтеза рекомбинантного белка в продуцентах на основе различных штаммов E.coli, содержащих экспрессионные плазмиды PTE2EL3. Высокий уровень биосинтеза чИЛ-3 с такой конструкцией экспрессионной плазмиды (конститутивный биосинтез) достигался в штаммах Е. coli HB 101 (тесА+) и SG20050 (Ion), в которых его содержание достигало 30 - 40% тотального белка клетки; значительно менее продуктивными оказались штаммы TG1 (тесА+) и VL902 (Ion) (рис. 29). По-видимому, соотношение скоростей процессов биосинтеза и деградации белка в различных штаммах является параметром,

кда

кДа

"l'SS 'fee''1

ff' sii i ¿fit ¿ей I- -

43 3D

20,1 fw, Ч

i^fi-:'

■ V

Рис. 29. Электрофорез в ПААГ клеточных лизатов продуцентов чИЛ-3 с плазмидой рТЕ21ЬЗ (I) в различных штаммах Е.соП: 1 - НВ101, 2 -Т01, 3 - УЬ902, 4- 5020050. Стрелкой отмечено положение полосы чИЛ-3.

jÖBfc

43 30

20,1 14, Ч

3

ч

;-) г

Рис. 30. Электрофорез в ПААГ клеточных лизатов продуцентов чИЛ-3 с плазиидами hTTE2IL3 (II) (I и 2) и pTOTE2IL3 (Ш) (3 и 4) в E.coli TGI без индукции IPTG (2 и 4) и после индукции через 4.5 ч (1 и 3).

определяющим уровень их продуктивности. Образующийся чИЛ-3 накапливался в виде телец включения, в которых его дальнейшая деградация затруднена. Высокопродуктивный штамм, однако, при продолжительном культивировании или многократных пересевах терял свою продуктивность вследствие сегрегации плазмиды, что, очевидно, обусловлено чрезмерным уровнем конститутивного биосинтеза рекомбинантного белка.

Поэтому для достижения высокого выхода рекомбинантного белка при одновременном повышении стабильности системы мы применили широко используемую схему биосинтеза с индукцией транскрипции на поздних стадиях роста культуры продуцента. С этой целью мы реконструировали плазмиду pTE2IL3 (I) и встроили в нее BamHI/EcoRI-фрагменг плазмиды рКК223-3, содержащий промотор Ptac и 1ас-оператор(0) (Amann Е. et al, 1983) между сайтами рестрпктаз BamHI и SphI, используя синтетический адаптер AATTCATG. Однако полученная плазмида pTTE2IL3 (И) в клетках Е, coli TG1 оказалась неспособной обеспечить индуцируемый синтез чИЛ-3; синтез белка интенсивно происходил и в отсутствие индуктора (IPTG), и накопление чИЛ-3 почти не увеличивалось после индукции (рис. 30). Очевидно, наличие одного оператора (О) в конструкции (II) оказалось недостаточным, чтобы ограничить транскрипцию с тандема двух промоторов PVIII и Ptac. Поэтому мы сконструировали плазмиду pTOTE2IL3 (Ш), аналогичную плазмиде (II), используя вместо адаптера AATTCATG синтетический оператор (Ор). Тандем двух операторов

AATTGTGAGCGGATAACAATTCTAG (Ор) CACTCGCCTATTGTTAA

в конструкции (III) оказался достаточно эффективным, и рост клеток продуцента (Е. coli TGI с плазмидой pTOTE21L3) без индуктора (IPTG) не приводили к образованию заметного количества рекомбинантного белка, но после индукции содержание образовавшегося чИЛ-З достигало 3040% тотального белка клетки (рис. 30). Сравнение уровней биосинтеза чИЛ-З в различных штаммах Е. coli, суперпродуцентах lac-penpeccopa (TG1, JMI05 и JM109), показало наличие существенных различий в уровнях накопления рекомбинантного белка, синтезируемого после индукции (рис. 31).

Для идентификации и получения биологически активного белка нами были разработаны методы его очистки и ренатурации.

Выделение рекомбинантного интерлейкина-З, продуцируемого Е. coli

Для получения рекомбинантного чИЛ-З в аналитическом варианте очистки мы использовали культуру продуцента Е. coli HBI01 с плазмидой pTE2IL3 в условиях конститутивного биосинтеза. Препаративный вариант очистки бьш разработан нами для получения чИЛ-З из продуцента Е. coli TGI с плазмидой pTOTE2IL3 (индуцируемый синтез).

Выделение чИЛ-З из клеток Е. coli НВ101 с плазмидой pTE2IL3

Продолжительность культивирования (20 ч при 37°С) была выбрана в соответствии с наивысшим содержанием чИЛ-З в тотальном лизате (рис. 32, 1) при высокой плотности клеток в культуре (А260 4-5). В этих условиях чИЛ-З накапливался в бактериальных клетках в виде нерастворимых белковых комплексов (телец включения). Успех получения из телец включения биологически активного целевого белка с высоким выходом, складывается из трех последовательных этапов -выделения высокоочищенных телец включения, ренатурации и окончательной очистки белка. Для получения грубого препарата телец включения клетки продуцента разрушали ультразвуком, тельца включения отделяли центрифугированием и дважды промывали раствором тритона Х-100, что позволило отделить большую часть балластных белков из препарата. Поскольку примеси значительно снижают выход белка после растворения и ренатурации, проводили дополнительную очистку телец

Ла

43 30

20.1 И.4

Рис. 31. Электрофорез в ПААГ клеточных лизатов продуцентов чИЛ-З с плазмидой pTOTE2IL3 (Ш) в различных штаммах E.coli: 1-TG1,2-JM105,3-JM109.

- 14,4

;Ч ' ] 2 З' Ч 6

Рис. 32. Электрофорез в ПЛАТ препаратов чИЛ-3 на рззличных стадиях очистки: 1 -клеточный лизат, 2 - супернатант экстракта СпНС1, 3 - осадок после экстракции Ог.НО, 4 - супернатант препарата после диализа, 5 - осадок из препарата после диализа, 6 - элюат с СМ-Тоуореаг! 6508.

Рис. 33. Биологическая активность чИЛ-3. Активация пролиферации Т-клеток человека (ИЛ-2-зависимый рост). Каждая точка представляет усредненный результат для четырех параллельных культур.

включения. После четырехкратной отмывки препарата раствором мочевины были получены высокоочищенные тельца включения чИЛ-3 (рис. 32, 2). Поскольку в тельцах включения рекомбинантиые белки присутствуют, как правило, в денатурированном состоянии (\isrston Б.А. е( а!., 1986), для получения биологически активной формы чИЛ-3 требуется тщательный подбор условий эффективного растворения и ренатурации белка. Использование 5 М СтНС1 позволило нам добиться практически полного растворения чИЛ-3, незначительный осадок содержал лишь примесные белки (рис. 32, 5).

Ренатурацию чИЛ-3 проводили при постепенном удалении денатурирующего агента в расчете на автоокисление 8Н-групп белка с образованием дисульфидных связей. После 10-кратного разбавления фосфатным буфером, препарат чИЛ-3 диализовали. В ходе диализа осаждались преимущественно балластные белки (рис. 32, 5). Хроматографический контроль процесса ренатурации осуществляли, основываясь на различии во времени удерживания денатурированного и ренатурированного чИЛ-3 на обращенной фазе при проведении ОФ ВЭЖХ. После завершения диализа практически весь белок переходит в ренатурированную форму. С помощью реагента Эллмана свободные БН-группы в полученном препарате не обнаруживались. Ренатурированный белок проявлял выраженную биологическую активность в тесте на стимуляцию ИЛ-2-зависимой пролиферации активированных Т-клеггок (рис. 33). Для дополнительной очистки чИЛ-3 проводили ионообменную хроматографию на колонке с СМ-Тоуореат1. Чистота чИЛ-3 (рис. 32, б) по данным интегрирования

хроматографических пиков (ОФ ВЭЖХ) составляла >98%. Молекулярная масса чИЛ-3 (ДСН-ЭФ) составляет 16 кДа (вычисленное значение 15,2 кДа). Результаты 5 циклов N-концевого секвенирования чИЛ-3 согласуются с известной аминокислотной последовательностью чИЛ-З.

Предложенный нами метод выделения позволяет получить в течение короткого времени до 35 мг практически гомогенного, биологически активного чИЛ-3 из 1 г влажных клеток с использованием одной хроматографической стадии.

Выделение чИЛ-3 из продуцента Е. coli TGI с плазмидой pTOTE2IL3

При разработке метода полупрепарагивного выделения чИЛ-3 из клеток продуцента Е. coli TGI мы внесли некоторые усовершенствования (ферментативное разрушение клеток, увеличение скорости и эффективности процесса ренатурации, использование ВЭЖХ) в представленную выше методику, позволяющие упростить процедуру при пилотных наработках рекомбинантных белков. Для выделения телец включения чИЛ-3 суспензию клеток продуцента обрабатывали лизоцимом и ДНКазой с последующим разрушением клеток ультразвуком. Такая последовательность операций позволяет добиться полного разрушения клеток и облегчает очистку. После отмывок телец включения растворами детергентов содержание чИЛ-3 в препарате достигало 80%. Солюбилизация этого препарата в 5М GnHCl позволила добиться практически полного растворения чИЛ-3 в течение 1 ч. Ренатурацию чИЛ-3 в препаративных количествах удобнее оказалось проводить в растворе GnHCl в присутствии глутатиона. В избранных условиях (pH 8,5; 20°С) практически весь белок за короткое время переходит в ренатурированную форму. Одновременно достигалась значительная очистка чИЛ-3 за счет осаждения примесных белков (рис. 34). Полученный препарат концентрировали с помощью ультрафильтрации и окончательно очищали с помощью ОФ ВЭЖХ (рис. 35). Чистота чШ1-3, по данным интегрирования хроматографических пиков составила >98%. Представленный метод выделения позволяет в течение короткого времени получать в препаративном количестве (2 г белка из 100 г влажных клеток) биологически активный рекомбинантный чИЛ-3 при использовании лишь одной хроматографической стадии. В целом, разработанные нами методические подходы, делают легко доступным получение препаративных количеств рекомбинантного белка и, вероятно, могут быть использованы для получения различных рекомбинантных белков из телец включения клеток штаммов-продуцентов Е. coli.

Представленные данные позволяют заключить, что обе использованные нами системы биосинтеза чИЛ-3 - индуцируемый синтез в продуценте E.coli TGI с плазмидой pTOTE2IL3 и конститутивный синтез в продуценте E.coli НВ101 с плазмидой pTE2IL3 - могут быть успешно использованы для получения рекомбинантного белка. При этом клеточная масса в первом случае (Е. coli TGI) была больше, чем во втором, и суммарное количество чИЛ-3, синтезируемого при этом в одинаковом объеме культуры, было выше. Однако во втором случае (Е. coli НВ101) оказалось, что чИЛ-3

3* Л *Аа

f -2 ,J

43

30

20,1

- ,

кцетонатрил> %

JO 75 20 25 Время удерясибания,т»

Рис. 34. Электрофорез в ПААГ препаратов чИЛ-3 на различных стадиях очистки. I -тельца включения чИЛ-3, 2 - препарат чИЛ-3 после диализа, 3 - элюат с Кис1еск11 300-7С4.

Рис. 35. Препаративное разделение чИЛ-3 на колонке с Кис1еоз11 300-7С4. Скорость потока 5 мл/мин.

образует тельца включения с меньшим содержанием сопутствующих примесей, что существенно упрощает его дальнейшую очистку.

Экспрессия синтетического гена нитерленкина-4 человека в клетках Е. coli. Получение биологически активного белка.

Для создания штамма-продуцента рекомбинантного чИЛ-4 использовали ген белка, полученный ранее путем химико-ферментативного синтеза с учетом наиболее часто используемых в Е. coli кодонов (Ажаев А. В. и др., 1990). Настоящая работа посвящена экспрессии этого гена в клетках Е. coli.

В качестве экспрессионного вектора была использована коммерческая плазмида рКК223-3 (Pharmacia). Она содержит сильный регулируемый tac-промотор (Ptac), участок связывания с рибосомами гена lacZ (SD-область), полилинкер EcoRI-Hindni плазмиды pUC18, а также сильный терминатор транскрипции гена ггпВ (ггпВ Т1Т2). Фрагмент EcoRI-Hindin, содержащий ген чИЛ-4, клонировали в полилинкерный участок рКК233-3 по соответствующим сайтам и получили плазмиду pKKhIL4-12 (рис. 36) (Батчикова и др., 1992). Этой плазмидой трансформировали клетки Е. coli TGI и рекомбинантный штамм (TGl/pKKhIL4) выращивали в присутствии индуктора (IPTG). Целевой белок в этих клетках практически не нарабатывается (рис. 37), по-видимому, из-за низкой эффективности процесса трансляции.

/ а Puul *

Рис. 36. Плазмвда рККЫЬ4-12, в которой клонирован ген чИЛ-4. Указаны сайты рестриктаз, положение промотора Рцс, терминаторов гтпВ Т] и Ь и генов резистентности к антибиотикам.

ti

1 . г з ч

Рис. 37. Электрофорез лизатов рекомбинантных штаммов клеток E.coli TGI, несущих варианты плазмиды pKKhIL4. 1 - pKKhIL4-12, 2 - pKKhIL4-10, 3 - pKKhIL4-9, 4 - контроль-штамм TGI с плазмидой рКК223-3.

torn

Puu.1L

Одним из факторов, влияющих на эффективность трансляции, является расстояние между RBS (сайт связывания рибосом) и стартовым кодоном ATG (Sato N. et al., 1989). Изменение этого расстояния может резко увеличить уровень экспрессии гена. Исходя из плазмиды pKKhIL4-12, где стартовый кодон ATG удален otRBS на 12 п.о., мы сконструировали плазмиды pKKhIL4-10 и pKKhIL4-9, в которых расстояние между ATG и RBS составляет 10 и 9 п.о., соответственно. Нуклеотидные последовательности участков трех плазмид, включающие BBS и начало структурного гена, приведены на рис. 38. Ппазмида pKKhIL4-10 получена путем расщепления pKKhIL4-12 ферментами EcoRl и SphI и лигирования вектора с октануклеотидом

pKKML4-12

EcoRI SphI PstI

AGGAAACA |GAATT0 |GCATGC| ATAAATGCGACATCACC jCTGCAGl

RBS

pKKhIL4-10

EcoRI PstI

AGGAAACA |GAATT0 ATGCATAAATGCGACATCACC |CTGCAG| RBS

pKKhIL4-9

Pst I

AGGAAACAGAATrATGCATAAATGCGACATCACC |CTGCAG| RBS

Рис. 38. Фрагменты нуклеотидных последовательностей плазмид рККЫЬ4-12, рККЫЬ4-10 и рККЫЬ4-9, включающие в себя область между ИВБ и стартовым кодоном АТв и начало структурного гена. Указано положение сайтов рестриктаз.

(5')AATTCATG. Для конструирования плазмиды pKKhIL4-9 исходную pKKhIL-12 обрабатывали рестриктазами EcoRI и Pstl и вектор лигировали с синтетическими олигокуклеотидами (5')AATTATGCATAAATGCG-ACATCACCCTGCA и (5')GGGTGATGTCGCATTTATGCAT. Полученными плазмидами трансформировали клетки Е. coli TGI и рекомбинантные штаммы выращивали в условиях индукции tac-промотора.

