Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хромосомная организация некоторых семейств повторяющейся ДНК у Allium cepa L. и Allium fistulosum L.

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Хромосомная организация некоторых семейств повторяющейся ДНК у Allium cepa L. и Allium fistulosum L."

На правах рукописи

БУДЫЛИН Михаил Вячеславович

ХРОМОСОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ НЕКОТОРЫХ СЕМЕЙСТВ ПОВТОРЯЮЩЕЙСЯ ДНК У ALLIUM СЕРА L. И ALLIUM FISTULOSUM L.

Специальность: 03.02.07 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 3 ДЕК 2012

Москва-2012

005057130

005057130

Работа выполнена в научно-образовательном Центре молекулярной биотехнологии ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Хрусталёва Людмила Ивановна

Официальные оппоненты:

Шилов Илья Александрович доктор биологических наук, профессор, ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук, лаборатория анализа геномов, заведующий лабораторией

Болшева Надежда Логиновна кандидат биологических наук, ФГБУН Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, лаборатория молекулярной кариологии и основ клеточной терапии, старший научный сотрудник

Ведущая организация: ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Защита состоится « 19 » декабря 2012 г. в 16-30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете -МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г.Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел./факс: (499) 976-24-92: e-mail: genetics@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева.

Автореферат разослан «16» ноября 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Полвека тому назад стало известно, что количество ДНК в геноме намного больше, чем это нужно для кодирования генетически наследуемой информации, т.е. не вся ДНК в геноме представляет собой гены. Повторяющиеся ДНК составляет значительную часть эукариотических геномов, количество которой варьирует у разных видов (Flavell et al., 1986). Лук репчатый (Allium сера L.) имеет огромный геном (1С = 16 415 млн. п.н.), 97% которого составляет повторяющаяся ДНК (Schmidt et al., 2000), для сравнения размер генома Arabidopsis thaliana - 125 млн. п.н., и повторяющаяся ДНК составляет лишь 10% генома (http://www.arabidopsis.org/agi.html). Интенсивные исследования повторяющихся последовательностей ДНК в последние годы показывают, что эти некодирующие ДНК влияют на экспрессию генов и способствует регулированию эпигенетических процессов (Ванюшин et al., 2006, Arbi et al., 2009).

В 1953 году Уотсон и Крик сообщили о своем блестящем открытии -молекулярной структуре молекулы ДНК (Watson et al.,1953), которая расположена и функционирует в хромосоме. Однако до сегодняшнего дня уровень наших знаний о молекулярной организации хромосом остается недостаточным. Разработка технологии флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) ознаменовала переход от классической цитогенетики в эру молекулярной цитогенетики и позволила намного расширить наши знания о молекулярной структуре хромосом.

Лук репчатый является не только важной сельскохозяйственной культурой как продукт питания человека, но представляет интерес для фармацевтической промышленности. Лук батун (Allium fistulosum L.) является источником генов устойчивости ко многим болезням, вредителям, факторам окружающей среды. В связи с проблемой отсутствия в генофонде лука репчатого ряда ценных признаков, лук батун может служить донором ценных признаков в селекции лука репчатого. FISH технологии позволяют визуализировать на хромосоме различные последовательности ДНК, родительские геномы в межвидовых гибридах, и таким образом следить за интрогрессией генетического материала от одного родителя к другому. Создание молекулярно-цитогенетических маркеров и изучение генома поможет в селекции новых сортов лука. Изучение различных семейств повторяющей ДНК и их организации в структуре хромосом пополнит наши знания о функции и эволюции некодирующей ДНК.

Цель и задачи работы. Цель работы - изучить хромосомную организацию некоторых семейств повторяющейся ДНК у Allium сера и Allium fistulosum.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Анализ распределения сайтов метилирования на хромосомах A.fistulosum с использованием антител к 5 - метилцитозину.

2. Физическое картирование высококопийных повторов (Cot-1 фракции А. fistulosum и А. сера) на хромосомах A. fisîulosum и А. сера с использованием in situ гибридизации.

3. Анализ межвидовых гибридов между A. fistulosum и А. сера с использованием Cot-1 фракции и геномной ДНК в качестве пробы для гибридизации in situ.

4. FISH анализ LTR ретротранспозонов Ту-1 copia и Ту-3 gypsy в геноме А. fistulosum и А. сера.

5. FISH анализ non-LTR ретротранспозона LINEs в геноме А. сера и А. fistulosum.

6. Физическое картирование ISSR-PCR продуктов на хромосомах А. fistulosum и А. сера.

7. Клонирование, секвенирование и FISH локализация центромерного повтора А. сера.

Научная новизна. Выявлен, клонирован и секвенирован прицентромерный повтор pCentAl-agc А. сера длиной 559 п.н.. До сих пор в подклассе Asparagales, к которому принадлежит А. сера, не было найдено прицентромерного повтора ни у одного вида. Впервые изучена физическая организация Ту 1 -copia ретротранспозонов на A. fistulosum и физическая организация Ту3-gypsy и LINEs на A. fistulosum и А. сера. Впервые выявлены стабильные сайты метилирования в терминальных областях хромосом 6 и 8 A. fistulosum и установлены различия в уровне метилирования у гомологичных хромосом. Показано наличие терминального видоспецифичного повтора у A. fistulosum. Впервые создана модель хромосомной организации некодирующий ДНК на А. сера и А. fistulosum.

Практическая значимость. Получены видоспецифичные молекулярно -цитогенетические маркеры, а именно, прицентромерный повтор у А. сера, терминальный повтор у A.fistulosum, ампликоны K10[AC]8YG, расположенные в проксимальной области короткого плеча хромосомы 2 у A. fistulosum, ампликоны К12 [ACjgG, расположенные на хромосоме 4 в дистальном районе короткого плеча и на хромосоме 5 в проксимальном районе короткого плеча А. сера, которые будут использоваться в селекции для мониторинга интрогрессии генетического материала в межвидовых гибридах луковых.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на II Международной научно-практической конференции "Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур.

Традиции и перспективы" (Москва, 2010), XII Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, 2011), XI молодежной научной конференции секции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011), б-ом Международном симпозиуме по съедобным Alliaceae (Фукуока, Япония, 2012), на Международной научной конференции молодых учёных и специалистов (Москва, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 110 страницах машинописного текста и включают 32 рисунка, 5 таблиц. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Выводы», «Заключение», «Список литературы», «Список иллюстративного материала» Список литературы включает 255 источников, из них 252 иностранных.

Объекты и методы исследования

Объекты исследования. В работе был использован следующий растительный материал: растения лука батуна A. fistulosum сорт Русский зимний, А. сера сорт Халцедон, выращенные в горшках в теплице. Межвидовые гибриды между А. сера и A. fistulosum, полученные во ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур: форма № 76 F5 А. сера * A. fistulosum, № 82 F5 А.сера х A. fistulosum, № 87 F3 А. сера х A. fistulosum, № 106 BCi [(F5 А. сера х A. fistulosum) х А. сера сорт Штутгартер Ризен], № 78 ВСг [(Fj А. сера х А. fistulosum) х А. сера сорт (Одинцовец) х А. сера сорт (Йыгева) и A. wakegi, предоставленный профессором М. Шигио (М. Shigyo), Ямагучи университет, Япония.

Выделение ДНК. Геномную ДНК выделяли из молодых листьев А. fistulosum сорта Русский зимний и А. сера сорта Халцедон СТАВ методом согласно Rogers & Bendich (1988) с некоторыми модификациями. Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием коммерческого набора реактивов «The GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit» (Fermentas, USA), согласно прилагаемому протоколу.

ПЦР-анализ. Амплификацию ретротранспозонов проводили с вырожденными праймерами для Ту 1 -copia PR 1 и PR 2 на обратную транскриптазу (Flavell et al 1997), для ТуЗ gypsy GyRT3 и GyRT4 на обратную транскриптазу (Friesen et al 2001), для LINEs BEL IMF и BEL2MR на обратную

з

транскриптазу (Kubis et al 2003). В ходе работы был использован набор ISSR праймеров.

Клонирование продуктов амплификации. Клонирование ПНР продуктов производили с помощью векторной системы pGEM® - Т Easy Vector System (Promega, U.S.A.), в соответствии с инструкцией фирмы производителя, в Е. coli. Трансформацию бактерий проводили методом электропорации.

Приготовление препаратов митотических хромосом. Приготовление цитологических препаратов метафазных хромосом А. сера и A. fistulosum проводили согласно Pijnacker et al. (1984) и Бочков и др. (1989) с некоторыми модификациями, а именно использование в качестве цитостатика закиси азота под давлением 10 атмосфер, использование 45% уксусной кислоты для сохранения структуры хромосом и отсутствие промывки в фиксаторе этанол: уксусная к-та (3:1).

Приготовление ДНК-пробы. Мечение плазмидной ДНК и Cot-1 фракции проводили методом Nick-трансляции с использованием DIG-Nick Translation Mix (Roche, Germany) и Biotin-Nick Translation Mix (Roche, Germany) согласно прилагаемой инструкции. Мечение продуктов амплификации проводили методом ПЦР мечения с использованием PCR DIG Labeling Mix (Roche, Germany).

Визуализация сайтов метилирования. Визуализация сайтов метилирования проводилась при помощи иммунодетекции антителами к 5-метилцитозину, полученными в мышах с последующей детекцией с антимышиными антителами с флуорохромом FITC, хроматин окрашивали DAPI.

Флуоресцентная in situ гибридизация. В FISH эксперименте предгибридизационную обработку слайдов и гибридизацию in situ проводили по Kuipers et al. (1997) с некоторыми модификациями. GISH проводили согласно ранее описанному протоколу Khrustaleva & Kik (2001).

Микроскопия и анализ изображения. Препараты хромосом были просмотрены с помощью микроскопа Zeiss Axiolmager Ml, снабженного фильтрами для детекции FITC, Texas Red и DAPI, ультрафиолетовой лампой НВО мощностью 100 Вт., а также соединенной с компьютером цифровой камеры AxioCam. Морфометрия и кариотипирование метафазных пластинок были проведены с помощью программ AxioVision v.4.6, Isis v.5.ru и MicroMeasure v.6.

Результаты исследований и их обсуждение 1.Анализ распределения сайтов метилирования на хромосомах А. АэШоэит с использованием антител к 5-метилцитозину.

Детекция сайтов метилирования с антителами к 5-мС выявила яркие флуоресцирующие сигналы на митотических метафазных хромосомах А. $$ш1о5ит (Рис. I).

а б

Рис. 1. Митотическая метафаза A. fistulosum после детекции сайтов метилирования с антителами к 5-мС. Зеленая флуоресценция - места посадки антител, голубая флуоресценция контрокрашивание хромосом DAPI:

а) микрофотосъемка с использованием только FITC-фильтра;

б) микрофотосъемка с использованием DAPI- и FITC- фильтров с последующим совмещением образов в программе AxioVision, версия 4.6.

