Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание геномной ВАС библиотеки Allium fistulosum L. и ее использование в молекулярно-цитогенетических исследованиях

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Создание геномной ВАС библиотеки Allium fistulosum L. и ее использование в молекулярно-цитогенетических исследованиях"

На правах рукописи

КИСЕЛЕВА Анна Витальевна

СОЗДАНИЕ ГЕНОМНОЙ ВАС БИБЛИОТЕКИ ALLIUM FISTULOSUM L. И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЯХ

Специальность: 03.02.07 - генетика

7 НОЯ 2G13

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2013

005537467

Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Хрусталева Людмила Ивановна

Официальные оппоненты:

Шилов Илья Александрович, доктор биологических наук, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук, лаборатория анализа геномов, заведующий лабораторией

Шеваль Евгений Валерьевич, кандидат биологических наук, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», отдел электронной микроскопии, старший научный сотрудник

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится «27» ноября 2013 г. в 14:30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете -МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел./факс (499) 976-24-92, e-mail: genetics@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан «25» октября 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время библиотеки бактериальных искусственных хромосом (bacterial artificial chromosome ВАС) являются одним из ключевых инструментов анализа геномов. Особое значение создание ВАС библиотек имеет для видов с крупными геномами, так как с помощью ВАС векторов можно клонировать и стабильно сохранять последовательности ДНК больших размеров, до 300 т.п.н. (Tao, Zhang, 1998). ВАС система клонирования имеет ряд значительных преимуществ по сравнению с другими способами клонирования ДНК, а именно: высокая эффективность клонирования, небольшой размер вектора, простота выделения и очистки, высокая стабильность клеток и низкий уровень химеризма. ВАС библиотеки внесли ощутимый вклад в проекты по секвенированию геномов.

Геном лука батуна {Allium fistulosum L.) остается слабо изученными по целому ряду причин, в числе которых: большой размер, высокая частота дупликаций и повышенная гетерозиготность. Близкородственный вид Allium сера L. (лук репчатый) является одной из самых важных овощных культур в мире, второй после томатов (FAO, 2011). Геном лука репчатого активно изучается. В 2001 году группой японских ученых под руководством Suzuki была создана ВАС библиотека лука репчатого, покрывающая 30% генома (Suzuki et al., 2001). Сейчас на сервере международного центра биотехнологической информации (NCBI) находятся более 5 млн. нуклеотидных последовательностей лука репчатого. Геном А. fistulosum остается практически неизученным: в базе NCBI выложено лишь 871 нуклеотидная последовательность.

Размер генома A. fistulosum на 28 % меньше генома лука репчатого (Narayan, 1988), что делает его более удобным объектом исследования. Более того, существует вероятность получения ВАС клонов А. fistulosum с высоким содержанием генов из-за их предполагаемой концентрации в проксимальном регионе хромосом (Havey et al., 2006). Также A. fistulosum является источником хозяйственно-ценных генов в селекции лука репчатого, генофонд которого оказался довольно обеднённым более чем за 5000 лет его возделывания человеком (Jones, Mann, 1963). A. fistulosum обладает генами устойчивости к луковой листовой гнили (Currah, Maude, 1984), розовой корневой гнили (Netzer et al., 1985) и антракнозу (Galvan et al., 1997), а также к луковой мухе (de Ponti, Inggamer, 1984). Кроме того, лук батун отличается высоким содержанием сухого вещества, более острым вкусом и морозостойкостью, более ранним и более коротким цветением, большей привлекательностью соцветий для насекомых-опылителей (Van der Meer, Van Bennekom, 1978).

Конструирование ВАС библиотеки A. fistulosum создает благоприятные условия для фундаментальных молекулярно-цитогенетических исследований луков. До сих пор остается неизвестной структура теломеры у луковых, в то время как для большинства растений последовательность теломеры хорошо известна (Sykorova et al., 2003с). В конце 2012 года японские ученые выявили

центромерный повтор A. fistulosum (Nagaki et al., 2012a). Однако исследовать его геномную организацию им не удалось. На важность изучения генома А. fistulosum и создания геномной ВАС библиотеки указывает и тот факт, что в 2013 году был начат проект по секвенированию его генома университетом Миссури (USA).

Дели и задачи работы. Цель работы - создание и анализ ВАС клонов генома лука {Allium fistulosum L.) как генетического ресурса для молекулярно-цитогенетических исследований и практической селекции.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Создать библиотеку ВАС клонов А. fistulosum-,

2. Разработать ДНК-зонды на основе известных нуклеотидных

последовательностей луков в генетической базе данных NCBI;

3. Провести скрининг ВАС библиотеки А. fistulosum с ДНК-зондами на:

- субтеломерный тандемный повтор;

- видоспецифичные последовательности - субтеломерные и центромерные;

- центромерные ретротранспозоны;

4. Провести FISH-BAC картирование отобранных ВАС клонов на

физической хромосоме;

5. Провести концевое секвенирование отобранных ВАС клонов;

6. Провести полное секвенирование ВАС клона, несущего

видоспецифичный субтеломерный повтор;

7. Провести полное секвенирование ВАС клона с прицентромерной

локализацией;

8. Провести биоинформатический анализ полученных нуклеотидных

последовательностей;

9. Провести FISH картирование тандемных повторов и

ретротранспозонов, входящих в состав последовательностей ДНК

ВАС клонов, на физической хромосоме.

Научная новизна. Впервые сконструирована библиотека ВАС клонов А. fistulosum, на базе которой созданы молекулярно-цитогенетические маркеры на видоспецифичный субтеломерный повтор (AfiT23, 255 п.н.), видо-хромосомоспецифичный прицентромерный повтор (AÜT32, 197 п.н.). Выделены ВАС клоны, несущие известный общий для луковых субтеломерный повтор и определена теломерно-центромерная ориентация ДНК-вставок. Выявлен в ВАС клоне 5.12.7 тандемный повтор Af!T347 (75 п.н.), определены его копийность в геноме и диспергированная организация на физической хромосоме. Выявлено 7 ВАС клонов, несущих последовательность обратной транскриптазы Ty3/gypsy ретротранспозона, и впервые было доказано присутствие в центромерном регионе А. fistulosum Ty3/gypsy ретротранспозонов. Проведен сравнительный анализ хромосомной организации Ту3/gypsy ретротранспозонов у A. fistulosum и А. сера, определена их копийность в геномах А. сера и A. fistulosum.