Уровень экспрессии чИЛ-4 в трех рекомбинантных штаммах и молекулярную массу чИЛ-4 оценивали методом ДСН-электрофореза тотальных клеточных белков, используя в качестве контроля клетки TG1, трансформированные плазмидой рКК223-3. Как видно на рис. 37, в клетках, содержащих плазмиды pKKhIL4-10 и pKKhIL4-9, нарабатывается полипептид с молекулярной массой -15 кДа, отсутствующий в клетках, несущих плазмиды рКК223-3 и pKKiiIL4-12. Количество этого полипептида увеличивается с уменьшением расстояния между RBS и стартовым кодоном ATG и достигает максимума в клетках, содержащих плазмиду pKKhIL4-9. Молекулярная масса этого полипеггтида соответствует теоретическому для чИЛ-4 (14,8 кДа).

Очистка чИЛ-4 из клеток штамма-продуцена TGl/pKKhEL4-9

Тельца включения получали и очищали с помощью методических приемов разработанных для выделения чИЛ-3. Очистка телец включения сопровождалась минимальными потерями целевого белка и позволила получить чИЛ-4 в достаточно чистом виде еще в составе телец включения (рис. 39, 2). Солюбилизация телец

включения чИЛ-4 в 5 М GnHCl позволила полностью растворить чИЛ-4 и в дальнейшем вести очистку белка с одновременной его ренатурацией. Препарат солюбилизированного чИЛ-4 разбавляли до конечной концентрации GnHCl 1 М и инкубировали раствор 1,5 ч. В процессе инкубации значительная часть остаточных балластных белков выпадала в осадок, который удаляли центрифугированием; при этом практически весь чИЛ-4 находился в супернатанте (рис. 39, 3, 4). Для дальнейшей очистки в супернатант добавляли ацетонитрил до конечной концентрации 15% и

хроматографировали препарат на колонке с фенил-сефарозой. чИЛ-4 не удерживался сорбентом, тогда как значительная часть примесей

1 г з' ч 5 ё 7

Рис. 39. Электрофорез в ПААГ препаратов чИЛ-4 на различных стадиях, очистки. 1 -клеточный лизат, 2 - чИЛ-4 из телец включения, 3 - экстракт 5М ОгНС!, 4 -осадок после инкубации препарата в 1М СтНС1, 5 - элюат с фенил-сефарозы, 6 -препарат после диализа, 7 - элюат с СМ-Тоуореаг].

А цегпонитрил,

"280 ОМ

aoi

0,02

0,01

/

2 / /

UJ

UiJ

70

35

W

35

О

0,1 1 10 Концентрация чИЛ-4, нг/мл

Рис. 41. Активация пролиферации Т-клеток человека чИЛ-4. Каждая точка представляет усредненный результат для четырех параллельных культур.

оставалась на колонке (рис. 39, 5). Диализ проскока с колонки против фосфатного буфера использовали в качестве стадии формирования внутримолекулярных дисульфидных связей и ренатурации белка (рис. 39, 6). После завершения диализа препарат был полностью ренатурирован, что было подтверждено с помощью хроматографических критериев (рис. 40) и данных о биологической активности препарата в тесте на активацию пролиферации Т-клеток (рис. 41). С помощью метода Эллмана в препарате чИЛ-4 после диализа свободные тиольные группы не обнаруживались. Таким образом, при постепенном удалении денатурирующего агента происходит автоокисление SH-rpynn с образованием внутримолекулярных дисульфидных связей и формированием нативной конформаци чИЛ-4. После заключительной стадии очистки - ионообменной хроматографии (CM-Toyopearl) и ОФ ВЭЖХ (Nucleosil 300-5С) (рис. 39, 7), чистота полученного чИЛ-4 составляла >99%. По данным аминокислотного секвенирования, полученный чИЛ-4 имеет N-концевую последовательность, соответствующую последовательности ИЛ-4 человека с дополнительным Met. Представленный метод выделения позволяет получить до 2 мг чИЛ-4 из 1 г влажных клеток.

5 10 15 го 25 Время удерживаниягмт

Рис. 40. Разделение чИЛ-4 на колонке с Кис1соз11 300-5С. а - препарат ренатурированного (1) и

денатурированного (2) чШ1-4; б - препарат после диализа.

а

1

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. С помощью разработанных эффективных модифицированных методов выделения получены ПКП и ее субстрат синапсин I. Изучены физико-химические свойства белков, субстратная специфичность ПКП, а также регуляторное влияние автофосфорилирования, фосфолипидов и жирных кислот на активность фермента.

2. Впервые показано наличие в структуре кальмодулинзависимых ферментов (ПКП, киназа фосфорилазы и фосфодиэсгераза сАМР) и синапсина I гомологичных кальмодулинсвязывающих участков, отражающих структурно-функциональную консервативность кальмодулинзависимых регуляторных механизмов.

3. Впервые продемонстрировано регуляторное влияние ПКП на процесс гликолиза, посредством активации ГАФД.

4. Обнаружена способность тубулина к связыванию с синапсином I и продемонстрировано регуляторное действие фосфорилирования различных сайтов синапсина I в отношении аффинности его взаимодействия с тубулином.

5. Исходя из полученных данных сформулирована гипотеза о ключевой роли фосфорилирования синапсина I в регуляции нейросекреции, наглядно иллюстрирующая чрезвычайную сложность избирательного проведения однонаправленного регуяяторного сигнала на стадии химической модификации субстрата активированными ферментными системами.

6. Путем химического синтеза получены системы направленного действия (СНД), включающие химиопрепараты (фталоцианины, хлорины, антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды) и векторные белки (чЭФР, чЭФРФР и чАФП), проявляющие цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека, превышающую активность соответствующих химиопрепаратов.

7. Показано преимущественное накопление антрациклиновых антибиотиков в основных мишенях их цитотоксяческого действия - ядрах опухолевых клеток - при использовании СНДэфр (ДР) и (КМ). Обнаружено, что при поступлении антрациклинов в опухолевые клетки в составе СНД уровень их содержания в клетках и ядрах, а также распределение между ядром и цитоплазмой практически не зависят от чувствительности клеток к антибиотикам. Динамика и уровень накопления свободных антрациклинов определяется уровнем резистентности опухолевых клеток.

8. Продемонстрировано значительное снижение резистентности опухолевых клеток к доксорубицину при использовании СНДэфр (ДР) и СНДэфрфр (ДР).

9. Показано, что при поступлении антрациклинов в клетки MCF-7Wt и MCF-7AdrR в составе систем направленного действия уровень их внутриклеточной деградации заметно снижается.

10. В экспериментах in vivo на мышах с привитыми солидными опухолями меланомы В16 продемонстрировано, что терапевтическое применение систем направленного действия, включающих фталоцианины, антрациклины и растительные алкалоиды, приводит к значительному ингибированию опухолевого роста и увеличению

продолжительности жизни животных. Применение свободных препаратов в тех же дозах практически не оказывает влияния на эти параметры.

11. Доказана возможность практического использования рецепторопосредованного эндоцитоза в качестве эффективного механизма селективного концентрирования и транспорта в клетку модуляторов клеточной активности и цитотоксических веществ, осуществляемого с помощью чЭФР, чЭФРФР и чАФП.

12. Для получения препаративных количеств рекомбшшггных векторных белков сконструированы плазмиды E.coli, позволяющие осуществить эффективную экспрессию синтетических генов ЭФР, ИЛ-3 и ИЛ-4 человека в условиях конститутивного и индуцированного биосинтеза белка.

13. На основании сравнительного изучения уровня синтеза рекомбинантного белка в продуцентах на основе различных штаммов E.coli, содержащих ряд экспрессионных плазмвд, несущих гены ЭФР, ИЛ-3 и ИЛ-4, выработано оптимальное сочетание генно-инженерной конструкции плазмиды и несущего ее штамма-продуцента. Получены штаммы-продуценты E.coli JM105/pBT-(hEGF)2 (чЭФР), HB101/pTE2IL3 и TGl/pTOTE2IL3 (чИЛ-3), TGl/pKKhIL4-9 (чИЛ-4), обеспечивающие высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков.

14. Разработаны эффективные методы выделения и ренатурации чЭФР, чИЛ-3, чИЛ-4, позволяющие получать рекомбинантные белки человека в препаративных количествах для использования в качестве компонентов терапевтических систем направленного действия.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Северин С.Е. (мл.), Луценко C.B. Регуляция калмодулин-зависимых ферментов бактериальным Са2*-независимым активатором. Симпозиум "Циклические нуклеогвды и система регуляции ферментативных реакций", Рязань, 1985, с. 77.

2. Свешникова Е.В., Бобрускин И.Д, Луценко C.B. Роль фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов в регуляции действия гормонов. Симпозиум "Химия и биохимия пептидно-белковых гормонов", Суздаль, 1985, с. 26-27.

3. Луценко C.B. Выделение и изучение некоторых свойств Са2+, халмодулинзависимой протеинкиназы П из мозга крысы. Симпозиум "Фундаментальные достижения нейрохимии-медицине", Горький, 1987, с. 107.

4. Алахов В.Ю., Луценко C.B., Быкова Е.В. Выделение и изучение физико-химических свойств синапсина I из мозга человека. Симпозиум "Фундаментальные достижения нейрохимии - медицине", Горький, 1987, с. 164.

5. Луценко C.B., Северин Е.С. Ингибированне активности Са2+/калмодулин-зависимой протеинкиназы II фосфолипидами и жирными кислотами. Симпозиум по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987, с. 136.

6. Алахов В.Ю., Клинский Е.Ю., Луценко C.B. Исследование регуляции калмодулинзависимой протеинкиназы II с помощью моноклональных антител к калмодулинсвязывакмцему центру Са2\ АТФазы. VU симпозиум "Химия белков и пептидов", Таллин, 1987, с. 92.

7. Луценко C.B., Быкова Е.В., Москвитина Е.Л., Красовская О.Э. Выделение синапсина I из мозга человека. VI симпозиум "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций", Петрозаводск, 1988, с. 79.

8. Луценко С В., Товмасян Е.К., Северин С.Е. (мл.), Швец В.И. Синапсин I из мозга человека - субстрат Са2+, фосфолипид-зависимой протеинкиназы. V Советско-Швейцарский симпозиум «Биологические мембраны: структура и функции», Рига, 1988, с. 90.

9. Ashmarina L.I., Lutsenko S.V., Severin S.E. (jr), Muronetz V. I., Nagradova N. K. Phosphorylation of glyceraldehyde-3-phosphat dehydrogenase by Ca2+/calmoduIin-dependent protein kinase II. FEBS Letters, 1998, v. 231(2), p.413-416.

10. Alakhov V.U., Modyanov N.N., Shakhparonov M.I., Zvaritch E.I., Lutsenko S.V. Elucidation of conservative element of calmodulin-dependent enzymes with the use of monoclonal antibodies. Biotecnology and Applied Biochemistry, 1988,10, p. 1-7.

11. Луценко C.B., Северин С.Е. (мл). Выделение и изучение свойств Са2+/калмодулинзависимой протеинкиназы II из мозга крысы. Биологические мембраны, 1989, т. 6(3), с. 267-274.

12. Луценко С.В., Северин С.Е. (мл). Синапсин I из мозга морской свинки. Выделение и свойства. Биологические мембраны, 1989, т. 6(4), с. 349-355.

13. Луценко С.В., Северин С.Е. (мл). Рефляция активности протеинкиназы II жирными кислотами и фосфолипидами. Биологические мембраны, 1989, г. 6(7), с. 694-698.

14. Луценко С. В., Северин С. Е. (мл). Связывание синапсина I с калмодулином и тубулином. Биологические мембраны, 1989, т. 6(7), с. 689-693.

15. Severin S.E. (jr)., Moskvitina E.L., Bykova E.V., Lutsenko S.V., Shvetz V.l. Synapsin I from human brain. Phosphorylation by Ca2+, phospholipid-dependent protein kinase. FEBS Letters, 1989, v. 258(2), p. 223-226.

16. Северин С.Е. (мл)., Москвитина ЕЛ, Быкова Е.В., Луценко С.В., Швец В.И. Синапсин I из мозга человека: фосфорилирование прогеннкиназой С. Биологические мембраны, 1990, т. 7(7), с. 718-723.

17. Гуревич А.И., Скалцова Н.В., Луценко С.В., Смирнов В.А., Куркин A.M., Ажаев A.B. Химико-ферментативный синтез усилителя трансляции гена 10 фага Т7 и функция элементов его структуры. Биоорганическая химия, 1991, т. 17(5), с. 647-652.

18. Луценко С.В., Гуревич А.И., Каневский В.Ю., Смирнов В.А., Назимов И.В., Ажикина Т.Л., Чернов И.П., Ростапшов В.М., Сонина Н.В., Ажаев A.B. Выделение рекомбинантного интерлейкина - 3, продуцируемого в Е. coli. Биоорганическая химия,

1991, т. 17(12), с. 1649-1654.

19. Луценко С.В., Гуревич А.И., Птицын Л.Р., Рязанова Л.А., Смирнов В.А., Ажаев A.B. Системы экспрессии в Е. coli рекомбинантного интерлейкина. Биоорганическая химия,

1992, т. 18(3), с. 391-397.

20. Батчикова Н.Б., Кулагина М.А., Луценко С.В., Смирнов В.А., Каневский В.Ю., Рязанова Л.А., Назимов И.В., Сонина Н.В., СинягинаЕ.А., Ажаев A.B. Экспрессия синтетического гена интерлейкина - 4 человека в клетках Е. coli. Получение биологически активного белка. Биоорганическая химия, 1992, т. 18(5), 660-669.

21. Батчикова Н.В., Альтман И.Б., Луценко С.В., Смирнов В.А., Назимов И.В., Эшкинд Л.Г., Синягина Е.А., Ажаев A.B. Секреция в периплазму рекомбинантного эпидермального фактора роста человека в клетках Escherichia coli. Биоорганическая химия, 1992, т. 18(6), 766-776.

22. Skryabin K.G., Kirpichnikov М.Р., Severin S.E., Lutsenko S.V., Mihailova L.I., Gumanov S.G. Development of cytotoxic conjugates of recombinant human epidermal growth factor with doxorubicin and phtalocyatiin and studies of their influence on malignant cells. Bayev memorial conference, Cobiotec-RAN, Moscow, Russia, 1996, p. 101.

23. Efdarov M.A., Karpychev I.V., Lutsenko S.V., Posypanova G.A., Gumanov S.G. Expression and secretion of epidermal growth factor in yeast. Bayev memorial conference, Cobiotec-RAN, Moscow, Russia, 1996, p. 101.

24. Lutsenko S.V., Posypanova G.A., Gumanov S.G., Severin S.E., Skryabin K.G., Kirpitchnikov M.P., Lukianetz E.A. The antitumoral effect of EGF-phtalocyanin conjugates in vitro. The XXIV Meeting of the ISOBM, San Diego, Calif. USA 1996, p. 189.

25. Луценко C.B., Туманов С.Г., Гукасова HB., Родина A.B, Северин С.Е. Использование эпидермального фактора роста для направленной доставки доксорубицина к клеткам -

мишеням. Второй съезд биохимического общества РАН, Москва, Пущино, Россия, 1997, с. 450.

26. Severin S.E., Moskaleva E.Yu., Katukov V.Yu., Belousova Yu.V., Rodina A.V., Lutsenko S.V., Gumanov S.G., Shmyiev I.I., Severin E.S. Efficiency of doxorubicin targeting in the form of conjugates with alpha-fetoprotein, epidermal growth factor and growth hormone. The XXVth Anniversary Meeting of the ISOBM, Montreux. Switzerland, 1997, p. 45.

27. Lutsenko S.V., Gumanov S.G., Gukasova N.V., Rodina A.V., Katukov V.Yu., Korzhenevsky

D.A., Severin S.E. EGF: a vector for doxorubicin and vincristine delivery to target cells. The XXVth Anniversary Meeting of the ISOBM, Montreux. Switzerland, 1997, p. 63.

