Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и применение высокочувствительного метода физического картирования генов на хромосомах растений

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение высокочувствительного метода физического картирования генов на хромосомах растений"

УДК: 575.116

На правах рукописи

КИРОВ Илья Владимирович

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО МЕТОДА ФИЗИЧЕСКОГО КАРТИРОВАНИЯ ГЕНОВ НА ХРОМОСОМАХ РАСТЕНИЙ

Специальность: 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

14 ОКТ 2015

Москва-2015

005563294

Работа выполнена в Центре молекулярной биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К. А. Тимирязева»

Научный руководитель: Хрусталева Людмила Ивановна,

доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник Центра молекулярной биотехнологии ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет -МСХА имени К. А. Тимирязева»

Официальные оппоненты:

Муравенко Ольга Викторовна, доктор биологических наук, профессор,

заведующая лабораторией молекулярной кариологии, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Шилов Илья Александрович, доктор биологических наук, заведующий

лабораторией анализа геномов, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Защита состоится «25» ноября 2015 г. в 16:30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 на базе ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева» по адресу: 127550, Москва, ул. Прянишникова, д. 19, тел./факс +7(499) 976-17-14, e-mail: dissovet@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева и на сайте http://www.timacad.ru/

Автореферат разослан « » октября 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

JI.C. Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Положение гена на хромосоме играет важную роль в изменении признаков и эволюции организмов (Rockman et al.. 2010). Знания о физическом положении генов на хромосоме позволяют прогнозировать возможность их переноса от одного генотипа к другому, ускорять процесс поиска и клонирования новых генов, судить о коллинеарности и синтении геномов, определять размеры селекционной популяции, время и экономические затраты на получение нужных форм.

Геномы лишь небольшого числа растений были полностью секвенированы и собранны, предоставляя наиболее полную информацию о физическом положении генов. Для подавляющего большинства видов растений полный сиквенс генома пока остается недоступным. Более того, часто конечный вариант сиквенса генома имеет неточности в положении контигов и скэффолдов (Shearer et al., 2014). Методы молекулярной цитогенетики позволяют визуализировать на хромосомах различные ДНК последовательности и тем самым устанавливают их точную физическую локализацию в геноме. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) - основной метод молекулярной цитогенетики. Главным недостатком FISH является низкая чувствительность, 5 — 10 тыс.п.н. (Valarik et al., 2004). В то время как средняя длина генов растений меньше 4 тыс.п.н. (Jaillon et al. 2007; Ling et al. 2013; Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium., 2003).

Главные составляющие успешного физического (молекудярно-цитогенетического) картирования коротких ДНК фрагментов на хромосомах растений являются: 1) высококачественные препараты хромосом; 2) система детекции сайтов гибридизации; 3) качество ДНК пробы, которая гибридизуется только в одном локусе; и 4) цитогенетические маркеры для идентификации индивидуальных хромосом. При этом определяющим фактором остаётся качество приготовленных препаратов хромосом, которое определяет 70% успеха физического картирования. Однако, современные методы приготовления препаратов требуют большого опыта и очень трудоёмки, что делает процесс приготовления препаратов «больше искусством, чем наукой» (Barch et al., 1997).

Для преодоления этого ограничения FISH был создан метод Tyramide-FISH (Raap et al. 1995), который позже был впервые применен для хромосом растений (Khrustaleva and Kik, 2001). Однако, из-за низкой частоты встречаемости сигнала по хромосомам и низкой воспроизводимости результатов в разных лабораториях и на разных видах растений (Jiang and Gill, 2006), Tyramide-FISH не был широко использован на хромосомах растений. Главными причинами этого являются ограниченные знания о факторах, влияющих на реакцию Tyramide-FISH, и отсутствие работ по оптимизации данного метода на хромосомах растений.

Физическое картирование хромосом затруднительно без знания кариотипа растения и возможности проводить идентификацию отдельных хромосом кариотипа. Морфологические признаки хромосом (центромерный индекс и относительная длина) предоставляют ограниченную информацию, которая для многих растений (часто растений с мелкими хромосомами) не позволяет эффективно отличать хромосомы кариотипа. В связи с этим актуальной является задача поиска новых цитогенетических маркеров хромосом растений. Среди всех известных типов цитогенетических маркеров FISH-маркеры хромосом растений открывают широкие возможности для специфичной идентификации хромосом.

Сочетание чувствительной системы детекции сайтов гибридизации, методов приготовления качественных препаратов хромосом растений и ДНК проб совместно с

использованием FISH-маркеров для идентификации хромосом растений формируют необходимую методологическую платформу для эффективного физического картирования генов на хромосомах растений.

Цель работы. Цель работы - повысить эффективность Tyramide-FISH, создать необходимую платформу (система детекции + метод приготовления препаратов + система цитогенетических маркеров) для физического картирования коротких фрагментов генов (1000 — 3000 п.н.), применить эту технологию на хромосомах видов Allium и Rosa wichurana, создать физические (хромосомные) карты и провести интегрирование физических и генетических карт этих видов.

Задачи работы:

1. Создать высокоэффективный и универсальный метод приготовления митотических метафазных и пахитенных хромосом растений с использованием видов с крупными геномами и хромосомами (виды рода Allium) и видов с мелкими хромосомами и малым размером генома (виды рода Rosa).

2. Провести клонирование фрагментов генов Rosa wichurana и Allium сера длиной не менее 550 п.н..

3. Оценить влияние способа приготовления препаратов с использованием разных концентраций уксусной кислоты на частот}' встречаемости сигнала после Tyramide-FISH с геном аллиназы корм 1 (1100 п.н.) на хромосомах А. сера.

4. Оптимизировать и сравнить прямую и непрямую системы детекции Tyramide-FISH на хромосомах А.сера и R.wichurana.

5. Провести оптимизацию высокоразрешающей и многоцветной Tyramide-FISH на хромосомах Rwicfmrana.

6. Провести картирование генов (гены семейства аллиназ и ген синтазы фактора слезотечения), вовлеченных в синтез сульфурорганических соединений, на хромосомах А.сера, A.fsitulosum и их близкородственных видов (A.vavilovii, A.schoenoprasum, A.altaicurrí).

7. Провести Tyramide-FISH картирование генов, вовлеченных в ответ растения на биотический и абиотический стрессы, на митотических и пахитенных хромосомах R.wichurana.

8. Провести генетическое картирование генов R.wichurana с помощью метода высокоразрешающего плавления (HRM).

9. Провести интегрирование рекомбинационной и хромосомной карт А.сера и Ли'ichurana.

10. Провести поиск молекулярно-цитогенетических маркеров для хромосом R.wichurana и A.fsitulosum с использованием данных секвенированния следующего поколения и биоинформатического анализа, и FISH выявления специфических паттернов гибридизации.

Научная новизна. Впервые изучена динамика разброса хромосом растений в процессе приготовления препаратов и установлены факторы, влияющие на структуру и разброс хромосом. Впервые показано, что эффективность Tyramide-FISH зависит от концентрации уксусной кислоты, используемой для приготовления препаратов хромосом. Идентифицированы повторяющиеся ДНК последовательности и на их основе разработаны эффективные системы цитогенетического маркирования хромосом А. fistulosum (новые повторы НАТ58 и AfiT32) и R. wichurana (теломерный повтор (GGGATTT)n). Впервые проведено интегрирование генетической и физической карт R.wichurana. С помощью Tyramide-FISH впервые показаны различия в гомеологичных

хромосомах 4 А.сера и A.fistulosum, обусловленные перицентрической инверсией и транслокацией/делецией.

Теоретическая н практическая значимость работы. Разработанный высокочувствительнй метод позволит ускорить физическое картирования генов и интегрирование генетических и физических карт исследуемых видов. Данные результаты являются ценной информацией для проектов по секвенировашпо генома А.сера (http://wwvv.oniongenome.net/) и Rosa (Foucher et al. 2013), так как позволят ускорить и верифицировать сборку геномов. Эта информация послужит важной основой для изучения синтении и коллинеарности между близкими видами внутри рода Allium и семейства Rosaceae, а также позволит более эффективно проводить клонирование генов, основанное на карте (от анг. map based cloning). Так же разработанный протокол многоцветной Tyramide-FISH с высоким разрешением позволяет существенно расширить возможности метода Tyramide-FISH.

