Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОРГАНИЗАЦИЯ ТЕЛОМЕРНОЙ ДНК ALLIUM FISTULOSUM L.

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "ОРГАНИЗАЦИЯ ТЕЛОМЕРНОЙ ДНК ALLIUM FISTULOSUM L."



На правах рукописи

ФЕСЕНКО Игорь Александрович

ОРГАНИЗАЦИЯ ТЕЛОМЕРНОЙ ДНК ALLIUM FISTULÖS UM L.

Специальности: 00.03.23 - биотехнология, 00.03.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Научный руководители:

доктор биологических наук, профессор Л И Хрусталева кандидат биологических наук Г И Карлов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Егоров Е Е Кандидат биологических наук Сотовьев А А

Ведущая организация:

Московский государственный университет им М В Ломоносова

Защита состоится /i " июня 2005 г в А часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева по адресу 127550, г Москва, ут Тимирязевская, д 49

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке

МСХА

Автореферат разослан *¿¿¿lcs 2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Е А Калашникова

Актуальность темы. Одним из основных элементов эукариотических хромосом являются теломеры, их физические окончания. Установлено, что теломеры защищают хромосомы от деградации нуклеазами и прогрессирующего укорачивания в результате незавершенной репликации в 5'-концах (Zakian, 1995). Имеются данные о важной роли теломер в коррекции спаривания гомологичных хромосом в мейозе (Heslop-Harrison et al., 1993; de Lange, 1998). Недавние исследования тонкой молекулярной структуры теломер указывают на их важную роль в процессах старения организма и пролиферации клеток (Егоров, 2001).

Теломеры большинства групп организмов представлены простыми повторяющимися GC-богатыми последовательностями ДНК (Futch et. al.,1995). Для высших растений характерен теломерный повтор - TTTAGGG (арабидопсис-тип) (Richards and Ausubel, 1988). Показано, что представители филогенетической ветви - Аспараговые, к которой относится семейство Луковые, потеряли растительный теломерный повтор и взамен, на концах хромосом, содержат характерный для позвоночных повтор - TTAGGG (Adams et. al. 2001, Sykorova et. al. 2003a). Однако, в отличие от других видов растений, у лука репчатого (Allium сера), не обнаружены ни арабидопсис-тип ни характерный для позвоночных теломерный повтор (Fuchs et. al., 1995, Sykorova et. al. 2003). Показано, что окончания хромосом лука репчатого (А. сера) и лука-батуна (A.fistulosum) содержат сателлитную ДНК размером 378-380 пар нуклеотидов (Irifune et al., 1995). В настоящее время неизвестно, как луковые защищают окончания своих хромосом и какие последовательности ДНК выполняют функцию теломер. Поэтому данные о строении и природе последовательностей ДНК составляющих теломеры A. fistulosum дополнят наши знания по эволюции растительной теломеры, ее молекулярной организации и функционированию. Более того, данная работа представляет практический интерес для селекции лука репчатого, так как лук-батун (А. fistulosum L) является источником хозяйственно-ценных генов, таких как, устойчивость к ржавчине (Urocystis cepulae Frost) (Jones and Mann, 1963), шейковой гнили (Botrytis squamosa Walker), луковой мухе (Hylemyia antique Bouche), корневой гнили (Phoma terrestris E. M. Hans.) (Porter & Jones, 1933), устойчивость к холоду, a также генов контролирующих высокое содержание сухого вещества (Van Der Meer and Van Benekom 1978). Данные об организации теломерной ДНК A. fistulosum L. необходимы для мониторинга и успешной интрогрессии генов в селекционных программах (Khrustaleva et al., 2005).

Цели и задачи исследования.