Биометрический анализ положения сайтов метилирования был проведен на хромосомах 6 и 8, так как эти хромосомы легко идентифицируются в хромосомном наборе без проведения кариотипирования, что позволило сделать количественный анализ хромосомной локализации сайтов метилирования на нескольких десятках хромосом и провести статистическую обработку результатов измерений.

Анализ хромосомы 6 показал, что стабильно были метилированы дистальные регионы на обоих плечах (рис.2). На длинном плече длина сайта метилирования составила в среднем 18,0 % ± 3,2 , а на коротком плече, размер сайта составил в среднем 9,6% ±1,9 хромосомы. У некоторых анализируемых хромосом 6 на длинном плече были выявлены сайты метилирования в прицентромерной области - в среднем 14,5% ± 6,6 длины хромосомы и на этих же хромосомах были метилированы интеркалярные участки - 12,3% ± 5,5 длины хромосомы. На коротком плече интеркалярных сайтов метилирования не было выявлено. Следует отметить наличие различий в распределении сайтов

метилирования в гомологичных хромосомах. В ряде случаев соответствующие сайты в гомологичных хромосомах могли быть метилированы в одном гомологе и неметилированы в другом. Спутник не имел четко выраженных сайтов метилирования.

хромосома 6 хромосома 8

Рис. 2. Расположение сайтов метилирования на хромосоме 6 и 8 Allium fistulosum: а, с) зеленая флуоресценция - места посадки антител к 5 -мС; Ь, d) идиограммы: - R^g районы стабильно метилированные;

EES] - районы редко метилированные, 1-' - неметилированные районы.

На хромосоме 8 были стабильно метилированы дистальные участки короткого и длинного плеча. На коротком плече размер метилированного сайта в среднем составил 18,9% ±4,1 от длины всей хромосомы. Выявлено два случая, когда короткое плечо было почти по всей длине метилировано. В двух вариантах были метилированы прицентромерные участки, длина сайта метилирования составила 11,7% ± 8,05. Был отмечен единичный вариант интеркалярного метилирования короткого плеча, размер сайта составил 14,1 %. Длинное плечо было стабильно метилировано в дистальном регионе, длина сайта метилирования составила 19,8% ± 4,7 хромосомы, в трех случаях метилированы прицентромерные области, длина участка составила 19,2% ±7,1. Как и на хромосоме 6, были выявлены различия в метилировании соответствующих сайтов у гомологов.

Сравнение распределения сайтов метилирования с полученными ранее результатами in situ гибридизации ПЦР продуктов с праймерами на субтеломерный гетерохроматиновый повтор у A. fistulosum (Фесенко et al., 2001), выявил ко-локализацию стабильных сайтов метилирования и тандемного сателлитного повтора 382 п.н.

2. Хромосомная организация высокоповторяющейся ДНК (Cotí фракция)

Проведённая работа показала характер распределения высоко копийных повторов ДНК на хромосомах А. сера и A. fistulosum. Cot-1 фракция, состоящая из высоко копийных повторов была выделена из геномной ДНК А. сера и A. fistulosum. FISH с Cot-1 фракцией А. сера на митотических хромосомах А. сера и А. fistulosum показала чёткие сигналы в терминальный областях и единичные сигналы по всей длине хромосом у обоих видов. Яркие сигналы в терминальных областях, скорее всего, соответствуют изученному ранее субтеломерному повтору длиной 375 п.н., который присутствует у А. сера и А.fistulosum (Pichetal., 1998)

FISH с Cot-1 фракцией A. fistulosum на митотических хромосомах А. fistulosum и А. сера показала интересный результат. При гибридизации Cot-Í фракции A. fistulosum на хромосомы A. fistulosum интенсивный сигнал локализовался на терминальном участке и давал редкие единичные сигналы по всем хромосомам так же, как и в предыдущем опыте с Cot-1 фракцией А. сера (Рис 3). Но при гибридизации Cot-1 фракции А. fistulosum на хромосомах А. сера сигнал в терминальной области хромосом отсутствовал. Объяснение данного феномена техническими причинами, связанными с постановкой FISH, отклоняется, так как гибридизация пробы на хромосомах А. сера прошла успешно, о чем свидетельствуют единичные сигналы, локализованные на всех хромосомах. Интенсивный сигнал на концах хромосом А. fistulosum может указывать на наличие у А. fistulosum видоспецифичного высококопийного субтеломерного повтора. По-видимому, при выделении Cot-1 фракции, которое основано на быстрой реассоциации высокоповторяющихся последовательностей ДНК, у А. fistulosum основную часть фракции составил именно видоспецифичный повтор.

A. fistulosum А. сера

Рис. 3. FISH с Cot-1 фракцией А. fistulosum на митотических хромосомах А. сера и А. fistulosum. Синяя флуоресценция - контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-lldUTP меченная Cot-1 фракции А. fistulosum, детектированная антителами с FITC.

Для более убедительного доказательства того, что в выделенной нами Cot-1 фракции A. fistulosum содержится видоспецифичный повтор, была проведена гибридизация Cot-1 фракции A. fistulosum с искусственными гибридами между A. fistulosum и А. сера: 87 F5 (А. сера, х A. fistulosum), 78 ВС2 F5 ( [ (F3 (А.сера, х A.fistulosum) х А.сера] х А.сера), 16 F5 (А. сера, х A. fistulosum), и A. wakegi - естественным гибридом между A. fistulosum и А.сера.

FISH на всех анализируемых межвидовых гибридах выявила интенсивные яркие сигналы в терминальных областях отдельных хромосом (Рис. 4).

Рис. 4. FISH с Cot-1 фракции А. fistulosum на митотических хромосомах межвидового гибрида 87 FS(A. сера, к А. fistulosum) (а), 78 BC2F5([(F5 (Л. сера, х A.fistulosum) х А.сера] х А.сера) (б), 76 Fs (А. сера, х А. fistulosum) (в), и А. wakegi - естественного гибрида между А. fistulosum и А. сера (г). Синяя флуоресценция (а,б,г) и серая (в) - контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-lldUTP детектированные антителами с FITC (а ,б, в), красная флуоресценция - Biotin- 16-dUTP детектированная антителами с Texas Red (г).

Последовательная in situ гибридизация с геномной ДНК (GISH) на A. wakegi на тех же самых препаратах, на которых была проведена FISH с Cot~ 1фракцией A. fistulosum, показала, что сигнал гибридизации СоЫфракции A. fistulosum был на хромосомах A. fistulosum (Рис. 5).

Рис. 5. Последовательная FISH и GISH на тех же препаратах хромосом А. wakegi. А - FISH с Cot-1 А. fistulosum, меченной Biotin - 16- dUTP и детектированной антителами с TexasRed (красная флуоресценция); В - GISH с геномной ДНК А. fistulosum, меченной Dig-lldUTP и детектированной антителами с FITC (зеленая флуоресценция) и немеченой геномной ДНК А. сера. Синяя флуоресценция - контрокрашивание DAPI.

Результаты GISH анализа с искусственными гибридами между А. fistulosum и А. сера: 87 F5 (А. сера, х А. fistulosum), 78 ВС2 Fj ([ (F5 (А.сера. х А.fistulosum) х А.сера] х А.сера), 76 F; (А. сера, х А. fistulosum) подтвердили, что сигнал гибридизации Cot-1 фракции А. fistulosum был только в терминальный областях плеч хромосом, принадлежащих А. fistulosum (рис. 6).

Итак, FISH с Cot-1 фракцией А. сера на митотических хромосомах А. сера и А. fistulosum показала чёткие сигналы в терминальный областях и единичные сигналы по всей длине хромосом у обоих видов, что свидетельствует о присутствии в геномах этих двух видов общих высокоповторяющихся последовательностей ДНК. В Cot-1 фракции А. fistulosum был выявлен видоспецифичный повтор, который локализован в терминальных регионах хромосом А. fistulosum. Наличие видоспецифичного повтора в геноме А. fistulosum и его хромосомная локализации были убедительно доказаны с помощью последовательной FISH+GISH.

и IiIIIIIIIIII III«.....................

ч' .

ННи^мНИНШШ

^дваНИМВМВНитттша

шшиШШМШ

Ii

Рис. 6. GISH с Biotin-16-dUTP меченной геномной ДНК А. fistulosum на митотических метафазных хромосомах межвидового гибрида В С2 F5 ( [ (F5 (А сера х A.fistulosum) х А.сера] х А.сера) селекционная форма 78. 14 хромосом с красной флуоресценцией принадлежат А. fistulosum, 14 хромосом с голубой флуоресценцией принадлежат А. сера и 4 рекомбинантные хромосомы между А сера и А. fistulosum (указаны стрелками). А и В - рекомбинантные хромосомы 7 (GISH); А' и В' - рекомбинантные хромосомы 7 с Cot-1 фракцией А. fistulosum.

Рис. 7. Идиограмма кариотипа гибрида В С2 F5 ([ (Fj (А.сера. х A.fistulosum) х А.сера] х А.сера) селекционная форма 78.

3. Сравнительный анализ хромосомной организации ретротранспозонов у А. сера и А. fistulosum

3.1 FISH анализ Tyl-copia LTR ретротранспозона

В результате FISH на митотических метафазных хромосомах А. fistulosum было установлено, что Tyl -copia ретротранспозон распределён по всей длине хромосом за исключением терминальных областей хромосом (Рис. 8). Проведенная нами FISH с Cot-1 фракцией А. fistulosum выявила наличие видоспецифичного повтора локализованного в терминальных областях хромосом. Кроме этого ранее было показано, что у А. fistulosum в этой области хромосом имеется еще и общий с А. сера субтеломерный повтор (Pich et al., 1998, Фесенко et al., 2001). Таким образом, возможно, отсутствие сигнала в терминальной области хромосом связано с захватом этих областей высокоповторяющимися повторами.

а б

Рис. 8. Tyl -copia ретротранспозонов A. fistulosum-. (а) - электрофореграмма ПЦР продукта с праймером на обратную транскриптазу Tyl -copia и геномной ДНК A. fistulosum; (б) - FISH с ПЦР продуктом на митотических хромосомах А. fistulosum (синяя флуоресценция -контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-lldUTP меченный ПЦР продукт, детектированный антителами с FITC).

Интенсивные FISH сигналы тесно располагались вдоль хромосом А. fistulosum. Такая же картина FISH локализации Tyl-copta была показана на А. сера (Brandes et al, 1997), в геноме которого содержится 100 000-200 000 копий Ту\-copia ретротранспозонов (Pearce et al., 1996 ).

3.2. FISH анализ ТуЗ-svdsv LTR ретоотранспозона

FISH ПЦР продукта с праймером на обратную транскриптазу ТуЪ-gypsy и геномной ДНК А. сера показал дисперсное распределение сигнала по всем хромосомам А. сера, кроме терминальной области (Рис 9). FISH ПЦР продукта с праймером на обратную транскриптазу ТуЗ-gypsy и геномной ДНК А. fistulosum на хромосомах А. fistulosum показал схожую с А. сера картину распределения сигнала, но у А. fistulosum сигнал отсутствовал так же в районе ЯД] П).