28. Lutsenko S.V., Savitsky A.A., Gelperina S.E., Gumanov S.G., Korzhenevsky D.A.. Katukov V.Yu., Posypanova G.A., Lebedeva V.S., Mironov A.F., Severin S.E. Study of possibility of targeted delivery of photofrine and chlorine e6 to tumor cells. The XXVth Anniversary Meeting of the ISOBM, Montreux. Switzerland, 1997, p. 126.

29. Lutsenko S.V., Finakova G.V., Feldman N.B., Gumanov S.G., Korzhenevsky D.A., Gukasova N.V., Severin S.E. The increase in selectivity of antitumor action of vinblastine and vincristine by targeted delivery of their EGF-conjugates to tumor cells. International Institute of anticancer research. International Conferences New Anticancer Agents, Athens, Greece, 1997, p. 56.

30. Луцснко C.B., Гукасова H.B., Посыпанова Г.А., Туманов С.Г., Фельдман Н.Б., Москалева

E.Ю., Северин Е.С., Северин С.Е., Скрябин К.Г. ЭФР как вектор для направленной доставки доксорубицина (ДР) к клеткам опухолевых линий, резистентных к ДР. VIII конференция ((Новые направления биотехнологии» РАН, Москва, Россия, 1997, с. 81.

31. Луценко С.В., Туманов С.Г., Фельдман Н.Б., Посыпанова Г.А., Москалева Е.Ю., Северин С.Е., Северин Е.С., Скрябин К.Г. Накопление и внутриклеточная локализация доксорубицина (ДР) при его направленном транспорте к опухолевым клеткам с помощью эпидермального фактора роста (ЭФР). VIII конференция «Новые направления биотехнологии» РАН, Москва, Россия, 1997, с. 82.

32. Lutsenko S.V., Gumanov S.G., Posypanova G. A., Severin S.E. The epidermal growth factor (EGF) as a vector for targeted delivery of citotoxic drugs to target tumor cells. The XXVI Meeting of ISOBM, Umea, Sweden, 1998, p. 80.

33. Lutsenko S.V., Gumanov S.G., Moskaljova E.Yu., Belushkina N.N., Eldarov M.A., Severin S.E., Skryabin K.G., Kirpichnikov M. P. Epidermal growth factor conjugates with doxorubicine and vincristine produce toxic effect on cell cultures resistant to antibiotics. 10fe NCA-EORTC symposium on new drugs in cancer therapy, Amsterdam, Netherland, 1998, p. 157.

34. Lutsenko S.V., Gukasova N.V., Gumanov S.G., Posypanova G.A., Korzhenevsky D.A., Feldman N.B., Severin S.E. Study of the cytotoxic activity of the epidermal growth factor-doxorubicin conjugate against human tumor cell cultures. 15й meeting European association for cancer research (EACRXV), Stockholm, Sweden, I998,p. 127.

35. Северин C.E., Савельева Г.М., Туманов С.Г., Луценко С.В., Москалева Е.Ю., Родина А.В., Клименко П.А., Шмырев И.И., Попова О.Н., Зыкова И.Е., Северин Е.С. Исследование противоопухолевой активности конъюгатов доксорубицина с альфа-фетопротеином и с эпидермальным фактором роста в отношении клеток карциномы яичника человека in vitro. Вестник акушерства и гинекологии, 1998, №2, с. 15-18.

36. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Gukasova N.V., Posypanova G.A., Gumanov S.G., Skryabin K.G., Severin S.E. Toxicity of epidermal growth factor conjugate with doxorubicin against antibiotics-resistant tumor cell cultures. Fourth european congress of pharmaceutical sciences, Milan, Italy, 1998, p. 56.

37. Луценко C.B., Финакова Г.В., Фельдман Н.Б., Туманов С.Г., Родина А.В., Посыпанова Г.А., Гукасова НВ., Корженевский Д.А., Катуков В.Ю., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П Рецепторопосредованпый токсический эффект конъюгата эпидермального фактора роста с доксорубицином в отношении опухолевых клеток. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1998, №1, с. 21-25.

38. Луценко С.В., Фельдман Н.Б., Финакова Г.В., Туманов С.Г., Гукасова Н.В., Корженевский Д.А., Бобрускин А.И., Геяьперина С.Э., Посыпанова Г.А., Катуков В.Ю., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П., Калия О.Л., Ворожцов Т.Н. Направленная доставка к клеткам - мишеням и цитотоксическая противоопухолевая активность окта-4,5-

карбоксифталоцианина (терафтал). Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1998, № 1, с. 34-37.

39. Родина А.В., Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А., Шиырев И.И., Туманов С.Г., Луценко С.В., Катуков В.Ю., Северин Е.С. Сравнение цитотоксической активности конъюгатов доксорубицина с алъфа-фетопротеином и эпвдермальным фактором роста в отношении чувствительных и резистентных к доксорубицину клеточных линий. Вопросы биологической, медицинской и фармацевгическоой химии, 1998, № 2, с. 20-25.

40. Луценко С.В., Фельдман Н.Б., Посыпанова Г.А., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Лукьянец Е.А., Ворожцов Г.Н., Северин Е.С. Изучение цитотоксической противоопухолевой активности конъюгатов фталоцианинов с эпидермальным фактором роста (ЭФР). Российский химический журнал (журнал Российского химического общества им ДИ Менделеева), 1998,т.Х1Л(5),с. 101-104.

41. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Finakova G.V., Posypanova G.A., Severin S.E., Skryabin K.G., Kirpichnikov M.P., Lukyanets E.A., Vorozhtsov G.N.. Targeting phthalocyanines to tumor cells using epidermal growth factor conjugates. Tumor biology, 1999, v. 20(4), p. 218-224.

42. Фельдман Н.Б., Луценко C.B., Финакова Г.В., Шмырев И.И., Посыпанова Г.А., Скрябин К.Г., Северин С.Е. Повышение противоопухолевой активности доксорубицина за счет его адресной доставки к клеткам-мишеням с помощью белковых векторов. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1999, N° 1, с. 44-48.

43. Луценко С.В., Фельдман Н.Б., Финакова Г.В., Посыпанова Г.А., Бобрускин А.И., Гельперина С.Э., Скрябин К.Г., Калия О.Л., Ворожцов Г.Н., Северин С.Е. Направленный транспорт ФЦ(Со) к опухолевым клеткам-мишеням с помощью алъфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1999, №1, с. 40-44.

44. Хомяков Ю.Н., Василенко И.А., Посыпанова Г.А., Луценко С.В., Сотииченко А.И., Зыкова И.Е., Северин С.Е. Прижизненная оценка современных средств доставки лекарств. Тезисы докладов VI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 1999, с. 486.

45. S.V.Lutsenko, N.V. Gukasova, S.V. Kiselev, M.E. Severina, N.B. Feldman, S.E. Severin. The cytotoxic effect of the alpha-fetoprotein- doxorubicin conjugate on human embrionic umbilical vein endothelial cells and tumor cells MCF-7. Abstracts of 274 meeting of the ISOBM, Kyoto, Japan, 1999, p. 35.

46. Хомяков Ю.Н., Василенко И.А., Посыпанова Г.А., Луценко С.В., Сотниченко А.И., Северин С.Е. Изучение рецептор-опосредованного эндоцитоза эпидермального фактора роста методами компьютерной фазовой морфометрии. Тезисы докладов II съезда биофизиков России, Москва, 1999, т. 2, с. 730-731.

47. S.M. Kiselev, N.V. Gukasova, N.B. Feldman, S.V.Lutsenko, S.E. Severin. The use of protein vector a-fetoprotein (AFP) for targeted delivery of doxorubicin (DR) to endothelial and cancerous human cells. Abstracts of the И"1 Meeting of the International Academy of Tumour Marker Oncology, Hong Kong, 2000, p. 31.

48. Туманов С.Г., Гукасова H.B., Родина A.B., Фельдман Н.Б., Луценко С.В., Северин С.Е. Цитотоксическая активность, накопление и внутриклеточное распределение доксорубицина и его конъюгата с эпидермальным фактором роста в чувствительных и резистентных к доксорубицину опухолевых клетках. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2000, в печати.

49.Фельдман Н.Б., Киселев С.М., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Луценко С.В., Северин С.Е.. Противоопухолевая активность конъюгата а-фетопротеина с доксорубицином in vitro и in vivo. Биохимия, 2000, в печати.

50. Савицкий А.А., Гукасова Н.В., Туманов С.Г., Фельдман Н.Б., Лукьянец ЕА., Миронов А.Ф., Якубовская Р.И., Луценко С.В., Северин С.Е.. Цитотоксическое действие конъюгатов хтьфа-фегопрогеина и эпидермального фактора роста с фотогемом, хлоринами и ф-галоцианинами. Биохимия, 2000, в печати.

51. Lutsenko S.V., Feldman N.B., Finakova G.V., Gukasova N.V., Petukhov S.P., Posypanova G.A., Skryabin K.G., Severin S.E. Study of antitumor activity of alpha-fetoprotein and epidermal growth factor conjugates in vitro and in vivo. Tumor Biology, 2000, in press.

52. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Северин С.Е. Получение, цитотоксическая активность и особенности накопления и локализации противоопухолевого препарата направленного действия на основе карминомшина Биомедицинские технологии, 2000, в печати.

53. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Киселев С.М., Северин С.Е. Повышение терапевтической эффективности доксорубицина при его адресном транспорте к опухоли-мишени с помощью альфа-фетопротеина. Биомедицинские технологии, 2000, в печати.

54. Луценко C.B., Киселев С.М., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Фельдман Н.Б., Северин С.Е. Эпидермальный фактор роста и его рецептор-связывающий фрагмент как векторы для направленной доставки доксорубицина в опухолевые клетки. Биомедицинские технологии, 2000, в печати.

55. Фельдман Н.Б., Киселев С.М., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Хомяков Ю.Н., Луценко C.B., Северин С.Е. Цитотоксическая и противоопухолевая активность конъюгата а-фетопротеина с доксорубицином. Тезисы докладов VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2000, в печати.

56. Туманов С.Г., Родина А.В., ФельдманН.Б., Луценко C.B., Северин С.Е. Цитотоксическая активность, накопление и внутриклеточное распределение доксорубицина и его конъюгата с эпидермальным фактором роста. Тезисы докладов VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2000, в печати.

57. Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Гукасова Н.В., Посыпанова Г.А., Киселев С.М., Северин С.Е. Использование белковых векторов для направленного транспорта доксорубицина в опухолевые клетки-мишени. Тезисы докладов VU Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2000, в печати.

58. Эльдаров М.А., Кагиянц С.М., Позмогова Г.Э., Луценко C.B., Северин Е.С., Кирпичников М.П., Скрябин К.Г. и Центр «Биоинженерия» РАН. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae - ВКМ CR- 349 D - продуцент эпидермального фактора роста человека. Заявка на выдачу патента РФ №99103153/13 (003431) от 04.06.99 г.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Луценко, Сергей Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Са2+/кальмодулин-зависимые протеинкиназы и их субстраты.

1.1.1. Кальций как вторичный мессенджер

1.1.2. Кальмодулин - универсальный клеточный модулятор 1 б

1.1.2.1. Распространение кальмодулина

1.1.2.2. Физико-химические свойства кальмодулина

1.1.2.3. Механизм действия кальмодулина

1.1.3. Са2+/кальмодулин-зависимые протеинкиназы.

1.1.4. Субстратные белки Са2+/кальмодулин-зависимых протеинкиназ.

1.1.4.1. Нейроспецифический белок синапсин I

1.1.4.2. Другие субстратные белки

1.2. Рецепторопосредованный эндоцитоз

1.2.1. Процессинг ЭФР-рецепторных комплексов

1.2.1.1. Мембранный этап процессинга ЭФР

1.2.1.2. Интернализация ЭФРРК

1.2.1.3. Внутриклеточная компартментализация ЭФРРК

1.2.1.4. Биохимический процессинг ЭФРРК

1.2.2. Создание цитотоксических систем направленного действия с использованием рецепторопосредованного эндоцитоза в качестве транспортного механизма

1.2.2.1. Преимущества и недостатки использования СНД

1.2.2.2. Ковалентное связывание

1.2.2.3. Нековалентное связывание

1.2.2.4. Критические параметры для использования СНД

1.2.2.5. Внутриклеточный транспорт ХП, ковалентно связанного с вектором

1.2.2.6. Внутриклеточный транспорт ХП, нековалентно связанного с вектором

1.2.3. Общие характеристики векторных белков

1.2.3.1. Альфа-фетопротеин

1.2.3.2. Эпидермальный фактор роста

1.2.3.2.1. Структура и физико-химические свойства ЭФР

1.2.3.2.2.Видоспецифичность ЭФР

1.3. Рекомбинантные белки

1.3.1. Векторы, используемые для экспрессии

1.3.2.Методы экспрессии

1.3.3. Методы лизиса клеток

1.3.4. Нерастворимые белки

1.3.5. Растворимые белки

1.3.6. Дополнительные проблемы, связанные с выделением рекомбинантных белков.

1.4. Цитокины

1.4.1. Терапевтический потенциал цитокинов

1.4.2. Применение ИЛ-4 при лечении онкогематологических заболеваний.

1.4.3. Локальное применение цитокинов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Выделение и изучение свойств Са2+, кальмодулинзависимой протеинкиназы II из мозга крысы

2.1.1. Выделение ПК П.

2.1.2. Определение активности ПК II.

2.1.3. Определение автофосфорилирования ПК П.

2.1.4. Влияние автофосфорилирования на активность ПК II

2.1.5. Определение молекулярной массы и радиуса Стокса ПК II.

2.1.6. Связывание 1-кальмодулина с полипептидами ПК П

2.1.7. Электрофорез препаратов ПК П

2.2. Выделение и изучение некоторых физико-химических свойств синапсина I из мозга морской свинки

2.2.1. Выделение синапсина I.

2.2.2. Электрофорез препаратов синапсина I

2.2.3. Определение молекулярной массы и радиуса Стокса синапсина I.

2.2.4. Определение базальной активности каталитической субъединицы сАМР-зависимой протеинкиназы.

2.2.5. Фосфорилирование синапсина I.

2.2.6. Определение аминокислотного состава синапсина I.

2.3. Связывание синапсина I с тубулином и кальмодулином.

2.3.1. Связывание синапсина I с liJI -меченым кальмодулином и Iмеченым тубулином на нитроцеллюлозных фильтрах.

2.3.2. Количественная характеристика связывания синапсина Ic I-меченым кальмодулином и 1251-меченым тубулином.

2.4. Получение и изучение свойств систем направленного транспорта на основе АФП и ЭФР.

2.4.1. Выделение и очистка АФП.

2.4.2. Выделение и очистка ЭФР.

2.4.3. Получение систем направленного действия (СНД), включающих химиопрепараты и векторные белки (ЭФР и АФП). 108 2.4.3 .1. СНД на основе ЭФР и АФП (СНДэфр и афп), включающие

ФЦ(А1), ФЦ(Со) и Вк.

2.4.3.2. СНДэфр и дфп, включающие Др, Км и Вб.

2.4.3.3. СНДэфр и афп, включающие XJI рб и XJI ее.

2.4.4. Культивирование клеток.

2.4.5. Определение цитотоксической активности препаратов in vitro.

2.4.5.1. ЦТА СНДэфр и афп , включающих ФЦ(А1), ФЦ(Со), ХЛ р6, ХЛ еб и свободных химиопрепаратов.

2.4.5.2. СНДэфр и афп, включающих антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды.

2.4.5.3. Оценка жизнеспособности клеток.

2.4.6. Исследование накопления и внутриклеточного распределения СНДэфр, включающих доксорубицин и карминомицин и свободных антрациклиновых антибиотиков.

2.4.7. Определение биологической активности ЭФР и ЭФРФР.

2.4.7. Противоопухолевая активность СНД in vivo.

2.4.8. Дозы препаратов и схемы их введения. 113 2.4.8.1. СНДэфр и -афп, включающие фталоцианины.