Практическая значимость. Сконструированная ВАС библиотека, насчитывающая более 1000 клонов, является ценным генетическим материалом для секвенирования генома A. fistulosum, поиска последовательностей ценных генов, создания молекулярных маркеров для ускорения селекционного процесса и создания новых сортов с заданными свойствами. Созданы хромосом- и видоспецифичные молекулярно-цитогенетические маркеры, которые могут быть использованы в селекционных программах для мониторинга интрогрессии генетического материала в межвидовых гибридах луковых и интегрирования генетических и физических карт A. fistulosum.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XIII молодежной научной конференции, секция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2013), XX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), 6-м Международном симпозиуме по съедобным Alliaceae (Фукуока, Япония, 2012), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 146-летию Академии имени К.А.Тимирязева (Москва, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 151 странице машинописного текста и включают 44 рисунка, 2 таблицы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Выводы», «Заключение», «Список литературы» и «Список иллюстративного материала». Список литературы включает 307 источника, из них 298 иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе был использован лук батун А. fistulosum L. сорт Русский зимний и лук репчатый А. сера L. сорт Халцедон. Семена данных сортов были произведены агрофирмой «Гавриш». Межвидовой гибрид между А. сера и A. fistulosum - A. wakegi был предоставлен профессором М. Shigyo, университет Ямагучи, Япония.

Выделение геномной ДНК. ДНК выделяли из проростков СТАВ-методом (Rogers, Bendich, 1988).

Выделение высокомолекулярной ДНК. Для выделения высокомолекулярной ДНК использовали молодые листья растений. Их замораживали в жидком азоте и сохраняли при -70 °С в морозильнике. Выделение интактных ядер проводили по ранее описанной методике (Zhang et al., 1995).

Запаиванне ядер в агарозных слайсах. Готовили 10 мл 1% легкоплавкой агарозы в 1хНВ буфере, охлаждали до 45 °С и оставляли на водяной бане при 45 °С. Ядра нагревали до 45 °С (около 5 мин), смешивали с равным объемом 1% легкоплавкой агарозы и заливали в охлажденную форму для слайсов. После застывания переносили слайсы из формы в 5-10 объемов

з

буфера для лизиса (0,5 М EDTA, pH 9,0 - 9,3; 1% лаурил саркозин натрия; 0,1 мг/мл протеиназы К), инкубировали в течение 24-28 ч при 50 °С с мягким покачиванием. После чего слайсы промывали один раз в 0,5 М EDTA (pH 9,0 -9,3) в течение 1 ч при 50 °С, один раз в 0,05 М EDTA (pH 8,0) в течение 1 ч на льду.

Рестрикция. Агарозные слайсы инкубировали в буфере для рестрикции в течение 20 мин на льду (1:1 (v/v) высокомолекулярная ДНК - 10 х буфер для рестрикции, 40 шМ спермидин). Добавляли 3 единицы рестриктазы ВатШ (Fermentas, Canada) и выдерживали 20 мин на льду и 5 мин при 37 °С. Останавливали реакцию добавлением 1/10 объема 0,5 М EDTA, pH 8,0 на льду.

Пульс-электрофорез. Анализировали результаты частичной рестрикции с помощью пульс-электрофореза при следующих условиях: 1% (w/v) легкоплавкая агароза (BIO-RAD, USA) в 0.5 х TBE, 14 °С, 120° угол, 6 В/см, начальный пульс 90 с, финальный пульс 90 с, продолжительность 18-22 ч. В качестве маркера размеров использовали DNA Size Markers-Yeast Chromosomal (BIO-RAD, USA).

Клонирование фрагментов геномной ДНК с вектором ВАС.

Полученные фрагменты геномной ДНК были клонированы согласно прилагаемому протоколу в векторе pCClBAC (Epicentre), размером 8128 п.н., с сайтом рестрикции для ВатШ. Трансформацию клеток Е. coli проводили вектором pCClBAC с вставками геномной ДНК на электропораторе MicroPulser (BIO-RAD, USA). Отбор колоний, несущих вектор со вставкой, проводили на селективной питательной среде с добавлением хлорамфеникола, IPTG и X-Gal.

Приготовление ДНК-зондов. В качестве ДНК-зондов использовались Cot-1 фракции ДНК A. fistulosum и А. сера, выделенные по стандартной методике (Zwick et al., 1997). Праймеры 34902/34903 (Фесенко и др., 2002) подбирали на нуклеотидную последовательность субтеломерного повтора лука батуна (Irifime et al., 1995):

34902 5' - ATCGATTCTTCGGACGGCCT - 3'

34903 5' - ATCCGCAGGGTGCAACATCTGCGG - 3'.

Праймеры AceRl на центромерные ретротранспозоны подбирали на нуклеотидную последовательность ЕТ645811.1 (GenBank): AceRIF: 5' - TACCGAAGAAGGATGGTTCG - 3' AceRIR: 5' - CTTCCCAATGAATGGTCTGAA- 3'.

Для подбора праймеров применялась программа РпгпегЗ. Для мечения ПЦР продуктов использовалась смесь нуклеотидов, содержащая Biotin- 16-dUTP или Dig-11-dUTP (Roche, Germany). Амплификацию проводили на амплификаторе "Tetrad" (BIORAD, USA).

Скрининг ВАС библиотеки с помощью дот-блот гибридизации. Дот-блот гибридизацию проводили с использованием Cot-1 фракции согласно ранее описанной методике (Khrustaleva, 2002). Биотин детектировали с помощью Alkaline Phospatase Streptavidin Conjugated (R&D Systems, USA).

Скрининг с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В 25 мкл

смеси для ПЦР содержалось: 0,2 мМ каждого нуклеотида, 1 х буфер для ПЦР, 100 нг ДНК-матрицы, 20 нг каждого праймера, 2,5 U ДНК-полимеразы. Амплификацию проводили на амплификаторе «Tetrad» (BIORAD, USA) при следующих параметрах: 94 °С - 5 мин; 30 циклов: 94 °С - 30 с, 58 "С - 45 с, 72 °С - 90 с. Продукты ПЦР разделяли в 1,5% агарозном геле с буфером ТВЕ (45 тМ трис-борат, 1 mM EDTA рН 8) при напряженности поля 6 V/см. В качестве маркера размеров использовали "100 bp leader" (Fermentas, Canada).

Секвенирование ВАС клонов. Концевое секвенирование проводили с помощью секвенатора ABI 3139x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Полное секвенирование проводили на секвенаторе Ulumina Miseq (Illumina, USA), программа сборки CLC Genomics Workbench v. 6.0.1(CLC bio, Denmark).

После проведенного полного секвенирования двух ВАС клонов на отобранные контиги и последовательности в них были подобраны праймеры.