Рис. 9. FISH с ТуЗ -gypsy (синяя флуоресценция - контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-lldUTP меченный ПЦР продукт, детектированный антителами с FITC). Красными стрелками указан ядрышковый организатор и следующий за ним спутник гомологичных хромосом 6 А. fistulosum.

Отсутствие ретротранспозонов в районе ядрышкового организатора было показано на ячмене (Heslop-Harrison et al., 1997) и сахарной свекле (Schmidt et al., 1995,1996). Возможно, что тандемная организация рибосомальных генов и специфика их конформации препятствуют вставки ретротранспозонов (Heslop-Harrison et al., 1997). Однако противоположные результаты были получены на Oestrum strigilatum, где также в качестве пробы в FISH был использован ПЦР продукт с праймером на обратную транскриптазу TyZ-gypsy, сильный сигнал гибридизации пробы был выявлен в районе локализации ядрышкового организатора (Jeferson et al., 2007). Такие различия в распределении ретротранспозонов в районе ядрышкового организатора скорее всего связаны с отсутствием у разных видов определенных семейств ретротранспозонов, которые локализуется в ядрышковом оганизаторе. Так, например, в полностью

А. сера

А. fistulosum

секвенированном геноме Arabidopsis thaliana было найдено 9 семейств ТуЗ-gypsy (Marín & Llórens, 2000).

3.3 FISH анализ LINEs non-LTR ретротранспозонов

FISH с ПЦР продуктом, полученным при амплификации геномной ДНК с вырожденными праймерами на обратную транскриптазу LINEs и геномной ДНК А. сера и A. fistulosum, выявил сигналы гибридизации на всех хромосомах, кроме терминальной области на обоих видах (Рис 10).

А. сера А. fistulosum

Рис. 10. FISH с LINEs (синяя флуоресценция - контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-lldUTP меченный ПЦР продукт, детектированный антителами с FITC).

Итак, в результате сравнительного анализа распределения Tyl-copia, ТуЗ-gypsy и LINEs ретротранспозонов не было выявлено существенных различий между А. сера и А. fistulosum в их хромосомной локализации. Изученные нами семейства ретротранспозонов распределены дисперсно по всей длине хромосом, кроме субтеломерных окончаний, где находится высоко повторяющийся субтеломерный повтор. Наблюдались различия в интенсивности сигнала между семействами ретротранспозонов: самый интенсивный сигнал даёт Tyl-copia ретротранспозон, затем идёт ТуЪ-gypsy и с наименьшей интенсивностью сигнала были LINEs (Рис. 11) на обоих видах, что отражает размер фракции трех изученных семейств ретротранспозонов в геномах А. сера и А. fistulosum.

Рис. 11. Сравнительный анализ распределения ретротранспозонов ТуЗ - gypsy, Tyl - copia и LINEs. Пробы ДНК ретротранспозонов меченные Dig-lldUTP, детектированные антителами с FITC, на митотических хромосомах А. сера и A. fistulosum. Микрофотосъемка сделана на FITC фильтре.

4. Хромосомная организации межмикросателлитых повторов у А. сера и А. fistulosum

Первичный скрининг геномной ДНК А. сера и А. fistulosum на наличие микросателлитных повторов был проведен с набором ISSR праймеров, включающей 20 праймеров. Продукты ПЦР с наибольшим количеством бэндов (ампликоны К24, К26, К12, К28, К27, К18, К10, К13 у А. сера и К10, К19, К12, К32 у А. fistulosum) были отобраны для FISH эксперимента.

FISH на митотических метафазах А. fistulosum

FISH с ампликонами K10[AC]8YG выявила единичные сигналы на всех хромосомах. Наиболее выраженный сигнал был обнаружен на хромосоме 2 в коротком плече в проксимальной его части (Рис. 12). Этот сигнал стабильно наблюдался на всех анализируемых метафазах.

Рис. 12. FISH продуктов амплификации ISSR с праймером К10 [AC]8YG на митотических хромосомах А. fistulosum. Синяя флуоресценция -| контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-1 ldUTP меченные ISSR ампликоны, детектированные антителами с FITC.

FISH с ПЦР продуктами на праймерах К19, К12, К32 не выявила четких сигналов гибридизации ни на одной из хромосом, что, вероятно, связано с недостаточным количеством копий межмикросателлитных повторов в одном локусе на хромосоме, т.е. протяженность ДНК мишени на хромосоме была ниже порога чувствительности FISH.

FISH на митотических метафазах А. сера

FISH с ампликонами К12 [AC]8G выявил единичные сайты с двойными сигналами гибридизации на хромосомах 4 и 5. На хромосоме 4 сигнал был в дистальном районе короткого плеча, а на хромосоме 5 в проксимальном районе короткого плеча.

Рис. 13. FISH продуктов амплификации ISSR К12 [AC]8G на митотических хромосомах А. сера. Синяя флуоресценция - контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-1 ldUTP меченные ISSR ампликоны, детектированные антителами с FITC.

FISH с ампликонами К24 [GA]8A выявила множественные сайты гибридизации, которые были распределены дисперсно по всем хромосомам, с ампликонами К26 [AG]8T были слабые сигналы на всех хромосомах. ПЦР продукты с праймерами К10, К13, К18, и К28 не дали FISH сигналов. Интересные результаты были получены с ампликонами К27 (AG^C. FISH сигнал был локализован в прицентромерной области на всех хромосомах А. сера (Рис. 14 а). Также отмечена четкая локализация сигнала на интерфазных ядрах на одном из полюсов, что может указывать на Rabí конфигурацию с цетромерами и теломерами, расположенными на противоположных полюсах (Рис. 14 б).

Рис. 14. FISH продуктов амплификации ISSR К 27 (AG)7C на митотических хромосомах А. сера.. Синяя флуоресценция - контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-lldUTP меченные ISSR ампликоны, детектированные антителами с FITC.

Известно, что центромерный повтор является видоспецифичным, как это было установлено для Arabidopsis arenosa и Arabidopsis thaliana (Kamm et al., 1995; Martinez-Zapater et al., 1996) и Beta (Gindullis et al., 2001), и даже может быть хромосом специфичным, как у Zea mays (Nagaki et al., 2003; Page et al., 2001). Для того чтобы проверить является ли продукт амплификации с праймером К 27 и геномной ДНК А. сера видоспецифичным была проведена FISH на метафазных хромосомах близкородственного вида A. fistulosum и естественного гибрида между А. сера и А. fistulosum - A. wakegi (Рис. 15).

Рис. 15. FISH продуктов амплификации ISSR К 27 (AG^C на митотических хромосомах A. wakegi (слева) и A.fistulosum (справа). Синяя флуоресценция - контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция -Dig-1 ldUTP меченные ISSR ампликоны, детектированные антителами с FITC.

FISH на А. wakegi выявил четкий сигнал в области центромеры только у 8 хромосом из 16. Кариотипический анализ установил, что сигнал гибридизации присутствовал только на хромосомах А. сера. При проведении FISH на A. fistulosum никаких сигналов гибридизации не было обнаружено. Было проведено клонирование ПЦР продукта, полученного с ISSR праймером К27 [AG]8C в векторе pGEMT- easy (Promega). В результате скрининга выросших колоний Е. coli с праймерами М13 нами было отобрано 48 клонов, со вставками различной длины (Рис. 16).

Рис. 16. Электрофореграмма размера вставки в клонирующем векторе: ПЦР с фланкирующим вставку праймером М13.

Размер вставок варьировал от 709 до 243 п.н. Из отобранных 48 клонов, 8 клонов (А5.1, А5.2, 07.4, Н1.8, Р25.8, Р31.1, Р5.32, Р6.43 (дорожки 1, 2, 4, 8, 25, 31, 32, 43) были секвенированы.

Получение сиквенсы 8 клонов были использованы для поиска схожих сиквенсов в базах данных NCBI (EST, GSS, SRA, Nucleotides, WGS) с помощью BLAST. Из 8 проанализированных сиквенсов 4 сиквенса имели высокую схожесть с сиквенсами А.сера в GSS (А5.1, F5.32, F6.43) и EST (А5.2) базах данных NCBI. Сиквенс клона А5.2 имел высокий уровень схожести с кДНК А.сера. Сиквенс клона HI.8 имел схожесть с геном А. сера, кодирующим цитохромоксидазу. BLAST трех клонов (G7.4, F25.8, F31.1) не обнаружил сиквенсов со значительным уровнем схожести в базе данных. На сервере GIRI с помощью программы Censor у шести сиквенсов (А5.1, А5.2, HI.8, F31.1, F5.32, F6.43) найдена схожесть их отдельных участков с известными мобильными элементами (ДНК транспозоны, ретротранспозоны). Для выявления внутренних повторов у 8 сиквенсов, нами был проведено построение дот матрицы, которая не выявила внутренних повторов. Анализ сиквенсов в программе UGene на наличие внутренних микросателлитных повторов показал присутствие в сиквенсах микросателлитных последовательностей, соответствующих сайтам посадки праймеров и короткие тринуклеотидные повторы. Для идентификации клона с предполагаемым прицентромерным повтором была проведена FISH с каждым из 8 клонов на хромосомах А.сера. FISH показала, что только клон А5.1 давал сигналы в прицентромерной области (Рис. 17) на всех 8 хромосомах А. сера. Проведённый биоинформатический анализ выявил очень короткий фрагмент (42 н.н.) сиквенса А5.1 со схожестью к ДНК транспозона и непротяжённые микросателлитные повторы, что не позволяет идентифицировать природу найденного нами прицентромерного повтора, т.е. отнести к определенному типу повторов, на основании известных в базе данных последовательностей ДНК. Поэтому, мы можем предположить, что выделенный клон А5.1 является единицей повтора или его частью.

Рис. 17. FISH с клоном А5.1. на А. сера. Электрофореграмма ПЦР клона с праймером М13 (слева). Синяя флуоресценция - контрокрашивание DAPI, зеленая флуоресценция - Dig-lldUTP меченные ISSR ампликоны, детектированные антителами с FITC.

FISH сигнал с клоном А5.1 был достаточно сильным, поэтому мы можем предполагать, что протяженность детектируемого повтора на хромосоме, по меньшей мере, составляет более 10 тыс. п. н. - порога чувствительности обычного FISH. Длина вставки клона А5.1 составляет 559 п.н., а значит, 1 открытый нами прицентромерный повтор, который мы назвали pCentAl-agc, I повторяется не менее сотни раз. У Triticum aestivum центромерный тандемный повтор Tain составляет 570-bp (Kishii et al., 2001), у Zea maize Cent4 - 740 п.н i (Ananiev et al., 1998), у Zingeria biebersteiniana Zbcenl 755-bp (Saunders et al., 2001). Возможно, такой достаточно большой размер тандемного повтора является характерным для класса Commelinanae однодольных растений, к которому согласно современной классификации, основанной на секвенировании хлоропластной, митохондриальной и ядерной ДНК, относится подкласс Poales (зерновые, травы; Chase et al., 2000; Fay et al, 2000). Подкласс Asparagales, представителями которого являются луковые, считается очень близким к Commelinanae и размер открытого нами 559 п.н. повтора pCentAl-agc хорошо с этим согласуется.