С целью выяснения механизма восстановления тетомерных окончаний хромосом у A fistulosum была изучена геномная организация теломерной ДНК При этом были поставлены следующие задачи

1 С помощью FISH и стот-блот анализа провести поиск последовательностей ДНК гомологичных теломерным повторам позвоночных и арабидопсиса

2 Изучить организацию сзтетлитного тетомерного повтора с помошью ПЦР, Саузерн-гибридизации и рестрикционного анализа

3 Изучить организацию и локализацию сателчитной ДНК на митотических хромосомах и растянутой ДНК с помощью FISH анализа

4 Опредепить наличие в структуре теломерных повторов микросателлитов и ретротранспозонов

Начиная новизна и практическая ценность работы. Впервые применен комплексный подход для изучения геномной организации сателлитного терминального повтора Allium fistulosum (378 по), включающий набор молекулярных (ПЦР, рестрикционный анатиз, Саузерн-бюттинг) и молекутярно-цитогенетических (FISH на митотическую и растянутую ДНК) методов Показано, что сателчитная ДНК A fistulosum организована тзндемно (в ориентации "голова-хвост') и содержит кластеры постедовательностей ДНК с перестройками в исходном сателлитном повторе 378 пн Выявлено, что в области сателлитного терминального повтора присутствуют микросатечлиты и ретротранспозоны

Впервые показано, отсутствие на окончаниях хромосом A fistulosum функционального теломерного повтора TTAGGG, характерного дтя позвоночных Однако выявлено, что в терминальном гетерохроматине присутствуют фрагменты теломерного повтора TTAGGG

На основе полученных данных построена модеть организации ДНК терминального сателтитного повтора Л fistulosum и предложены возможные механизмы восстановления те томер у туковых

Полученные данные по молекулярной структуре тетомерных повторов у Allium fistulosum могут быть использованы для мониторинга и успешной интрогрессии генов в селекционных программах На основании данных о нуклеотидной последовательности клонов теломерной ДНК могут быть разработаны молекулярные маркеры

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научной генетической конференции, посвященной 100-тетию со дня рождения А Р Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской

сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (2002); 4-й международной российско-иранской конференции «Сельское хозяйство и природные ресурсы, 2004; на научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов МСХА, 2004. Публикации

По теме диссертации опубликованы 4 печатных работы. Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на //Страницах машинописного текста и включает 34 рисунка и 6 таблиц. Диссертация состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты исследований", "Объсуждение","Выводы" и "Список литературы". Список цитируемой литературы включает /^¿/наименований, из них/££$иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В работе был использован следующий растительный материал: лук-батун A. fistulosum (2п=16), линии CGN 14763; .тук репчатый А. сера, сорт Jumbo (полученные из Центра генетических ресурсов, Вагенинген, Нидерланды).

Растительный материал выращивали в пленочной теплице. Семена проращивали в чашках Петри при температуре 24°С.

Получение цитологических препаратов. Цитологические препараты для флюоресцентной in situ гибридизации были приготовлены методом давления.

Выделение ДНК. ДНК выделяли из молодых листьев по методу Bernatzky и Tanksley (1986) с некоторыми модификациями.

ПЦР-анализ. Для изучения структуры сателлитного повтора использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). На основании данных о нуклеотидной последовательности сателлитного повтора лука-батуна (Irifune et al. 1995) были подобраны и синтезированы праймеры:

34902 5'-ATCGATTCTTCGGACGGCCT-3'

34903 5ATCCGCAGGGTGCAACATCTGCGG-3'. Праймеры, обратные выше названным:

34905 5' - AG ATGTTGC ACCCTTCGG АТ-3'

34906 5' -TGGCCGTCCG A AG A ATCGAT-3'

Для анализа также были использованы праймеры специфичные для растительного теломерного повтора:

PTELOl 5' ТТТ AGG GTT TAG GGT TTA GGG TTT AGG GTT TAG GG 3' PTEL02 5' CCC TAA ACC СТА A AC CCT AAA ССС ТА А АСС СТА А А 3'

Праймеры, специфичные для гетомерного повтора млекопитающих HTELOl 5' ТТА GGG ТТА GGG ТТЛ GGG ТТА GGG ТТА GGG 3' HTEL02 * СССГААССС ГА Ч ССС ТА\ ССС ГА А ССС 1АА V

Амтификацию проводили на амплификаторе * Терцик ( ДНК-технология", Москва)

Продукты ПЦР разделяли в 1 5°о агарозном геле с буфером ГВЕ при напряженности поля 6 V см В качестве маркера размеров испо 1мовали 100 bp leader" (Fermentas)