На ВАС клон 5.12.7: AfiT347-lF 5'- CCGAATCCCCAGAGTGC -3' AfiT347-lR 5'- TGCTCCGGGGACTTAGAGTA -3' AfiT347-2F 5'- AAATCTCCGAATCCCCAGAG -3' AfiT347-2R 5'- TTAGAGTACTCCGCTCCGCACT -3' AfiT23-F 5'-AGGCTATCCGAACCTCAATC-3' AfiT23-R 5'-AGCAAAGGGAATACCAAAAGA-3' AfiRT515-F 5'- ACAGCTGGGTAAAACGATGG -3' AfiRT515-R 5'- GCCGAAGGAACACTTCAGAG -3' AfiRT628-F 5'- TCTTCAATCCAAAGGGCATC -3' AfiRT628-R 5'- GGAAATGGAGGACTTGCGTA -3'

На ВАС клон 5.10.7: AfiT32-F 5'- TCCCACCTAAATTACGGACA -3' AfiT32-R 5'- AAATAGCGGCTTCTGCACTA -3' AfiT32-R' 5'- TAGGCGGAGTTCAAATATGG -3'

Анализ нуклеотидных последовательностей. Анализ секвенированных последовательностей проводили с помощью программного обеспечения GenDoc (Multiple sequence alignment editor and shading utility. Ver. 2.6.002. Copiright © by K. Nicholas); CLC Genomics Workbench v. 6.0.1, CLCbio 9x (CLC bio, Denmark); Blast NCBI (NCBI BLAST); Screen sequence for vector contamination, (NCBI vecscreen); Gypsy Database (Llorens et al., 2011; Gydb); Tandem Repeats Finder version 4.04 2009-07-02 (Gary Benson, 2009); RepeatExplorer (Goecks et al., 2010, Blankenberg et al., 2010, Giardine et al., 2010, Repeat Explorer). Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили в открытой базе генетических данных GenBank (GenBank).

Выделение плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК проводилось с использованием коммерческого набора реактивов «The GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit» (Fermentas, Canada), согласно прилагаемому протоколу.

Приготовление препаратов митотическнх хромосом. Семена А. сера (2п =2х=16) сорта Халцедон и A. fistulosum сорта Русский зимний (2п =2х=16)

прорастали на влажной фильтровальной бумаге в течение 72 ч при 25 °С, затем перенесены последовательно в 0,75 тМ гидроксимочевину при 25 °С на 24 ч,' на фильтровальную бумагу, смоченную водой, при 25 °С на 4 ч и в 0,05% (w/v) колхицин при 25 °С в течение 3,5 ч. Молодые корешки A. wakegi были собраны у растений, выращенных в теплице в горшках, затем обработаны N2O в камере под давлением 10 атмосфер в течение 3 ч. Фиксация корней проводилась в этанол: уксусной кислоте (3:1) (v/v). Препараты хромосом готовили по описанной ранее методике распластывания (Pijnacker, Ferwerda, 1984).

Приготовление ДНК-пробы. Мечение ДНК проводилось методом Nick-трансляции с использованием DIG-Nick Translation Mix и Biotin-Nick Translation Mix (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany) или напрямую с помощью ПЦР с использованием Dig-PCR Mix и Biotin-PCR Mix (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany) согласно прилагаемой инструкции.

Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Предгибридизационную обработку стекол и гибридизацию проводили по Kuipers et al. (1997) с некоторыми модификациями. FISH выполняли согласно стандартной методике (Khrustaleva, Kik, 1998) с некоторыми модификациями.

Микроскопия и анализ изображения. Препараты анализировались на флуоресцентном микроскопе Axiolmager Ml (Carl Zeiss Microimaging, Jena, Germany) с использованием цифровой камеры AxioCam MRm. Обработку изображений производили с помощью программы Axio Vision, версия 4.6.3 (Carl Zeiss Microimaging, Jena, Germany) и Isis v.5 (MetaSystems, Altlussheim, Germany). Снимки были оптимизированы с помощью функции контраста и яркости в программе Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, California, USA).

Кариотипирование. Кариотипиование было проведено согласно стандартной номенклатуре для луков, предложенной Kalkman (1984) и одобренной на 4-ом симпозиуме Эукарпия по луковым (the Fourth Eucarpia Allium Symposium) (Vries, 1990). Кариотипический анализ был проведен на 510 митотических метафазах с хорошим разбросом хромосом. Морфометрия хромосом была выполнена с использованием программы MicroMeasure (Reeves, Tear, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание ВАС библиотеки A. fistulosum

Для создания ВАС библиотеки был выбран вектор pCCIBAC с сайтом рестрикции для ВатШ в связи с тем, что сайт рестрикции данного фермента не встречается в субтеломерном повторе A. fistulosum, изучение молекулярной организации которого было одной из поставленных задач наших исследований. ВАС библиотека была создана на основе геномной ДНК A. fistulosum, сорт Русский зимний. В ходе проделанной работы нами было получено более 1000 ВАС клонов A. fistulosum (Киселева и др., 2012). Размер вставок варьировал от 50 до 225 т.п.н.

Скрининг ВАС библиотеки A. fistulosum на субтеломерную последовательность

Для выявления клонов, несущих вставку геномной ДНК A. fistulosum, локализованной на дистальном (теломерном) окончании хромосом, была проведена ПЦР с праймерами (34902 и 34903) на субтеломерный повтор. Было обнаружено 4 ВАС клона (5.3.1, 5.3.6, 5.8.7, 7.11.7), несущих данную последовательность (средний размер вставки около 50 т.п.н.) (Киселева и др., 2012).

Отобранные ВАС клоны были проанализированы с помощью концевого секвенирования. ВАС клон 7.11.7 с обоих концов выявил гомологию к 378 п.н. субтеломерному повтору. Поэтому мы можем предположить, что вставка геномной ДНК этого клона происходит из участка генома, находящегося внутри данного сателлитного повтора. У трех других ВАС клонов только с одного конца выявлена гомология к 378 п.н. субтеломерному повтору, а с другого конца обнаружена гомология к GSS (genomic survey sequences) сиквенсам А. сера. FISH на растянутой ДНК и адаптер ПЦР с прямым клонированием теломерного конца предполагают, что сателлитный повтор занимает самый конец хромосом А. сера (Pich, Schubert, 1998). Поэтому мы можем предположить, что концы ВАС клонов с гомологией к субтеломерному повтору ориентированы к теломере, а противоположные концы, не имеющие гомологии к субтеломерному повтору, ориентированы к центромере (Киселева и др., 2013). Выравнивание последовательностей ВАС клонов показало, что они не гомологичны друг к другу, и, возможно, принадлежат разным плечам/хромосомам.

Все четыре ВАС клона были проанализированы с помощью BAC-FISH с целью установления их положения на хромосомах. В результате гибридизации in situ были выявлены ярко выраженные сигналы на дистальных концах хромосом (Рисунок 1). _

л

<9 ** щ i

\ \

Рисунок 1. ВАС-ПвН с клоном 5.3.6, несущим субтеломерную последовательность. ВАС клон был помечен Digoxigemn-ll-dUTP и детектирован антителами Anti-Digoxigenm-РГГС (зеленая флуоресценция). Хромосомы окрашены ОАР1 (голубая флуоресценция)

Скрининг ВАС библиотеки А. fistulosu.ni на видоспецифичные последовательности

В качестве ДНК-зонда для отбора ВАС клонов, несущих видоспецифичный повтор лука батуна, была использована СоМ фракция геномной ДНК, которая содержит высокоповторяющиеся последовательности, такие как микросателлиты и минисателлиты (теломерный и центромерный

повтор, рДНК). Скрининг с помощью перекрестного дот-блот анализа с меченными биотином СоЫ фракциями А. сера и А. АэМоэит выявил 2 ВАС клона со слабой гибридизацией с Со1>1 фракцией А. сера. Это может указывать на присутствие в этих двух клонах вставок ДНК с низкой гомологией к фракции высокоповторяющейся ДНК лука репчатого, а, следовательно, несущих видоспецифичные последовательности ДНК. На остальных клонах был получен сильный сигнал, что и следовало ожидать в связи с известной высокой степенью гомологии геномов у этих двух близкородственных видов (Ш&пе е* а1., 1995).