2.4.8.2. СНДэфр и афп, включающие антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды.

2.4.8.3. Контрольные животные.

2.4.9. Объем опухолей.

2.4.10. Продолжительность жизни животных.

2.5. Конструирование систем экспрессии рекомбинантного чЭФР в клетках Е. coli.

2.5.1. Получение Лй-РМ-фрагмента гена OmpF.

2.5.2. Замена дистального (по ходу трансляции) сайтаPstl.

2.5.3. Конструирование плазмиды pKKD.

2.5.4. Конструирование плазмиды pBT-hEGF.

2.5.5. Конструирование плазмиды pBTN-hEGF.

2.5.6. Конструирование серии плазмид pBT-(hEGF)n.

2.5.7. Выделение чЭФР.

2.5.8. Определение аминокислотной последовательности чЭФР.

2.5.9. Определение биологической активности чЭФР.

2.6. Химико-ферментативный синтез усилителя трансляции гена фага Т

2.6.1. Синтез олигонуклеотидов.

2.6.2. Анализ белков.

2.7. Создание систем экспрессии рекомбинантного интерлейкина-3 в клетках Е. coli.

2.7.1. Электрофорез препаратов чИЛ-3.

2.7.2. Выделение чИЛ-3 из продуцентов E.coli с плазмидами pTE2IL3 и pTOTE2IL3.

2.7.3. Выделение рекомбинантного чИЛ-3 из продуцента Е. coli НВ с плазмидой pTE2IL3.

2.7.3.1. Выделение чИЛ-3.

2.7.3.2. Восстановление S-S-связей в молекуле чИЛ-3 и чИЛ-4.

2.7.3.3. Определение N-концевой аминокислотной последовательности чИЛ-3.

2.8. Создание систем экспрессии рекомбинантного чИЛ-4 в клетках Е. coli.

2.8.1. Выделение плазмидной ДНК.

2.8.2. Электрофорез ДНК.

2.8.3. Элюция ДНК из легкоплавкой агарозы.

2.8.4. Синтез олигонуклеотидов.

2.8.5. Выделение рекомбинантного чИЛ-4.

2.8.5.1. Лизис Е. coli для анализа клеточных белков.

2.8.5.2. Бактериальная культура.

2.8.5.3. Выделение чИЛ-4.

2.8.5.4. Определение биологической активности чИЛ-3 и -4.

Стимуляция пролиферации активированных Т-лимфоцитов человека.

2.8.5.6. Электрофорез препаратов чИЛ-3 и -4.

2.8.5.7. Определение аминокислотной последовательности чИЛ-4 128 2.9. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 13О 3.1. Роль ПК II и синапсина I в регуляции клеточной активности

3.1.1. Выделение и изучение некоторых физико-химических и кинетических свойств ПК II из мозга крысы.

3.1.2. Пути регуляции активности ПКП

3.1.2.1. Исследование кальмодулинсвязывающих свойств ПК П

3.1.2.2. Роль автофосфорилирования в регуляции активности ПК II

3.1.2.3. Регуляция активности ПК II жирными кислотами и фосфолипидами

3.1.2.4. Роль ПК II в энзиматической регуляции клеточной активности

3.1.3. Выделение и изучение некоторых физико-химических свойств синапсинаI

3.1.4. Фосфорилирование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы ПК

3.1.5. Связывание синапсина I с тубулином и кальмодулином.

3.1.6. Фосфорилирование синапсина I протеинкиназой С

3.1.7. Регуляция фосфорилирования синапсина!ПК С кислыми фосфолипидами

3.1.8. Ингибирование фосфорилирования синапсина I ПК С кальмодулином

3.2. Созданиехимиотерапевтических противоопухолевых систем направленного действия с использованием белковых векторов.

3.2.1. Получение систем направленного действия (СНД) на основе ЭФР (СНДэфр) и АФП (СНДафп) и химиотерапевтических противоопухолевых препаратов (ХП).

3.2.2. Цитотоксическая активность противоопухолевых СНДэфр и

СНДафп

3.2.2.1. Сравнительное исследование ЦТА свободных и входящих в состав СНД фталоцианинов и хлоринов.

3.2.2.2. ЦТА свободных и входящих в состав СНД антрациклиновых антибиотиков.

3.2.2.3. ЦТА свободных и входящих в состав СНД растительных алкалоидов.

3.2.3. Сравнительное исследование ЦТА, динамики накопления и внутриклеточного распределения свободных и входящих в состав

СНДэфр антрациклиновых антибиотиков

3.2.3.1. ЦТА свободных и входящих в состав СНДэфр антрациклинов.

3.2.3.2. Накопление свободных и входящих в состав СНДэфр антрациклинов в чувствительных и резистентных опухолевых клетках

3.2.3.3. Накопление свободных и входящих в состав СНДэфр антрациклинов в ядрах чувствительных и резистентных опухолевых клеток.

3.2.4. Использование СНД для преодоления лекарственной резистентности опухолевых клеток

3.2.5. Исследование противоопухолевой активности СНДэфр и афп, включающих фталоцианины, антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды, in vivo.

3.2.5.1. Противоопухолевая активность свободного и входящего в состав СНДэфр и афп ФЦ(Со) in vivo.

3.2.5.2. Противоопухолевая активность свободных и входящих в состав СНДэфр и афп антрациклиновых антибиотиков in vivo.

3.2.5.3. Противоопухолевая активность свободных и входящих в состав СНДэфр и афп растительных алкалоидов.

3.3. Разработка методов получения человеческих ЭФР, ИЛ 3 и 4 с использованием генно-инженерных подходов

3.3.1. Получение рекомбинантного ЭФР человека

3.3.2. Химико-ферментативный синтез усилителя трансляции гена фага Т7 и функция элементов его структуры

3.3.3. Выделение рекомбинантного интерлейкина-3, продуцируемого Е.

3.3.4. Системы экспрессии в Е. coli рекомбинантного интерлейкина-3.

3.3.5. Экспрессия синтетического гена интерлейкина-4 (чИЛ-4) человека в клетках Е. coli. Получение биологически активного белка.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание химиотерапевтических противоопухолевых систем направленного действия с использованием белковых факторов"

Одной из важнейших задач современного естествознания является поиск путей и возможностей проведения регуляторных сигналов для осуществления целенаправленного воздействия на физиологические процессы, протекающие в живой клетке. В качестве таких путей нами рассматривалась система мессенджеров, реализующая каскадное усиление внешнего сигнала и рецепторопосредованный эндоцитоз - механизм селективного концентрирования и поглощения специфических лигандов (рис. 1). Посредством согласованного действия систем мессенджеров реализуется регуляция ключевых внутриклеточных процессов. При взаимодействии первичных мессенджеров с соответствующими рецепторами, под действием сопряженных с рецептором ферментативных систем, внутриклеточный уровень вторичных мессенджеров изменяется, что приводит к запуску регуляторных ферментных каскадов, основными звеньями которых являются ферменты, модифицирующие соответствующие субстраты, что в конечном итоге приводит к определенным физиологическим реакциям. Одним из ключевых ферментов, играющих важную роль в передаче трансмембранного сигнала, но до настоящего времени недостаточно изученным, является Са2+/кальмодулинзависимая протеинкиназа II (ПКП), опосредующая регуляторное действие

Са на внутриклеточные процессы. Основным физиологическим субстратом ПКП является синапсин I - белок, ассоциированый с цитоплазматической поверхностью синаптических везикул нервных окончаний, участвующий в процессах нейросекреции и возникновении ряда заболеваний нервной системы. Изучение свойств и роли ПКП в процессах клеточной пролиферации, секреции нейротрансмиттеров, функционировании цитоскелета, гликолизе, опухолевом росте и патологических нарушениях нервной системы представляется актуальным. Разъяснение значения фосфорилирования синапсина I и взаимодействия белка с элементами цитоскелета создает основу для более детального понимания механизма нейросекреции. Исследование физиологической роли ПКП и ее субстратов позволяет не только определить место данного фермента в системе регуляции 1 1 мембранные трансмиттеры клеточные эффекторы активность клеточных процессы »ядре активация гекое

Рис. 1. Подходы к избирательности регуляции клеточного метаболизма. клеточной активности, но и расширить представления о возможности избирательной регуляции внутриклеточных процессов на уровне вторичных мессенджеров и на стадии химической модификации субстрата активированными ферментными системами.

Помимо системы мессенджеров, перспективным путем избирательного воздействия на внутриклеточные процессы является рецепторопосредованный эндоцитоз - общий механизм переноса в клетки эукариот биологически активных веществ. С использованием эндоцитоза может быть осуществлен избирательный транспорт в клетку-мишень химически связанных с физиологическими лигандами различных модуляторов клеточной активности, в том числе и лекарственных препаратов. Избирательность транспорта при этом достигается за счет способности лиганда (вектора) к высокоаффинному связыванию со специфическими рецепторами, экспрессированными только/или преимущественно на клетках-мишенях. Для практического применения векторы должны отвечать ряду требований, к числу которых относятся: доступность в препаративных количествах, стабильность, сохранение высокого сродства к рецептору после химической модификации. В полной мере этим требованиям отвечают эпидермальный фактор роста (ЭФР), аномально высокий уровень экспрессии рецепторов которого отмечается в клетках опухолей эпителиального происхождения, и онкофетальный белок альфа-фетопротеин (АФП), рецепторы которого экспрессируются практически всеми типами раковых клеток, но отсутствуют на клетках нормальных тканей. Поэтому ЭФР и АФП были использованы нами для создания систем направленного действия, предполагающих наличие специфического рецептора и ковалентно связанных векторного белка и модулятора клеточной активности. Подобные системы могут найти применение в различных областях медицины для изучения возможностей направленного влияния на физиологические процессы и повышения эффективности действия известных химиотерапевтических средств при лечении целого ряда заболеваний, включая онкологические. В настоящее время фундаментальной проблемой практической онкологии является высокая токсичность и низкая избирательность действия противоопухолевых препаратов известных классов. Применение систем направленного транспорта с использованием моноклональных антител в качестве векторов не оправдало надежд на их высокую терапевтическую активность. Создание противоопухолевых систем направленного действия с использованием физиологических векторов (АФП и ЭФР) для избирательного транспорта широко применяемых в клинической практике химиопрепаратов - порфиринов, антрациклиновых антибиотиков и растительных алкалоидов - в опухолевые клетки призвано послужить решению задачи повышен™ терапевтической эффективности химиопрепаратов за счет снижения токсичности и увеличения избирательности их действия. Сравнительное исследование в модельных экспериментах in vitro и in vivo уровня противоопухолевой активности полученных систем направленного действия позволяет оценить возможности их применения в области практической онкологии. Изучение динамики накопления и внутриклеточного распределения химиопрепаратов, доставляемых в клетку в составе систем направленного действия, имеет существенное теоретическое и прикладное значение, поскольку позволяет прояснить механизм их цитотоксического действия и наметить пути повышения его эффективности.

В настоящее время масштабное исследование биологических функций и возможностей применения в медицине целого ряда белков, особенно факторов роста и цитокинов, ограничено из-за их труднодоступности в препаративных количествах из природных источников. В связи с этим представляется

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Луценко, Сергей Викторович

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. С помощью разработанных эффективных модифицированных методов выделения получены ПКП и ее субстрат синапсин I. Изучены физико-химические свойства белков, субстратная специфичность ПКП, а также регуляторное влияние автофосфорилирования, фосфолипидов и жирных кислот на активность фермента.

2. Впервые показано наличие в структуре кальмодулинзависимых ферментов (ПКП, киназа фосфорилазы и фосфодиэстераза сАМР) и синапсина I гомологичных кальмодулинсвязывающих участков, отражающих структурно-функциональную консервативность кальмодулинзависимых регуляторных механизмов.

3. Впервые продемонстрировано регуляторное влияние ПКП на процесс гликолиза, посредством активации ГАФД.

4. Обнаружена способность тубулина к связыванию с синапсином I и продемонстрировано регуляторное действие фосфорилирования различных сайтов синапсина I в отношении аффинности его взаимодействия с тубулином.

5. Исходя из полученных данных сформулирована гипотеза о ключевой роли фосфорилирования синапсина I в регуляции нейросекреции, наглядно иллюстрирующая чрезвычайную сложность избирательного проведения однонаправленного регуляторного сигнала на стадии химической модификации субстрата активированными ферментными системами.

6. Путем химического синтеза получены системы направленного действия (СНД), включающие химиопрепараты (фталоцианины, хлорины, антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды) и векторные белки (чЭФР, чЭФРФР и чАФП), проявляющие цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека, превышающую активность соответствующих химиопрепаратов.

7. Показано преимущественное накопление антрациклиновых антибиотиков в основных мишенях их цитотоксического действия - ядрах опухолевых клеток - при использовании СНДэфр (ДР) и (КМ). Обнаружено, что при поступлении антрациклинов в опухолевые клетки в составе СНД уровень их содержания в клетках и ядрах, а также распределение между ядром и цитоплазмой практически не зависят от чувствительности клеток к антибиотикам. Динамика и уровень накопления свободных антрациклинов определяется уровнем резистентности опухолевых клеток.

8. Продемонстрировано значительное снижение резистентности опухолевых клеток к доксорубицину при использовании СНДэфр (ДР) и СНДэфрфр (ДР).

9. Показано, что при поступлении антрациклинов в клетки MCF-7wt и MCF-7AdrR в составе систем направленного действия уровень их внутриклеточной деградации заметно снижается.

10. В экспериментах in vivo на мышах с привитыми солидными опухолями меланомы В16 продемонстрировано, что терапевтическое применение систем направленного действия, включающих фталоцианины, антрациклины и растительные алкалоиды, приводит к значительному ингибированию опухолевого роста и увеличению продолжительности жизни животных. Применение свободных препаратов в тех же дозах практически не оказывает влияния на эти параметры.

11. Доказана возможность практического использования рецепторопосредованного эндоцитоза в качестве эффективного механизма селективного концентрирования и транспорта в клетку модуляторов клеточной активности и цитотоксических веществ, осуществляемого с помощью чЭФР, чЭФРФР и чАФП.

12. Для получения препаративных количеств рекомбинантных векторных белков сконструированы плазмиды E.coli, позволяющие осуществить эффективную экспрессию синтетических генов ЭФР, ИЛ-3 и ИЛ-4 человека в условиях конститутивного и индуцированного биосинтеза белка.

13. На основании сравнительного изучения уровня синтеза рекомбинантного белка в продуцентах на основе различных штаммов E.coli, содержащих ряд экспрессионных плазмид, несущих гены ЭФР, ИЛ-3 и ИЛ-4, выработано оптимальное сочетание генно-инженерной конструкции плазмиды и несущего ее штамма-продуцента. Получены штаммы-продуценты E.coli JM105/pBT-(hEGF)2 (чЭФР), HB101/pTE2IL3 и TGl/pTOTE2IL3 (чИЛ-3), TGl/pKKhIL4-9 (чИЛ-4), обеспечивающие высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Луценко, Сергей Викторович, Москва

1. Abelev G.I., Perova S.D., Khratkova N.I., Postnikova Z.A., Irlin I.S. Production of embrional alpha-globulin by transplantable mouse hepatomas (1963). Transplantation, 1, 174-180.

2. Aboud-Pirak E., Hurwitz E., Bellot F., Schlessinger J., and Sela M. Inhibition of human tumor growth in nude mice by a conjugate doxorubicin with monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (1989). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3778.

3. Adelstein R.S. Calmodulin and the regulation of the actin myosin interaction in smooth muscle and non-muscle cells (1982). Cell, 30, 349-350.

4. Adelstein R.S., Sellers J.R, Conti M.A., Pato M.D., De Lanerolle P: Regulation of smooth muscle contractile proteins by calmodulin and cAMP (1982). Fed. Proc., 41, 2873-2878.