Разработанный метод приготовления препаратов митотических метафазных и пахитенных хромосом ("SteamDrop") был успешно испытан на 28 видах растений, что указывает на его высокую адаптивность и возможность использования для многих видов растений. Метод имеет ряд преимуществ, таких как хороший разброс хромосом, мягкий режим обработок, максимально сохраняющий структуру хромосом, простота и быстрота приготовления препаратов, долгое хранение суспензии клеток без потерь качества препаратов. Разработанная система цитогенетических маркеров для A.fistulosum, основанная на FISH с новыми тандемными повторами НАТ58 и AfiT32, и для Rwichurana, основанная на FISH с (GGGATTT)8 теломерным повтором, делает возможным высокоразрешающее физическое картирование на мейотических хромосомах, идентификация которых у луков и роз невозможна без использования молекулярно-цитогенетических маркеров.

Методология и методы диссертационного исследования. Работа выполнена с использованием современного оборудования и молекулярно-биологических и молекулярно-цитогенетических методов, разработанных ведущими учеными мира. Результаты статистически обработаны.

Положения, выносимые на защиту

1. Метод "SteamDrop" - универсальный и эффективный метод приготовления хромосом растений, подходящих для in situ детекции уникальных и повторяющихся последовательностей ДНК.

2. Использование пониженной концентрации уксусной кислоты для приготовления препаратов существенно повышает эффективность физического картирования генов Tyramide-FISH.

3. Фрагменты генов длиной от 1000 п.н. могут быть эффективно картированы на хромосомах Rwichurana и видов Allium, приготовленных с помощью "SteamDrop", используя оптимизированные системы детекции Tyramide-FISH.

4. НАТ58 - новый высококопийный (160.000 копий/IC) тандемный повтор генома A.fistulosum.

5. Созданы системы цитогенетических маркеров для хромосом Rwichurana и A.fistulosum.

6. С помощью Tyramide-FISH проведено картирование хозяйственно-ценных генов на крупных хромосомах А.сера, A.fsitulosum, A.vavilovii, A.schoenoprasum, A.altaicum и мелких хромосомах Rwichurana.

1. Проведено интегрирование генетических и физических карт А.сера и Rwichurana.

8. Инверсия участка хромосомы привела к различиям между гомеологичными хромосомами 4 А. сера и A.fsUulosum.

Степень достоверности н апробация результатов. Результаты работы опубликованы в 35 печатных работах, в том числе 11 статьях в рецензируемых международных (8) и отечественных (3) журналах из списка ВАК. Ключевые результаты работы были доложены на международных и российских форумах и конференциях, в том числе: XI молодежная научная конференция «биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011); XVIII международная научная конференция студентов, аспирантов н молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2011 г.); 35th conference of agricultural students and veterinary medicine with international participation (Сербия, 2011); XIV молодежная научная конференция «биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011); 2-я Международная школа-конференция молодых учёных (Звенигород, 2011 г.); 6th International symposium on Edible Alliaceae (Япония, 2012 г.); 19th International Chromosome Conference, (Италия, 2013); Journées Cytogénétique et Polyploïdie, (Франция, 2013); 7th International symposium on Edible Alliaceae (Турция, 2015 г.); Plant molecular cytogenetics in genomic and postgenomic era (Польша, 2014), 3-я Всероссийская научно-практическая конференция по геномному секвенированию (NGS-2015, Москва, 2015); XXVth International Symposium of the EUCARPIA Section Ornamentals "Crossing borders" (Бельгия, 2015).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 35 работ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 172 страницах машинописного текста и включают 44 рисунка, 22 таблицы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список литерату ры включает 293 источника, из них 290 иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе были использованы растения R. wichurana, выращенные в условиях теплицы без искусственного контроля света и температуры, а также семена А. сера (сорт Халцедон), A.fistulosum (сорт Русский зимний), A.schoenoprasum (сорт Медонос) фирмы «Гавриш». Семена A.altaicum Альвес фирмы «Седек». Растения A.vavilovii, F1 (Асера х A.vavilovii ) и A.proliferwn были предоставлены ВНИИСОК. Растения A.wakegi были предоставлены Dr. Masyoshi Shygio (Yamaguchi University, Faculty of Agriculture, Japan).

Приготовление препаратов митотических хромосом. Препараты метафазных хромосом были приготовлены методом "SteamDrop" (Kirov et al. 2014).

Приготовление препаратов пахитенных хромосом. Приготовление пахитенных хромосом А.сера и R.\vichurana проводилось по методике Kirov et al. (2014, 2015).

Выделение ДНК. ДНК выделяли согласно протоколу Rogers and Bendich (1985) из молодых листьев R.wichurana и проростков Allium.

Получение проб для Tvramide-FISH и FISH. Праймеры на изучаемые гены были подобраны с помощью программы Primer 3.0 Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/nrimer3nlus/Drimer3Dlus,cgi). Последовательности генов и их номера в NCBI, которые были использованы для подбора праймеров, представлены в таблице 1. Температура отжига для всех праймеров составила 58°С.

Таблица 1. Информация о праймерах

Вид Ген Праймеры, 5'-3' Номер в NCBI

Allium сера Аллиназа корня I (AOB249) CAGAATTCACCAAGGCGAAGGG ACCGGATAATAAGGGGCATGAG АА451570.1

Allium сера Аллиназа луковицы GGTCATCTCCCTTTCACCAA TGATCAAACTCAAACGCAC L48614.1

Allium сера Аллиназа корня II CCACGGGTCGAGATGGGATGGA AAAAACGCCCTTCGCCTTGGTG АВ111058.1

Allium сера Синтаза фактора слезотечения (LFS) AAAATGGAGCTAAATCCTGGTG CATAATGCATCACAGCACTGAA AB094593

Allium сера Халкон сшггетаза (CHS) TCCATGATCAGGAAACGCTAC CGAACGCACCCATTAACAAT AY221245.1

Rosa wichura na Орцинол-О-метил трансераза (ООМТ) TGCACTACCAATCCATCCAA TGCCAAGTAACATTTGGCTTT AJ786302

Rosa wichura na Локус устойчивости к мучнистой росе О 1 (ML01) TCAAAGCCACCAAAAATTCA TGCTTCTTAGCCGTGTGATG JX847131.1

Rosa wichura na Локус устойчивости к мучнистой росе О 2 (ML02) AGGATTTCAAGGTCGTGGTG TGGTCGGCTAGCATTTTTCT JX847132.1

Rosa wichura na Локус устойчивости к мучнистой росе О 3 (ML03) AAAACACCAACATGGGCAGT TTCCGAAAATCAAAGGTCGT JX847133.1

Rosa wichura na Пирролше-5-Карбоксилат Сшггаза (P5CS) GCTGGCATCCCTGTTGTTAT CTTCGGATCGCTAATGAAGC FC865594.1

Rosa wichura na Феншгаланин аммония лиаза (PAL) ACCACTGGKTTTGGTGCWAC CCYTTGAASCCATAATCCAA Scaffold 2:20,819, 497.-20,820,563 (Prunus pérsica)

Rosa wichura na АТФаза (ААА2) GTTCCCTTTGTCATTGCAG ACGGCCTCTTCATCAATT LG7: 21485846..2148109 0 (Fragaria vesca)

Rosa wichura na Монодегидроаскорб ат редуктаза (MDAR) GAGGCGGTATGGTTAATTT AAACTTGGGCTTTGGTGA CF349908.1

Rosa wichura na Манноз1и гликопротеин эндо-бета-маннозидаза (MGM) CGGCATGGAAAATGAGTCAA GAACAAAGGGATCTGCCA LG6: 5180627..5186123

Rosa wichura na Аннексии Dl (AD1) TAAAGTACCAGCATGCGTT С САТАААСААСАС СААСТСА EC586738.1

Rosa wichura na Нарингешш (Nar) AATTCCGATCATTTCCCTCTC CCTTGCTCATTCTTCTTCTT BQ105585.1

ПЦР продукты были клонированы в pGEM-T easy (Promega) или pCR2.1-TOPO (Invitrogen) и секвенированы на секвенаторе ABI 3130 XL (Applied Biosystem).