ВАС

клон

5.12.7

видоспепифичной субтеломерной

последовательностью

Отобранный ВАС клон 5.12.7 со слабой гомологией к Cot-1 фракции А. сера дал ярко выраженный FISH сигнал на дистальных окончаниях хромосом А. fistulosum (Рисунок 2а). ВАС клон 5.12.7 был гибридизован также на хромосомах А. wakegi, который является естественным гибридом между А. fistulosum и А. сера (Hizume, 1994). В результате FISH на А. wakegi были получены яркие сигналы на 8 хромосомах и очень слабые сигналы на 8 хромосомах А. сера (Рисунок 26). Интерпретируя полученные результаты ВАС- FISH на А. wakegi, мы можем предположить следующее: (1) возможно ВАС клон 5.12.7 содержит наряду с общим субтеломерным повтором последовательность ДНК, специфичную для А. fistulosum, или (2) число копий общего субтеломерного повтора значительно больше в субтеломерных регионах хромосом, принадлежащих А. fistulosum, чем у хромосом, принадлежащих А. сера. Предположение о существовании у А. fistulosum видоспецифичного субтеломерного повтора было высказано ранее на основании результатов GISH анализа искусственных межвидовых гибридов между А. fistulosum и А. сера (Khrustaleva, Kik, 1998).

_ mSB

Jf

V'' «

А J

,10Нт yh'

Рисунок 2. Сравнительный BAC-FISH клона 5.12.7, несущего вставку видоспецифичного субтеломерного повтора А. fistulosum, на хромосомах А. fistulosum — гибридизационный сигнал (зеленая флуоресценция на дистальных концах всех хромосом) (а) и на хромосомах А. wakegi (естественный гибрид А. fistulosum х А. сера) - яркий гибридизационный сигнал на 8 хромосомах А. fistulosum и слабый на 8 хромосомах А. сера (б)

Для проверки этих предположений был проведен FISH эксперимент на хромосомах А. fistulosum и А. сера с меченой ДНК ВАС клона 5.12.7 и

немеченым ПЦР продуктом, полученным с праймерами на 378 п.н. общий субтеломерный повтор и с геномной ДНК А. fistulosum и А. сера. Немеченый ПЦР продукт был использован в концентрации, превышающей в 50 раз концентрацию меченного ВАС клона, для блокирования на хромосомах общего субтеломерного повтора. В результате FISH на хромосомах А. fistulosum были выявлены гибридизационные сигналы в субтеломерной области хромосом (Рисунок За). В тоже время на хромосомах близкородственного вида лука репчатого сигналов выявлено не было (Рисунок 36).

Ф

0

б

Рисунок 3. ВАС-РВН с клоном 5.12.7, несущим вставку видоспецифичного субтеломерного повтора А. АзЫовит. Гибридизационная смесь содержала меченный Digoxígeшn-ll-dUTP клон 5.12.7 и немеченый ПЦР-продукт, полученный с праймерами на субтеломерный повтор с геномной ДНК А. /шЫоэит, в соотношении 1 ;50. На хромосомах А. ^тЛояит (а) и на хромосомах А. сера (б)

Секвенирование ВАС клона 5.12.7, сборка контигов, аннотирование

Было проведено полное секвенирование ВАС клона 5.12.7 для установления ДНК последовательности видоспецифичного повтора и определения его организации в геноме. В результате было собрано 1062 контига, суммарная длина которых составила 534407 п.н. Биоинформатический анализ самого большого контига 1062 (8724 п.н.) схематически представлен на рисунке 4.

ABlum сера done 1G-12-89DQ273270.1

AUnim сера ACRAD21-1 gene for cohesin subunit RAD21-1AB747099 Allium сера GSS

Retrotransposones

'"> RNAse -2L

protein, putative Tandem repeat 75 bp

Рисунок 4. Схема организации контига С12 ВАС клона 5.12.7

Так как тандемные повторы представляют множество идентичных, следующих друг за другом последовательностей, для их предсказания был использован показатель «среднего покрытия» (СП) контига. СП отражает плотность покрытия контига ридами. Таким образом, уникальная последовательность будет иметь меньшее СП, чем последовательность, повторенная многократно. Используя этот параметр, были выбраны 14 контигов с наибольшим покрытием.

Тандемный повтор AfiT347

Поиск тандемных повторов с помощью программы Tandem Repeats Finder (Benson, 2009) выявил в контигах 347 и С12 повтор длиной 75 п.н. (далее АЙТ347 - A. fistulosum). С помощью ПЦР был доказан тандемный характер организации этого повтора: на электрофорезе была выявлена лестница фрагментов с шагом, равным длине единицы повтора. Для выявления инверсий в данном повторе была проведена односторонняя ПЦР. Как с праймером AfiT347-lF, так и с AfiT347-lR была получена лестница фрагментов, свидетельствующая об инверсиях. С единичными праймерами AfiT347-2F и AfiT347-2R продуктов амплификации не было получено. Отсутствие ПЦР продукта может быть объяснено нарушением сайта посадки односторонних праймеров AfiT347-2R и AfiT347-2F в инвертированных фрагментах (Рисунок

5).

Праймеры:

AfiT347-1 F -»

AfiT347-1 R <-

AfiT347-2F -*■

Отжиг праймеров AfiT347-2R «-

75 (п.н.)

-Г^- >< > ; J»

Рисунок 5. Схема геномной организации тандемного повтора АЙТ347, составленная на основании результатов ПЦР с парой праймеров и единичными праймерами для выявления инверсий повтора

Продукт амлификации с парой праймеров AfiT347-lR/F и ВАС клоном 5.12.7 был помечен Biotm-16-dUTP и гибридизован на хромосомах лука батуна (Рисунок 6а). Продукт амплификации с той же парой праймеров, но геномной ДНК А. сера, также был помечен Biotin- 16-dUTP и гибридизован на хромосомах лука репчатого (Рисунок 66).

J У и» Ц'ЧТ' ф ■Г

"с У-

* т.