5. Ahmad Z., De Paoli-Roach A. A., Roach P.J. Purification and characterization of a rabbit liver calmodulin-dependent protein kinase able to phosphorylate glycogen syntase (1982). J. Biol. Chem., 25, 8348-8355.

6. Akashi K. et al. EL-4 supresses the spontaneous growth of chronic myelomonocytic leukemia cells (1991). J. Clin. Invest., 88, 223.

7. Alderson P.F., Sze P.Y. Purification and characterization of a soluble cyclic nucleotide-independent Ca/calmodulin-sensitive protein kinase from rat brain (1966). J. Neurochem., 46(2), 594-603.

8. Allen G., Paynter C.A., Winther M.D. Production of epidermal growth factor in Escherichia coli (1985). J. Cell Sci. Suppl., 3, 29-38.

9. Allen T.M. Long-circulating (sterically stabilized) liposomes for targeted drug delivery (1994). TiPS, 4, 15, 215.

10. Amann E., Brosius J., Ptashne M. Vectors bearing a hybrid trp-lac promoter useful for regulated expression of cloned genes in Escherichia coli (1983). Gene, 25(2-3), 167-178.

11. Anderson I.M., Cormier M.J. Calcium-dependent regulator of NAD kinase in higer plants (1978). Biochem. Blophys. Res. Commun., 84(3), 595-602.

12. Autric F., Ferraz C., Kllhoffer M.C., Cavadore J.-C., Demaille J.G. Large-scale purification and characterization of calmodulin from rat testis. Its metal ion-dependent conformers (1980). Biochim. Biophys. Acta., 631(1), 139-147.

13. Baines A.J., Bennett V. Synapsin I is a microtubule-binding protein (1986). Nature, Lond., 319, 145-147.

14. Baines A.J., Bennett V. Synapsin I is a spectrin-binding protein immunologically related to erytrocyte protein 4.1 (1985). Nature, Lond., 315, 410-413.

15. Bartlett D.C., Moroney S. Wolff D.J. Purification, characterization and substrate specificity of calmodulin-dependent myosin light chain kinase from bovine brain (1987). Biochem. J., 247, 747-750.

16. Baudier J., Cole R.D. Interactions between the microtubule-associated -proteins and S 100b regulate -phosphorylation by the Ca/calmodulin-dependent protein kinase II (1988). J. Biol. Chem., 263, 5876-5883.

17. Baudier J., Cole R.D. Phosphorylation of tau proteins to a state like that in Alzheimer's brain is catalyzed by a calcium/calmodulin-dependent kinase and modulated by phospholipids (1987). J. Biol. Chem., 262, 17577-17583.

18. Beale E.G., Dedman J.R., Means A.R. Isolation and regulation of the protein kinase inhibitor and the calcium-dependent cyclic nucleotide phosphodiesterase regulator in the Sertoli cell-enriched testis (1977). Endocrinology, 101, 1621-1634.

19. Beguinot L., Lyall R., Willingham M., Pastan I. Down regulation of the epidermal growth factor receptor in KB cells is due to receptor internalization andsubsequent degradation in lysosomas // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 2384-2388.

20. Belagaje R.M., MayneN.G., Van Frank R.M., Rutter W.J. (1984). DNA, 3, 120.

21. Beneze WL, Schmid K// Anal. Biochem. 1957, 29: 1193-1196.

22. Bennet M.K., Kennedy M.B. Deduced primary structure of the subunit of brain type II Ca/calmodulin-dependent protein kinase determined by molecular cloning (1987). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8, 1794-1798.

23. Bennett A., Rhind S.K., Lowe P.A., Hentschell C.C.G. (1984). U.K., Patent GB2140810A.

24. Bennett M.K., Erondu N.E., Kennedy M.B. Purification and characterization of a calmodulin-dependent protein kinase that is highly concentrated in brain (1983). J. Biol. Chem., 258, 12735-12744.

25. Billingsley M.L., Velletry P.S., Kuhn D.M. Levine R.A., Lovenberg W. Carboxymetilation inhibits calmodulin-dependent phosphorylation in rat brain membranes and cytosol (1983). Soc. Neurosci. Abstr., 9, 596-600.

26. Bird M.M. Endogenous phosphorylation of a microtubule-associated protein (1976). Cell Tissue Res., 168, 101-115.

27. Birnboim H.C., Doly I. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA (1979). Nucl. Acids Res., 7(6), 1513-1522.

28. Bolton A.E., Hunter W.M. The labelling of proteins to high specific radioactivities by conjugation to a 1251-containing acylating agent (1973). Biochem J., 133(3), 529-539.

29. Bomsel M. and Mostov K. Sorting of plasma membrane proteins in epithelial cells (1991). Curr. Opin. Cell Biol., 3, 647.

30. Boonstra J., de Laat S. W., Ponec M. Epidermal growth factor receptor expression related to differentiation capacity in normal and transformed keratinocytes (1985). Exp. Cell Res., 161, 421-433.

31. Bosco M.C. et al. IL-4 inhibits IL-2-induced tumoricidal activity and secretory function of human monocytes (1995). J. Immunol., 155(3), 1411.

32. Bourgiugnon L.J.W., Kerrick W.G.L. Phosphorylation-dependent regulation of Limulus myosin (1983). J. Membr. Biol., 75, 65-72.

33. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding (1976). Anal.Biochem., 72, 248-254.

34. Bretaudiere J.-P., Spillman T. (1984). In: Methods in Enzymatic Analysis IV, Bergmeyer H.U. (ed.), Verlag Chemie, GmBH, p. 75.

35. Builder S.E, Ogez J.R. (1985). US Patent No. 4511502.

36. Burgess R.R., Jendrisak J.J. A procedure for the rapid, large-scall purification of Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase involving Polymin P precipitation and DNA-cellulose chromatography (1975). Biochemistry, 14(21), 4634-4638.

37. Burgess W.H., Jemiolo D.K., Kretsinger R.M. Interaction of calcium and calmodulin in the presence of sodium dodecyl sulfate (1980). Biochirh. Biophys. Acta., 263, 257-260.

38. Burke B.E., De Lorenzo R.J. Ca and calmodulin-dependent phosphorylation of endogenous synaptic vesicle tubulin by a vesicle-bound calmodulin kinase system (1982). J. Neurochem., 38, 1205-1218.

39. Bush K., Sykes R.B. (1984). In: Methods in Enzymatic Analysis IV, Bergmeyer

40. H.U. (ed.), Verlag Chemie, GmBH, p. 280.

41. Butcher R.W., Sutherland E.W. Adenosine 3',5'-phosphate in biological materials.

42. Purification and properties of cyclic 3', 5'-nucleotlde phosphodiesterase and use of this enzyme to characterize adenosine 3',5'-phosphate in human urine (1962). J. Biol. Chem., 237,1244-1250.

43. Cabilly S., Riggs A.D., Pande H., Shirely J.E., Holmes W.E., Rey M., Perry L.J., Wetzel R., Heyneker H.L. Generation of antibody activity from immunoglobulin polypeptide chains produced in Escherichia coli (1984). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 3273.

44. Carlin R.K., Grab D.G., Cohen R.S., Siekevitz P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain region, enrichment of different types of postsynaptic densities (1980). J. Cell Biol., 86, 831-845.

45. Carnegie P.R., Moore W.J. Myelin basic protein (1980). In: Proteins of the nervous system, 2nd ed., BradshawR.A., Schneider D.M., eds., N.Y., 119-143.

46. Carpenter G., Lembach K. 1., Morrison M. M., Cohen S. Characterization of the binding of 125I-labeled epidermal growth factor to human fibroblasts // J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P. 4297-4304.

47. Carrier M.J., Nugent M.E., Tacon W.C., Primrose S.B. (1983). Trends Biotechnol., 1, 109.

48. Casini T. et al. Bicistronic retroviral vector reveals capacity of verb-A to induce erythroleukemia and to co-operate with v-myb (1995). Oncogene, 11(6), 1019.

49. Caulcott C.A., Lilley G., Wright E.M., Robinson M.K., Yarranton G.T. Investigation of the instability of plasmida directing the expression of Met-prochymosin in Escherichia coli (1985). J. Gen. Microbiol., 131, 3355-3365.

50. Caulcott C.A., Rhodes P.M. Temperature-Induced Synthesis of Recombinant Proteins (1986). Trends Biotechnol., 4(6), 142-146.

51. Cheung W.Y. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation (1980). Science, 207, 19-27.

52. Cheung W.Y. Cyclic 3', 5 -nucleotide phosphodiesterase: evidence for and properties of a protein activator (1971). J. Biol. Chem., 246, 2859-2869.

53. Cheung W.Y. Cyclic 3',5'-nucleotide phosphodiesterase. Demonstration of an activator (1970). Biochem. Biophys. Res. Cominun., 38(3), 533-539.

54. Cheung W.Y. Role of calmodulin in brain function (1982). Prog. Brain Res., 56, 237-253.

55. Childers S.R. Siegal F.L. Isolation and purification of a calcium-binding protein from electrophase of Electrophorus electriens (1975). Blochlm. Biophys. Acta., 405(1), 99-108.

56. Cohen C.N., Chang A.C.Y., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA (1972). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69(8), 2110-2114.

57. Cohen P. The role of cyclic AMP-dependent protein kinase in the regulation of glycogen metabolism in mammalian skeletal muscle (1978). Curr. Top. Cell Reg., 14, 117-196.

58. Cohen P. The role of phosphorylase kinase in the nervous and hormonal control of glycogenolysis in muscle (1974). Biochem. Soc. Symp., 39, 51-73.

59. Cohen P. The role of protein phosphorylation in the hormonal control of enzyme activity (1985). Eur. J. Biochem., 151, 439-448.

60. Cohen P. The subunit structure of rabbit skeletal muscle phosphorylase kinase and the molecular basis of its activation reactions (1973). Eur. J. Biochem., 34, 1-14.

61. Cohen P., Burchell A., Foulkes J.G., Cohen P.T.W., Vanaman T.C., Nairn A.C. Identification of the Ca-dependent modulator protein as the fourth subunit of rabbit skeletal muscle phosphorylase kinase (1978). FEBS Lett., 92, 287-293.

62. Cohen S. Isolataion of a mous submaxillary gland protein accelerating incisor eruption and eylid opening in the new-born animal (1962). J. Biol. Chem., 273, 1555-1562.

63. Cox J.A., Malnoe A., Stein E.A. Regulation of brain cyclic nucleotide phosphodiesterase by calmodulin (1981). J. Biol. Chem., 256, 3218-3222.

64. Craig R., Smith R., Kendrick J. Phosphorylation of myosin light chains promotes assembly of myosin filaments (1983). Nature, 302,436-439.

65. Curiel D.T., Agarwal S., Wagner E., and Gotten M. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery (1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8850.

66. Dabrowska R, Sherry J.M.F., Aromatoria D.K., Hartshorne D J. Modulator protein as a component of the myosin light chain kinase from chicken gizzard (1978). Biochemistry, 17(2), 253-258.

67. De Camilli P., Ueda T., Bloom F.E., Battenberg E., Greengard P. Widespread distribution of Protein I in the central and peripheral nervous system (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 5977-5961.

68. De Gennaro L.J., McCaffery C.A., Kirchgessner C.V., Yang-Feng T.L., Francke U. Molecular analysis of Synapsin I, a candidate gene for Rett syndrome (1987). Brain & Development, 9, 469-474.

69. Dedman J.R., Potter J.D., Jackson R.L., Johnson J.D., Means A.R. Physico-chemical properties of rat testis Ca-dependent regulator protein of cyclic nucleotide phosphodiesterase (1977). J. Biol. Chem., 252, 8415-8422.

70. Dedman J.R. Jackson R.L., Schreiber W.E., Means A.R. Sequence homology of the Ca-dependent regulator of cyclic nucleotide phosphodiesterase from rat testis with other Ca-binding protein (1978). J. Biol. Chem., 252, 8415-8422.

71. Dedman J.R. Welsh M.J., Means A.R. Ca-dependent regulator: production and characterization a monospecific antibody (1978). J. Biol. Chem., 253, 7515-7521.

72. Demaille J.G., Pechere J.-F. The control of contractility by protein phosphorylation (1983). Adv. Cyclic Nucleotide Res., 15, 337 371.

73. Deutch H.F. Chemistry and biology of alpha-fetoprotein (1991). Cancer Res., 56, 252-267.

74. Drummond G.I. Perrot-Yee S. Enzymatic hydrolysis of adenosine 3',5'-phosphoric acid (1961). J. Biol. Chem., 236, 1126-1129.

75. Dunn J. J., Studier F.W. Complete nucleotide sequence of bacteriophage T7 DNA and the locations of T7 genetic elements (1983). J. Mol. Biol., 166(4-5), 477-535.

76. Dunn W.A. and Hubbard A.L. Receptor-mediated endocytosis of epidermal growth factor by liepatocytes in the perfused rat liver: Ligand and receptor dynamics (1984). J. Cell. Biol., 98, 2148.

77. Edelman A.M., Krebs E.G. Phosphorylation of skeletal muscle myosin light chain kinase by the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase (1982). FEBS Lett., 138, 293-298.

78. Egrie J.C., Campbell J.A., Flangas A.L., Siegel F.L. Regional, cellular and subcellular distribution of calcium-activated cyclic nucleotide phosphodiesterase and calcium-dependent regulator in porcine brain (1977). J. Neurochem., 28, 1207-1213.

79. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups (1959). Arch. Biochem. and Biophys., 82(1), 70-77.

80. Emerick A.W., Bertolani B.L., Ben-Bassat A., White T.J., Konrad M.W. (1984). BIO/TECHNOL, 2, 165.

81. Endo T., Hidaka H. Ca-calmodulin-dependent phosphorylation of mielin isolated from rabbit brain (1984). Biochem. Biophys. Res. Commun., 97, 553-558.

82. Filburn C.R., Sacktor B. Cyclic nucleotide phosphodiesterase of rabbit renalcortex. Characterization of brush border membran activities (1976). Arch. Biochem. Biophys., 174, 249-261.

83. Filmus J., Trent J.M., Pollak M.N., Buick R.N. Epidermal growth factor receptor gene-amplified MDA-468 breast cancer cell line and its nonamplified variants (1987). Mol. And Cell.Biol., 7, 251-257.

84. Flockhart D.A., Corbin J.D. Regulatory mechanisms in the control of protein kinases (1982). CRC Crit. Rev. Biochem., 12, 133-186.

85. Forn J. Greengard P. Depolarizing agents and cyclic nucleotides regulate the phosphorylation of specific neuronal proteins in rat cerebral cortex slices (1978). Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 75, 5195-5199.

86. French A.R., Sudlow G.P., Wiley H.S., and Lauffenburger D.A. Postendocytic trafficking of epidermal growth factor-receptor complexes is mediated through saturalble and specific endosomal interactions (1994). J. Biol. Chem., 269, 15749.

87. Fukunaga K., Goto S., Miyamoto E. Immunohistochemical localization of Ca/calmodulin-dependent protein kinase II in rat brain and various tissues (1988). J. Neurochem., 51, 1070-1078.

88. Fukunaga K., Yamamoto H., Matsui K., Hidashi K., Miyamoto E. Purification and characterization of a Ca and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain (1982). J. Neurochem., 39, 1607-1617.

89. Gill D.L. Receptors coupled to calcium mobilization (1985). Adv. in Cyclic Nucleotide and Protein Phosphorylation Research., 19, 307-323.

90. Goelz S.E., Nestler E.J., Chehrazi B., Greengard P. Distribution of Protein I in mammalian brain as determined by detergent-based radioimmunoassay (1981). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2130-2134.