Выделенная ДНК плазмид была помечена с помощью DIG-Nick Translation Mix или Biotin-Nick-Translation Mix (Roche) согласно прилагаемой инструкции.

Повтор НАТ58, АЙТ32 и Afil 1 были помечены с помощью ПЦР с геномной ДНК A.fistulosum и PCR labeling Mix (Roche), используя следующие праймеры (табл. 2).

Таблица 2. Прайме зы на повторы

Название повтора Праймеры, 5'-3' Номер в NCBI

НАТ58 F.-AAAAACATCTTCCAACAGCATAAA R:TGCATGAAAAGACAGCGTTT н/п*

AÍÍT32 FrTCCCACCTAAATTACGGACA R:AAATAGCGGCTTCTGCACTA н/п

Afil 1 F: AAAGGTTCATGCCTGCTTTC R: TTTTACGGCATGCGATACCT АВ735740

*н/п - номер не присвоен

Пробы на теломерный повтор Arabidopsis типа (СССТААА)3 и повтор НАТ58 (5'-TGCATGAAAAGACAGCGTTTAGAGTTTTTATGC-3') бьши синтезированы и помечены TAMRA на 5 ' конце компанией Синтол (Москва, Россия).

FISH и ND-FISH (nondenaturating FISH). FISH проводили согласно протоколу Khrustaleva and Kik (2001) с некоторыми модификациями. ND-FISH проводили согласно протоколу Cuadrado and Jouve (2010).

Многоцветная Tvramide-FISH. Биотин- меченые фрагменты генов PAL и MGM и дигоксигенин - меченый фрагмент гена ML02 бьши использованы для многоцветной Tyramide-FISH. Детекцию проводили последовательно, согласно протоколу Kirov et al. (2015).

Флуоресцентная микроскопия и анализ изображения. Препараты после FISH и Tyramide-FISH были проверены на микроскопе Zeiss Axio Imager Ml (Carl Zeiss Microimaging, Jena, Germany). Фотографии были сняты камерой Axio Cam MRm с помощью программы AxioVision 4.6. Яркось/контраст были отрегулированы в программе AxioVision 4.6 или Photoshop CS7.

Изолирование повтора НАТ58. Повтор НАТ58 был выделен из данных секвенирования следующего поколения, доступных для A.fistulosum в базе данных NCBI (SRX268217), с помощью программы RepeatExplorer (Novak et al. 2013). Минимальная длина перекрытий между ридами для построения контига была 40 п.н., а для кластеризации 55 п.н..

Генетическое картирование. II RM был проведен согласно Deryckere et al. (2013). Паттерны расщепления для каждого маркера бьши добавлены к существующим данным, описанным Moghaddam et al. (2012). Для картирования были использованы следующие параметры: используя сцепление с частотой рекомбинации меньше, чем 0.49 и LOD выше, чем 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

SteamDrop — новый универсальный метод приготовления препаратов хромосом растении

Нами впервые было проведено детальное исследование процесса разброса хромосом растений после нанесения клеточной суспензии на стекло. Результаты данного эксперимента показали, что в период с момента добавления фиксатора и

образованием мениска над клетками происходит быстрое исчезновение цитоплазмы и разрушение клеточной стенки. Хромосомы остаются не разбросанными.

В следующем эксперименте, после нанесения клеток, добавления фиксатора и образования мениска, была проведена обработка клеток на стекле паром от водяной бани, нагретой до 55°С. Эксперимент был проведен на клетках А./ишЬяит и Нити1т ]аротсш. В противоположность результатам первого варианта (без пара), происходил быстрый разброс как крупных хромосом А./шикит, гак и мелких хромосом Н.]аротст (рис. 1).

А о

■ •

iSIß^

ff:

Рисунок 1. Процесс разброса хромосом A.fistulosum (А-Н) и H.japonicus (А'-Н') после капания фиксатора: А,В и А',В' - образование мениска над клеткой (II - Ш этапы), С, D и С -Н - клетки набухают и цитоплазма становится прозрачной (Ш этап), Е-Н и F'-H' - разброс хромосом и иммобилизация клеток к стеклу (III - IV этапы). Этапы С-Н и С'-Н' происходили под действием пара. Линейка — 10 мкм.

Динамика разброса хромосом - разрушение клеточной стенки, гидролиз цитоплазмы, разброс хромосом и их прикрепление к стеклу. Главным практическим выводом проделанной работы стало то, что действие пара на препарат во время образования мениска значительно улучшает разброс хромосом.

Относительная влажность воздуха и температура - критические факторы разброса хромосом растений

Дтя проверки взаимосвязи между влажностью воздуха и качеством разброса хромосом растений и установления оптимальных условий разброса, было проведено сравнение динамики разброса хромосом при трех вариантах относительной влажности воздуха (25-30%, 50-55% и 65-70%) при комнатной температуре. Нами были определены оптимальные условия для метода «паровой капли»: 45-55% относительной влажности воздуха и температура 23-25°С. Метод «SteamDrop» («паровая капля»)

Метод был применен на 28 видах растений как с мелкими, так и с крупными хромосомами (рис. 2). На видах с мелкими хромосомами (Cannabis sativa, Humulus japonicus, Humulus lupulus, Linum. usitatissimum, Populus nigra, Brassica oleráceo, Ricinus communis) число метафазных пластинок с хорошим разбросом хромосом (менее 2 перекрытий хромосом) составило 85-97%, а для видов с крупными хромосомами до 32%.

I Í

Адаптация метода "SteamDrop" для приготовлении препаратов пахитенных хромосом А.сера и R.wichurana

Несмотря на ценность препаратов пахитенных хромосом для физического картирования, для многих видов растений получения таких препаратов затруднительно (de Jong el al. 1999; Kulikova et al. 2001; De Capdeville G. et al. 2009; lacia and Pinto-Maglio, 2013). Пахитенные хромосомы видов Rosaceae и Alliaceae никогда не были использованы в молекулярно-цитогенетических исследованиях. Использование дополнительной обработки уксусной кислотой в протоколе "SteamDrop" позволило получить препараты пахитенных хромосом R.wichurana с подходящим разбросом и без цитоплазмы (Kirov et al. 2015).

Использование препаратов, приготовленных методом "SteamDrop", для FISH и Tyramide-FISH

Для ответа на вопрос о возможности использования препаратов, приготовленных методом "SteamDrop", в современных молекулярно-цитогенетических исследованиях, данные препараты были задействованы в протоколах FISH и Tyramide-FISH (рис. 2).

Рисунок 2. Результат использования препаратов, приготовленных методом "SteamDrop", для FISH и Tyramide-FISH. (А) FISH с Dig меченным повтором HJSR Kpri (Alexandrov et al. 2012) на хромосомах Я. japonicus, FISH с 5S рРНК на метафазных хромосомах A.fistulosum (В) и пахитенных хромосомах А сера (С); (D) FISH на хромосомах T.aestivum с (AAC)S микросателлитом; FISH с 45S рРНК на метафазных (Н) и пахитенных хромосомах Kwichurana (G); Tyramide-FISH с Dig меченным фрагментом гена LFS (Е) (550 п.н.) и аллиназы луковицы (F) (1100 п.н.) на хромосомах А.сера. Линейка - 10 мкм

«SteamDrop» метод был использован в молекулярно-цитогенетических исследованиях генома R.wichurana (Kirov et al., 2014: Kirov et al. 2015), Cannabis sativa (Divashuk et al. 2014; Razumova et al. 2015), A.cepa (Kiseleva et al. 2014, Romanov et al. 2015), Nicotiana (Laskowska et al. 2015), Pennisetum squamulatum (Sapkota, 2014).