Гибридизация по C.iv iepiiv. После электрофореза ДНК переносили на мембрану Immobilon-N (Vlillipore LSA) с помошью вакуумного насоса (Millipore, LSA) В качестве метки исполыовали шнды, меченные biotin-ll-dUTP ( Синтол', Москва) поточенные методом ПЦР Детекцию проводили с помощью щелочной фосфатазы, ковалентно связанном со сгрептавилином

Фиооресиентная /и situ гибридизация Флюоресцентную m um гибридизацию проводили как описано (kh^ustaleva & kik 1998) Зонды, меченные биотином и дшокеигенином полунаги с помошью ПЦР Смесь для мечения биотином была получена коммерчески и содержала Bio-lldLTP ( Синтол , VIocKBa) Для детекции биотина использовали системч стретгавидин-антистрептавидин с красителем СуЗ (Vector Laboratories Burlmgaire, Cal ISA) Дигок'си' екин детектировали с помощью системы FITC-антидигочсигенин (Boebrny.- Manrenhein, Cjermany) Хромосомы окрашивали с 6 мг*мл DAPI в Vectashield Анализ FISH-сигнала бь i проведен на флуоресцентном микроскоьс Axiophot ( Zeiss , Германия) с соответствующей системой ии ыров Для анализа изображении производи ш фотосъемку на пленку Fuji 400 После проявки п 1енку сканировали в компьютер н обрабатывали изображение, используя программу Photoshop < О

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Геномная организация сагепитной ДНК

1 1 ПЦР шализ с праймерами на сателлитный повтор

Для ПЦР анализа бь.ли использованы две пары праимеров первая пара праймеров 34902 и 34903 в прямой ориентации и вторая пара праимеров 349US и 34906 в обратной ориентации При этом праимер 34902 был комплиментарен 34906, а праймер 34903 комплиментарен 34905

При проведении ПЦР с праймерами 34902 и 34903 амплифицировали два фрагмента ДНК размером 378 и 760 п.н., что соответствует длине теломерного повтора. При использовании только одного праймера 34902 происходила амплификация сдвоенных фрагментов длиной от 195 до 1040 п.н. (рис.1-1) Амплификация таких фрагментов ДНК показывала некоторую периодичность с шагом 380-400 п.н. При одностороннем ПЦР с праймером 34903 амплифицировалась лестница фрагментов являющихся мультимерами фрагмента 395 п.н. (рис.1-2). При использовании праймера 34903 в обратной ориентации (праймер 34905) также амплифицировалась лестница фрагментов с шагом в 400 п.н. (рис.1-3). При ПЦР с праймером 34906, амплифицировалась лестница фрагментов, начиная с фрагмента, размером 400 п.н. (рис. 1-4).

Для оценки степени гомологии между полученными фрагментами и сателлитной ДНК 378 п.н., была использована гибридизация по Саузерну. Было выявлено, что полученные при односторонней амплификации фрагменты ДНК проявляют гомологию к сателлитному повтору и, по-видимому, являются результатом перестроек в тандемном сателлитном повторе. Следует отметить, что размеры ПЦР-продуктов, образующихся при амплификации с одним из теломерных праймеров, практически во всех случаях (за исключением праймера 34903) были меньше исходной единицы повтора.

Рис. 1. Результаты одностороннего ПЦР с сателлитными праймерами.

1 - праймер 34902, 2 - праймер 34903, 3 - праймер 34905, 4 - праймер 34906, М - маркер

Такие данные говорят о том что перестройки в те^омерных регионах Л fistulusum не являются результатом образования в структуре гандемного теточерного повтора участков с организацией единиц повюра в ориентации голова-к-годове и xboct-k-xhoctv, как это было описано Вершининым с соавторами на ржи (Vershinm et al, 11>Q5)

1 2 Рестрикционныи анализ

Для ботее летального изучения перестроек в сателзитноч повторе быт проведен рестрикшюнныи анализ грех фрагментов 3^5 п н - продукт праимера 34О03, 145 пн - продукт праимера 34402 и 378 ri н - исходной посзедовательности Фрагменты бьь-и обработаны восемью рестриктазами (Bam HI, EcoRI, EcoRV, Нае III HindlH, Pst I. Taq I, HincII) Бы ю установлено что перестройка, приведшая к обраюванию последовательности 395 п н могла реализоваться вследствие инверсии участка содержаыего сайт дтя праимера 34903 (Рис 2) Причем такая перестройка по-видимому, возникла непосредственно в тандеме о чем говорят данные ПЦР

-SÄ.