а б

Рисунок 6. FISH ПЦР-продукта, полученного с праймерами AfiT347-lR/F и ДНК ВАС клона 5.12.7, меченного Biotin-16-dUTP (красная флуоресценция) на хромосомах А. fistulosum (а) и с геномной ДНК А. сера на хромосомах А. сера (б)

В результате FISH анализа было выявлено, что сигналы тандемного повтора были диспергированы по всей длине хромосом обоих видов. С помощью биоинформатического анализа было определено расчетное число копий этого повтора - 2444608/2С, что составляет 0,08% генома А. fistulosum. Для получения дополнительных данных об организации выделенных повторов в геноме A.fistulosum, с помощью сервера RepeatExplorer (Goecks et al., 2010; Blankenberg et al., 2010; Giardine et al., 2010; RepeatExplorer) была проведена кластеризация ридов, полученных Hertweck (2013), и визуализация полученных кластеров в двумерном пространстве (Рисунок 7). Полученный кластер имел характерный для тандемных повторов вид глобулы (при визуализации кластера в трехмерном пространстве) или плотного облака (в двумерном пространстве) (Noväketal., 2010).

а б

Рисунок 7. Кластер, содержащий повтор АЙТ347: а - кластер с представленными соединительными линиями между ридами. б - кластеризация ридов без отображения соединительных линий

Идентификация и геномная организация ретротранспозонов ВАС клона 5.12.7

Для поиска в контигах последовательностей, имеющих сходство к известным последовательностям ретротранспозонов, был использован BLAST на сервере базы данных мобильных элементов растений Gydb (Llorens et al., 2011; Gydb). В базе данных Gydb в 5 контигах была найдена гомология к доменам интегразы, обратной транскриптазы и РНКазы Ty3/gypsy ретротранспозонов. Ранее было показано, что ТуЗ элементы представляют небольшую часть генома лука батуна (6,17%) (Hertweck, 2013).

Два из пяти контигов, 515 и 628 показали сходство на аминокислотном уровне к домену обратной траскриптазы Ty3/gypsy ретротранспозонов Tat4-1, Tñ2, RIRE2 и CRM, Gloin, Lególas, Ogre, соответственно. На нуклеотидные последовательности данных контигов, соответствующих обратной транскиптазе, были подобраны праймеры AfiRT515 (на контиг 515) и AfiRT628 (на контиг 628). ПЦР-продукт с этими праймерами был помечен Biotin-16-dUTP, после чего была проведена FISH на хромосомах лука батуна (Рисунок 8а, б). FISH анализ выявил диспергированный характер сигналов на хромосомах обоих видов, что свойственно большинству ретротранспозонов (Bennetzen, 2000; Zhang et al, 2004). Схожий паттерн гибридизации был ранее описан для Ту3/gypsy ретротранспозона Ogre (Ceccarelli et al., 2013).

» /Ъ ^

а б

Рисунок 8. FISH на хромосомах А. fistulosum с меченным Biotin- 16-dUTP ПЦР-продуктом, полученным с праймерами AfiRT515 -R/F (а), AfiRT628-R/F (б) и ДНК ВАС клона 5.12.7

Комплексный FISH анализ

В результате FISH анализа было выявлено, что сигналы тандемного повтора и ретротранспозонов, входящих в состав ДНК последовательности ВАС клона 5.12.7, были диспергированы по всей длине хромосом. Результаты FISH стали неожиданными, так как FISH с ВАС клоном 5.12.7 давал только четкий сигнал в субтеломерном регионе и не было выявлено диспергированных сигналов по хромосоме (Рисунок 2). Такое расхождение результатов FISH могло быть связано с разной системой получения меченой пробы и детекции сигнала. Для проверки этой гипотезы была проведена FISH с ВАС клоном 5.12.7, меченным Biotin- 16-dUTP и детектированным в три шага. В результате были выявлены помимо четко выраженного субтеломерного сигнала также сигналы, диспергированные по хромосоме (Рисунок 9а). Для визуализации видоспецифичной последовательности в ВАС клоне 5.12.7 и блокирования диспергированных сигналов был проведен FISH эксперимент, в котором в качестве пробы использовался меченный Biotin-16-dUTP ВАС клон 5.12.7, а в качестве блока - смесь из немеченых ПЦР-продуктов с праймерами АЙТ347-R/F на тандемный повтор, AÜRT515-R/F и AfiRT628-R/F на обратную транскриптазу Ty3/gypsy ретротранспозонов (Рисунок 96).

а б

Рисунок 9. FISH на хромосомах А. fistulosum с меченным Biotin-16-dUTP (красная флуоресценция) ВАС клоном 5.12.7 (а), с меченным Biotin-16-dUTP (красная флуоресценция) ВАС клоном 5.12.7, блокированным ПЦР-продуктами с праймерами АЙ347-1R/F, AfiRT515-R/F и AfiRT628-R/F (б)

В результате были выявлены четкие сигналы в субтеломерной области хромосом лука батуна, что свидетельствует о том, что в ВАС клоне 5.12.7 присутствует еще невыявленный видоспецифичный повтор. В результате полного секвенирования и анализа контигов нами с помощью FISH было изучено лишь 2389 п.н., что составляет 27% от самого большого контига С12 (8724 п.н.), и примерно только 5% от общей длины ВАС клона 5.12.7. Следовательно, хромосомная организация 95% данного ВАС клона все еще оставалась не проанализированной.

Тандемный повтор АЙТ23

Поиск видоспецифичного повтора был продолжен в других собранных нами контигах. Контиг 23 (длиной 500 п.н.) с СП 42 (21387 ридов) выявил гомологию 92% к тандемному повтору pAf'072 (AF074873.1) (Seo et al., 1999) А fistulosum, гомологичному субтеломерному повтору А. fistulosum (D38432.1) Irifune et al., 1995) на 95%. Контиг 23 имел также 78% гомологии к субтеломерному повтору А. сера (Х02572.1) (Barnes et al., 1985). Проведенная кластеризация субтеломерных последовательностей показала наличие у А. fistulosum и А. сера как своих видоспецифичных повторов, так и общего повтора, который, вероятно, был у их общего предка.

На часть (1 - 349 п.н.) отобранного контига 23 были подобраны праймеры AfiT23. ПТТР продукт с этими праймерами (255 п.н.), меченный Digoxegenin-11-dUTP, был гибридизован на хромосомах гибрида A. wakegi, который является естественным гибридом между А. сера и А. fistulosum (Рисунок 10).

Рисунок 2. FISH ПЦР-продукта, полученного с праймерами AfiT23 и ДНК ВАС клона 5.12.7, меченного Digoxigenin-11-dUTP (зеленая флуоресценция), на хромосомах A.fistulosum

FISH анализ ПЦР продукта с праймерами АЙТ23 на контиг 23 выявил сигналы только на 8-ми хромосомах, принадлежащих А. fistulosum. Полученные результаты свидетельствуют о том, что последовательность AfLT23 (255 п.н.) является частью или полностью мотивом тандемного видоспецифичного повтора А fistulosum.

ВАС клон с прицентромерной локализацией

Отобранный ВАС клон 5.10.7 со слабой гомологией к Cot-1 фракции А. сера дал выраженный сигнал в прицентромерном регионе на 4-х хромосомах А. fistulosum (Рисунок 11а), тогда как на хромосомах А. сера сигналов обнаружено не было (Рисунок 116). В результате кариотипирования BAC-FISH метафаз А. fistulosum было установлено, что четкие сигналы гибридизации были на гомологичных хромосомах 5 и 6 (Рисунок 12).