91. Goelz S.E., Nestler E.J., Greengard P. Phylogenetic survey of proteins related to Synapsin I and biochemical analysis of four such proteins from fish brain (1985). J. Neurochem., 45, 63-72.

92. Goldenring J.R., Gonzales B., De Lorenzo R.J. Calcium-calmodulin-dependent tubulin kinase in brain cytosol (1983). Trans. Am. Soc. Neurochem., 14, 186-169.

93. Goldenring J.R., Lasher R.S., Vallano M.L., Ueda T., Naito S., Sternberger L.A.,

94. De Lorenzo R.J. Association of Synapsin I with neuronal cytoskeleton. Identification of cytoskeletal preparation in vitro and immunocytochemical localization in brain of Synapsin I (1986). J. Biol. Chem., 261, 8495-8504.

95. Goldenring J.R., Vallano M.L., De Lorenzo R.L. Purification and characterization of a calmodulin-dependent protein kinase from rat brain cytosol able to phosphorylate tubulin and microtubule-associated proteins (1985). J. Neurochem., 45, 900-905.

96. Grab D.G. Carlin R.K., Siekevitz P. Function of calmodulin in postsynaptic densities. Presence of a calmodulin-activable protein kinase activity (1981). J. Cell Biol., 89, 440-448.

97. Grab D.J. Berzins K., Cohen R.S., Siekevitz P. Presence of calmodulin in postsynaptic densities isolated from canine cerebral cortex (1979). J. Biol. Chem., 254, 8690-8696.

98. Gray G.L., Baldridge J.S., McKeown K.S., Heyneker H.L., Chang C.N. Cloning and expression of c DNA for human lymphotoxin, a lymphokine with tumour necrosis activity (1985). Gene, 39, 247-254.

99. Gregory H. Isolation and structure of urogastrone and its relationship to epidermal growth factor (1975). Nature, 257, 325-327.

100. Griffith L.C., Schulman H. The multifunctional Ca/calmodulin-dependent protein kinase mediates Ca-dependent phosphorylation of tyrosine hydroxylase (1988). J. Biol. Chem., 263, 9542-9549.

101. Guidotti A., Konkel D.R., Ebstain B., Corda M.G., Wise B.C., Krutzch H„ Meek J.L., Costa E. Isolation, characterisation and purification to homogeneity of a rat brain protein (GABA-modulin) (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6084-6088.

102. Haas C.A., De Gennaro L.J. Multiple Synapsin I messenger RHAs are differentially regulated during neuronal development (1988). J. Cell Biol., 106, 195-203.

103. Hait W.N., Weiss B. Charateristics of the cyclic nucleotide phosphodiesteraseof normal and leukemic lymphocytes (1977). Biochim. Biophys. Acta., 497, 86100.

104. Hamon M., Bourgoin S., Artaud F., El Mestikawy S. The respective roles of tryptophan uptake and tryptophan hydroxylase in the regulation of serotonin synthesis in the central nervous system (1981). J. Physiol., Paris, 77, 269-279.

105. Hanley R.M., Means A.R., Kemp B.E., Shenolikar S. Mapping of calmodulin-binding domain of Ca/calmodulin-dependent protein kinase II (1988). Bichem. Biophys. Res. Comm., 152(1), 122-128.

106. Harris T.J.R. (1983). Nordic Symposium on Protein Engineering. PROTEIN ENGINEERING, 1(2), 81-82.

107. Harris T.J.R., Patel T., Marston F.A.O., Little S., Emtage J.S., Opdenakker G., Volckaert G., Rombauts W., Billiau A., De Somer P. (1986). Mol. Biol. Med., 3(1), 279-284.

108. Hartman JR., Gelles T., Yavin Z., Bartfield D., Kanner D., Aviv H., Gorecki M. High-level expression of enzymatically active human Cu/Zn superoxide-dismutase in Escherichia Coli (1986). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83(19), 71427146.

109. Hashimoto Y., Schworer C.M., Roger J.C., Soderling T.R. Autophosphorylation of a Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Effects on total and Ca-independent activities and kinetic parameters (1987). J. Biol. Chem., 262, 8051-8055.

110. Henderson B. et al. Therapeutic potencial of cytokine manipulation (1992). Trends Pharmacol. Sei., 12(4), 145-151.

111. Henning U., Cole S.T., Bremer E., Hindernach I., Schaller H. Gene fusion using the omp A gene coding for a major outer-membrane protein of Escherichia coli K 12 (1983). Eur. J. Biochem., 136, 233-240.

112. Heyde M., Portalier R. Regulation of major outer-membrane porin proteins of Escherichia Coli K-12 by pH (1987). Mol. Gen. Genet., 208(3), 511-517.

113. Hostomsky Z., Smrt J., Paces V. Cloning and expression in Escherichia coli of the synthetic proenkephalin analogue gene (1985). Gene, 39, 269-274.

114. Hsiung H.M., Mayne N.A., Becker G.W. Expression, efficient secretion and folding of human growth-hormone in Escherichia Coli (1986). BIO/TECHNOL, 4(11), 991-995.

115. Huang C.-K., Browning M.D., Greengard P. Purification and characterisationof protein III, a mammalian brain phosphoprotein (1982). J. Biol. Chem., 257, 6524-6528.

116. Hughis P.A. et al. The adjuvant potencial of cytokines (1992). Biotechnol. Ther., 3 (3-4), 101-117.

117. Huttner W.B., De Gennaro L.J., Greengard P. Differential phosphorylation of multiple sites in purified Protein I by cyclic AMP-dependent and calcium-dependent protein kinases (1986). J. Biol. Chem., 256, 1482-1488.

118. Ihle J. et al. Immunological regulation of hematopoietic/lymphoid stem cell differentiation by interleukin-3 (1986). Adv. Immunol., 39, 1-50.

119. Inokushi K., Muton N., Matsuyama S., Mizushima S.//Nucl. Acids Res. 1982, 21: 6957-6968.

120. Jackie S., Runquist E.A., Miranda-Brady S., and Havel R.J. Trafficking of the epidermal growth factor receptor and transferrin in three hepatocytic endosomal fractions (1991). Biol. Chem., 266, 1396.

121. Jacobs P., Cravador A., Loriau R., Brockly F., Colau B., Churchana P., Van Elsen A., Herzog A., Bollen A. Molecular cloning, sequencing, and expression in Escherichia coli of human preprourokinase cDNA (1985). DNA, 4, 139-146.

122. Jacobsen T.W. et al. Inhibition of SCF-induced proliferation of primitive murine hematopoietic progenitor cells signaled through the 75-kDa TNF-receptor (1995). J. Immunol., 154(8), 3732.

123. Jamieson G.A. (Jr.), Vanaman T.C., Blum J.J. Presence of calmodulin in Terrahymena (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76(12), 6471-6475.

124. Jansen J.H. et al. Inhibitory effect of IL-4 on the proliferation of acutemyeloid leukemia cells wirh myelomonocytic differentiation (AML-M4/M5); the role of IL-6 (1993). Leukemia, 7, 643.

125. Jarret H.W., Kyte J. Human erythrocyte calmodulin: further chemical characterization and the site of its interaction with the membrane (1979). J. Biol. Chem., 254, 8237-8244.

126. Jayaram B., Devor R., Guiser Y., Fiers W. Purification of Human Interleukin-4 Produced in Escherichia-Coli (1989). Gene, 79(1-2), 345-354.

127. Joh T.H., Park D.H., Reis D.J. Direct phosphorylation of brain tyrosine hydroxylase by cAMP-dependent protein kinase: mechanism of enzyme activation (1978). Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 75, 4744-4748.

128. Johnson E.M., Ueda T., Maeno H., Greengard P. Adenosine 3', 5'-monophosphate-dependent phosphorylation of a specific protein in synaptic membrane fractions from rat cerebrum (1972). J. Biol. Chem., 247, 5650-5652.

129. Jones H.P., Bradford M.M., McRorie R.A., Cormier M.J. High levels of a calcium-dependent modulator protein in spermatozoa and its similarity to brain modulator protein (1978). Biochem. Biophys. Res. Commun., 82, 1264-1272.

130. Kakiuchi S., Yamazaki K., Hakajima H. Properties of heat-stable phosphodiesterase activating factor isolated from brain extracts studies on cyclic 3',5'-nucleotide phosphodiesterase (1970). Proc. Jpn. Acad., 46, 589-592.

131. Kamata N., Chida K., Rikimaru K. et al. Growth-ingibitory effects of epidermal growth factor and overexpression of its receptor on human sqaumous carcinomas in culture (1986). Cancer Res., 46, 1648-1653.

132. Kato Y. and Sugiyama Y. Binding, internalization, degradation, and mitogenic effect of epidermal growth factor in cultured rat hepatocytes (1993). STP Pharm. Sci., 3, 75.

133. Kawasaki T. and Ashwell G. Carbohydrate structure ofglycopeptides isolated from an hepatic membrane-binding protein specific for asialoglycoproteins (1976 a). J Biol. Chem., 251, 5292.

134. Kawasaki T. and Ashwell G. Chemical and physical properties of an hepatic membrane protein that specifically binds asialoglycoproteins (1976 b). J. Biol. Chem., 251, 1296.

135. Kelly P.T., McGuinness T.L., Greengard P. Evidence that the major postsynaptic density protein is a component of a calclum-calmodulin dependent protein kinase (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 945-949.

136. Kelly P.T. Montgomery P.R. Subcellular localization of the 52 000 molecular weight major postsynaptic density protein (1982). Brain Res., 233, 265-266.

137. Kennedy M.B., McGuinness T., Greengard P. A calcium/calmodulin-dependent protein kinase from mammalian brain that phosphorylates Synapsin I: partial purification and characterization (1983). Neurosci., 3, 818-831.

138. Kennedy M.S., Greengard P. Two calcium/calmodulin-dependent protein kinases which are highly concentrated in brain phosphorylate protein I at distinct sites (1981). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, 1293-1297.

139. Kim H. Binder L.I., Rosenbaum J.L. The periodic association of MAP-2 with brain microtubules in vitro (1979). J. Cell. Biol., 80, 266-276.

140. Kimmenade A., Bond M.W., Shumacher J.H., Laguoi C., Kastelein R.A. Expression, renaturation and purification of recombinant human interleukin-4 from Escherichia Coli (1988). Eur. J. Biochem., 173(1), 109-114.

141. Kindler V., Thorens B., Kossodo S, Allet B., Eliason J.F., Thatcher D., Färber N., Vassalli P. Stimulation of hematopoiesis in vivo by recombinant bacterial murine interleukin-3 (1986). Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 83(4), 1001-1005.

142. Klee C.B. Calmodulin: Structure function relationships. In: "Calcium and cell function", Cheung W.Y. ed, Acad. Press, N.Y., p. 69-77.

143. Klee C.B. Conformational transition accompanying the binding of Ca to the protein activator of 3', 5'-cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase (1977). Biochemistry, 16(5), 1017-1024.

144. Konrad M.W., Lin L.S. (1984). US Patent No. 4450103.

145. Krebs E.G. Phosphorylation and dephosphorylation of glycogen Phosphorylase: a protype for reversible covalent enzyme modification (1981). Curr. Top. Cell Reg., 18, 401-419.

146. Krebs E.G., Beavo J.A. Phosphorylation dephosphorylation of enzymes (1979). Annu. Rev. Biochem., 48, 923-959.

147. Kretsinger R.H. Calcium-binding proteins (1976). Ann. Rev. Biochem., 45, 239-266.

148. Kretsinger RH. Structure and evolution of calcium modulated proteins (1980). C.R.C. Crit. Rev. Biochem., 8, 119-174.

149. Kretsinger R.H. The informational role of calcium in the cytosol (1979). Adv.Cyclic Nucleotide Res., 11, 1-26.

150. Krueger B.K., Forn J., Greengard P. Depolarization-induced phosphorylation of specific proteins, mediated by calcium ion influx in rat brain synaptosomes (1977). J. Biol. Chem., 252, 2764-2773.

151. Kuret J, Schulman M. Purification and characterization of a Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase from rat brain (1984). Biochemistry, 23, 5495-5504.

152. Kuret J., Schulman H. Mechanism of autophosphorylation of the multifunctional Ca/calmodulin-dependent protein kinase (1985). J. Biol. Chem., 260, 6427-6430.

153. Kuznicki J. Kuznicki L. Drabikowski W. Ca-binding modulator protein in protozoa and myxomicete (1979). Cell Biol. In. Rep., 3, 17-23.

154. Kwiatkowski A.P., Shell D.J., King M.M. The role of autophosphorylation in activation of the type II calmodulin-dependent protein kinase (1988). J. Biol. Chem., 263, 6484-6486.

155. La Porte D.C., Wierman B.M., Stiorm D.R. Calcium-induced exposure of a hydrophobic surface on calmodulin (1980). Biochemistry, 19, 3814-3818.

156. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 (1970). Nature, 227, 680-684.

157. Lai J., Nairn A.C., Greengard P. Autophosphorylation reversibly regulates the Ca/calmodulin-dependence of Ca/calmodulin-dependent protein kinase II (1986). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4253-4257.

158. Lai Y., McGuinness T., Greengard P. Purification and characterization of brain Ca/calmodulin-dependent kinase II that phosphorylates synapsin I (1983). Soc. Neurosci. Abstr., 9, 1029-1033.

159. Lai Y., Nairn A.C., Gorelick F., Greengard P. Ca/calmodulin-dependent protein kinase II: identification of autophosphorylation site responsible for generation of Ca/calmodulin-independence (1987). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 5710-5714.

160. Lazar M.A., Lockfield A.J., Truscott R.J.W., Barchas J.D. Tyrosine hydroxylase from bovine striatum: catalitic properties of the phosphorylated forms of the purified enzyme (1982). J. Neurochem., 39, 409-422.

161. Le Peuch C.J., Haiech J., Demaille J.G. Concerted regulation of cardiac sarcoplasmic reticulum calcium transport by cyclic adenosine monophospnate-dependent and calcium-calmodulin-dependent phosphorylations (1979). Biochemistry, 18, 5150-5157.

162. Le Vine H., Sahyoun N.E. Characterization of a soluble M 30,000 catalitic fragment of the neuronal calmodulin-dependent protein kinase II.

163. Le Vine H.III.,Sahyoun N.E., Two types of brain calmodulin-dependentprotein kinase II: morphological, biochemical and immunochemical properties (1988). Brain Research, 439, 47-55.

164. Lee J.D. et al. IL-4 inhibits the expression of TNFa and (3, IL-1(B and -6 and IFN-y (1995). Immunol, and Cell Biol., 73(1), 57.

165. Lee J.M., Ullrich A. (1984). European Patent Application No. 0128733.

166. Lin C.R., Kapiloff M.S., Durgerian S., Tatemoto K., Russo A., Hanson P., Schulman H., Rosenfeld M.G. Molecular cloning of a brain-specific calcium/calmodulin-dependent protein kinase (1987). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 5962-5966.

167. Lin Y.M., Liu Y.P., Cheung W.Y. Cyclic 3', 5'-nucleotide phosphodiesterase. Purification, characterization and active form of the protein activator from bovine brain (1974). J. Biol. Chem., 249, 4943-4954.

168. Lisman J.E., Goldring M.A. Feasibility of long-term storage of graded information by the Ca/calmodulin-dependent protein kinase molecules of the postsynaptic density (1986). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5320-5324.

169. Lord S.T. Expression of a cloned human fibrinogen cDNA in Escherichia coli: synthesis of an A alpha polypeptide (1985). DNA, 4, 33-38.

170. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

171. Luokkamaki M., Palva E.T. Cold-sensitive Ompb mutants affecting expression of Ompc in Escherichia Coli-K12 (1987). FEMS Microbiol. Lett., 40(1), 21-25.

172. Magun B. E., Planck S. R., Wagner H. N. Intracellular processing of 125I-epidermal growth factor in rat embrio fibroblasts (1982). J. Cell. Biochem., 20, 259-276.