Заключение

Клонирование, секвенирование и локализация с помощью in situ гибридизации семейств повторяющихся последовательностей ДНК, которые составляют значительную часть генома луковых, позволило лучше понять организацию их геномов, структуру хромосом и сделать следующие обобщения: изученные семейства ретротранспозонов Ту 1 -copia, ТуЪ-gypsy и LINEs распределены дисперсно по всем хромосомам у А. сера и A. fistulosum, причем отмечена закономерность в интенсивности сигнала и числе сайтов гибридизации характерная для обоих видов - больше всего сигналов давало семейство Tyl-copia, затем ТуЗ-gypsy и наименьшее LINEs, что отражает размер фракции трех изученных семейств ретротранспозонов в геномах обоих видов. Следует отметить особенность локализации ТуЪ-gypsy на хромосомах A. fistulosum - сигнал отсутствовал в районе ядрышкового организатора и спутника на гомологичных хромосомах 6.

Анализ локализации сайтов метилирования ДНК на хромосомах A. fistulosum с помощью антител к 5-метилцитозину выявил, что всегда были метилированы терминальные области хромосом и были отмечены различия в уровне метилирования гомологичных хромосом. Стабильные сайты метилирования совпадали с местами локализации Cot-1 фракции и субтеломерного повтора, выделенного и изученного ранее (Фесенко и др., 2001). В терминальных областях, занятых субтеломерным повтором,

отсутствовали сигналы гибридизации Ту \-copia. Следует отметить, что у луковых не выявлен типичный для многих растений (TTTAGGG)n теломерный повтор, который защищает хромосому от укорачивания при каждом раунде репликации (Sykorova et al. 2003). До сих пор мы не знаем как луковые стабилизируют свои хромосомы.

Выделенная нами Cot-1 фракция A. fistulosum и её физическая локализация на хромосомах А. сера, A. fistulosum и гибридов между А. сера и на A. fistulosum, позволяет сделать вывод, что нам удалось выявить видоспецифичный для A. fistulosum субтеломерный повтор.

С помощью in situ гибридизации амликонов, полученных с ISSR праймером (AG)7C и последующим их клонированием и секвенированием был найден А. сера прицентромерный повтор, который мы назвали pCentAl-agc.

Результаты in situ гибридизации изученных семейств повторяющейся ДНК интегрированы в моделях хромосом для А. сера и A. fistulosum (Рис. 18).

В pCentAl-agc Ш UNEs * a "fyl-copia S Ty3-gyp6y 88 Ногаетшатетакряыййовгар Щ

Вдаосишф™ый1торд.щА,!Шскш & НеетгаоЛта®мфый|ежгор I UNEs *

tyt-mpa Ш *íy3-©p£? В Пргивйпромчяшо&ваъ Ш

Рис. 18. Модель распределения некоторых семейств некодирующей ДНК на хромосомах А. сера (а) и A. fistulosum (б).Данные по локализации Tyl -copia на хромосомах А. сера взяты из работы Brandes et al. (1996).

выводы

1. Выявлены стабильные сайты метилирования в терминальных областях хромосом 6 и 8 А. fistulosum; установлены различия в уровне метилирования у гомологичных хромосом.

2. FISH с Cot-1 фракцией А. сера на митотических хромосомах А. сера и А. fistulosum показала чёткие сигналы в терминальных областях и единичные сигналы по всей длине хромосом обоих видов.

3. Выявлен видоспецифичный субтеломерный повтор в Cot-1 фракции А. fistulosum. Доказана видоспецифичность повтора с помощью FISH+GISH на хромосомах А. сера, А. fistulosum и гибридов между А. сера я на А. fistulosum

4. FISH с продуктом амплификации обратной транскриптазы Tyl-copia показала, что этот LTR ретротранспозон распределён по всей длине хромосом за исключением терминальных областей у А. fistulosum.

5. FISH с продуктом амплификации обратной транскриптазы ТуЗ-gypsy показала, что этот LTR ретротранспозон распределён по всей длине хромосом за исключением терминальных областей у А. сера и А. fistulosum; ретротранспозон отсутствовал так же в районе ядрышкового организатора и спутника на гомологичных хромосомах 6 А. fistulosum.

6. FISH с продуктом амплификации обратной транскриптазы LINEs показала, что этот non-LTR ретротранспозон распределён по всей длине хромосом за исключением терминальных областей у А. сера и А. fistulosum.

7. Выявлена для обоих видов луковых одинаковая закономерность в интенсивности FISH сигнала между семействами ретротранспозонов: самый интенсивный сигнал дают Tyl -copia ретротранспозоны, затем ТуЗ-gypsy и с наименьшей интенсивностью сигнала был LINEs, что отражает размер фракции трех изученных семейств ретротранспозонов в геномах А. сера и А. fistulosum.

8. FISH локализация межмикросателлитных повторов выявила единичные сигналы на всех хромосомах А. fistulosum с ампликонами K10[AC]gYG. Наиболее выраженный сигнал был обнаружен в проксимальной области короткого плеча хромосомы 2.

9. У А. сера FISH с ампликонами К12 [AC]8G, выявила единичные локусы гибридизации на хромосоме 4 в дистальном районе короткого плеча и на хромосоме 5 в проксимальном районе короткого плеча.

10. Найден прицентромерный повтор у А. сера путем клонирования и секвенирован ПЦР продуктов, полученных при амплификации праймера К27 [AG]8C с геномной ДНК А. сера. С помощью FISH доказывает локализацию клона А5.1, несущего вставку 559 п.н., названную pCentAl-agc, в прицентромерной области.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Будылин М.В., Сахарова A.M., Андреева Г.Н., Хрусталёва Л.И. Анализ распределения сайтов метилирования на хромосомах 6 и 8 Allium fistulosum L. с использованием антител к 5-метилцитозину // Известия ТСХА, 2011.- № 4,-С. 73-80.

2. Будылин М.В., Хрусталёва Л.И. Особенности распределения некодирующей ДНК в геноме A. fistulosum // Сборник статей XII международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности».- Санкт-Петербург, 2011.- Т. I.- С. 203-205.

3. Будылин М.В., Хрусталёва Л.И. Хромосомная организация некодирующей ДНК в геноме лука батуна // II Международная научно-практическая конференция "Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы".- Москва, 2010.Т. И.-С. 134.

4. Будылин М.В., Хрусталёва Л.И. Особенности распределения некодирующей ДНК в геноме луковых // Сборник тезисов участников XI молодежной научной конференции секции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии».- Москва, 2011.- С. 45.

5. Будылин М.В., Хрусталёва Л.И. Физическая локализация некодирующей ДНК // Сборник тезисов участников XI молодежной научной конференции секции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии».-Москва, 2011.- С. 67.

6. Будылин М.В., Хрусталёва Л.И. Особенности хромосомной организации некодирующей ДНК в геноме Allium fistulosum // Международная научная конференция молодых учёных и специалистов.- Москва, 2012.- С. 8.

7. Khrustaleva L., Romanov D., Budylin M., Kirov I., Fesenko I., Kiseleva A. Chromosomal Organization of Genes and Some Types of Extragenic DNA in Allium (Хромосомная организация генов некоторых типов негенной ДНК у Allium) //Материалы б-го Международного симпозиума по съедобным Alliaceae, Фукуока, Япония, 21-24 мая 2012.- С. 34.

Автор выражает особую благодарность своему научному руководителю профессору Хрусталёвой Людмиле Ивановне, за неоценимую помощь в написании диссертации и помощи в достижении результата. Так же отдельное спасибо автор выражает к.б.н. Дивашуку Михаилу Георгиевичу за помощь в секвенировании и Кирову Илье Владимировичу за помощь в биоинформатическом анализе. Автор выражает благодарность заведующей лаборатории генетики и цитологии ВНИИССОК к.с-х.н. Кан Людмиле Юрьевне и профессору МавауоБЫ Ямагучи университет, Япония за

предоставленный растительный материал.

Благодарность за материальную и моральную поддержку на протяжении всего периода аспирантуры, автор хотел бы выразить своему отцу Будылину Вячеславу Ивановичу и матери Будылиной Рите Бякёновне.

Отпечатано с готового оригинал-макета

60х84'/|б. Усл. печ. л 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 495.

Издательство РГАУ - МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.: (499) 977-00-12, 977-26-90, 977-40-64

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Будылин, Михаил Вячеславович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клонирование, секвенирование и локализация с помощью in situ гибридизации семейств повторяющихся последовательностей ДНК, которые составляют значительную часть генома луковых, позволило лучше понять организацию их геномов, структуру хромосом и сделать следующие обобщения: изученные семейства ретротранспозонов Tyl-copia, ТуЗ-gypsy и LINEs распределены дисперсно по всем хромосомам у А. сера и A. fistulosum, причем отмечена закономерность в интенсивности сигнала и числе сайтов гибридизации характерная для обоих видов - больше всего сигналов давало семейство Tyl -copia, затем ТуЗ -gypsy и наименьшее LINEs, что отражает размер фракции трех изученных семейств ретротранспозонов в геномах обоих видов. Следует отметить особенность локализации Ty3-gypsy на хромосомах A. fistulosum - сигнал отсутствовал в районе ядрышкового организатора и спутника на гомологичных хромосомах 6.

Анализ локализации сайтов метилирования ДНК на хромосомах А. fistulosum с помощью антител к 5-метилцитозину выявил, что всегда были метилированы терминальные области хромосом и были отмечены различия в уровне метилирования гомологичных хромосом. Стабильные сайты метилирования совпадали с местами локализации Cot-1 фракции и субтеломерного повтора, выделенного и изученного ранее [199]. В терминальных областях, занятых субтеломерным повтором, отсутствовали сигналы гибридизации Tyl -copia. Следует отметить, что у луковых не выявлен типичный для многих растений (TTTAGGG)n теломерный повтор, который защищает хромосому от укорачивания при каждом раунде репликации [241]. До сих пор мы не знаем как луковые стабилизируют свои хромосомы.

Выделенная нами Cot-1 фракция A. fistulosum и её физическая локализация на хромосомах А. сера, A. fistulosum и гибридов между А. сера и на A. fistulosum, позволяет сделать вывод, что нам удалось выявить видоспецифичный для A. fistulosum субтеломерный повтор.

87

С помощью in situ гибридизации амликонов, полученных с ISSR праймером [AG]8C и последующим их клонированием и секвенированием был найден А. сера прицентромерный повтор, который мы назвали pCentAl-agc.