395 п н

► праимер 34902

праимер 34903 ^ место инверсии

Рис 2 Модель инверсии, которая может приводить к получению ирод v к та праймера 34903 размером 395 п н

При амплификации с праймероч 34905 были получены фрагменты 180, 560, 940 пни выше Исходя из предложенной выше модели инверсии сайта содержащего праймер 34403, ожидаемый ПЦР продукт от обратного к нему праимера 34905 должен составить 400 п н Ампификапия фрагмента меньших размеров (1Ь0 пн) может свидетельствовать о наличии наряду с инверсиеи

также делении. Рестрикционный анализ с Нае III, Hinc II, EcoRV, Taql показал, что деледия произошла в области близкой к сайту инверсии (рис. 3).

$23

-SSl

395 п.н. 378 п.н.

<>Z2

фа

<=э

180 П.н. праймер 34905 ^ праймер 34903

<£¿1 праймер 34902

место инверсии

место возможной делеции

Рис. 3. Модель перестроек в сателлитном повторе, приводящих к амплификации продуктов ПЦР с праймером 34905

Для проверки степени гомологии ПЦР продуктов с обратными праймерами к исходной теломерной последовательности была использована Саузерн-гибридизация с ДНК-зондом 378 п.н. Обнаружена сильная гибридизация со всеми продуктами ПЦР. Такие данные показывают, что продукты перестроек в сателлитном повторе, происходят внутри единиц этого повтора или между ними. Полученные продукты ПЦР с одним праймером указывают, что перестройки сателлитной ДНК, такие как делеции, инсерции и инверсии происходили довольно часто.

1.3 Гибридизация in situ на растянутую ДНК A. fistuiosum Для изучения геномной организации сателлитной ДНК была использована флюоресцентная in situ гибридизация на растянутую ДНК A. fistuiosum, в качестве пробы был использован сателлитный повтор, полученный с помощью праймеров 34902 и 34903.

Метод растянутой ДНК позволяет визуализировать отдельные молекулы ДНК, растянутые на стекле. Такой метод дает возможность изучать организацию сателлитного повтора на отдельных молекулах ДНК. При гибридизации сателлитного повтора 378 п.н. на растянутую ДНК был получен прерывистый сигнал указывающий на возможное наличие вставок несателлитной ДНК в теломерный повтор (рис.4).

Рис 4 Флуоресцентная т чаи гибридизация метки 378 п н на растянутмо ДНК ■< и1отт

Стрелчачи показаны места ьо полных вставок несателлитной ДНК

1 4 ПНР анализ неигге-'читнои ДНК

Анализ организации сателлитнои ДНК на уровне отдельных молекул полазал наличие не^атеплтнои ДНК в тетомерном районе Быта предположено, что участки между сайтами гибридизации представляют собой чикрое.пепиты и или ретротранспозоны Для проверки )тои гипотезь был проведен ПЦР с использованием праимеров 34902 "¡4903 34905, 34906 с праймерами на межмикросате питные последовательности и фрагмент обратной гранскриптазы регротранено ¡она Ту 1-сорта (Рг1 и Рг2)

При исгсьзовании микросате питного праймера (ОА)Ь УС и ьраймеров на сателлитныи повтор были получены дополнительные фрагменты с праймерами 34905 и 34902 Размер поучившихся фрагментов состави I окото 175 пн (праимер 34902) и ¡60 пн (праимер 3490^) Поскольку такие микросателлитные мотивы отсутствуют в нуклеотидной нос ¡еловсл ельности сателлитного повтора 378 пн (1пШпе ег а1 1495) такие резУ1ьгаты тишь подтвердили нашу гипотезу о том что получившиеся ПЦР продукты ре)У тыат перестроек в сателлитном повторе