173. Mahajna J., Oppenheim A.B., Rattray A., Gottesman M. Translation initiation of bacteriophage-lambda gene cii requires integration host factor (1986). J. Bacteriol., 165(1), 167-174.

174. Maniatis T., Fritsch E.E., Sambrook J.//Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSHLab. 1982.

175. Markey K.A., Kondo S., Shenkman L., Goldstein M. Purification and characterization of tyrosine hydroxylase from a clonal pheochromacytoma cell line (1980). Mol. Pharmacol., 17, 79-85.

176. Marston F.A.O. The Purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia Coli (1986). Biochem. J., 240(1), 1-12.

177. Marston F.A.O., Angal S., Lowe P.A., White S. Solubilization and activation of recombinant calf prochymosin from Escherichia Coli (1984). Biochem. Soc. Transactions, 13(6), 1035-1035.

178. Maruyama K., Takizawa T., Yuda T., Kennel S.J., Huang L. Targetability of novel immunoliposomes modified with amphipathic poly(ethyleneglycol)s conjugated at their distal terminals to monoclonal antibodies (1995). Biochim. Biophy. Acta., 1234, 74.

179. Maxam A.M., Gilbert W.// Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1977, 74(2): 560-564.

180. McCarthy J.E.G., Schairer H.U., Sebald W. Translational initiation frequency of atp genes from Escherichia coli: indentification of an intercistronic sequence that enhances translation (1985). EMBO J., 4(2), 519-526.

181. McCarthy J.E.G., Sebald W., Lammers R. Enhancement of translational efficiency by the Escherichia Coli Atpe translational initiation region its fusion with 2 human genes (1986). Gene, 41(2), 201-216.

182. McClelland M., Hanish J., Nelson M., Patel Y. Kgb a single buffer for all restriction endonucleases (1988). Nucl. Acids Res., 16(1), 364.

183. McGuinness T., Kelly P.T., Ouimet C.C., Greengard P. Studies of the subcellular and regional distribution of calmodulin-dependent protein kinase II in rat brain (1983). Soc. Neurosci. Abstr., 9, 1029-1033.

184. McGuinness T., Lai Y., Greengard P. Ca/calmodulin-dependent protein kinase II (1985). J. Biol. Chem., 260, 1696-1704.

185. McGuinness T.L., Lai J., Greengard P., Woodgett J.R. Cohen P. A multifunctional calmodulin-dependent protein kinase: similarities between skeletalmuscle glycogen syntase kinase and a brain Synapsin I kinase (1984). FEBS Lett., 163, 329-334.

186. Meijer D.K.F. and Molema G. Targeting of drugs to the liver (1995). Semin. Liver Dis., 15, 202.

187. Mesri E.A., Kreitman R.J., Fu Y., Epstein S.E. and Pastan I. Heparin-binding transforming growth factor a-pseudoinonas exotoxin A (1993). J. Biol. Chem., 268, 4853.

188. Mitoh N.//FEBS Lett. 1982, 137(2): 171-174.

189. Miyamoto E., Kakiuchi S. In vitro and in vivo phosphorilation of myelin basic protein by exogenous and endogenous cAMP-dependent protein kinases (1974). J. Biol. Chem., 249, 2769-2777.

190. Mizejewski G.J. a-Fetoprotein as a biologic response modifier: relevance to domain and subdomain structure (1997). J. Exp. Biol. Med., 14, 333-362.

191. Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein signal sequences: a proposed mechanism for subcellular localisation and organelle targeting (1995). J. theor. Biol., 176, 103-113.

192. Mizejewski G.J., Jacobson H.I. Alpha-fetoprotein is a dual regulator of growth in estrogen-responsive tissues (1985). CRS Press, Boca Raton, Florida, 1, 71-82.

193. Mora R., Tamaoki T., Wegmann T.G., Longenecker B.M., Laderoute M.P. Monoclonal antibodies directed against a widespread oncofetal antigen: the alpha-fetoprotein receptor (1993). Tumor Biol.,' 14, 116-130.

194. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. J. Immunol. Meth. 1983, 65, 5563.

195. Nagahari K., Kanaya S., Monakata K., Aoyagi Y., Mizushima S. Secretion into the culture medium of a foreign gene product from Escherichia coli: use of the omp F gene for secretion of human beta-endorphin (1985). EMBO J., 4, 35893592.

196. Nagai K., Perutz M.F., Poyart C. Oxygen binding properties of human mutant hemoglobins synthesized in Escherichia coli (1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7252-7255.

197. Nairn A.C., Bhagat B., Palfrey H.C. Identification of calmodulin-dependent protein kinase III and its major M 100,000 substrate in mammalian tissues (1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7939-7943.

198. Nairn A.C., Greengard P. Purification and characterization of brain Ca/calmodulin-dependent protein kinase I that phosphorylated synapsin I (1983). Soc. Neurosci. Abstr., 9, 1029-1034.

199. Nairn A.C., Greengard P. Purification and characterization of Ca/calmodulin-dependent protein kinase I from bovine brain (1987). J. Biol. Chem., 262, 72737281.

200. Nairn A.C., Palfrey H.C. Identification of the major M 100,000 substrate for calmodulin-dependent protein kinase III in mammalian cells as elongation factor 2 (1987). J. Biol. Chem., 262, 17299-17303.

201. Nestler E.J. Greengard P. Distribution of Protein I and regulation of its state of phosphorylation in the rabbit superior cervical ganglion (1982). J. Neurosci., 2, 1011-1023.

202. Niggli V., Adunyah E.S., Carafoli E. Acidic phospholipids, unsaturated fatty acids and limited proteolysis mimic the effect of calmodulin on the purified erytrocyte Ca-ATPase (1981). J. Biol. Chem., 256, 8588-8592.

203. Nilsson G. et al. TNF-a and IL-6 induce differentiation in the human basophilic leukemia cell line Ku 812 (1994). Immunology, 81(1), 73-78.

204. O'Farrell P.H., Gelfand D.H,. Shepard H.M., Polisky B. Isolation and characterization of ColEl-derived plasmid copy-number mutant (1978). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75(12), 5869-5873.

205. O'Garra A., Umland S. B-Cell Factors Are Pleiotropic (1988). Immunology Today, 9(2), 45-54.

206. Offensperger W., Wahl S., Neurath A.R., Price P., Strick N. Kent S.B.H., Christman J.K., Acs G. Expression in Escherichia coli of a cloned DNA sequence encoding the pre-S2 region of hepatitis B virus (1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7540-7544.

207. Ohgai H., Kumakura T., Komoto S., Matsuo Y., Ohshiden K., Koide T., Yanaihara C., Yanaihara N. Production of rat epidermal growth factor by Escherichia Coli cells containing a secretion plasmid (1989). J. Biotechnol., 10(2), 151-160.

208. Oka T., Sakamoto S., Miyoshi K.-I., Fuwa T., Yoda K., Yamasaki M., Tamura G., Miyake T. Synthesis and secretion of human epidermal growth factor by Escherichia coli (1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7212-7216.

209. Okabe M. et al. Inhibitory effect of IL-4 on the in vitro growth of Ph+-positive acute lymphoblastic leukemia cells (1991). Blood, 78(6), 1574-1580.

210. Okabe T., Sobue E. Identification of a new 84/82 KDa calmodulin-binding protein, which also interact with actin filaments, tubulin and spectrin, as synapsin I (1987). FEBS Lett., 213(1), 184-188.

211. Okuno S., Fujisawa H. Purification and some properties of tyrosine 3-monooxygenase from rat adrenal medulla (1982). Eur. J. Biochem., 122, 49-50.

212. Olins P.O., Devine C.S., Rangavala S.H. A translational enhancer sequence -application for high-level expression of foreign genes in Escherichia Coli (1988). Abstr. of Am. Chem. Soc., 196, 61.

213. Olins P.O., Rangwala S.H. A novel sequence element derived from bacteriophage-T7 messenger-RNA acts as an enhancer of translation of the Lacz gene in Escherichia Coli (1989). J. Biol. Chem., 264(29), 16973-16976.

214. Ostrow K.S., Silhavy T.J., Garrett S. Cis-acting sites required for osmoregulation of Ompf expression in Escherichia Coli K-12 (1986). J. Bacteriol., 168(3), 1165-1171.

215. Ouime T.C.C., McGuinness T.L., Greengard P. Immunocytochemical localization of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in rat brain (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5604-5608.

216. Palfrey H.C., Rothlein J.E. Greengard P. Calmodulin-dependent protein kinase and associated substrate in Torpedo electric organ (1983). J. Biol. Chem., 258, 9496-9503.

217. Pardridge W.M. Receptor-mediated transcytosis ofpeptides through the blood-brain barrier, in Peptide Drug Delivery to the Brain, Pardridge, W.M., Ed., Raven Press, New. York, 1991, 160.

218. Payne M.E., Fong Y.-L., Ono T., Colbran R.J., Kemp B.E., Soderling T.R., Means A.R. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II. Characterization ofdistinct calmodulin binding and ingibitory domains (1988). J. Biol. Chem., 263, 7190-7196.

219. Payne M.E., Soderling T.R. Calmodulin-dependent glycogen syntase kinase (1980). J. Biol. Chem., 255, 8054-8056.

220. Pechel C. et al. Effects of B-cell stimulatory factor-1 / interleukin-4 (1987). Blood, 70(1), 254-263.

221. Perales J.C., Ferkol T., Beegen H., Ratnoff O. D., and Hanson R.W. Gene transfer in vivo: Sustained expression and regulation of genes introduced into the liver by receptor-targeted uptake (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 4086.

222. Perales J.C., Ferkol T., Molas M., and Hanson R.W. An evaluation ofreceptor-mediated gene transfer using synthetic DNA-ligand complexes (1994). Eur. J. Biochem., 226, 255.

223. Pires E., Perry S.V. Purification and properties of myosin light chain kinase from fast skeletal muscle (1977). Biochem. J., 167, 137-146.

224. Pitcher J., SaunderK. //Lett. Appl. Microbiol. 1989, 8(4): 151-156.

225. Potter J.D., Gergely J. The calcium and magnesium binding sites on troponin and their role in the regulation of myofibrillar adenosine triphosphatase (1975). J. Biol. Chem., 250, 4628-4633.

226. Prigent S. A., Lemoine N. R. The type 1 (EGFR-related) family of growth factor receptors and there ligands (1992). Progress Growth Factor Res., 4, 1-24.

227. Rasmussen M. Cell communication, calcium ion and cyclic adenosine monophosphate (1970). Science, 170, 404-412.

228. Rasmussen M., Goodman D.B.P. Relationship between calcium and cyclic nucleotides in cell activation (1977). Physiol. Rev., 57, 421-509.

229. Roberts R.J. Restriction and modification enzymes and their recognition sequences (1978). Gene, 4(3), 183-194.

230. Runge M.S., Hewgley P.B., Puett D., Williams R.C. (jr). Cyclic nucleotide phosphodiesterase activity in 10-nm filaments and microtubule preparations from bovine brain (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 2561-2565.

231. Ryasanov A.G., Natapov P.G., Shestakova E.A., Severin F.F., Spirin A.S. Phosphorylation of the elongation factor 2: the fifth Ca/calmodulin-dependent system of protein phosphorylation (1988). Biochimie, 70, 619-626.

232. Saitoh T., Schwartz J.H. Phosphorylation-dependent subcellular translocation of a Ca/calmodulin-dependent protein kinase produced a autonomous enzyme in Aplisia neurons (1985). J. Cell Biol., 100, 835-842.

233. Salzman P.M., Roth R.H. Noradrenergic neurons: post-stimulation increase in catecholamine biosynthesis (1978). In: Neuro-psycho-pharmacology, Deniker P., Radouco-Thomas C., Villeneuve A., eds., Pergamont, N. Y., 2, 1439-1455.

234. Sanyal G., Marquis-Omer D., Gress J.O., Middaugh C.R. A transforming growth factor-a-Pseudomonas exotoxin hybrid protein undergoes pH-dependent conformational changes conducive to membrane interaction (1993). Biochemistry, 32, 3488.

235. Sasagawa T., Ericsson L.M., Walsh K.A., Schreiber W.E., Fisher E.H., Titani R. Complete amino acid sequence of human brain calmodulin (1982). Biochemistry, 21(10), 2565-2569.

236. Sassenfeld H.M., Brewer S.J. (1984). BIO/TECHNOL, 2, 76.

237. Sato N., Hayami T., Murata K., Watanabe K., Kariya Y., Sakaguchi M., Kimura S., Nonaka M., Kimura A. Expression of tuna growth-hormone cDNA in Escherichia Coli (1989). Appl. Microbiol. Biotechnol., 30(2), 153-159.

238. Savage C.R., Cohen J. Epidermal growth factor and a new derivative: rapid isolation procedures and biological and chemical characterisation. J. Biol. Chem. 1972, 247, 7609-7611.

239. Savage Jr C.R., Hash G.H., Cohen S. Epidermal growth factor, location of disulfide bonds (1973). J. Biol. Chem., 248, 7669-7672.

240. Savage Jr C.R., Inagami T., Cohen S. The primary structure of epidermal growth factor (1972). J. Biol. Chem., 247, 7612-7621.

241. Schoner B.E., Belagale R.M., Schoner R.G. Translation of a synthetic 2-cistron messenger RNA in Escherichia Coli (1986). Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 83(22), 8506-8510.

242. Schoner R.G., Ellis L.F., Schoner B.E. (1985). BIO/TECHNOL, 3, 151.

243. Schulman H. Calcium-dependent protein phosphorylation (1984). J. Cell Biol., 99, 11-19.

244. Schulman H., Greengard P. Ca -dependent protein phosphorylation system in membranes from various tissues and its activation by calcium-dependent regulator (1978). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 5432-5436.

245. Schulman H., Greengard P. Stimulation of brain membrane protein phosphorylation by calcium and endogenous heat-stable protein // Nature.-1978.-V.271.-P.478-479.

246. Seymour L.W., Ulbrich K., Wedge S.R., Hume I.C., Strohalm J., and Duncan R. N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide copolymers targetted to the hepatocyte galactose receptor: pharmacoldnetics in DBA2 mice (1991). Br. J. Cancer, 63, 859.

247. Shapiro J.T., Leng M., and Felsenfeld G. Deoxyribonucleic acid-polylysine complexes. Structure and nucleotide specificity (1969). Biochemistry, 8, 3219.

248. Sharma S.K. Recovery of soluble human renin from inclusion-bodies produced in recombinant Escherichia Coli (1986). J. Biotechnol., 4(2), 119-124.

249. Shaw G. Specific postsynaptic density proteins bind tubulin and calmodulin-dependent protein kinase type II (1984). Nature, 30, 496-497.

250. Shen S.-H. Multiple joined genes prevent product degradation in Escherichia coli (1984). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 4627-4631.

251. Shenolikar S., Lickteig R., Hardie D.G., Soderling T.R., Hanley R.M., Kelly P.T. Calmodulin-dependent multifunctional protein kinase (1986). Eur. J. Biochem., 161, 739-747.

252. Shields S.M., Vernon P.J., Kelly P.T. Autophosphorylation of calmodulin-dependent kinase II in synaptic junctions modulates endogenous kinase activity (1984). J. Neurochem., 43, 1599-1609.

253. Shimizu A. and Kawashima S. Kinetic study ofmternalization and degradation of 131I-labeled follicle-stimulating hormone in mouse Sertoli cells and its relevance to other systems (1989). J. Biol. Chem., 264, 13632.

254. Shine J., Fettes I., Lan N.C. Y., Roberts J.L., Baxter J.D. Expression of cloned beta-endorphin gene sequences by Escherichia coli (1980). Nature, 285, 456-463.

255. Shoji S., Ohnishi J., Funakoshi T., Fukunaga K., Miyamoto E., Ueki H., Kubota Y. Phosphorylation sites of bovine brain myelin basic protein phosphorilated with Ca/calmodulin-dependent kinase from rat brain (1987). J. Biochem., 102, 1113-1120.

256. Slaughter G.R., Means A.R. Quantitation and significance of 1251-calmodulin binding to myosin light chain kinase and phosphorylase distributed on polyacrylamide gels (1985). BBRC, 126, 295-303.

257. Sloboda R.D., Rudolph S.A., Rosenbaum J.L. Greengard P. Cyclic AMP-dependeht endogenous phosphorylation of a microtubule-associated protein (1975). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 177-18L

258. Smoake J.A., Song S.-Y, Cheung W.Y. Cyclic 3', 5'-nucleotide phosphodiesterase: distribution and developmental changes of the enzyme and its protein activator in mammalian tissues and cells (1974). Biochim. Biophys. Acta., 341(2), 402-411.

259. Soderling T.R., Payne M.E. Rabbit liver calmodulin-dependent glycogen synthase kinase (1987). Cold Spring Harbor Conf. Cell Prolif., 8, 413-423.

260. Soderling T.R., Schworer C.M., El-Maghrabi M.R. Pilkis S.J. Phosphorylation of liver pyruvate kinase by Ca/calmodulln-dependent protein kinase: characterization of two phosphorylation sites (1986). Biochem. Biophys.

261. Res. Coramun, 139(3), 1017-1023.

262. Sofer G. (1984). BIO/TECHNOL, 2, 1035.

263. Stormo G.D., Gold L., Schneider T.D. Quantitative analysis of the relationship between nucleotide-sequence and functional activity (1986). Nucl. Acids Res., 14(16), 6661-6679.

264. Strom T.W., Anderson P.L., Rubin-Kelley V.E., Williams D.P., Kiyokawa T., Murphy J.R. Immunotoxins and cytokine toxin fusion proteins (1991). Ann. NY Acad. Sci., 636, 233.

265. Suissa M., Altuvia S., Koby S., Giladi H., Oppenheim A.B. Translational signals of a major head protein gene of bacteriophage-lambda (1988). Mol. Gen. Genet., 214(3), 570-573.

266. Sutherland E.V., Rail T.W., Menon T. Adenylatecyclase. 1. Distribution, preparation and properties (1962). J. Biol. Chem., 237, 1220-1227.

267. Suzuki Yuji, Zeng Q.Y., Alpert E. Isolation and partial characterization of a specific alpha-fetoprotein receptor on human monocytes (1992). J. Clin. Invest., 90, 1530-1536.

268. Szoka P.R., Schreiber A.B., Chan H., Murthy J. A General method for retrieving the components of a genetically engineered fusion protein (1986). DNA, 5(1), 11-20.

269. Taft W.C., Tennes-Rees K.A., Blair R.E., Clifton G.L., De Lorenzo R.J. Cerebral ischemia decreases endogenous calcium-dependent protein phosphorylation in gerbil brain (1988). Brain Research, 447, 159-163.

270. Taira T., Kii R., Sakai E., Tabuchi H., Takimoto S., Nakamura S., Takahashi J., Hashimoto E., Yamamura H., Nishizuka Y. Comparison of glycogen phosphorylase kinases of various rat tissues (1962). J. Biochem., 91, 883-888.

271. Talmadge K., Gilbert W. Cellular location affects protein stability in Escherichia coli (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79(6), 1830-1833.

272. Tanaka T., Hidaka H. Hydrophobic regions function in calmodulin-enzyme(s) interaction (1980). J. Biol. Chem., 255, 11078-11080.

273. Tatarinov Yu.S. Human alpha-fetoprotein 30 years from basic resrarch to clinical applications. Russian State Medical Univ., Moscow, 1995.

274. Taylor G., Hoare M., Gray D.R., Marston F.A.O. Size and density of protein inclusion-bodies (1986). BIO/TECHNOL, 4(6), 553-557.

275. Teo T.S., Wang T.H., Wang J.H. Purification and properties of the protein activator of bovine heart cyclic adenosine 3', 5'-monophosphate phosphodiesterase (1973). J. Biol. Chem., 248, 588-595.

276. Teshima Y., Kakiuchi S. Mechanism of stimulation of Ca plus Mg dependent phosphodiesterase from rat cerebral cortex by the modulator protein and Ca (1974). Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 489-495.

277. Teshima Y., Kakiuchi S. Membrane-bound forms of Ca-dependent and independent binding of modulator protein to the barticulate fraction from brain (1978). J. Cyclic Nucleotide Res., 4, 219-231.

278. Torchilin V.P., Klibanov A.L., Huang L. O'Donnell S., Nossiff N.D., and Khaw B.A. Targeted accumulation ofpolyethylene glycol-coated immunoliposomes in infarcted rabbit myocardium (1992). FASEB J., 6, 2716.

279. Torres J.M., Geuskens M., Uriel J. Receptor-mediated endocytosis and recycling of alpha-fetoprotein in human B-lymphoma and T-leukemia cells (1991). Int. J. Cancer, 47, 110-117.

280. Torres J.M., Naval J., Laborda M. Expression of alpha-fetoprotein receptors by human T-lymphocytes during blastic transformation (1989). Mol. Immunol., 26, 851-857.

281. Tsou K., Greengard P. Regulation of phosphorylation of proteins I, Ilia and Illb in rat neurohypophysis in vivo by electrical stimulation and by neuroactive agents (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6075-6079.

282. Ueda T., Greengard P. Adenosine 3', 5'-monophosphate-regulated phosphoprotein system of neuronal membranes. Solubilization, purification and some properties of an endogenous phosphoprotein (1977). J. Biol. Chem., 252, 5155-5163.

283. Uhlen M., Nilsson B., Abrahmsen L., Moks T. Secretion of heterologous gene-products to the culture- medium of Escherichia Coli (1986). Nucl. Acids Res., 14(18), 7487-7500.

284. Uriel J., Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin Ch. Uptake of radiolabeled alpha-fetoprotein by mouse mammary carcinoma's and its usefulness in tumor scintigraphy (1984). Cancer Res., 44, 5314-5319.

285. Van Eldik. L.J., Watterson D.M. Characterization of a calcium-modulated protein from transformed chicken fibroblasts (1979). J. Biol. Chem., 254, 1025010255.

286. Varsanyi M., Heilmeyer L.M.G. (jr.). The protein kinase properties of calsequestrin (1979). FEBS Lett., 103, 85-88.

287. Varsanyi M., Heilmeyer L.M.G. Autocatalytic phosphorylation of calsequestrin (1980). FEBS Lett, 122, 227-230.

288. Villacampa M.J, Lapreave F, Calvo M., Naval J., Pineiro A, Uriel J. Incorporation of radiolabeled AFP in the brain and other tissues of the developing rat (1984). Dev. Brain Res, 12, 77-82.

289. Vulliet P.R., Langan T.A., Weiner N. Tyrosine hydroxylase: a substrate of cyclic AMP-dependent protein kinase (1980). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 9296.

290. Wagner F.W., Burger A.R., Vallee B.L. Kinetic properties of human liver alcohol dehydrogenase: oxidation of alcohol by class I isoenzymes (1983). Biochemistry, 22, 1857-1863.

291. Wang J.H., Stull J.T., Huang T.-S., Krebs E.G. A study of the autoactivation of rabbit muscle Phosphorylase kinase (1976). J. Biol. Chem., 251, 4521-4527.

292. Watterson D.M., Harrelson W.G., Keller P.M., Sharief F., Vanaman T.C. Structural similarities between the Ca-dependent regulatory properties of 3', 5'-cyclic nucleotide phosphodiesterase and actomyosin ATPase (1976). J. Biol. Chem., 251, 4501-4513.

293. Watterson D.M., Sharief F., Vanaman T.C. The complete amino acid sequence of the Ca-dependent modulator protein (calmodulin) of bovine brain (1980). J. Biol. Chem., 255, 962-975.

294. Weir M.P., Sparks J. Purification and renaturation of recombinant human interleukin-2 (1987). Biochem. J., 245(1), 85-91.

295. Welsh M.J., Dedman J.R., Brinkley B.R. Means A.R. Calcium-dependent regulatory protein: localization in mitotic apparatus of eukariotic cells (1978). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 1867-1871.

296. Wetzel R, Goeddel D.V. (1983). In: Peptides, Gross E. and Meienhofer J. (eds.), Academic Press Inc., New York, Vol. 5, p. 1.

297. Wieslander L. A simple method to recover intact high molecular weight RNA and DNA after electrophoretic separation in low gelling temperature agarose gels (1979). Anal. Biochem., 98(2), 305-309.

298. Willingham M. C., Haigier H. T., Fitzgerald D. J., Gallo M. G., Rutherford A. V., Pastan I. H. The morphologic pathway of binding and internalization of epidermal growth factor in cultured cells// Exp. Cell Res. 1983. Vol.146. P.163-175.

299. Winkler M.E., Blaber M, Bennett G.L., Holmes W., Vehar G.A. (1985). BIO/TECHNOL, 3, 990.

300. Wise B.C., Guidotti A., Costa E. Phosphorilation induced a decrease in the biological activity of the protein inhibitor (GABA-modulin) of aminobutiric acid binding sites (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 886-890.

301. Witer-Giannott J.A.S., Leary A.C., Kriz R., Donahue R.E., Wong G.G., Clark S.C. Human IL-3 (multi-CSF) identification by expression cloning of a novel hematopoietic growth factor related to murine IL-3 (1986). Cell, 47(1), 3-10.

302. Witholt B., Kingma J., de Leij L. Nature of the regions involved in the insertion of newly synthesized protein into the outer membrane of Escherichia coli (1976). Biochim. Biophys. Acta., 553(2), 224-34

303. Wolf D.J, Siegal F.L. Purification of calcium-binding phosphoprotein from pig brain (1972). J. Biol. Chem., 247(13), 4180-4185.

304. Wolf H., Hofman P. Purification of myosin light chain kinase from bovine cardiac muscle (1980). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5852-5855.

305. Wolff D.J., Poirier P.G, Brostrom C.O., Brostrom M.A. Divalent cation binding properties of bovine brain Ca-dependent regulator protein (1980). J. Biol. Chem., 252, 4108-4112.

306. Wood J.G. Wallace R.W., Cheung W.Y. Immunocytochemical studies of calmodulin and CaM-BP in brain (1980). In: "Calcium and cell function", Cheung W.Y. ed., Acad. Press, N.Y., p.291-303.

307. Woodgett J.R., Davison M.T., Cohen P. The calmodulin-dependent glycogen synthase kinase from rabbit skeletal muscle. Purification and substrate specificity (1983). Eur. J. Biochem., 136, 481-487.

308. Wu C.H, Wilson J.M., and Wu G.Y. Targeting genes: Delivery and persistent expression of a foreign gene driven by mammalian regulatory elements in vivo (1989). J. Biol. Chem, 264, 16985.

309. Wu G.Y. and Wu C.H. Liver-directed gene delivery (1993). Adv. Drug Delivery Rev, 12, 159.

310. Wu G.Y. and Wu C.H. Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo (1988). J Biol. Chem, 263, 14621.

311. Yagi K, Matsuda S, Nagamoto H, Mikuni T, Yazawa M. Structure and Cadependent conformational change of calmodulin. In: "Calmodulin and intracellular Ca receptors", Kakiuchi S., HidakaH., Means A.R., eds., Phenum., N.Y., p.75-92.

312. Yagi K., Yasawa M., Kakiuchi S., Oshima M., Uenishi K. Identification of an activator protein for myosin light chain kinase as the Ca-dependent modulator protein (1978). J. Biol. Chem., 253, 1338-1340.

313. Yamamoto Т., Kamata N., Kawano H. et al. High incidence of amplification of gene in human sqaumous carcinoma cell lines (1986). Cancer Res., 46, 414416.

314. Yamauchi Т., Fujisawa H. Disassembly of microtubules by action of calmodulin-dependent protein kinase (kinase II) which occur only in brain tissues (1983). Biochem. Biophys. Res. Commun., 110, 287-291.

315. Yamauchi Т., Fujisawa H. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 by calmodulin-dependent protein kinase II which occurs only in the brain tissues (1982). Biochem. Biophys. Res. Comm., 109, 975-981.

316. Yamauchi Т., Fujisawa H. Purification and characterization of the brain calmodulin-dependent protein kinase (kinase II) which is involved in the activation of tryptophan-5-mono-oxygenase (1983). Eur. J. Biochem., 132, 15-21.

317. Yarranton G.T., Wright E.M., Robinson M.K., Humphreus G.O. Dual-origin plasmid vectors whose origin of replication is controlled by the coliphage lambda promoter (1984). Gene, 28, 1293-1300.

318. Yoshikawa T. and Pardridge W.M. Biotin delivery to brain with a covalent conjugate of avidin and a monoclonal antibody to the transferrin receptor (1992). J. Pharmacol. Exp. Ther., 263, 897.

319. Zemel-Dreasen O., Zamir A. Secretion and processing of an immunoglobulin light chain in Escherichia coli (1984). Gene, 27, 315-322.

320. Богуш T.A., Шубина И.Ж., Смирнова Г.Б., Сыркин А.Б., Богуш Е.А. Прижизненная количественная оценка внутриклеточного распределения доксорубицина в опухолевых клетках. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1995. №11. с. 518-521.

321. Гуревич А.И., Некрасова О.В. Новые плазмидные векторы для клонирования и экспрессии генов (1988). Биоорган, химия, 14(2), 149-152.

322. Гуревич А.И., Скапцова Н.В., Луценко С.В., Смирнов В.А., Куркин А.Н., Ажаев А.В. Химико-ферментативный синтез усилителя трансляции гена 10фага Т7 и функция элементов его структуры (1991). Биоорган, химия, 17(5), 647-652.

323. Клаус Д. Лимфоциты и методы. М., 1990, 292-293.

324. Ковальчук Л.В. и др. Иммуноцитокины и локальная иммунокоррекция (1995). Иммунол., 1, 4-7.

325. Краев A.C. Простая система клонирования в фаге М13 и секвенирование ДНК с терминатора (1988). Мол. биол., 22(5), 1164-1197.

326. Кулагина М.А., Скапцова Н.В., Батчикова Н.В., Куркин А.Н., Ажаев A.B. Н-фосфонатный метод в синтезе структурного гена интерлейкина-4 человека1990). Биоорган, химия, 16(5), 625-634.

327. Луценко C.B., Гуревич А.И., Каневский В.Ю., Смирнов В.А., Назимов И.В., Ажикина Е.Л., Чернов И.П., Ростапшов В.М., Сонина Н.В, Ажаев A.B. Выделение рекомбинантного интерлейкина-3, продуцируемого Е. coli1991). Биоорган, химия, 17(12), 1649-1654.

328. Никольский H. Н., Соркин А. Д., Сорокин А. Б. Эпидермальный фактор роста. 1987, Л.: Наука, 200 с.

329. Потапнев М.П. B-лимфоциты. Цитокинообразующая функция (1994). Иммунол., 4, 4-7.

330. Северин С.Е. (мл.), Швец В.И., Балденков Г.Н., Ткачук В.А. Влияние жирных кислот на регуляцию кальмодулином аленилатциклазы стриарной системы мозга (1983). Биохимия, 48(11), 1906-1913.

331. Скапцова Н.В., Куркин А.Н., Ажаев A.B. Н-фосфонатный синтез олигодезоксирибонуклеотидов с использованием п-нитрофенилэтильной защитной группы (1989). Биоорган, химия, 15(7), 940-946.

332. Чувпило С.А., Кравченко В.В. Твердофазный метод определения нуклеотидной последовательности ДНК (1983). Биоорган, химия, 9(12), 301304.247