а б

Рисунок 3. Сравнительный ВАС-НЭН клона 5.10.7, несущего вставку хромосомо- и видоспецифичного повтора А. /мЫозит (зеленая флуоресценция) на хромосомах А. [ШиШит (а) и на хромосомах А. сера (б).

Рисунок 12. Кариотип митотической метаОр&зы A. fistulosum после BAC-FISH клона 5.10.7, меченного Digoxigenin-11-dUTP.

Для подтверждения видоспецифичности данного ВАС клона был проведен последовательный BAC-FISH и GISH анализ на хромосомах А. wakegi. В первом случае на хромосомы был гибридизован меченный Biotin-16-dUTP ВАС клон 5.10.7 (Рисунок 13а), во втором - на ту же метафазную пластинку была гибридизована меченная Digoxigenin-11-dUTP геномная ДНК A. fistulosum, с блоком геномной ДНК А. сера, превышающей метку по концентрации в 30 раз (Рисунок 136). GISH анализ подтвердил, что сигнал гибридизации ВАС клона 5.10.7 был на хромосомах A. fistulosum.

& i Ch.5 / • • « Я •• <• -- • • • . Л "4. >

Ii \ ch.e Юрт f \V 10 pm

а б

Рисунок 13. Последовательная BAC-FISH и GISH на митотической метафазе A. wakegi:

(а) BAC-FISH видоспецифичного клона 5.10.7, меченного Biotin- 16-dUTP (красный сигнал);

(б) GISH с геномной ДНК А. fistulosum, меченной Digoxigenin-11-dUTP и блокированной геномной ДНК А. сера. Стрелки указывают на локализацию сигнала на хромосомах

Секвенированне ВАС клона 5.10.7, сборка контигов, аннотирование

Было проведено полное секвенирование ВАС клона 5.10.7, локализованного в прицентромерном регионе 5-ой и 6-ой хромосом А. fistulosum . В результате было собрано 276 контигов, суммарная длина которых составила 128411 п.н.

Поиск и геномная организация повторяющихся последовательностей

Поиск тандемных повторов с помощью программы Tandem Repeats Finder (Gary Benson, 2009) выявил в контигах 32 и С8-С9 тандем длиной 197 п.н. (AfiT32 - A. fistulosum), что сопоставимо с длиной тандемных повторов, найденных на Silene latifolia (Hobza et al., 2006; Macas et al., 2011). Для проверки наличия инверсий в данном повторе была проведена односторонняя

ПНР. При одностороннем ПЦР лестница фрагментов была получена с праймером АйТ32-1Г, с праймерами АйТ32-11, АЙТ32-Р ПЦР продуктов не было получено. Полученные результаты свидетельствуют о наличии инверсий изучаемого повтора в геноме А. /Ши1о8ит (Рисунок 14).

Праймеры:

Ш32-? ->

АйТ32-К <-

АПТ32-К' <-

1 2141 146_156 197 (п.И.)

—тгг*

Рисунок 14. Схема геномной организации тандемного повтора АЯТ32, составленная на основании результатов ПЦР с парой праймеров и единичными праймерами для выявления инверсий повтора

ПЦР-продукт с праймерами АйТ32-БЖ был помечен и посажен на хромосомы А. А$ш1о8ит (Рисунок 15а). В качестве контроля использовалась рДНК 5Б, меченная Вюйп-16-<ИЛР. В результате мы получили сигналы, аналогичные сигналам самого ВАС клона 5.10.7, т.е. в прицентромерной области 2х пар хромосом 5 и 6 А./нЫ1озит (Рисунок 156).

Рисунок 15. FISH с ПЦР-продуктом с праймерами AfiT32-F/R на тандемный повтор и ДНК ВАС клона 5.10.7, меченным Digoxigenin-l 1-dUTP (зеленая флуоресценция) и 5S рДНК, меченной Biotin-16-dUTP (красная флуоресценция) в качестве контроля на хромосомах A. flstulosum (а); кариотип той же метафазной клетки (б).

Тандемный повтор АЙТ32 был также выявлен на границе двух перекрывающихся контигов С8-С9, длиною в 13 т.п.н. А так как выявленный повтор удалось визуализировать с помощью FISH, то мы можем утверждать, что его длина в ВАС клоне 5.10.7 не меньше 10 т.п.н. (порог чувствительности FISH (Jiang, Gill, 1994)), что составляет 50 копий данного тандема, и тогда общая длина контигов С8-С9 будет составлять на 10 т.п.н. больше (Рисунок 16). Для подсчета копийности повтора в геноме был проведен биоинформатический анализ. Расчетное число копий АЙТ32 - 104765/2С, что составляет 0,09% генома A. fistulosum.

F 5.10.7 — 393 п.Н. 1 500

не.10.7 -676пл. ......

Контиг lacs - 103Э5 п ч

КОНГКГ М5С8 — 7032 ПЛ.

Рисунок 16. Схема организации контига С8-С9 ВАС клона 5.10.7

Для получения дополнительных данных об организации выделенных повторов в геноме A.fistulosum, с помощью сервера RepeatExplorer (Goecks et al., 2010; Blankenberg et al., 2010; Giardine et al., 2010; Repeat Explorer) была проведена кластеризация ридов, полученных Hertweck (2013), и визуализация полученных кластеров в двумерном пространстве (Рисунок 17).

а б

Рисунок 4. Кластер, содержащий повтор AfiT32: а - кластер с представленными соединительными линиями между ридами. б - кластеризация ридов без отображения соединительных линий

Полученная картина кластеризации для повтора АЙТ32 в виде кольца (Рисунок 17а, б) встречается у тандемных повторов, чья длина значительно больше длины ридов, участвовавших в кластеризации. Такая форма кластера была показана для высоко-повторяющейся последовательности ДНК NicCL3 у Nicotiana tabacuna (Renny-Byfield et al., 2012) и рРНК у силены (Macas et al., 2011).

Скрининг ВАС библиотеки A. fïstulosum на центромерные ретротрансопозоны и BAC-FISH отобранных клонов

Ранее было показано, что ретротранспозоны с центромерной локализацией относятся к линии хромовирусов семейства Ty3/gypsy (термин "центромерный" используется далее для обозначения как центромерного, так и прицентромерного региона, так как их трудно отличить друг от друга) (Neumann et al., 2011). Чтобы идентифицировать последовательности лука, имеющие сходство с последовательностями хромовирусов Ty3/gypsy ретротранспозонов, поиск был проведен в GSS базе данных NCBI при помощи NCBI Entrez (NCBI, А. сера) среди всех ДНК последовательностей А. сера. Кластерный анализ аминокислотных последовательностей обратных

хранскриптаз (ОТ) разных групп Ty3/gypsy, включенных в базу данных повторов RepeatExplorer, и ОТ транслятов выявленных 73 GSS последовательностей А.сера, показал, что 7 сиквенсов лука репчатого выделились в отдельный кластер, в который входили так же референсные последовательности хромовирусов Ty3/gypsy, выделенные из генома банана (MusAl) и Brassica rapa (BraR6 и BraRl). Одна из 7 GSS последовательностей (ЕТ645811) была нами использована для дальнейших экспериментов. На часть этой последовательности GSS сиквенса (от 260 до 777), подбирались праймеры AceRl, которые позволяли амплифицировать фрагмент ОТ размером 300 п.н.