При изучении во$можного присутствия регротранспоюнов в терминальном гетерохроматине бьп испотьзован ПЦР с сатеттитными праймерами и праймерами на фрагмент обратной гранскриптазы ретротранспозона Ту1-соры (Р-1 и Рг2) Был обнаружен дополнительный фрагмент размером 120 п н при ПЦР с сател штными праймерами 34905 и Рг2 (рис 5а) При Са\"зерн-гибридизации с ПЦР продуктами, гле в качестве юнла использовалась теломерная последовательность 378 п н сигнал не детектировался на фрагменте 120 п н (рис 5в)

Рлс 51 Реjv"ьтаты ПЦР с сатепитныч праймером 34905 и

ретротранслозонныч праймером Рг2 4 - 1 - пр,.шмер 34'М)* 2 -1 рмшьр 34У0< и Pi 2 3 - маркер рилмьра Б -2 Си\ jeрн I jpitàiu 1 ,1<я rat ■•ovcpuoti по^.ш)оьыпе.гьности j "V п н на ПЦР tpod\hir>u rp nïui-puts 34W5 и PR2 I - I puiatt-p 34У<1^ 2 г рлшьр 34<Л)5 и Рг2 3 - с ci а <. -чипнии похтор 3 74 п н Стр<. ¡кои ! окл in фра Wtum сlaâo *.u3puàiu\ ющнйся с пычом^рным гоачорои

При гибридизации этого фрагмента на рестрицированную геномную ДНК 1 l,\tulontm и Г1ЦР-продукт 378 п н наблюдалась очень стабая гибридлзаьия на ПЦР-продукт и часть высокочотекузярнои геномной ДНК У 1 cep j бы~ш обнаружены в течочерных окончаниях хромосом гос ^едоваге 1ыюсти гимошгичнье к транспортам (Pich et al , 1948) Данные, штченные Pi^h <_t j! (IWK) и наши ре ivтьгаты говорят о во¡можнои ро ш чобитьныч лементов в формировании тетомер у Луковых

2. Из\чение локализации продуктов амплификации на хромосомах Л ß\tulosum

Д -я к сучения юкализации теточерного повтора и продуктов его ачптификации на хромосомах мы испотьзовали флуоресцентную m situ гибри нплшю Допо'т.печьныи фрагмент ДНК полученный в результате амтификации с сатепитныч праймером и чикросатетштныч праймером (GA}8 YC бы I помечен и гибридизован на хромосомы i fhtulasuni При гибридизации бьп moivich четкий сигнал на течомерах, в нескотьких принентримерных и интерстициольных сайтах (рис 7)

Рис. 6 Результаты in situ гибридизации ПЦР-продукта праймеров 34902 и GA8YC на хромосомах A. fistulosum.

Продукт амплификации между сателлитным праймером 34905 и ретротранспозонным Рг2 также был гибридизован на хромосомы А. fistulosum. По данным FISH сигнал преимущественно локализовался в теломерной части. Также наблюдали слабый сигнал, распределенный по всей хромосоме. Так как данный продукт не имеет гомологию с теломерной последовательностью 378 п.н., то видимо он гибридизуется на другие участки теломерного гетерохроматина. Поскольку мы получили достаточно сильный сигнал из теломерной области, то можно сделать вывод о присутствии в данной области множества участков для гибридизации этой последовательности, что свидетельствует в пользу того, что данный продукт не является результатом уникальной вставки. Также, были локализованы продукты амплификации праймера 34902 и продукт амплификации праймера 34903 размером 395 п.н. В первом случае мы получили четкий теломерный сигнал, говорящий о том, что продукты амплификации результат перестроек в тандемном сателлитном повторе 378 п.н. Фрагмент 395 п.н. локализовался в теломерной области и в нескольких интерстициальных сайтах (рис. 7).

Рис 7 Результаты in situ /iiiipiiji' шит i роду кта ПЦР с праймером <4903 (395 II и ) на чромосомы 1 / sn о\ит

В результате проведенных исследований бы ¡а построена модель ор!анизации сате 1"итною повтора в терминальном гетерочроматине •1 fis'ulo\um(рис 8)

Теломеры^

Перестройки в сателпитном повторе

Несателлитная ДНК

(микросателлиты

ретротранслозоны)

Рис 8 Модель организации сателлитного повтора в терминальном гетерочроматине i fi%tu!o\um

3. Слот-блот анализ геномной ДНК A. fistulosum с теломерным повтором позвоночных -TTAGGG

Для некоторых представителей Аспараговых, таких как Aloe, Hyacinthella, Othocalis siberica было показано наличие теломерных повторов, характерных для позвоночных (Weiss-Schneeweiss et. al. 2004, Weisss and Scherthan 2002). Для анализа генома A. fistulosum на наличие теломерных повторов, характерных для позвоночных был использован метод слот-блот гибридизации - и флуоресцентной in situ гибридизации. Однако и слот-блот анализ и флуоресцентная in situ гибридизация не показали наличия этих последовательностей в геноме A. fistulosum. Такие данные соответствуют результатам, которые получила Sykorova и др. (2003 а) при изучении А. сера, в геноме которого не было обнаружено теломерных повторов TTAGGG (характерного для позвоночных), а также TTAGG (характерного для насекомых), TTTTAGGG (характерного для водорослей), TTTTGGGG и TTGGGG (характерных для простейших) (Sykorova et. al., 2003 а). Таким образом, оба близких вида из семейства Луковых показывают отсутствие в геноме теломерных повторов тех типов, которые были обнаружены у высших растений - арабидопсис-тип и повтор, характерных для позвоночных.

4. ПЦР аналнз геномной ДНК с праймерамн на теломерный повтор TTAGGG и TTTAGGG

Для детального анализа наличия в геномах А. сера и A. fistulosum нуклеотидных последовательностей теломерных повторов обоих типов использовали праймеры, обозначенные как PTelol и РТе1о2, гибридизующиеся с теломерным повтором арабидопсис-типа и HTelol и НТе1о2, гибридизующиеся с теломерным повтором, характерных для позвоночных. ПЦР с праймерами, специфичными для теломерного повтора, характерного для позвоночных, показал наличие последовательностей ДНК, специфичных для этого повтора в геномах А. сера и A. fistulosum. При проведении ПЦР амшшфицировалось несколько четких фрагментов и протяженные шмеры (Рис. 9). При этом размеры амплифицированных фрагментов ДНК различались у обоих видов и обнаруживали схожесть только при ПЦР с праймером HTelo 2. При повышении температуры отжига до 70°С не происходило изменение размеров продуктов амплификации, что указывает на высокую степень гомологии между праймерами и сайтами посадки праймеров. Поскольку слот-блот гибридизация и in situ гибридизация не показала наличие в геномах обоих видов Луковых какого-либо значительного количества нуклеотидных последовательностей теломерных повторов обоих типов, амплификация, по-

видимом\ происходит от разбросанных по геному, коротких ччастков те юмерного повтора

1 2 3 4 М

Рис ч Резч-'ь'^ть ПЦР с праимерами специфичными на геломернь.и повтор

позвоночных (Н Ге!о! и НТе1о2) Дорожки I и 2 аиплифшаци г с. прайиьрами НТьЫ и НТь1о2 ¡.оот^шетпьнно на ДНК 1 сер г

Дорожки 3 и 4 амтифика цш и праимерами НТе1о1 и НТс1о2 соотььт<,1гь1,нно ни ДНК I ш!о.\ит V- маркер раз \ttpo«

Поско ьк\ при ПЦР образовывались в основном фрагменты ДНК варьирующей дшны наличие в геноме инвертированных V частков приводящих к амплификации фрагментов ДНК определенного размера очень мало

5. Локлизапия продуктов амплификации щыймеров НТе1о1 и НТ1ео2 н.1 \ро\юсомл\ А. П*П11омпп.

Дм млчения локализации продуктов ПЦР с тетомерными граймерами НТе1о1 и НТс1о2 была гитользована флюоресцентная т 5 т гибридизация С по й целью меченые продукты ПЦР гибридизовалиеь на хромосомы •1 /ыи/оиьшг Продукты амплификации пралмера НТе1о1 показали геломерную локализадию на некоторых но не всех хромосомах А /пщ1ии.и<т (рис 10) Гакие данные позволяют сделать предположение, что на окончаниях хромосом присутствуют остатки гелочернот повтора ТГЛООО Таким образом у Луковых чопо произойти ¡амещение предкового повтора арабадопсис-гипа на повтор характерный для почвоночных

Рис. 10. Результаты флуоресцентной in situ гибридизации продуктов ПЦР праймера HTelol на хромосомы A.fistulousum.

Однако в процессе эволюции произошла утрата и этого повтора. Остатки этого повтора могли послужить сайтами посадки для праймеров и амплифицировать последовательность, заместившую теломерный повтор ТТАОСС (рис.11). Подтверждением этой гипотезы может служить отсутствие сигнала при гибридизации продуктов ПЦР праймера НТе1о2. Связано это с тем, что праймер НТе1о1 удлиняется по направлению к теломере, таким образом, позволяя амплифицировать тот повтор, который, возможно, заместил теломерный повтор ТТАОСО.

HTelol

►

ААТСССААТСССААТСССААТ| TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA

^мннмшв^вв^^ теломера

НТе!о2

Рис. 11 Модель амплификации повтора, заместившего теломерный повтор ТТАОСО.

Возможно, в процессе эволюции у Луковых произошла потеря теломерного повтора и функцию защиты теломер стал выполнять сателлитный повтор, обогащенный ретротранспозонными последовательностями. Также, возможно, что произошло замещение этого повтора на другой, неизвестный для других групп организмов.

выводы

1 Сателлитная ДНК в терминальном гетерохроматине А /ЪшЬзит организована тандемно (в ориентации "голова-хвост") и содержит кластеры последовательностей ДНК с перестройками в исходном тетомерном повторе 378 п н Перестройки являются частями единицы сателлитного повтора и образуются в резутьтате инверсий и детеций в структуре повтора

2 Продукты перестроек в сателлитном повторе локализуются в терминальном гетерохроматине всех 16 теломер и в интерстициальных участках на некоторых хромосомах

3 Установлено наличие микросателлитов и ретротранспозонов в терминальном <_ателлитном повторе А ]1$ш1ояит

4 На окончаниях хромосом А }тикпит отсутствует функциональный геломерный повтор ТГАООО, характерный для позвоночных, однако, выявлены отдельные фрагменты этого повтора в теюмерной ДНК, что указывает на его наличие у предка современных туковых

5 Построена модель геномной организации теломерного повтора на основании которой предлагается возможный механизм восстановления теломерных окончании хромосом у 4 }Ъш1озит функции ишиты теломер может выполнять сателлитный повтор, обогащенный ретротранспозонными последовате льностями

Список опубликованных работ по материалам диссертации

1. G.I.Karlov, G.N.Andreeva, I.A.'Fesenko, L.I. Khrustaleva. Characterization and chromosome location of Ту 1-copia group retretransposons in some Alliaceae, Liliaceae and Iridaceae species (Характеристика и локализация на хромосомах Ту 1-copia ретротранспозонов у некоторых представителей Alliaceae, Liliaceae и Iridaceae) И Cytogenetics and Cell Genetics, v.85, 1-2-, 1999. P.135

2. Карлов Г.И., Фесенко И.А., Андреева Г.Н., Тикунов Ю.М., Хрусталева Л.И. Изучение физической организации Tyl-cjpia и Ty3-gypsy подобных ретротранспозонов в геноме томата, лука, тюльпана и крокуса // Материалы науч. конф., посвященной 100-летию со дня рождения А.Р. Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева - М.: Изд-во МСХА, 2002.-С. 136

3. З.Фесенко И.Л., Хрусталева Л.И., Карлов Г.И. Использование оптического картирования для изучения структуры генома лука-батуна // Материалы науч. конф., посвященной 100-летию со дня рождения А.Р. Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева - М.: Изд-во МСХА, 2002.-С. 336-337

4. Фесенко И.А., Хрусталева Л.И. и Карлов Г.И. Изучение организации сателлитного повтора 378 п.н. в терминальном гетерохроматине Allium fistulosum // Генетика, 2002, том 38, №7 - С. 894-903

Объем 1,0 печ. л. Зак. 304. Тираж 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО МСХА им. К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44