Результаты in situ гибридизации изученных семейств повторяющейся ДНК интегрированы в моделях хромосом для А. сера и A. fistulosum (Рисунок 32).

Общий да Allium c\6re.w»q»ejH тада*ный ixurrop ■ pCentAI-agc ■ а Ту!- copia > Ty3-©psy Я

LINB

Исюасстиый гсюмсрный повтор и

Ватосгкцнфичный повтор лт* A. fistulosum к Напассгсшй гсломсраий irorop ■ 6 Ту!-copia ■ ТуЗ-gypsy Ш

LINEs

Прниалромср»ая область |

Общий xa Ailium су€те.томер№й таадсмный iioerop I

Рисунок 32. Модель распределения некоторых семейств некодирующей ДНК на хромосомах А. сера (а) и A. fistulosum (б).Данные по локализации Ту\-copia на хромосомах А. сера взяты из работы Brandes et al. (1997).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Будылин, Михаил Вячеславович, Москва

1. Schmidt, A., Doudrick, R.L., Heslop-Harrison, J.S., Schmidt, Т., The Contribution of Short Repeats of Low Sequence Complexity to Large Conifer Genomes // Theor Appl Genet 2000 - 101:7-14.

2. Macas, J., Neumann, P., Navratilova, A. Repetitive DNA in the pea (Pisum sativum L.) genome: comprehensive characterization using 454 sequencing and comparison to soybean and Medicago truncatula. BMC // Genomics 2007 -8(1): 427-443.

3. Alix, K, Heslop-Harrison, J.S. The diversity of retroelements in diploid and allotetraploid Brassica species // Plant Molecular Biology 2004 - 54: 895-909.

4. Ohno, S. So much 'junk' DNA in our genome. In: Smith, H.H. ( Ed.) // Brookhaven Symposia in Biology No. 23. Gordon and Breach, New York, -1972 pp. 366-370.

5. Orgel, L. E., and Crick, F. H., C. Selfish DNA: the ultimate parasite // Nature 1980 - 284: 604 - 607.

6. Csink, A. K., Henikoff, S. Genetic modification of heterochromatic associations and nuclear organization in Drosophila II Nature 1996 - 381:529— 531.

7. Vagnarelli, P., Ribeiro, S. A., Earnshaw, W. C. Centromeres: old tales and new tools//FEBS Lett.-2008-582 : 1950—1959.

8. Beridze, T. Satellite DNA // Springer Verlag. Berlin, Heidelberg.1986.

9. Bostock, C. Chromosome-specific subfamilies within human alphoid repetitive DNA // Phil. Trans. Roy. Soc. Lond .B 1986 - 312, 261-273.

10. Kit, S. On the topography of the genetic fine // Mol. Biol 1961 - 7, 711-716.

11. Sueoka, N. Cheng, T. // Proc. Natl. Acad. Sei 1961 - 48, 1851—1856.

12. Ganal, M.W., Lapitan, N.L.V., and Tanksley, S.D. A molecular and cytogenetic survey of major repeated DNA sequences in tomato. MOI // Gen. Genet-1988 -213, 262-268.

13. Schweizer, G., Ganal, M., Ninnemann, H., Hemleben, V. Species specific DNA sequences for identification of somatic hybrids between Lycopersicon esculentum and Solanum acaule // Theor Appl Genet 1988 -75:679-684.

14. Britten, R.J., and Kohne, D.E. Repeated sequences in DNA // Science (Washington, D.C.) 1968 - 161: 529-540.

15. Peterson, D.G., Schulze, S.R., Sciara, E.B., Lee, S.A., Bowers, J.E., Nagel, A., Jiang, N., Tibbitts, D.C., Wessler, S.R., Paterson, A.H. Integration of Cot Analysis, DNA Cloning, and High-Throughput Sequencing Facilitates

16. Genome Characterization and Gene Discovery // Genome Res 2002 - 12(5): 795807.

17. Miguel, P., Tikhonov, A., Jin, Y.K., Motchoulskaia, N., Zakharov, D. Nested retrotransposons in the intergenic regions of the maize genome // Science -1996- 765-68.

18. San Miguel, P., Bennetzen, J.L. Evidence that a recent increase in maize genome size was caused by the massive amplification of intergene retrotransposons // Annals of Botany 1998 - 82 (Supp. A.): 3744.

19. Knoop, V., Unseld, M., Marienfeld, J., Brandt, P., Siinkel, S., Ullrich, H., Brennicke, A. copia-, gypsy- and LINE-like retrotransposon fragments in the mitochondrial genome of Arabidopsis thaliana // Genetics 1996 - 142: 579-585.

20. Kunze, R., Saedler, H., Lonnig, W.E. Plant transposable elements // Adv. Bot. Res 1997 - 27:331^170.

21. Berger, S.L. Histone modifications in transcriptional regulation // Curr. Opin. Genet.Devel 2002 — 12, 142-148.

22. Carlson, C.M., Largaespada, D.A. Insertional mutagenesis in mice: new perspectives and tools // Nature Rev. Genet 2005 - 6, 568-580.

23. Xiong, Y., Eickbush, T.H. Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences // EMBO J 1990 - 9:3353-62

24. Smit, A. The origin of interspersed repeats in the human genome // Curr. Opin. Genet. Dev 1996 - 6:743-48 168.

25. Boeke, J.D., Corces, V.G. Transcription and reverse-transcription of retrotransposons // Annu. Rev. Microbiol 1989 - 43:403-34.

26. Xiong, Y., Eickbush, T.H. Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences // EMBO J -1990 9:3353-62

27. Temin, H.M. Origin of retroviruses from cellular moveable genetic elements // Cell 1980 - 21:599-600.

28. Cost, G.J., Boeke, J.D. Targeting of human retrotransposon integration is directed by the specificity of the LI endonuclease for regions of unusual DNA structure // Biochemistry 1998 - 37:18081-93.91

29. Moore, J.K., Haber, J.E. Capture of retrotransposon DNA at the sites of chromosomal double-strand DNA breaks // Nature 1996 - 383:644^5.

30. Irifune, K., Hirai, K., Zheng, J., Tanaka, R., Morikawa, H. Nucleotide sequence of a highly repeated DNA sequence and its chromosomal localization in Allium fistulosum II Theor Appl Genet 1995 V. 90. P. 312-316.

31. Kurose, K., Hata, K., Hattori, M., Sakaki, Y. RNA polymerase III dependence of the human LI promoter and possible participation of the RNA polymerase II factor YY1 in the RNA polymerase III transcription system // Nucleic Acids Res -1995-23:3704-9.

32. Moore, J.K., Haber, J.E. Capture of retrotransposon DNA at the sites of chromosomal double-strand DNA breaks // Nature 1996 - 383:644-45.

33. Tautz, D., and Renz, M. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes // Nucl. Acids Res 19841 - 2, 4127-4138.

34. Biessmann, H., Mason, J.M. Telomeric repeat sequences // Chromosoma- 1994- 103, 154-161.

35. Condit, R., Hubbell, S.P. Abundance and DNA sequence oftwo-base repeat regions in tropical tree genomes // Genome 1991 - 34:66-71.

36. Schug, M.D., Hutter, C.M., Wetterstrand, K.A., Gaudette MS, Mackay, TFC, Aquadro, C.F. The mutation rates of di-, tri- and tetra-nucleotide repeats in Drosophila melanogaster II Mol Biol Evol 1998 - 15:1751-1760.

37. Liu, Z., W., Biyashev, R. M., Saghai-Maroof, M. A. Development of simple sequence repeat DNA markers and their integration into a barley linkage map // Theor Appl Genet -1996 93:869-876.

38. Innan, H., Terauchi, R., Miyashita, N.T. Microsatellite polymorphism in natural populations of the wild plant Arabidopsis thaliana //Genetics — 1997— 1441-1452.

39. MacHugh, D.E., Shriver, M.D., Loftus, R.T., Cunningham, P., Bradley, D.G. Microsatellite DNA variation and the evolution, domestication and phylogeography of taurine and zebu cattle (Bos taurus and Bos indiens) II Genetics 1997-146:1071-1086.

40. Pedersen, C., Rasmussen, S.K., Linde-Laursen, I. Genome and chromosome identification in cultivated barley and related species of the Triticeae (Poaceae) by in situ hybridization with the GAA-satellite sequence // Genome -1996-39: 93 -104.

41. Ramsay, L. Intimate association of microsatellite repeats with retrotransposons and other dispersed repetitive elements in barley // Plant J. -1999 17, 415-425.

42. Schmidt, T., and Heslop-Harrison, J.S. The physical and genomic organization of microsatellites in sugar beet // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 -93:8761-8765.

43. Gortner, G., Nenno, M., Weising, K., Zink, D., Nagl, W., Kahl, G. Chromosomal localization and distribution of SSRs and the Arabidopsis-type telomere sequence in the genome of Cicer arietinum L. // Chrom -1998 Res 6:97-104.

44. Cuadrado, A., Jouve, N. Similarities in the chromosomal distribution of AG and AC repeats within and between Drosophila, human and barley chromosomes // Cytogenet Genome 2007a - Res 119:91-99.

45. Levinson, G., Gutman, G.A. Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution // Mol Biol Evol 1987 - 4:203-221.

46. Rico, C., Rico, I., Hewitt, G. 470 million years of conservation of microsatellite loci among fish species // Proc R Soc Lond 1996 - 263:549-557.

47. Johnson, J.M., Edwards, S., Shoemaker, D., Schadt, E.E. Dark matter in the genome: evidence of widespread transcription detected by microarray tiling experiments // Trends Genet -2005 21, 93-102.

48. Kapranov, F., Cawley, S.E., Drenkow, J., Bekiranov, S., Strausberg, R.L., Fodor, S.P.A., Gingeras, T.R. Large-scale transcriptional activity in Chromosomes 21 and 22 // Science 2002 - 296, 916-919.

49. Costantini, M., Clay, O., Federico,C., Saccone, S., Auletta, F., Bernardi, G. Human chromosomal bands: nested structure, high-definition map and molecular basis // Chromosoma 2007 - 116, 29-40.

50. Daniels, G.R., Fox, M., Lowensteiner, D., Schmid, C., and Deininger, P.L. Species specific homogeneity of the primate Alu family of repeated DNA sequence // Nucleic Acids Res -1983 -11: 7579-7593.

51. Leeton, P.R.J., and Smyth, D.R. An abundant LINE-like element amplified in the genome of Lilium speciosum II Mol. Gen. Genet 1993 - 237: 97104.

52. Bureau, T.E., and Wessler, S.R. Mobile inverted-repeat elements of the Tourist family are associated with the genes of many cereal grasses // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 1994 -91:1411-1415.