Оптимизация Tyramide-FISH

0nmuMU3aijUR системы детекции для хромосом R.wichurana Для оптимизации системы детекции Tyramide-FISH для физического картирования генов\маркеров на хромосомах розы R.wichurana был клонирован фрагмент гена ООМТ (о-орцинол метил трансфераза), размером 1.1 тыс.п.н. Нами было выявлено, что ключевым фактором, влияющим на интенсивность сигнала и фона является концентрация тирамид-биотин коньюгатов. Было найдено, что разбавление 1:25

тирамид-биотин коьюгатов и 1:100 антител етрептавидин-СуЗ давали наиболее интенсивный и часто встречающийся сигнал с низким уровнем фона. Использование оптимальных концентраций позволило нам впервые провести физическое картирование гена с помощью Tyramide-FISH на мелких хромосомах растений (Kirov et al. 2014, 2015). Оптимизация прямой и непрямой систем детекции для физического картирования генов на крупных хромосомах Allium сера

В качестве пробы был использован фрагмент (Allbe) гена аллиназы луковицы (L48614), для которого с помощью прямой системы детекции ранее была показана локализация в дистальной части хромосомы 4 (Khrustaleva et al. 2012). Для детекции аллиназы нами была впервые для хромосом лука применена непрямая система детекции сигнала с использованием биотинилированных тирамидов е последующей детекцией стрептавидин-СуЗ. Tyramide-FISH с различными концентрациями тирамидов и вторичных антител (Стрептавидин-СуЗ) позволили выявить оптимальные значения данных показателей, которые составили: разбавление тирамидов - 1:25 и стрептавидин-СуЗ - 1:100. Сравнение прямой и непрямой систем детекции с использованием Allbe фрагмента позволило установить, что интенсивность флуоресценции на порядок выше при непрямой системе детекции. При использовании непрямой детекции соотношение сигнал/фон был в 2-3 раза выше, чем при прямой детекции. Влияние приготовления препаратов хромосом на результаты Tyramide-FISH

Ранее было высказано предположение, что активированные тирамиды связываются с некоторыми аминокислотами гистонов (Raap et al. 1995). Поэтому, мы предположили, что понижение концентрации уксусной кислоты при приготовлении препаратов приведет к снижению экстракции гистонов из хромосомы и позволит улучшить результаты Tyramide-FISH. Для оценки был проведен подсчет частоты встречаемости сигналов (ЧВС = число хромосом 2 и 6 с сигналом х 100%/общее число анализированных хромосом 2 и б) от гена аллиназы корня (Рисунок 3).

СЬ2С«4

силы

Рисунок 3. Положение и обозначения 4 локусов аллиназы корня, учитываемых при подсчетах ЧВС на хромосомах 2 и 6 А.сера. Красный сигнал - ген аллиназы. Зеленый сигнал - 45Э рДНК.

Результаты показали, что 1) морфология хромосом, приготовленных с использованием разных концентраций уксусной кислоты, была различна после Тугап^е-РКН и в варианте с использованием низкой концентрации уксусной кислоты, хромосомы имели ярко выраженные вьтетливания хроматина; и 2) ЧВС на препаратах, приготовленных с низкой и высокой концентрацией уксусной кислоты, существенно отличаются (рис. 4).

100 -I

90 ч

80 J Я

70 ЯШ т

во J ИИ В

so J т ..."

llil

Ch6 Ch2S Ch2LCent Ch2L Те] Рисунок 4. Сравнение показателя частоты встречаемости хромосом с сигналом (ЧВС) после Tyramide-FISH детекции аллиназы корня для хромосомы 2 по 3 локусам (Ch2S, Ch2Cent, Ch2Tel) и для хромосомы 6 по одному локусу (Ch6). Столбцы гистограммы представляют два варианта фиксаторов, используемых для приготовления препаратов: синий столбец - вариант с низкой концентрацией уксусной кислоты (фиксаторы 10:1 (спирт:кислота) - первая капля и 5:1 - вторая капля), красный столбец - вариант с высокой концентрацией уксусной кислоты (фиксаторы 1:1 — первая капля и 100% уксусная кислота - вторая капля).

Достоверные различия ЧВС были выявлены по всем 4 локусам (рис. 4) аллиназы. Во всех случаях показатель ЧВС был существенно выше при использовании низкой концентрации уксусной кислоты. Данные результаты подтвердились и на хромосомах розы.

Поиск цитогенетичеких маркеров

Поиск цитогенетических маркеров для хромосом Allium Поиск ДНК последовательностей-кандидатов в цитогенетические маркеры для хромосом A.fistulosum был проведен с помощью сервера RepeatExplorer (Novak et al. 2013). Для анализа были использованы короткие геномные риды A.fistulosum, доступные в базе данных NCBI (SRX268217). Результаты анализа ридов с помощью RepeatExplorer позволили выявить один кластер ридов, С158, имеющий глобулярную форму, соответствующую тандемным повторам (Novak et al. 2013). Данный повтор был назван НАТ58. BLASTN поиск в базе данных NCBI не выявил каких либо сиквенсов, схожих с НАТ58. Согласно данным RepeatExplorer данный повтор занимает 0,09% генома A.fistulosum, что составляет около 160 000 копий/IC. ПЦР с подобранными праймерами на НАТ58 и геномной ДНК A. fistuloswn подтвердила тандемную организацию НАТ58 в геноме A. fistulosum. ПЦР с подобранными праймерами и геномной ДНК А.сера не дала положительных результатов. FISH с меченым ПЦР продуктом НАТ58 и хромосомами A.fistulosum выявил четкие сигналы в хромосомах 6, 7 и 8 (рис. 5).

Рисунок 5. FISH на хромосомах A.fistulosum: (А) с биотин меченым повтором HLAT58; (Б) с биотин меченым повтором НАТ58 (красный) и дигоксигенини мечеными 5S и 45S (зеленый); (В) с биотин меченым повтором САТ36 (красный) и дигоксигенини меченым НАТ58 (зеленый); (Г) ND-FISH с флуорохром меченым НАТ58 (TAMRA, красный). Линейка - 10 мкм.

На основе данных двуцветной FISH бьша построена идиограмма хромосом A.fistulosum с указанным положением всех цитогенетических маркеров (рис. 6), включая картированные ранее АЙТ32 (Киселева, 2014) и 45, 5S рДНК.

Рисунок 6. Локализация цитогенетических маркеров на хромосомах A.fistulosum. Звездочкой отмечен

полиморфный локус НАТ58.

Для уменьшения времени идентификации хромосом была проведена безденатурационная FISH (ND-FISH, Cuadrado and Jouve (2010)). ND-FISH была успешно проведена с флуорохром-мечеными олигонуклеотидами НАТ58 на хромосомах A.fistulosum (рис. 5Г)-

Поиск цитогенетичесих маркеров для хромосом Rosa wichurana В качестве ДНК проб-кандидатов в цитогенетические маркеры для хромосом R.wichurana были использованы консервативные последовательности геномов растений, а именно 45S, 5S рДНК и теломерный повтор Arabidopsis типа (GGCrATTT)n. Нами была проведена совместная локализация 45 S рДНК и теломерного повтора Arabidopsis типа (GGGATTT)n на хромосомах R.wichurana с помощью FISH. 45S рДНК, как и ожидалось, локализована в спутничной части хромосомы 7 (рис. 1С).

Рисунок 7. FISH на хромосомах Rmchnrana с теломерным повтором Arabidopsis типа (GGGATTT)n и 5S, 45S рДНК. А. FISH с теломерным повтором Arabidopsis типа при мягких условиях гибридизации (25°С). В. Та же метафаза после FISH с 5S рДНК. С. FISH с теломерным повтором Arabidopsis типа (красный) и 45S рДНК (зеленый).

В то же время, теломерный повтор Arabidopsis типа (GGGATTT)n кроме сайтов локализации в теломерных частях хромосомы, локализовался в дополнительных сайтах -интерстициальные теломерные повторы (ИТП) в центромерном регионе одной пары хромосом (рис. 7С). Так как часто. ИТП имеют лишь частичное сходство с теломерным повтором, была проведена FISH с более мягкими условиями гибридизации. Результаты показали, что один локус ИТП и локус 5S рДНК локализованы на одной хромосоме 7. В то же время, второй локус 5S рДНК не ко-локализуется ни с одним из локусов ИТП. Проведение кариотипирования позволили установить принадлежность сайтов ИТП и 5S рДНК к конкретным хромосомам. Так, локусы ИТП локализованы в центромерных

областях хромосом 1, 2, 5 и 7, а 58 рДНК в проксимальных частях длинного плеча хромосом 4 и 7 (рис. 8).

п

LJ

х X

П ñ

я

** 5s

ш 45S

Хитп

Житп'

» » Теломеры

Рисунок 8. Локализация 5S, 45S рДЯК и теломерного повтора Arabidopsis типа на хромосомах Rwichurana '-сайты, которые видимы только при гибридизации при 25°С.

Физическое картирование генов с помощью оптимизированных протоколов и построение интегрированных генетических и физических карт

Allium

На сегодня известно, что весь спектр вкусовых характеристик видов Allium определяется работой двух ферментов, аллиназы (alliin alkyl-sulfonate-lyase, alliin lyase, alkyl Cys sulfoxide lyase, Cys sulfoxide lyase, and C-S lyase) и синтазы фактора слезотечения (LFS) (Lancaster and Boland, 1990; Imai S. et al. 2002). В связи с важностью этих ферментов, их гены (ген аллиназы луковицы, ген аллиназы корня 1 и II, ген LFS) были выбраны для физического картирования с помощью Tvramide-FISH. Tyramide-FISH был проведен на хромосомах A. fistulosum, A.altaicum, A.vavilovii и A.schoenoprasum (рис. 9).

Рисунок 9. Кариотнпы близкородственных видов АШшп после Tyramide-FISH с геном аллиназы луковицы.

Полученные данные не соотносятся с филогенетическими данными на основе полиморфизма хлоропластной ДНК (Friesen et al. 2006). Только A. fistulosum и А. altaicum с очень близким генетическим родством, имеют абсолютно одинаковое положение гена аллиназы луковицы в дистальной части хромосомы 4.

Дтя того чтобы пролить свет на реорганизацию, обусловившую различия в положении генов аллиназ на хромосоме 4 А.сера и A.fistulosum, было проведено картирование гена аллиназы корня II (ALLI, Do et al. 2004) и халкон синтазы (CHS, Masuzaki et al. 2006), которые генетически были картированы на хромосоме 4. Сравнительное Tyramide-FISH картирование ALLI и CHS на хромосомах А.сера и A.fistulosum показало, что локализация данных генов отличается у этих видов (рис. 10).

.-í .¿Ынкнен

Рисунок 10. Tyramide-FISH локализация генов аллиназы луковицы, А111 и CHS A.flstulosum.

на хромосоме 4 А.сера и

На основе локализации четырех генов на хромосоме 4 А.сера и A.fistulosum, можно выдвинуть предположение о перицентрической инверсии, возникшей после расхождения двух видов от общего предка. В результате физического in situ картирования было установлено положение на хромосомах А.сера и A.fistulosum 5 генов, вовлеченных в образование специфических вкуса и запах лука (гены аллиназ и ген LFS), а также окраски луковицы (ген CHS). Гены были картированы в 9 и 5 локусах на хромосомах А сера vl A.fistulosum, соответственно (табл. 3).

Таблица 3. Размер проб и физическое положение генов, использованных в Tyramide-

Название гена Размер пробы, п.а. Хромосомная локализация Физическое положение, %'

А. сера A.fistulosum

Аллиназа корня I (АОВ249) 1100 Хромосома 2: 23 2L 2L 37±1.5 44±1.1 73±1.5 36±1.5 н/д н/д

Хромосома 4: 4Э 28±1.5 н/д

Хромосома 6: 68 30±1.2 н/д

Аллиназа луковицы 1100 Хромосома 4: 48 4L н/д 26±1.12 28±1.5 н/д

Аллиназа корня II (ALLI) 1100 Хромосома 4: 4L 48 33±1 н/д н/д 60±2

LFS 550 Хромосома 5 74±0.7 74±1.2

CHS 1000 Хромосома 4: 4L 4Э 44±1.2 н/д н/д 55±3

- расстояние от теломеры данного плеча до сигнала х 100%/длина плеча 2- данные заимствованы из Романов (2012) н/д — не было детектировано

Интегрирование генетической и физической карт А.сера

Благодаря тому, что из 9 локусов, картированных с помощью Tyramide-FISH на хромосомах А.сера, 4 локуса были до этого картированы генетически (Martin et al. 2005;

King et al. 1998), мы смогли провести интегрирование генетической и физической карт для хромосом 4 и 6 (рис. 11).

Рисунок 11. Интегрирование физической и генетической карт хромосом 4 и 6 А. сера.

Rosa wichurana

Для физического картирования были выбраны гены, ответственные за устойчивость розы к мучнистой росе (гены MLOl, ML02, ML03), формирование запаха розы (ген ООМТ) и устойчивость к абиотическим факторам (PAL, P5CS). С помощью оптимизированной непрямой детекции Tyramide-FISH шесть генов были

-

ЛИ о шШ Ш-02 v: Р #

Рисунок 12. Результаты Tyramide-FISH с фрагментами (от 1100 п.н.) генов MLO1, ML02, ML03, PAL, PSCS и ООМТ. Линейка - 10 мкм

Результаты этого эксперимента показати: 1) короткие фрагменты генов (от 1100 п.н.) могут быть успешно физически картированы на хромосомах к.и>1скигапа с помощью оптимизированной непрямой системы детекции Тугап^е-РВН; 2) препараты, приготовленные с помощью "81еатВгор", обеспечивают достаточное количество метафаз высокого качества для успешного физического картирования коротких ДНК проб на хромосомах Ктскигапа\ 3) разрешающая способность Тугагшёе-РКН (7 млн.п.н.) на мелких митотических хромосомах Липскигапа недостаточна для картирования близко расположенных генов.

г

I j

Высокоразрешающая и многоцветная Tyramide-FISH на пахитенной хромосоме \ R.wichurana

Для увеличения разрешающей способности физического картирования генома R.wichurana, была применена Tyramide-FISH на пахитенной хромосоме (высокоразрешающая Tyramide-FISH). Модифицированный протокол "SteamDrop" позволил приготовить препараты пахитенных хромосом высокого качества. Для двух пахитенных хромосом (4 и 7) были построены карты расположения гетерохроматина и проведены расчеты длины хромосом, ценромного индекса и содержания гетерохроматина (рис. 13). Эти данные послужат в дальнейшем для детального физического картирования генома R.wichurana и более точного расчета частоты рекомбинации вдоль хромосомы.

Щ! a г

W W

Рисунок 13. Инвертированная фотография пахитенных хромосом 4 (А) и 7 (В) R.wichurana после DAPI i окрашивания и идиограмма. Звездочками отмечено положение центромеры.

Общая длина всех пахитенных хромосом R.wichurana варьировала от 235 мкм до 411 мкм, что в 10-20 раз больше длины митотических хромосом (20±1 мкм, Kirov et al. j 2014).

j Приготовленные "SteamDrop" препараты пахитенных хромосом R.wichurana были

использованы для картирования генов (табл. 4), из которых: 6 генов (MLOl, ML02, ML03, ООМТ, PAL, P5CS) были картированные на митотической хромосоме с [ помощью Tyramide-FISH; 5 генов (ААА-2, MDAR, MGM, AD1, Nar) были выбраны на Í основе знаний о локализации этих генов в секвенированном геноме Fragaria vesca } (Shulaev et al. 2011, FraVesHawaii_1.0), как сцепленных с ML02, PAL (MGM, MDAR) i или ML03, P5CS (ААА-2) или ООМТ (ADl, Nar). Размер ДНК фрагментов, j используемых для Tyramide-FISH в качестве пробы, составлял от 1100 до 3500 п.н. > Все 11 генов были успешно картированы по отдельности на пахитенных

I хромосомах R.wichurana (табл. 4) и определено их физическое положение. ЧВС для f генов составила в среднем 70%, что на порядок выше ЧВС, наблюдаемой после ; Tyramide-FISH на митотической хромосоме (Perez et al. 2009; Kirov et al. 2014). Для ; уточнения положения близкорасположенных генов были проведены Tyramide-FISH [ эксперименты с парами генов, для хромосомы 7: MDAR+PAL, PAL+ML02, | ML02+MGM; и для хромосомы 4: P5CS+ML03, ML03+AAA-2; хромосома 1: ADl+Nar, j Nar+OOMT (рис. 14В, G, Н).

1 Картирование генов PAL и ML02, детектированных одним флуорохромом, не

\ позволило установить их локализацию относительно друг друга на хромосоме 7. Для ¡ решения этой проблемы нами впервые был оптимизирован и применен на хромосоме ' растений двухцветный Tyramide-FISH: PAL был локализован более проксимально, чем ! ML02. На основе длины пахитенной хромосомы 7 (41±1.5 мкм), несущей I неперекрывающиеся сигналы, относительной длины хромосомы 7 (10.0 ± 0.1%), размера генома (562МЬ/1С) и разрешающей способности микросокопа (0,25мкм), можно сделать вывод, что физическое расстояние между PAL и ML02 составляет около 340 тыс.п.н.

Таблица 4. Гены розы и их физическое положение на хромосоме, установленное с ' помощью высокоразрешающей Тугагтс1е-Н5Н_;

Название гена Аббревиатура Хромосома Физическое положение, %' Размер пробы

Локус устойчивости к ML032 4L 44.0 ± 1.5 1750

мучнистой росе О

Пирролине-5- P5CS2 4L 30.0 ±2.0 1700

Карбоксилат Синтаза

АТФаза ААА-2 4L 8.0 ± 1.0 3500

Монодегидроаскорбат MDAR 7L 52.0 ± 1.5 3000

редуктаза

Фенилаланин аммония PAL2 7L 46.6 ± 1.0 1700

лиаза

Локус устойчивости к ML022 7L 44.8 ±0.5 1850

мучнистой росе О

Маннозил гликопротеин MGM 7L 18.0 ± 1.5 3000

эндо-бета-маннозидаза

Локус устойчивости к MLOl2 2S 56±2 1750

мучнистой росе О OOMT2

Орцинол-О-метил 1P 94±0.1 1100

трансераза

Аннексии Б1 AD1 lq 72±1.2 3000

Нарингенин Nar lq 41±1.5 1300

'- расстояние от теломеры плеча до сигнала х 100%/длина плеча 2- гены, которые были картировании на митотической хромосоме

» ? в к ш - с ' 1

m in .... Ж VÄ .. '

W Ш... WSn¡gh е- Í

EaTJ

Hl EÜÜ

Рисунок 14. Результат высокоразрешающей Tyramide-FISH с фрагментами целевых генов (1100 -3500 п.н.); А. Пахитена Hwichurana после FISH с 45S рДНК, используемая для последующего Tyramide- ! FISH картирования гена MGM, локализованного на хромосоме 7 (D); F. Двуцветная высокоразрешающая Tyramide-FISH с ML02, MGM и PAL генами, Одноцветная высокоразрешающая \ Tyramide-FISH с одним геном: С - ААА2, Е - MDAR, I - ML01 и двумя генами: В - ML03/P5CS, G - | Nar/ADl, H-Adl/OOMT Стрелки показывают положение центромеры. Линейка - 10 мкм.

В заключение, мы рекомендуем на розе - виде с мелкими хромосомами - для физического картирования генов и последующего интегрирования физических и генетических карт использовать менее конденсированные пахитенные хромосомы.

Генетическое картирование генов. Интегрирование генетической и физической карт

R.wichurana

Ни один из физически картированных нами генов не был ранее картирован генетически. Нами было проведено генетическое картирование 3 генов, а именно ООМТ, P5CS и PAL,, распределенных по 3 хромосомам (1, 4 и 7). Для генетического картирования была использована популяция F1 (90 растений), полученная от скрещивания R.wichurana и R. х "Yesterday". Для детекции SNP были использованы НЕМ (высокоразрешающее плавление) маркеры (Croxford et al. 2008). Данные генетического и физического картирования согласуются, т.к. три гена, картированные в трех хромосомах, локализованы в 3 группах сцепления (Рисунок 15, Kirov et al. 2014).

Шях.

FvChr7 RwLG-BI^

Т^Ш

Ñfgf

If

Рисунок 15. Интегрирование генетической карты (11чу1Хг), полученной с помощью 1оттар 4.0, и физической карты для хромосом 1 (Я\уСЬг1), 4 (1ЫС11г4) и 7 (К\\'СЬг7) Лш'с/шгала и псевдохромосом 6 (Р\тСЬг6) и 7 (1чгСЬг7) .Рл'елга (РгаУезНа\уап_1.0, ЫСВ1). Генетические карты Rлvichurana были сконструированны ранее (Moghaddam й а1. (2012)).

Проведенные исследования позволяют сделать вывод, что группы сцепления Клу],0-В2, Ки'ЬО-В 1 и Кл\1,0-В3 относятся к хромосомам 1, 7 и 4, соответственно. Кроме этого, интегрирование карт позволяет сделать предположение о локализации гена ООМТ в регионе с низкой частотой рекомбинации, о чем говорит его проксимальное физическое положение на хромосоме 1 и более высокая плотность маркеров на генетической карте в районе его локализации.

I I

I' 1

выводы

1. Оптимизированные протоколы "SteamDrop" и Tyramide-FISH позволяют успешно физически картировать короткие фрагменты генов (от 550 п.н.) и ДНК повторов на мелких (R.wichurana) и крупных (виды Allium) хромосомах.

2. Разработанный протокол "SteamDrop" позволил приготовить высококачественные препараты митотических и пахитенных хромосом для видов с мелкими и крупными хромосомами за короткое время и высоким выходом препаратов с одной меристемы.

3. Установлено, что разброс хромосом зависит от влажности (оптимальная 45-55%) и температуры воздуха (оптимальная 23-26°С).

4. Использование препаратов, приготовленных "SteamDrop" с пониженной концентрацией уксусной кислоты (15% для хромосом Allium и 50% для хромосом Rosa vvichurana) существенно (в 2-3 раза) повышает частоту встречаемости хромосом с сигналом после Tyramide-FISH детекции.

5. Оптимизированная непрямая система детекции с использованием повышенной концентрации тирамид-биотин (1:25 вместо 1:50) и антител (1:100 вместо 1:250) позволяет физически картировать фрагменты генов (от 1100 п.н.) на хромосомах R.wichurana с частотой встречаемости хромосом с сигналом до 51%.

6. Выявлен новый цитогенетический маркер - высококопийный (160.000 копий/1С), видоспецифичный, тандемный повтор A.fisulosum НАТ58, для идентификации хромосом 6, 7 и 8.

7. Установлено наличие наряду с ожидаемой теломерной локализацией теломерного повтора Arabidopsis типа (GGGATTT)n дополнительные сайты его гибридизации в центромерном регионе хромосом 1, 2, 5 и 7, что в сочетании с показателями центромерного индекса позволяет идентифицировать все митотические метафазиые хромосомы R.wichurana.

8. Выявлено, что гены аллиназы луковицы, алиназы корня II (ALLI) и халкон синтазы (CHS) локализованы в коротком плече хромосомы 4 у А.сера, а у A.fistulosum в гомеологичной хромосоме 4 эти же гены расположены в длинном плече, что указывает на события инверсии и делеции/транслокации участка хромосомы после дивергенции этих видов от общего предка.

9. Успешно картированы 11 одно-локусных генов на пахитенных хромосомах R.wichurana с помощью оптимизированной высокоразрешающей и многоцветной Tyramide-FISH.

10. С помощью HRM маркирования было проведено генетическое картирование генов P5CS, PAL и ООМТ на популяции F1 от скрещивания R.wichurana и R.x 'Yesterday' , что позволило поместить эти гены в существующую генетическую карту R.wichurana, созданную на той же популяции.

11. Получены интегрированные генетические и физические карты для хромосом 1,4 и 7 Rwichurana и 4, 6 А.сера.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Физическое картирование отдельных генов и их фрагментов на хромосоме растений остается сложной задачей для большинства видов. Это обусловлено рядом причин: плотной компактизацией митотической хромосомы растений, наличием клеточной стенки и сложностью приготовления препаратов хромосом, отсутствием оптимизированных систем детекции и хорошо разработанных систем цитогенетического маркирования. В данной работе мы провели разработку и оптимизацию ключевых этапов физического картирования генов на хромосомах растений. Результаты работы

показывают, что ключевой фактор в картировании коротких фрагментов ДНК на хромосоме является способ приготовления хромосом. Как на митотической, так и на пахитенной хромосоме (для Hwichuraná) изменение условий приготовления препаратов приводило к значительным изменениям в частоте детекции сигнала Tyramide-FISH. Также нами была проведена оптимизация прямого и непрямого методов детекции. Оптимизированные протоколы позволили добиться оптимального соотношения интенсивность фона/сигнала и провести картирование генов.

Использование сравнительного Tyramide-FISH картирования генов семейства аллиназ на разных видах Allium позволило впервые выявить хромосомные различия внутри рода. Нами показана возможная хромосомная перицентрическая инверсия, возникшая после расхождения А.сера и A.fistiilosiim от общего предка. Предположение о наличии такой инверсии были высказаны более 70 лет назад Леваном (1941) на основе анализа мейоза у F1 гибридов между А. сера и A.fistidosum.

Обнаруженный высококопийный повтор HATS 8 - может быть использован для сортинга отдельных хромосом (FISHIS, Giorgi et al. 2013) для последующего секвенирования. Данные результаты свидетельствуют, что Tyramide-FISH - ценный инструмент для сравнительной геномики растений. Так как геномы растений богаты повторяющимися элементами ДНК, то использование отдельных генов для сравнительного картирования позволяет преодолеть целый ряд трудностей, связанных с неспецифической гибридизацией.

Физическое картирование коротких фрагментов на хромосомах R.wichurana с помощью оптимизированной Tyramide-FISH совместно с высокопроизводительным HRM маркированием сделали возможным интегрирование физической и генетической карт R.\vichurana (Kirov et al. 2014, Kirov et al. 2015). Увеличение числа генетически и физически картированных маркеров для R.wichurana позволит в дальнейшем пролить свет на распределение плотности рекомбинации вдоль хромосомы и уровень синтении с другими видами семейства Rosaceae, чьи геномы были секвенированы (Fragaria vesca, Malus х domestica, Prunus pérsica, Pyrus communis).

В связи с продолжающимися проектами по секвенированию геномов А.сера (http://vvww.oniongenome.net/) и Rosa (Foucher et al. 2013) результаты данной работы представляют особую значимость для сборки геномов. Разработанные платформы для физического картирования генов на хромосомах исследуемых видов могут быть использованы на других видах растений.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Хрусталева, Л.И. Молекулярно-цитогенетический анализ естественных и синтетических гибридов Allium fistulosimi* А сера! Л.И. Хрусталева, Л.Ю. Кан, И.В. Киров, A.A. Сальник. // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии.- 2010.- №4,- С. 12-21.

2. Киров, И. В. Клонирование и секвенирование генов, кодирующих аллиназу и синтазу фактора слезотечения / И.В. Киров, Д.В. Романов, И.А. Фесенко, Л.И. Хрусталева // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии.- 2011.- № 3.- С. 58-65.

3. Khnistaleva, L. The chromosome organization of genes and some types of extragenic DNA in Allium. / L. Khrustaleva, I. Kirov, D. Romanov, M. Budylin, I. Lapitskaya, A. Kiseleva, I. Fesenko, G. Karlov // Acta Hort.- 2012,- № 969,- P. 43-51.

4. Киселева, A.B. Сравнительная организация субтеломерного гетерохроматина у Allium fistulosum L., Allium cepa L. и Allium wakegi с использованием BAC-FISH / A.B. Киселева, И.В. Киров, О.С. Павленко, Д.В. Романов, Л.И. Хрусталева // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной акадешш-2013.-№4,- С. 23-31.

5. Divashuk, M.G. Molecular Cytogenetic Characterization of the Dioecious Cannabis sativa with an XY Chromosome Sex Determination System / M.G. Divashuk, O.S. Alexandrov, O.V. Razumova, I.V. Kirov, G.I. Karlov // PLoS ONE.- 2014,- V. 9(1): e85118. doi:10.1371/journal.pone.0085118.

6. Kiseleva, A.V. Chromosomal organization of centromeric Ty3/gypsy retrotransposons in Allium сера L. and Allium fistulosum L." / A. Kiseleva, I.V. Kirov, L.I. Khrustaleva // Russian Journal of Genetics.- 2014,- V. 50.-№6.- P. 586-592.

7. Kirov, I. An easy "SteamDrop" method for high quality plant chromosome preparation /1. Kirov, M. Divashuk, K. Van Laere, A. Soloviev, L. Khrustaleva// Molecular Cytogenetics.- 2014,- V. 7. - №1.

8. Kirov, I. Anchoring linkage groups of the Rosa genetic map to physical chromosomes with Tyramide-FISH and EST-SNP markers. / I. Kirov, K. Van Laere, J. De Riek, E. De Keyser, N. Van Roy, L. Khrustaleva // PLoS ONE.- 2014,- V. 9. - №4.

9. Laskowska D. Cytology and fertility of amphidiploid hybrids between Nicotiana wuttkei Clarkson et Symon and N. tabacum L. / D. Laskowska, A. Berbec, K. Van Laere, I. Kirov, A. Czubacka, A. Trojak-Goluch//Euphytica.-P. 1-12. doi. 10.1007/sl0681-015-1459-3.

10. Kirov, I. Molecular cytogenetics of the genus Rosa: current status and future perspectives / I. Kirov, K. Van Laere, N. Van Rov, L. Khrustaleva // Acta horticulturae.- 2015,- V. 1087. - P. 4148.

11. Kirov, I. (2015) High Resolution Physical Mapping of single gene fragments on pachytene chromosome 4 and 7 of Rosa /1. Kirov, K. Van Laere, L. Khrustaleva // BMC Genetics.-2015.-V.16.-№l.-P. 1-10.

12. Киров, И.В. Физическое картирование генов аллиназы и слезоточения фактора синтазы на хромосомах Allium сера с помощью Tyr-FISH / Киров И.В., Романов Д.В., Фесенко И.А., Хрусталева Л.И.: // XI молодежная научная конференция «биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва,- 2011.- с. 23.

13. Романов, Д.В. Клонирование и сиквенирование генов, кодирующих аллиназу и слезоточения фактор сшггазу / Романов Д.В., Киров И.В., Фесенко И.А., Хрусталева Л.И. // XI молодежная научная конференция «биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва,- 2011.-е. 40-41.

14. Киров, И.В. Цитогенетическое картирование генов аллшшы и слезоточения фактора синтазы с помощью многоцветной tyr-FISH на хромосомах Allium сера L. // Материалы XVIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», Москва -2011.-е. 90-91.

15. Романов, Д.В. Клонирование, секвенирование и физическое картирование генов аллиназы и слезотечения фактора синтазы у луковых / Романов Д.В., Киров И.В., Фесенко И.А., Хрусталева Л.И. // Сборник статей XII международной конференции по высоким технологиям, Спб.-2011.-Том 1,- с. 236.

16. Van Laere, К. Cytogenetic mapping of candidate genes involved in drought resistance in a diploid Rosa wichurana x Rosa 'Yesterday' population using Tyramide-FISH / Van Laere K, Kirov I, De Keyser E, Razavi F, Khrustaleva L, Van Huylenbroeck J. // 18th International Chromosome Conference, UK.-2011 c.63.

17. Kirov, I. Physical mapping of the onion genes using Tyramide-FISH / Kirov I., Romanov D./7 Proceeding of the 35th conference of agricultural students and veterinary medicine with international participation, Serbia.- 2011,- c. 225-230.

18. Киров, И.В. Tyramide-FISH - ценный инструмент для сравнительной геномики растений / Киров И.В., Романов Д.В. // Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях.-2011: 2-я Международная школа-конференция молодых учёных, Звенигород,- 2011.-е. 48.

19. Khrustaleva, L. Single-gene detection using ultra-sensitive Tyramide-FISH for assembling physical and recombination maps in the onion (Allium сера) / Khrustaleva L., Kirov I., Romanov D., Fesenko I. // International conference: Molecular mapping and marker assisted selection, Vienna, Austria.- 2012,- p. 19.

20. Киселева, А.В. Сравнительная молекулярная организация прицентромерной области хромосом Allium сера и A. fistulosum / Киселева А.В., Киров И.В., Будылин М.В., Романов Д.В., Хрусталева Л.И. // ХШ Молодежная парная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва. -2013.-C.26-27.

21. Киселева, А.В. Изучения генома Allium fistulosum L. с использованием ВАС библиотеки. / Киселева А.В., Киров И.В., Романов Д.В., Будылин М.В., Хрусталева Л. И.: // Ломоносов-2013: XX Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых: Секция «Биология», Тезисы докладов, Москва. - 2013 - М.: МАКС Пресс.-с. 83-84.

22. Kirov, I. Integration of genetic and physical maps of Rosa by means of Tyramide-FISH mapping of abiotic stress related genes / Ilya Kirov, Katrijn Van Laere, Ludmila Khrustaleva: // Journées Cytogénétique et Polyploïdie, Lion, France. - 2013.- c. 12.

23. Kirov, I. Tyramide-FISH is a useful tool for cytogenetic mapping of genes in plant species with small and large chromosomes / Kirov I., Van Laere K., Romanov D., De Keyser E., De Riek J., Khrustaleva L. // 19th International Chromosome Conference, Bologna, Italy.-2013.- P. 205-206.

24. Kirov, I. Integration of genetic and physical maps for Rosa wichurana using Tyramide-FISH / Kirov Ilya: Van Laere Katrijn; Khrustaleva Ludmila; De Keyser Ellen; De Riek Jan // Sixth International Symposium on Rose Research and Cultivation, Hannover, Germany: abstracts.-

2013,-p. 19.

25. De Keyser, E. The use of EST-SNP markers to integrate genetic and physical maps for Rosa wichurana / De Keyser, Ellen, Kirov, Ilya; Van Laere, Katrijn; Khrustaleva, Ludmila; De Riek, Jan // Plant Gene Discovery & "Omics" Technologies, Vienna, Austria: Program and Abstracts. -

2014. -P. 30.

26. Киров, И.В. Соотнесение групп сцепления и физических хромосом Rosa wichurana с помощью Tyramide-FISH и HRM маркеров / Киров И.В., Van Laere К., De Riek J., De Keyser E., Хрусталева Л.И. // XTV Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва.- 2014,- с. 39.

27. Kirov, I. An easy "SteamDrop" method for high quality plant chromosome preparation / Ilya Kirov, Mikhail Divashuk, Katrijn Van Laere, Oleg Alexandrov, Alexander Soloviev, Ludmila Khrustaleva // Plant molecular crtogenetics in genomic and postgenomic era, Katowice, Poland.-2014.-P. 61.

28. Van Laere, K. Anchoring linkage groups of the Rosa genetic map tophysical chromosomes with Tyramide-FISH and EST-SNP markers / Katrijn Van Laere, Ilya Kirov, Jan De Riek, Ellen De Keyser, Nadine Van Roy, Ludmila Khrustaleva // Plant molecular cytogenetics in genomic and postgenomic era, Katowice, Poland.-2014.- P. 69.

29. Khrustaleva, L. Integrating the recombination and cytogenetic maps in onion (Allium сера L.) by single gene/marker in situ mapping / Khrustaleva L., Kirov I, Romanov D, von Kohn C., Soloviev A.. Havey M. // Plant molecular cytogenetics in genomic and postgenomic era, Katowice, Poland.-2014.-P. 60.

30. Alexandrov, O. Molecular cytogenetic studying of the novel hemp tandem repeat CS-237 that is linked with IGS 18S-26S rDNA / Oleg Alexandrov, Olga Razumova, Ilya Kirov, Mikhail Divashuk, Gennady Karlov // Plant molecular cytogenetics in genomic and postgenomic era, Katowice, Poland.-2014.-P. 31.

31. Киров, И.В. Применение NGS данных дня разработки молекулярно-цитогенетических маркеров хромосом растений: на примере Allium fistulosum и Cannabis sativa / Киров И.В., Александров О.С., Разумова О.В., Дивашук М.Г., Хрусталева Л.И., Карлов Г.И.: // 3-я Всероссийская научно-практическая конференция по геномному секвенированию (NGS-2015), Москва.-2015.- с. 14.

32. Kirov, I.V. Development of cytogenetic chromosome markers in Rosa by low-depth next generation sequencing/ Ilya V. Kirov, Katrijn Van Laere, Jan De Riek, Ellen De Keyser, Tom Ruttink, Nadine Van Roy, Ludmila I. Khrustaleva // XXVth International Symposium of the EUCARPIA Section Ornamentals "Crossing borders" Melle, Belgium.- 2015.-P.14.

33. Khrustaleva, L. Single-locus visualization using Tyramide-FISH for assembling physical and recombination maps of onion (Allium cepa L.) / L. Khrustaleva, I. Kirov, D. Romanov, A. Soloviev, M. Havey // 7th International Symposium on Edible Alliaceae, Nigde, Turkey.-2015.- P. 63.

34. Kirov, I. Isolation and molecular characterization of new tandem repeats in Allium fislulosum genome and their application for chromosome identification / I.V. Kirov, A.V. Kiseleva, M. Ali Sheikh Beig, K. Van Laere, L.I. Khrustaleva // 7th International Symposium on Edible Alliaceae, Nigde, Turkey.- 2015,- P. 64.

35. Ali Sheikh Beig Goharrizi, M. Construction and characterization of a low coverage bacterial artificial chromosome library of Allium fislulosum / M. Ali Sheikh Beig Goharrizi, A.V. Kiseleva I.V. Kirov, L.I. Khrustaleva: // 7th International Symposium on Edible Alliaceae, Nigde, Turkey. -2015,-p. 113.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю огромную признательность своему научному руководителю -доктору биологических наук, профессору Хрусталевой Людмиле Ивановне за бесценную помощь в написании и проведении этой работы и самоотверженное руководство всей моей научной деятельностью. Выражаю особую благодарность Dr. Katrijn Van Laere (ILVO, Бельгия) за помощь в проведении работ в Бельгии и за прекрасное научное руководство. Особенно я хотел бы поблагодарить доктора биологических наук, профессора Соловьева Александра Александровича, доктора биологических наук, профессора Карлова Геннадия Ильича и кандидата биологических наук Дивашука Михаила Георгиевича за помощь и интересные научные дискуссии. Я благодарю всех сотрудников Центра молекулярной биотехнологии и кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства за теплую и дружественную атмосферу. За оказанную помощь в подготовке и выполнении научной работы я выражаю слова благодарности кандидату биологических наук Киселевой Анне Витальевне, Алёне Сальник и Маргарите Руденок. За огромную помощь в подготовке к защите я благодарю кандидата биологических наук Большакову Людмилу Семеновну.

Я от всего сердца благодарю мою семью, а особенно мою жену и дочь за надёжный тыл, понимание и терпение.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Подписано в печать 28.09.2015 г. Формат 60x84 1/1б. Усл.печ.л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 532.

Издательство РГАУ-МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул., 44 Тел.: (499) 977-00-12, 977-40-64