В ввду того, что в базе данных очень мало информации о геноме А. fistulosum, поиск сиквенсов и подбор праймеров осуществлялся на ДНК последовательностях А. сера. Поэтому FISH эксперимент был выполнен сначала с ПЦР продуктом с праймерами AceRl и геномной ДНК А. сера на хромосомах А. сера. FISH выявила ярко выраженные сигналы в центромерной области хромосом А. сера и слабые сигналы в разных регионах хромосом, что может свидетельствовать о преимущественном встраивании центромерных ретротранспозонов (ЦР) в центромерный регион (Рисунок 18а).

а б

Рисунок 18. FISH меченого ПЦР-продукта, полученного с праймерами AceRl и геномной ДНК А. сера, на хромосомах А. сера (а); ПЦР-продукта с праймерами AceRl и геномной ДНК А. fistulosum на хромосомах А. fistulosum (б).

FISH на хромосомах А. fistulosum с ПЦР продуктом, полученным с AceRl праймерами и геномной ДНК А. fistulosum, выявила сигналы различной интенсивности в центромерном регионе и в других регионах хромосом (Рисунок 186). Наибольшее количество сигналов, распределенных по всей длине хромосомы было получено на 7-й и 8-й парах хромосом, что свидетельствует о встраивании большого количества Ty3/gypsy ретротранспозонов в ДНК этих хромосом. Ранее для хромосомы 8 А. fistulosum был показан высокий уровень метилирования (Будылин et al., 2011), а также значительное содержание высоко-повторяющихся последовательностей было показано для гомеологичной хромосомы 8 лука репчатого (Durante et al., 1985), что может указывать на высокое содержание мобильных элементов. Такое явление оккупации генома ретротранспозонами наблюдается также у злаковых с большим геномом, таких как пшеница, ячмень и кукуруза (Vitte et al., 2006).

С помощью биоинформатического анализа было рассчитано предполагаемое число копий центромерных ретротранспозонов ТуЗ^уряу, которое составило для А. сера - 25651/2С копий и для А. /Ши1озит - 6671/2С копий. Установленные различия в хромосомной организации центромерных ретротранспозонов TyЗ/gypsy у А. сера и А. /Ши1ояит может указывать на разные пути эволюции геномов у этих двух близкородственных видов.

После проведенного анализа ЦР на двух близкородственных видах луковых был проведен скрининг ВАС библиотеки с праймерами АсеШ, который выявил 7 ВАС клонов. Отобранные ВАС клоны, содержащие ЦР, были гибридизованы на хромосомах А./иМояит (Рисунок 19).

Рисунок 19. ВАС-РВН клона 8.5.3, содержащего центромерные ретротранспозоны, на хромосомах А. /ши1ояит. ВАС клон был помечен Вю1:ш-16-диТР (красная флуоресценция)

В результате FISH с каждым из 7-ми отобранных ВАС клонов были получены диспергированные сигналы по всей длине хромосом. Картина гибридизации была сходна с той, что была получены с ПЦР продуктом с праймерами AceRl и геномной ДНК А. fistulosum на хромосомах А. flstulosum (Рисунок 186).

выводы

1. Создана ВАС библиотека геномной ДНК A. flstulosum, содержащая более 1000 ВАС клонов, которая является базой для изучения генома А. ßstulosum и использования в практической селекции.

2. Скрининг ВАС библиотеки с ДНК-зондом на общий для луковых субтеломерный повтор выявил 4 ВАС клона. С помощью концевого секвенирования и биоинформатического анализа определена теломерно-центромерная ориентация ДНК вставок и их принадлежность к разным плечам/хромосомам. Методом гибридизации in situ (BAC-FISH) была доказана физическая локализация этих ВАС клонов в дистальных окончаниях хромосом.

3. Скрининг ВАС библиотеки на видоспецифичные повторы методом перекрестной дот-блот гибридизации с Cotí фракциями геномной ДНК А.сера и A. fistulosum выявил два ВАС клона. С помощью FISH была показана видоспецифичная локализация ВАС клона 5.12.7 в субтеломерном регионе и ВАС клона 5.10.7 в центромерном регионе на хромосомах А. fistulosum.

4. В результате полного секвенирования ВАС клона 5.12.7 собрано 1062 контига, суммарная длина которых составила 534407 п.н..

5. Методами биоинформатического и филогенетического анализа последовательностей ДНК ВАС клона 5.12.7 были отобраны повторы-кандидаты в субтеломерные видоспецифичные повторы: (а) тандемные повторы AfiT347 (75 п.н.) и AfiT23 (255 п.н.); и (б) ретротранспозоны AÍÍRT515 (148 п.н.) и AfiRT628 (240 п.н.).

6. Установлено, что повтор AfiT347 является общим для А. fistulosum и А.сера тандемным повтором, диспергированным по всем хромосомам у обоих видов. Установлено наличие инверсий фрагментов повтора AfiT347. Расчетное число копий этого повтора - 2444608/2С, что составляет 0,08% генома A. fistulosum.

7. Найден видоспецифичный A. fistulosum субтеломерный повтор AfiT23 (255 п.н.), доказана его тандемная организация и строгая локализация на физических хромосомах A. fistulosum. AÍIT23 может быть использован для мониторинга интрогрессии генетического материала от A. fistulosum в геном А. сера в селекционных программах.

8. Установлено, что последовательности AfiRT515 и AfiRT628, входящие в ВАС клон 5.12.7, с гомологией на аминокислотном уровне к домену обратной траскриптазы Ty3/gypsy ретротранспозонов Tat4-1, Tft2, RIRE2 (для AfiRT515) и Gloin, Lególas, Ogre (для AfiRT628), являются общими для A. fistulosum и А.сера и распределены по всей длине хромосом у обоих видов.

9. Проведено полное секвенирование ВАС клона 5.10.7, локализованного в центромерном регионе. Было собрано 276 контигов, суммарная длина которых составила 128411 п.н.

10. Найден видо- и хромосомоспецифичный тандемный повтор A.fistulasum AfiT32 (197 п.н.) в ВАС клоне 5.10.7, который локализован в центромерной области 5-ой и 6-ой хромосом A. fistulosum. Расчетное число копий АПТ32 - 104765/2С, что составляет 0.09% генома А. fistulosum. Данный повтор может быть использован для интегрирования генетических и физических карт A. fistulosum и в селекционных программах для мониторинга интрогрессии генетического материала от донора к реципиенту.

11.Скрининг ВАС библиотеки с праймерами AceRl на GSS сиквенс А. сера (ЕТ645811.1), который имеет сходство с обратной транскриптазой Beetle 1 и CRM Ty3/gypsy центромерных ретротранспозонов Beta procumbens и Zea mays, выявил 7 ВАС клонов. С помощью FISH изучена их хромосомная организация. Были выявлены сигналы гибридизации в центромерном регионе и других участках хромосом.

12.Показано, что в состав центромерной области А. сера и А. fistulosum входят Ty3/gypsy ретротранспозоны. FISH с ПЦР продуктом с праймерами AceRl доказал локализацию Ty3/gypsy в центромерном регионе у А. сера и А. fistulosum. Характер локализации Ty3/gypsy отличался: сконцентрированные преимущественно в центромерном регионе у А. сера и более диспергированные по хромосомам у А. fistulosum. Было рассчитано предполагаемое число копий центромерных ретротранспозонов ТуЗ/gypsy, которое составило для А. сера - 25651/2С копий и для А. fistulosum - 6671/2С копий. Установленные различия в хромосомной организации центромерных ретротранспозонов Ty3/gypsy у А. сера и А. fistulosum могут указывать на разные пути эволюции геномов у этих двух близкородственных видов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами впервые была создана ВАС библиотека лука батуна, состоящая из более 1000 ВАС клонов. Целью для ее создания стало эффективное использование геномной библиотеки в молекулярно-цитогенетических исследованиях для анализа хромосомной организации геномов растений (Dong et al., 2000; Lysak et al., 2001; Qi et al., 2013; Ziolkowski, Sadowski, 2012). Если клонирование небольших последовательностей ДНК in vivo стало рутиной в молекулярных лабораториях, то создание библиотеки геномной ДНК в бактериальных искусственных хромосомах остается сложной технической процедурой, требующей специального оборудования, реактивов и навыков работы.

Для скрининга ВАС библиотеки были созданы ДНК-зонды на важные морфологические структуры хромосом, такие как субтеломерный и центромерный регионы, а также на видоспецифичные последовательности. В результате скрининга с созданными ДНК-зондами был выявлен ВАС клон 5.12.7 с видоспецифичным субтеломерным повтором, ВАС клон 5.10.7 с видо-и хромосомоспецифичной центромерной последовательностью, 4 ВАС клона с общим субтеломерным повтором луковых и 7 ВАС клонов с последовательностью обратной транскриптазы ТуЗIgypsy ретротранспозонов с центромерной локализацией. Было проведено концевое или полное секвенирование отобранных клонов. Для сборки контигов и анализа ДНК последовательностей был использован большой арсенал современных методов и компьютерных программ.

Сконструированная ВАС библиотека будет активно использована для секвенирования генома А. ßstulosum, изучения эволюции генома луковых и в функциональной геномике. Найденные и тщательно проанализированные видо- и хромосомоспецифичный тандемный повтор, видоспецифичный субтеломерный тандемный повтор, центромерные Ty3/gypsy ретротранспозоны и ретротранспозоны того же семейства Ty3/gypsy, но диспергированные по всему геному, пополнят наши знания о молекулярной организации и эволюции хромосом луковых и их основных морфологических и функциональных структур теломеры и центромеры. Созданные молекулярно-цитогенетические маркеры послужат для интегрирования рекомбинационных и физических карт. Полученные данные могут быть использованы в практической селекции для мониторинга интрогрессии генетического материала от А. ßstulosum в геном лука репчатого.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Киселева, А. В. Сравнительная организация субтеломерного гетерохроматина у Allium fistulosum L., Allium сера L. И Allium wakegi с использованием BAC-FISH / А. В. Киселева, И. В. Киров, О. С. Павленко, Д. В. Романов, Л. И. Хрусталева // Известия ТСХА. - 2013. - № 4. - С. 2331.

2. Киселева, А. В. Создание геномной ВАС библиотеки Allium fistulosum L. для получения цитогенетических маркеров / А. В. Киселева, И. А. Фесенко, Л. И. Хрусталева // Известия ТСХА. - 2012. - № 6. - С. 31- 39.

3. Khrustaleva, L. The Chromosome Organization of Genes and Some Types of Extragenic DNA in Alliums (Хромосомная организация генов некоторых типов негенной ДНК у Allium) / L. Khrustaleva, G. Karlov, I. Kirov, Lapitskaya I., D. Romanov, M. Budylin, A. Kiseleva, I. Fesenko // Acta Horticulturae. - 2012. - № 969. - P. 43-51.

4. Киселева, А. В. Сравнительная молекулярная организация прицентромерной области хромосом Allium сера и A. fistulosum / А. В. Киселева, И. В. Киров, М. В. Будылин, Д. В. Романов, Л. И. Хрусталева // Сборник тезисов участников XIII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва.-2013,- С.26-27.

5. Киселева, А. В. Изучение генома Allium fistulosum L. с использованием ВАС библиотеки / А. В. Киселева, И. В. Киров, Д. В. Романов, М. В. Будылин, Л. И. Хрусталева // Сборник тезисов участников XX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, Москва. - 2013. - С. 83-84.

6. Khrustaleva, L. The Chromosome Organization of Genes and Some Types of Extragenic DNA in Alliums (Хромосомная организация генов некоторых типов негенной ДНК у Allium) / L. Khrustaleva, I. Kirov, D. Romanov, M. Budylin, Lapitskaya I., A. Kiseleva, I. Fesenko, G. Karlov // Материалы 6-го Международного симпозиума по съедобным Alliaceae, Фукуока, Япония, 21-24 мая.-2012.-Р. 34.

7. Киселева, А. В. Компаративная геномная in situ гибридизация (cGISH) на хромосомах луковых с использованием геномной ДНК Arabidopsis thaliana / А. В. Киселева, Л. И. Хрусталева /У Сборник тезисов участников Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, Москва. - 2012. - № 1. - С. 46-49.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность и благодарность своему научному руководителю - доктору биологических наук, профессору Хрусталевой Людмиле Ивановне за бесценную помощь при выполнении и написании научной работы; всем сотрудникам кафедры генетики и биотехнологии, особенно доктору биологических наук, профессору Соловьеву Александру Александровичу и кандидату биологических наук Большаковой Людмиле Семеновне за постоянную поддержку и помощь; всем сотрудникам Центра молекулярной биотехнологии, особенно доктору биологических наук, профессору Карлову Геннадию Ильичу, кандидату биологических наук Дивашуку Михаилу Георгиевичу, Кирову Илье Владимировичу и Павленко Ольге Сергеевне за оказанную помощь на всех этапах подготовки и проведения научной работы. Отдельную благодарность автор выражает кандидату биологических наук Фесенко Игорю Александровичу за полученные знания и навыки; своей семье и друзьям за понимание и неоценимую поддержку.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60х84'/]6. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 487.

Издательство РГАУ - МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.: (499) 977-00-12, 977-26-90,977-40-64