53. McCouch, S.R., and Tanskley, S.D. The world rice economy: challenges ahead. In Rice biotechnology; biotechnology in agriculture No. 6. Edited by G.S. Khush and G.H. Toenniessen // Commonwealth Agricultural Bureaux International, Wallingford, U.K. 1991.

54. Flavell, R.B., Bennett, M.D., Smith, J.B., and Smith, D.B. Genome size and the proportion of repeated sequence DNA in plants // Biochem. Genet. -1974-12: 257-269.

55. Barrett, M.T. CHO chromosome in situ hybridization suppression with hamster Cot-1 DNA // Focus (Gaithersburg, Md.) 1992 - 14: 124- 126.

56. Zwick, M.S., Hanson, R.E., McKnight, T.D. A rapid procedure for the isolation of COM DNA from plants // Genome 1997 - 40, 138-142.

57. Currah, L., MAUDE, R. B. Laboratory tests for leaf resistance to Botrytis squamosa in onions // Annals of Applied Biology 1984 - 105 : 277283.

58. Netzer, D., Rabinowitch, H. D., and Weintal CH. Greenhouse technique to evaluate onion resistance to pink root // Euphytica 1985 - 32 : 385391.

59. Galvân, G. A., Wietsma, W.A., Putrasemedja, S., Permadi, A.H., and Kik, C. Screening for resistance to anthracnose (colletotrichum glorosporioides Penz.) in Allium cepa and its wild relatives // Euphytica 1997 - 95: 173 — 178.

60. Chase, M. Molecular systematics of Lilianae. In monocotyledons: Systematics and evolution, P. Rudal, P.Crib, D. Culter, and C.Humphries // eds London:Royal Botanic, gardens, KEW-1995-pp. 107- 137.

61. Watson, J.D. Molecular biology of the gene. 3rd ed. W.A. Benjamin // Inc., Menlo Park, California -1976.

62. Gall, J.G., and Pardue, M . Formation and detection RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations // Proc.Natl.Acad.Sci. USA —1969— 63:378-383.

63. John, H.A., Bimstiel, M.L. and Jones, K.W. RNA-DNA hybrids in the cytological level // Nature (London) 1969 -223:582 - 587.

64. Flavell, A.J., Pearce, S.R., Heslop-Harrison, J.S., Kumar, A. The evolution of Tyl-copia group retro transposons in eukaryote genomes // Genetica -1997- 100: 185-195.

65. Watson, J.D., and Crick, F.H.C. Molecular structure of nucleic acids — a structure for deoxyribose nucleic acids //Nature (London) -1953 —171: 737738.

66. Schwarzacher, Т. Leitch, A. R., Bennett, M. D., and Heslop-Harrison, J. S. In situ localization of parental genomes in a wide hybrid // Ann. Bo t-1989 -№64. C. 315-324.

67. Хрусталева Л.И. Молекулярная цитогенетика в селекции растений // Известия ТСХА 2007 - № 1 с.45-55.

68. Wang. Z., Zemetra, R.S., Hansen, J. Determination of the Paternity of Wheat (Triticum aestivum L) x Jointed Goatgrass (Aegilops cylindrica Host) BCi Plants by Using Genomic In Situ Hybridization (GISH) Technique // Crop Science -2002-№42. C. 939-943.

69. Dong, F., Novy, R.G., Helgeson, J.P., and Jiang, J. Cytological characterization of potato- Solanum etuburosum somatic hybrids and their backcross progenies by genomic in situ hybridization // Genome -1999 №42. C. 987-992.

70. Gavrilenko, Т., J. Larkka, E. Pehu, and V. -M Rokka Identification of mitotic chromosomes of tuberous and non-tuberous Solanum species {Solanum tuberosum and Solanum brevidens) by GISH in their interspecific hybrids // Genome -2002 №45. C. 442-449.

71. Bennett, S.T., Kenton, A. Y., and Bennett, M. D. Genomic in situ hybridization reveals the allopolyploid nature of Milium montianum (Gramineae) // Chromosoma- 1992-№101. C. 420-424.

72. Khrustaleva, L. I. and Kik, C.Cytogenetical studies in the bridge cross Allium сера x (A. fistulosum xA. roylei) II Theor Appl Genet 1998 - №96. C. 814.

73. Khrustaleva, L.I., and Kik, C. Introgression of Allium fistulosum into А. сера mediated by A. roylei И Theor Appl Genet 2000 - №100. C. 17-26.

74. Rogers, S.O., Bendich, A.J . Extraction of DNA from plant tissues / Gelvin SB, Schilperoot RA Plant molecular biology manual A6 // Kluwer Academic Publ, Dordrecht, The Netherlands 1988 - C. 1 - 10.

75. Pijnacker, L. P, Ferwerda, M. A . Giemsa C-banding of potato chromosomes // Can J Genet Cytol -1984 №26. C. 415-419.

76. Khrustaleva, L, I., Kik, C. Cytogenetical studies in the bridge cross Allium cepa x (A. fistulosam x A. roylei) II Theor Appl, Genet 1988 - № 96. C. 8 -14.

77. Wright, D.A., Ke, N., Smalle, J., Hauge, B.M., Goodman, H.M., Voytas, D.F. Multiple non-LTR retrotransposons in the genome of Arabidopsis thaliana II Genetics 1996 - 142:569.

78. Kim, J.M., Vanguri, S., Boeke, J.D., Gabriel. A., Voytas. D.F. Transposable elements and genome organisation: A comparative survey of retrotransposons revealed by the complete Saccharomyces cerevisiae genome sequence // Genome Res 1998 - 8:464-78.

79. Suzuki, G., Ura, A., Saito, N., Sook, G., Bo, B., Yamamoto, M.,and Mukai, Y. BAC FISH analysis in Allium cepa //Genes Genet. Syst 2001 -76, p. 251-255.

80. Hudson, D.F., Fowler, K.J., Earle, E. Centromere protein B null mice are mitotically and meiotically normal but havelower body and testis weights // J. Cell Biol-1998 -141, 309-319.

81. Ikeno, M., Grimes, B., Okazaki, T., Nakano, M., Saitoh, K., Hoshino, H., McGill, N.I., Cooke, H. and Masumoto, H. Construction of YAC-based mammalian artificial chromosomes // Nature Biotechnol -1998 -16, 431-439.

82. Alix, K., Heslop-Harrison, J.S. The diversity of retroelements in diploid and allotetraploid Brassica species // Plant Molecular Biology 2004 -54 : 895-909.

83. He, D., Zeng, C., Woods, K., Zhong, L., Turner, D., Busch, R.K., Brinkley, B.R. and Busch, H. CENP-G: a new centromeric protein that isassociated with the a-1 satellite DNA subfamily // Chromosoma 1998 -107, 189— 197.

84. Stack, S. M, Comings, D.E. The chromosomes and DNA of Allium сера 11 Chromosoma 1979 - 70:161-181.

85. Durante, M., Tagliasacchi, S., Avanzi. Fast reannealing sequences of DNA in Allium сера: characterization and chromosomal localization // Cytobios -1985 -44:263 -271.

86. Havey. Restriction enzyme analysis of the nuclear 45s ribosomal DNA of six cultivated Alliums (Alliaceae) // Plant System Evolution 1992 -181:45-55.

87. Maggini, F., and Carmona, M. J. Sequence heterogeneity of the ribosomal DNA m Allium сера (Liliaceae) // Protoplasma — 1981 108, 163-171.

88. Ricroch, A., Peffley, E. В., Baker, R. J. Chromosomal location of rDNA in Allium in situ hybridization using biotin- and fluorescein-labelled probe // Theor Appl Genet 1992-83:413-418.

89. Hizume, M. Allodiploid nature of Allium wakegi Araki revealed by genomic in situ hybridization and localization of 5S and 18S rDNAs // Jpn J Genet. 1994-69:407-15.

90. Lee, S.H., Do, G.S., Seo, B.B. Chromosomal localization of 5S rRNA gene loci and the implications for relationships within the Allium complex // Chromosome Res 1999 - 7:89 - 93.

91. Ванюшин, Б. Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика // Генетика. 2006 - Т. 42, № 9. с. 1186 -1199.

92. Bird, A., Tate, P., Nan, X., Campoy, J., Meehan, R., Cross, S., Tweedie, S., Charlton, J., Macleod, D. Studies of DNA methylation in animals // J Cell Sci Suppl 1995 -19:37-9.

93. Gowher, H., Leismann, O., Jeltsch, A. DNA of Drosophila melanogaster contains 5-methylcytosine // The EMBO Journal 2000.

94. Law J.A., Jacobson S.E. Establishing, maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals. Review // Nature genetics, -20101. V. 11. P. 203-220.

95. Toyota, M, Ahuja, N, Suzuki, H, Itoh, F, Ohe-Toyota, M, Imai, K, Stephen B. Baylin, and Jean-Pierre J. Issa. Aberrant Methylation in Gastric Cancer Associated with the CpG Island Methylator Phenotype // Cancer Res 1999 -59:5438-5442.

96. Friesen, N, Brandes, A, Heslop-Harrison, J.S. Diversity, origin and distribution of retrotransposons (gypsy and copia) in conifers // Molecular Biology and Evolution-2001 18: 1176-1188.

97. Doerfler, W. Patterns of de novo DNA methylation and promoter inhibition: studies on the adenovirus and the human genomes.// 1993 64:262-99.

98. Kumar, A. and Bennetzen, J.L. Plant retrotransposons // Annu. Rev. Genet 1999-33:479-532

99. Herman, J.G., Graff, J.R., Myôhânen, S., Nelkin, B.D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands // Proceedings of the National Academy of Sciences 1996 - Vol. 93, pp. 9821-9826.

100. Clark, A. L., Docherty, K. Negative regulation of transcription in eukaryotes // Biochem. J -1993 Vol. 295. p. 521-541.

101. Côté, S., Sinnett, D., Momparler, R.L. Demethylation by 5-aza-2'-deoxycytidine of specific 5-methylcytosine sites in the promoter region of theretinoic acid receptor beta gene in human colon carcinoma cells // Anticancer Drugs 1998 - 0ct;9(9):743-50.

102. Toyota, M., Ahuja, N., Ohe-Toyota, M., Herman Stephen, J.G., Baylin, B., Jean-Pierre, J. Issa. CpG island methylator phenotype in colorectal cancer // PNAS 20 1999 - vol. 96 no. 15 8681-8686.

103. Arbi, Q., Naceur, B., Chokri, M. A simple, rapid and efficient method for the extraction of genomic DNA from Allium roseum (Alliaceae) / African J.Biotechnol.,v 2009 - 8,17, 4020-4024.

104. Madlung, A. Genomic changes in synthetic Arabidopsis polyploids II Plant J 2005 - № 41, p. 221-230.

105. Nucleic Acids Res 2003 -31: 4490-4496.101

106. Lodish, H. Molecular cell biology: Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P., Baltimore, D. and Darnell, J. // 2000 1083стр.

107. Doerfl er W. DNA Methylation — a regulatory signal in eukaryotic gene expression // J. Gen. Virol 1981 - V. 57. P. 1-20.

108. Erlich, M. and Wang. R.Y. 5-methylcytosine in eukaryotic DNA // Science 1981- V. 212. P. 1350-1357.

109. Хемлебен, В., Беридзе, Т.Г., Бахман, JT. Сателлитные ДНК // Успехи биологической химии 2003 - Т. 43. С. 267-306.

110. Bennett, M.D., Johnston, S., Hodnett,G.L., Price, H.J. Allium сера L. Cultivars from Four Continents Compared by Flow Cytometry show Nuclear DNA Constancy // Annals Bot 2000 - 85, 351-357.

111. Schmidt, T. and Heslop-Harrrison, J.S. Genomes, genes and junk: the larrgescale organization of plant chromosomes // Trends Plant Sci 1998 - № 3, p. 195-199.

112. Castiglione, R.M., Giraldi, E., Frediani, M. The DNA Methylation of Allium сера Metaphase Chromosmes // Biol. Zent. B1 1995 - № 114, p. 52-66.

113. Barnes, S. R., James, A. M., Jamiesson, G. The organization, nucleotide sequence, and chromosomal distribution of a satellite DNA from A. сера II Chromosoma 1985- 92, 185.

114. Sook Do, G., Bo Seo, В., Yamamoto, M., Suzuki, G., Mukai, Y. Identification and Chromosomal Location of Tandemly Repeated DNA Sequences in Allium сера II Genes Genet. Syst- 2001 № 76, p.53-60.

115. Wei, W., Zhao, W., Wang, L., Chen, В., LI, Y., and SONG, Y. Karyotyping of Brassica napus L. Based on COM DNA Banding by Fluorescence

116. Situ Hybridization — 2005 — 47(12): 1479-1484.102

117. Zhou, J., Lan, W., Qin, R. Comparative karyotypic analysis of A and C genomes in the genus Oryza with C0t-1 DNA and RFLP // Front. Agric. China -2011 -5(2): 173-180.

118. Bennetzen, J. L., Ma, J., Devos, K. M. Mechanisms of recent genome size variation in flowering plants // Ann Bot 2005 - 95(1): 127-132.

119. Brooke, D., Peterson-Burch D., Nettleton and Voytas, D. F. Genomic neighborhoods for Arabidopsis retrotransposons: a role for targeted integration in the distribution of the Metaviridae // Genome Biology 2004 - 5:R78.

120. Heslop-Harrison, J.S. Comparative genome organization in plants: from sequence and markers to chromatin and chromosomes // Plant Cell 2000 -V. 12. P. 617-635.

121. Miller O.J., Schnedl W., Allen J.B. Erlanger 5-methyl cytosine localised in mammalian constitutive heterochromatin // Nature, 1974. Vol. 251. P. 636-637.

122. Reeves, A., Tear, J. Mlirromasure for Windows, Version 3.2. 1999. Free program distributed by the authors at www/colostate /edu/depts/biology/ micromeasure.

123. Finnegan, E.J., Peacock, W.J., Dennis, E.S. Reduced DNA methylation in Arabidopsis thaliana results in abnormal plant development // Proc. Natl. Acad. Sci 1996 -V. 93. P. 8449-8454.

124. Патрушев JI.И., Минкевич, И.Г. Проблема размера генома эукариот // Успехи биологической химии 2007 - 293-370.

125. Pich, U., & Schubert, I. Terminal heterochromatin and alternative telomeric sequences in Allium сера II Chromosome Res 1998 - 6:315-321.

126. Shibata, F., Hizume, M., Kuroki, Y. Chromosome painting of Y chromosomes and isolation of a Y chromosome-specific repetitive sequence in the dioecious plant Rumex acetosa II Chromosoma 1999 - 108: 266-270.

127. Lengerova, M., Kejnovsky, E., Hobza, R., Macas, J., Grant, S. R., Vyskot, B. Multicolor FISH mapping of the dioecious model plant, Silene latifolia II Theor Appl Genet 2004 - 108:1193-1199.

128. Rayburn, A.L., and Gill, B.S. Repeated DNA sequences in Triticum (Poaceue): chromosomal mapping and its bearing on the evolution of В and G genomes //Plant Syst. Evol 1988 - 159: 229-235.

129. Lapitan, N.L.V., Gill, B.S., and Sears, R.G. Genomic and phylogenetic relationships among rye and perennial species in the Triticeae // Crop Sci- 1987-27: 682-686.

130. Navratilova, A., Neumann, P., and Macas, J. Karyotype analysis of four Vicia species using in situ hybridization with repetitive sequences // Ann. Bot. (London) 2003-91:921-926.

131. Koo, D.H., Choi, H.W., Cho, J., Hur, Y., and Bang, J.W. A highresolution karyotype of cucumber (Cucumis sativus L.) revealed by C-banding, pachytene analysis, and RAPD aided fluorescence in situ hybridization // Genome - 2005-48: 534-540.

132. Dong, F., Song, J., Naess, S.K., Helgeson, J.P., Gebhardt, C., and Jiang, J. Development and applications of a set of chromosome specific cytogenetic DNA markers in potato // Theor. Appl. Gent - 2000 - 101: 1001 -1007.

133. Kim, J.S., Childs, K.L., Islam-Foridi, M.N., Menz, M.A., Klein, R.R., Klein, P.E. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs // Genome 2002 - 45: 402-412.

134. Zhang, P., Li, W.L., Fellers, J., Friebe, B., and Gill, B.S. BAC FISH in wheat identifies chromosome landmarks consisting of different types of transposable elements // Chromosoma - 2004a- 112: 288-299.

135. Koumbaris, G. L., Bass, H. W. A new single locus cytogenetic mapping system for maize {Zea mays L.); overcoming FISH detection // 2003 - 35. 647-659.

136. Kaszas, E., Birchler, J.A. Meiotic transmission rates correlate with physical features of rearranged centromeres in maize // Genetics 1998— 150:1683-1692.

137. Kubis, S, Schmidt, T, Heslop-Harrison J.S. Repetitive DNA elements as a major component of plant genomes // Annals of Botany -1998-82S: 45-55.

138. Olin-Fatih, M., Heneen, W.K. C-banded karyotypes of Brassica campestris, B. oleracea, and B. napus II Genome 1992 - 35, 583-589.

139. Cheng, B.F., Heneen, W.K., Chen, B.Y. Mitotic karyotypes of Brassica campestris and Brassica alboglabra and identification of the B. alboglabra chromosome in an addition line // Genome — 1995 38, 313-319.

140. Snowdon, R. J., Friedt, W., Köhler, A. Molecular cytogenetic location and characterization of 5S and 25 S rDNA loci for chromosome identification in oilseed rape {Brassica napus L.) // Ann Bot 2000 - 86, 201-204.

141. Hasterok, R., Maluszynska, J. Cytogenetic markers of Brassica napus chromosomes // JAppl Genet 2000- 41, 1-9.

142. Hasterok, R., Jenkins, G., Langdon, T. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes // Theor Appl Genet 2001 - 103, 486-490.

143. Kulak, S., Hasterok, R., Maluszynska, J. Karyotyping of Brassica amphidiploids using 5S and 25S rDNA as chromosome markers // Hereditas -2002- 136, 144-150.

144. Wen-Hui, W., Wan-Peng, Z., Li-Jun, W., Bo, C., Yun-Chang, L., and Yun-Chun, S. Karyotyping of Brassica napus L. Based on COM DNA Banding by Fluorescence In Situ Hybridization // 2005 47 (12): 1479- 1484.

145. Zakrzewski, F., Wenke, T., Holtgräwe, D., Weisshaar, B., Schmidt, T. Analysis of a c0t-l library enables the targeted identification of minisatellite andsatellite families in Beta vulgaris. Zakrzewski et al // BMC Plant Biology 2010 -10:8.

146. Schmid, C.W. Does SINE evolution preclude Alu function? // Nucleic Acids Res 1998-26: 4541 - 50.

147. Matsunaga, S., Yagisawa, F., Yamamoto, M., Uchida, W., Nakao, S., Kawano, S. LTR retrotransposons in the dioecious plant Silene latifolia // Genome -2002-745-751(7).

148. Anja, G.J., Kuipers, J.S., (Pat) Heslop-Harrison, and Evert Jacobsen. Characterisation and physical localisation of Ty\-copia-\\ks, retrotransposons in four Alstroemeria species // 1998 41: 357.367.

149. Aragon-Alcaide L. A cereal centromeric sequence // Chromosoma -1996 -105, pp. 261-268.

150. Jiang, J. A conserved repetitive DNA element located in the centromeres of cereal chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A -1996 -93, pp. 14210-14213.

151. Miller J.T. Retrotransposon-related DNA sequences in the centromeres of grass chromosomes // Genetics 1998 - 150, pp. 1615-1623.

152. Presting, G.G. A Ty3/gypsy retrotransposon-like sequence localizes to the centromeric regions of cereal chromosomes // Plant J 1998 - 16, pp. 721— 728.

153. Langdon, T. Retrotransposon evolution in diverse plant genomes // Genetics 2000 -156 , pp. 313-325.

154. Nunes Fregonezi, J., Laurival, A., Vilas-Boas, Pelegrinelli, M., Letaif Gaeta M., Vanzela A. Distribution of a Ty3>lgypsy-\\k.Q retroelement on the A and B-chromosomes of Cestrum strigilatum Ruiz & Pav. And Cestrum intermedium

155. Sendtn. (Solanaceae) // Genetics and Molecular Biology 2007 - 30, 3, 599-604.107

156. Kejnovsky, E., Kubat, Z., Macas, J., Hobza, R., Mracek, J., and Vyskot, B. Retand : a novel family of gypsy-like retrotransposons harboring an amplified tandem repeat // Molecular genetics and genomics 2006 - 254-263.

157. Evan Staton, S., Mark, C., Ungerer and Richard, Moore, C. The genomic organization of Ty3/ gypsy like retrotransposons in helianthus (Astereceae) homoploid hybrid species // American Journal of Botany -2009-96(9): 1646-1655.

158. Heitkam, T., and Schmidt, T. BNR a LINE family from Beta vulgaris - contains a RRM domain in open reading frame 1 and defines a LI sub-clade present in diverse plant genomes // The Plant Journal - 2009 - 59, 872-882.

159. Sakamoto, K., Ohmido, N., Fukui, K., Kamada, H. and Satoh, S. Site-specific accumulation of a LINE-like retrotransposon in a sex chromosome of the dioecious plant Cannabis sativa II Plant Mol. Biol 2000 - 44,723-732.

160. Vershinin, A.V., Druka, A., Alkhimova, A.G., Kleinhofs, A. and Heslop-Harrison, J.S. LINEs and gypsy-like retrotransposons in Hordeum species // Plant Mol. Bio 2002 - 49, 1-14.

161. Leeton, P.R., Smyth, D.R. An abundant LINE-like element amplified in the genome of Lilium speciosum II Mol. Gen. Genet -1993 237:97-104.

162. Wright, D.A., Ke, N., Smalle, J., Hauge, B.M., Goodman, H.M., Voytas, D.F. Multiple non-LTR retrotransposons in the genome of Arabidopsis thaliana II Genetics 1996 -142: 569 - 578.

163. Higashiyama, T., Noutoshi, Y., Fujie, M., Yamada, T. Zepp, a LINElike retrotransposon accumulated in the Chlorella telomeric region // EMBO J. -1995 -16:3715-23.

164. Cuadrado, A., Schwarzacher, T., Jouve, N. Identification of different chromatin classes in wheat using in situ hybridization with simple sequence repeat oligonucleotides // Theor Appl Genet- 2000 — 101:711—717.

165. Havey, M. J. Restriction enzyme analysis of the chloroplast and nuclear 45s ribosomal DNA of Allium sections Cepa and Phyllo- dolon (Alliaceae) II PI. Syst. Evol- 1992- 183:17-31.

166. Kumar, A. The adventures of the Tyl-copia group of retrotransposons in plants // Trends Genet 1996 -12: 41-43.

167. Pearce, S.R., Harrison, G., Li, D., Heslop-Harrison, J.S., Kumar, A and Flavell, A.J. The Tyl-copia group retrotransposons in Vicia species: copy number, sequence heterogeneity and chromosomal localization // Mol. Gen. Genet. 1996a-250: 305 —315.

168. Jiang, J., Birchler, J.A., Parrott, W.A., Kelly Dawe, R. A molecular view of plant centromeres // Trends in plant science 2003 - 570-575.

169. Irifune, K., Hirai, K., Zheng, J., Tanaka, R., Morikawa, H. Nucleotide sequence of a highly repeated DNA sequence and its chromosomal localization in Allium fistulosum II Theor Appl Genet 1995 - 90: 312-316.

170. Фесенко, И.А., Хрусталева, Л.И., и Карлов, Г.И. Изучение организации сателлитного повтора 378 п.н. в терминальном гетер охр оматине Allium fistulosum //Генетика-2001-38: 7.С. 893-903.

171. Clarke, L. Centromeres: proteins, protein complexes, and repeated domains at centromeres of simple eukaryotes // Curr. Opin. Genet. Dev 1998 - 8, 212-218.

172. Csink, A. K., and Henikoff, S. Something from nothing: the evolution and utility of satellite repeats // Trends Genet 1998 -14, 200-204.

173. Round, E. K. Arabidopsis thaliana centromere regions: genetic map positions and repetitive DNA structure // Genome Res 1997 - 7, 1045-1053.

174. Jackson, S. A. Application of Fiber-FISH in physical mapping of Arabidopsis thaliana II Genome 1998 - 41, 566-572.

175. Cheng, Z. K. Functional rice centromeres are marked by a satellite repeat and a centromere-specific retrotransposon // Plant Cell 2002 - 14, 1691— 1704.

176. Henikoff, S. The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving DNA // Science 2001 - 293, 1098-1102.

177. Cheng, Z. K. Functional rice centromeres are marked by a satellite repeat and a centromere-specific retrotransposon // Plant Cell — 2002 -14, 1691— 1704.

178. Harrison, G.E., and Heslop-Harrison, J.S. Centromeric repetitive DNA sequences in the genus Brassica II Theor. Appl. Genet 1995 - 90, 157-165.

179. Kamm, A. Molecular and physical organization of highly repetitive, undermethylated DNA from Pennisetum glaucum II Mol. Gen. Genet-1994 244, 420^125.

180. Kamm, A. Analysis of a repetitive DNA family from Arabidopsis arensa and relationship between Arabidopsis species // Plant Mol. Biol 1995 —2 7, 853-862.

181. Miller, J.T. Cloning and characterization of a centromerespecific repetitive DNA element from Sorghum bicolor II Theor. Appl. Genet 1998 - 96, 832-839.

182. Gindullis, F. The large-scale organization of the centromeric region in beta species // Genome Res 2001 - 11, 253-265.

183. Sun, X.P. Molecular structure of a functional Drosophila centromere //Cell-1997-91, 1007-1019.

184. Mroczek, R.J., and Dawe, R.K. Distribution of retroelements in centromeres and neocentromeres of maize // Genetics 2003 - 165: 809-819.

185. Shelby, R.D. Chromatin assembly at kinetochores is uncoupled from DNA replication // J. Cell Biol 2000 -115,1113-1118.

186. Barnes, S. R., James, A. M. and Jamieson, G. The organization, nucleotide sequence, and chromosomal distribution of a satellite DNA from Allium cepa// Chromosoma 1985 -№92. C. 185-192.

187. Irifune, K., Hirai, K., Zheng, J. Nucleotide sequence of a highly repeated DNA sequence and its chromosomal localization in Allium fistulosum // Theor. Appl. Genet 1995 -№90. C. 312-316.

188. Khrustaleva, L. I., Kik, C. Localization of single-copy T-DNA insertion in transgenic shallots {Allium cepa) by using ultra-sensitive FISH with tyramide signal amplification // The plant journal 2001 - 699 - 707.

189. Nagaki, K., Cheng, Z., Ouyang, S., Talbert, P.B., Kim, M. Sequencing of a rice centromere uncovers active genes // Nature Genetics -200436, 138- 145 .

190. Schmidt, T., Kubis, S., and Heslop-Harrison, J.S. Analysis and chromosomal localization of retrotransposons in sugar beet {Beta vulgaris L.): LINEs and Ty\-copia-\\k& elements as major components of the genome // Chromosome Res 1995 - 3:335-345.

191. Van Sluys, M., Scortecci, K.C., and Costa. A.P. O genoma instâvel, seqiiências genéticas moveis. In: Matioli SR (ed) Biologia Molecular e Evoluçâo // Holos Editora, Ribeirâo Preto -2001-pp 70-81.

192. Marin, I., and Lloréns, C. Ty3/Gypsy Retrotransposons: Description of New Arabidopsis thaliana Elements and Evolutionary Perspectives Derived from Comparative Genomic Data // Molecular Biology and Evolution 2000 -Volume 17. Pp. 1040-1049.

193. Rayburn, A.L., and Gill, B.S. Use of biotin labeled probs to map specific DNA sequence on wheat chromosomes // J. Hered - 1985 - 76. 78 - 81.

194. Flavell, R.B. Repetitive DNA and chromosome evolution in plants // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 1986 - 312: 227-242.

195. Sun, X., Wahlstrom, J., Karpen, G.H. Molecular structure of a functional Drosophila centromere // Cell 1997 - 92:1007-1019.

196. Kamm, A. Analysis of a repetitive DNA family from Arabidopsis arenosa and relationship between Arabidopsis species 11 Plant Mol. Biol — 1995 — 27, 853-862.

197. Martinez-Zapater, J.M. A high repeated DNA sequence in Arabidopsis thaliana II Mol. Gen. Genet 1996 - 204, 417-423.

198. Maluszynsak, J., and Heslop-Harrison, J.S. Localization of tandemly repeated DNAsequences in Arabidopsis thaliana II Plant J 1991-1, 159-166.

199. Gindullis, F. The large-scale organization of the centromeric region in beta species // Genome Res 2001 - 11, 253-265.

200. Leach, C. R. Organisation and origin of a B chromosome centromeric sequence from Brachycome dichromosomatica II Chromosoma -1995-103, 708714.

201. Aragón-Alcaide, L. A cereal centromeric sequence // Chromosoma -1996- 105,261-268.

202. Iwabuchi, M. et al. Molecular and cytorogical characterization of repetitive DNA sequences in Brassica. Theor. Appl. Genet. 1991 - 81, 349-355.

203. Presting, G. G. ATy3/gypsy retrotransposon-like sequence localizes to the centromeric regions of cereal chromosomes // Plant J 1998 - 16, 721-728.

204. Hudakova, S. Sequence organization of barley centromeres // Nucleic Acids Res-2001 -29, 5029-5035.

205. Cheng, Z. K. Functional rice centromeres are marked by a satellite repeat and a centromere-specific retrotransposon // Plant Cell 2002-14, 16911704.

206. Dong, F. Rice (Oryza sativa) centromeric regions consist of complex DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998 - 95, 8135-8140.

207. Nonomura, K.I., and Kurata, N. Organization of the 1.9-kb repeat unit RCE1 in the centromeric region of rice chromosomes // Mol. Gen. Genet. 1999 -261, 1-10.

208. Sykorova E., Lim K. Y, Kunicka. Z, Chase, M.W, Bennett, M. D., Fajkus, J.and Leitch, A.R. Telomere variability in the monocotyledonous plant order Asparagales // Journal of Biological Sciences 2003- 270, 1893-1904.

209. Entani, T. Centromeric localization of an S-RNase gene in Petunia hybrid// Vilm. Theor. Appl. Genet 1999 - 99, 391-397.

210. Nagaki, K. A novel repetitive sequence of sugar cane, SCEN family, locating on centromeric regions // Chromosome Res- 1998 -6,295-302.

211. Francki, M.G. Identification of Bilby, a diverged centromeric Tyl-copia retrotransposon family from cereal rye (Secale cereale L.) // Genome 2001 -44, 266-274.

212. Miller, J.T. Cloning and characterization of a centromerespecific repetitive DNA element from Sorghum bicolor II Theor. Appl. Genet 1998 - 96, 832-839.

213. Jiang, J. A conserved repetitive DNA element located in the centromeres of cereal chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1996 - 93, 14210-14213.

214. Miller, J.T. Retrotransposon-relatedDNA sequences in the centromeres of grass chromosomes // Genetics -1998-150, 1615-1623.

215. Zwick, M.S. Distribution and sequence analysis of the centromere-associated repetitive element CEN38 of Sorghum bicolor (Poaceae) // Am. J. Bot. -2000-87, 1757-1764.

216. Kishii, M. A tandem repetitive sequence located in the centromeric region of common wheat (Triticum aestivum) chromosomes // Chromosome Res. -2001-9,417-428.

217. Cheng, Z-J. and Murata M. A centromeric tandem repeat family originating from a part of Ty3/gypsy-retroelement in wheat and its relatives // Genetics -2003 164, 665-672.

218. Nagaki, K. Molecular and cytological analyses of large tracks of centromeric DNA reveal the structure and evolutionary dynamics of maize centromeres // Genetics 2003 -163, 759-770.

219. Ananiev, E.V. Chromosome-specific molecular organization of maize (Zea mays L.) centromeric regions // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1998 -95, 13073-13078.

220. Alfenito, M.R., and Birchler, J.A. Molecular characterization of a maize B chromosome centric sequence // Genetics 1993 -135, 589-597.

221. Page, B.T. Characterization of a maize chromosome 4 centromeric sequence: evidence for an evolutionary relationship with the B chromosome centromere // Genetics 2001 -159, 291-302.

222. СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА