Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-цитогенетические маркеры хромосом льна посевного (Linum usitatissimum L.)

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-цитогенетические маркеры хромосом льна посевного (Linum usitatissimum L.)"

На правах рукописи

РАЧИНСКАЯ Ольга Анатольевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ХРОМОСОМ ЛЬНА ПОСЕВНОГО (ЫШМ (КГ ТА ТШ1М11М Ь.)

специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2015

005568475

005568475

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной кариологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Научный доктор биологических наук, профессор,

руководитель: Ольга Викторовна Муравенко, зав. Лабораторией

молекулярной кариологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Официальные доктор биологических наук

оппоненты: Юрий Михайлович Борисов, ведущий научный сотрудник

Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институгапроблем экологии.и эволюции им. А. Н. Северцова Российской академии наук;

кандидат биологических наук

Александра Александровна Шишкина, старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова Российской академии наук

Защита состоится «26» мая 2015 г. в 14:00 на заседании диссертационного совета Д002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждении науки Российской академии наук Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Автореферат разослан «-/Д » ®<«р-2М2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

кКрицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования Вид возделываемого льна - Linum usitatissimum L. (лен посевной, культурный, обыкновенный) является полиморфным. Он представлен разнообразными формами, которые подразделяются на несколько разновидностей. Для целей селекции используют обычно лен масличный (кудряш), лен-долгунец (прядильный), а также межеумки, объединяющие льны с различными свойствами. Геном некоторых форм L. usitatissimum, так называемых генотрофов, обладает необычайно высокой пластичностью. В зависимости от условий произрастания у этих форм в процессе онтогенеза могут происходить количественные и качественные изменения геномов, которые передаются по наследству. Вместе с тем, этот вид относится к самоопьиителям, что неизбежно приводит к снижению генетического разнообразия его сортов. Для того чтобы поддерживать достаточное генетическое разнообразие и получать новые высокопродуктивные и устойчивые сорта льна приходится вводить в селекционный процесс использование стародавних местных сортов (ландрас), обладающих высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам среды. С этой же целью, требуется привлечение других разновидностей L. usitatissimum и близкородственных видов для интрогрессивной гибридизации.

Необходимость оценки уровня генетического разнообразия сортов льна, изучения результатов скрещивания, проведения направленного отбора и создания сортов с ценными для селекции генотипами делает актуальным поиск как можно большего числа специфических генетических маркеров. В настоящее время у льна межсортовое разнообразие активно изучается с помощью различных молекулярных маркеров (RAPD, SSR, AFLP, ITS и т.д.). Секвенирование генома льна посевного значительно увеличило число геномных ДНК-маркеров. На основе полученных данных у льна установлено соответствие физической и генетической (группы сцепления) карт, что положило начало к созданию единой интегрированной генетической карты его генома. Вместе с тем, межсортовой хромосомный полиморфизм льна остается практически не изученным вследствие малых размеров хромосом и связанной с этим трудностью сравнительного исследования геномов различных сортов льна. Небольшое количество хромосомных маркеров и хромосомное картирование только рибосомных генов не позволяет достаточно точно определить наличие хромосомных перестроек или сортоспецифических особенностей кариотипа. Поиск новых хромосомных маркеров, особенно ассоциированных с хозяйственно-ценными признаками, и изучение внутри- и межсортовой хромосомной изменчивости у льна посевного станов1гтся особо важной проблемой.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение хромосом льна посевного (Цпит шиайзтит Ь.) с помощью молекулярно-цитогенетических маркеров. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Усовершенствовать методику получения метафазных хромосом необходимой для детального анализа степени деконденсации с помощью новосинтезированных соединений из группы пиридобензимидазолов.

2. Усовершенствовать методику приготовления давленных хромосомных препаратов с целью улучшения их качества для дальнейшего проведения молекулярно-цитогенетических анализов льнов и других мелкохромосомных растений.

4. На основе рисунков распределения на хромосомах молекулярно-цитогенетических маркеров: ОАР1-бэндов и сайтов локализации 265 и 5Э рДНК, изучить внутри- и межсортовой хромосомный полиморфизм 18 сортов и гибрида льна посевного.

5. Уточнить общую хромосомную идиограмму вида и построить для каждого образца сортоспецифическую идиограмму.

6. Оценить возможность и целесообразность использования в качестве молекулярно-цитогенетических маркеров для точной идентификации хромосом и изучения внутривидового полиморфизма льна посевного последовательности теломерного повтора ДНК и консервативного фрагмента генов мультигенного семейства Се$А.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что воздействие любого из новосинтезированных соединений из группы пиридобензимидазолов (7-ЫН2-РВ1, 7-СРЗ-РВ1, 9-ЫН2-7-СРЗ-РВ1) на делящиеся клетки корневой меристемы Ь. %гап<ИАогит приводит к значительному возрастанию средней длины митотических хромосом. Стандартизованы этапы процесса приготовления давленных хромосомных препаратов, что позволило повысить воспроизводимость и разрешение цитогенетических методов.

Впервые у 19 образцов льна посевного разных групп селекции по рисунку ОАР1-бэндинга и локализации 265 и 5Б рДНК идентифицированы хромосомы, составлены индивидуальные идеограммы и изучен внутривидовой хромосомный полиморфизм.

Впервые на хромосомах льна посевного картирован консервативный фрагмент малокопийных генов целлюлозосинтаз (СмЛ) и исследован внутривидовой хромосомный полиморфизм по локализации СезА генов и последовательности теломерного повтора (ТТТАСОО).

Разработанная комбинация молекулярно-цитогенетических маркеров позволила точно идентифицировать шесть хромосом 1, 2, 3, 8, 9, 13 (по цитологической классификации), что повысило надежность кариотипирования сортов льна посевного и изучения межсортового хромосомного полиморфизма. Кроме того, это открывает новые

возможности для объединения генетической, физической и цитологической карт генома льна в единую интегрированную карту.

Практическая значимость. Применение новых соединений из группы пирцдобензимидазолов наряду с усовершенствованной методикой приготовления давленных хромосомных препаратов позволяет существенно повысить уровень разрешающей способности щггогенетических методов исследования. Это особенно актуально для исследования кариотипов мелкохромосомных объектов, к которым относится множество важных сельскохозяйственных культур, в том числе и лен.

Дифференциальное окрашивание хромосом в комплексе с локализацией на них высокоповторяющихся последовательностей и маюкопийных генов дает возможность для достоверной идентификации хромосом и выявления внутривидового полиморфизма, что, в свою очередь, может послужить основой для паспортизации сортов льна посевного.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VIII международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва, Россия, 2009г.), на V съезде ВОГиС «Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 20-летию со дня рождения Чарльза Дарвина» (Москва, Россия, 2009г.), на VI Совещании по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений «Кариология и молекулярная систематика» (Санкт-Петербург, Россия, 2009г.), на международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, Россия, 2009г.), на конференции молодых ученых ИМБ РАН (Москва, 2009г.), на 4-ом международном хромосомном коллоквиуме (The 4th Asian Chromosome Colloquium) (Пекин, Китай, 2010г.), на VII международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, Украина, 2011г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, 1 патент и 11 тезисов устных докладов и иостерных сообщений.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и включает следующие главы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Диссертация содержит 3 таблицы, 17 рисунков и 284 литературные ссылки.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

Усовершенствование методов приготовления препаратов мелких хромосом льна

Для локализации на хромосомах с целью их физического картирования высокоповторяющихся и уникальных последовательностей ДНК широко применяются

методы дифференциального окрашивания хромосом (бэндинг) и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Разрешающая способность этих подходов и их воспроизводимость, а соответственно, информативность и надежность получаемых результатов, в значительной мере зависят от степени конденсации хромосом и качества получаемых из них препаратов. Это особенно актуально для мелкохромосомных видов, в том числе льна.

Повышение разрешающей способности хромосомного анализа с помощью пиридо[1,2-а/бензимидазолов

Для повышения разрешающей способности хромосомного анализа за счет искусственного замедления конденсации метафазных хромосом было предложено использование интеркаляторов ДНК, например, 9-аминоакредина (9-АМА). Плоские молекулы интеркаляторов встраиваются в двойную спираль ДНК между парами азотистых оснований, снижая степень конденсации хроматина (Lerman, 1963). Ранее в ИМБ РАН, в лаборатории молекулярной кариологии, было установлено, что воздействие 9-АМА позволяет получать хромосомные препараты с большим числом метафазных пластинок с недоконденсированными хромосомами (Муравенко, Зеленин, 2009). Была подобрана оптимальная концентрация вещества (5мкМ/л), которая не оказывает сильного митостатического эффекта (Попов и др., 2001).

Однако, в ряде случаев, например при кариотипировании 30-хромосомных видов льна сек. Limim, которые обладают хромосомами размером 1-4 мкм, деконденсирующего действия 9-АМА оказывается недостаточно, поэтому на кафедре биоорганической химии Ярославского Государственного Университета им. П.Г. Демидова были синтезированы конденсированные гетероциклы на базе пиридо[1,2-а]бензимидазолов (PBI): 7-NH2-PBI, 7-CF3-PBI, 9-NH2-7-CF3-PBI, близких по химическому строению к 9-АМА.

Основываясь на сходном строении всех трех РВ1 с 9-АМА, мы обрабатывали корневую меристему растений указанными веществами по методике, разработанной ранее для 9- AMA и в той же концентрации (5мкМ/л). В качестве негативного контроля использовались хромосомные препараты, полученные из необработанных корешков льна, а в качестве позитивного контроля выступали препараты, сделанные из корневых меристем при воздействии 9- AMA.

В качестве объекта для сравнения была выбрана хромосома 3 из кариотипа L. grandiflorum (2п=16) (Рис. 1). Эта хромосома обладает относительно крупными размерами, содержит большие гетерохроматиновые блоки. Идентификацию хромосомы 3 производили по наличию сигнала 5S рДНК в проксимальном районе длинного плеча.

Рис.1. DAPI-

инвертнрованные изображения хромосом L. graniiijlorum и локализация на них 26S (зеленый) и 5S рДНК (красный). Хромосома 3 указана стрелками. Хромосомные пластинки с препаратов, полученных после воздействия: ледяной воды -контроль (А), 9-АМА (Б), 7-CF3-9-NH2-PB! (В), 7-CF3-PBI (Г), 7-NH2-PBI (Д). Ваг=5 мкм.

При воздействии всех исследованных PBI, а также 9-АМА. на корневую меристему льна линейные размеры хромосомы 3 значительно увеличились. Результаты измерений длины хромосомы 3 при действии исследуемых агентов представлены в таблице 1 При этом обработка делящихся клеток любым из PBI приводит к замедлению компактизации хромосом по сравнению с 9-АМА. Средняя длина хромосомы 3 достигает максимального значения на хромосомных препаратах, полученных после обработки 7-NH2-PBI: 224% по сравнению с контролем и 140% по сравнению с 9-АМА (Таблица 1).

Обработка корневой меристемы 7-CF3-PBI меньше двух других PBI влияет на компактизацию прицентромерного гетерохроматического района. После воздействия на делящиеся клетки этим интеркалирующим агентом, также как после воздействия 9-АМА и в контроле, на хромосомных препаратах средние линейные размеры прицентромерного DAPI-бэнда относительно всей длины хромосомы 3 составляют около 10%. Вместе с тем, после обработки меристемы 9-NH2-7-CF3-PBI на препаратах в хромосоме 3 размеры этого бэнда составляют более 14%, а после воздействия 7-NH2-PBI- 13 %, что может косвенно свидетельствовать о большем сродстве данных соединений к AT- богатым районам ДНК. Способность более эффективно тормозить конденсацию гетерохроматических районов хромосом может быть полезной при определении последовательности расположения разных семейств тандемных повторов в гетерохроматических районах. 9-АМА имеет простую химическую структуру, низкую константу связывания с ДНК и отсутствие АТ/ГЦ-специфичности (Lerman, 1963; Sakore et al.. 1977). Видимо, поэтому его действие равномерно тормозит процесс сокращения эу- и гетерохроматических районов хромосом. Сходным образом действует и 7-CF3-PBI. Однако, для прояснения этой ситуации необходимо проведение детального исследования физико-химических свойств

испытанных агентов самих по себе и в комплексе с ДНК различного нуклеотидного состава.

Таблица 1. Действие PBI и 9-АМА на длину хромосомы 3 L. grandißorum.

Исследуем ое вещество Район хромосомы 3 N Wmax MKM MKM X, MKM SD, MKM

Контроль, без интеркалятора W 35 3.33 1.74 2.52 0.33

S 35 1.59 0.54 1.08 0.21

Cht 35 0.38 0.15 0.23 0.04

9-АМА W 32 7.45 2.87 4.03 1.17

S 32 3.35 1.15 1.71 0.53

Cht 32 0.58 0.23 0.38 0.08

7-CF3-PBI W 49 9.14 2.02 4.79 1.78

S 49 3.44 0.51 1.89 0.72

Cht 49 0.96 0.28 0.57 0.17

7-CF3-9-NH2-PBI W 35 11.34 2.09 4.65 2.39

S 35 3.56 0.78 1.77 0.79

Cht 35 1.38 0.32 0.66 0.29

7-NH2-PBI W 40 11.89 2.62 5.62 2.04

s 40 6.84 1.19 2.59 1.04

Cht 40 2.02 0.37 0.73 0.33

Обозначения: W- длина хромосомы, S- длина короткого плеча хромосомы, Cht- длина

прицентромерного гетерохроматинового блока, 14- число хромосом в выборке, \Vmax- максимальная длина, \Vmin- минимальная длина, Х- среднее значение длины, $1)- стандартное отклонение.

Воздействие на клетки корневой меристемы 9-АМА и всех изученных РВ1 в целом не нарушает основного рисунка ОАРЬбэндинга хромосом Ь. цгапсИ^огит. Однако после обработки меристемы 7-МН;>-РВ1 число проксимальных интеркалярных бэндов на плечах хромосомы 3 в хромосомных пластинках увеличивается с одного в контроле до шести блоков в коротком плече, а после обработки 9-ЫН2-7-СРз-РВ1 - с двух в контроле до семи в длинном плече. После воздействия на делящиеся клетки 9-АМА выявляются два ОАР1-бэнда в коротком плече и три — в длинном плече хромосомы. На хромосомных препаратах, полученных после обработки меристемы 7-СРз-РВ1, максимально пропорционально сохраняется рисунок ОАРГ-бэндинга хромосомы 3, при этом в коротком плече выявляется три бэнда, а в длинном — четыре.

Усовершенствование и стандартизация метода приготовления давленных хромосомных препаратов льна

Для исследования структурно-морфологических особенностей хромосом растений малых размеров особую актуальность приобретает процесс приготовления препаратов. Требуется получить на препаратах хромосомные пластинки без остатков цитоплазмы, без

наложений и с небольшим разбросом хромосом нужной длины. Желаемая длина хромосом на препарате может быть достигнута использованием обработки интеркалятором ДНК, а для того, чтобы воспроизводимо делать чистые препараты нужно максимально точно определить все параметры этого процесса.

В настоящей работе методика приготовления давленных хромосомных препаратов была отработана на хромосомах двух видов (L. alpinum и L. amurense) секции Adenolinum. Хромосомы этих видов мельче, чем у L. grandiflorum, но, тем ни менее, немного больше чем у льна посевного, при этом число хромосом всего 2п=18, что делает эти виды хорошим объектом для доработки методики. Усовершенствование и стандартизация методики были проведены на всех основных этапах приготовления препаратов.

1. Фиксация материала. Фиксация корневой меристемы осуществлялась в смеси ледяной уксусной кислоты и 96% этанола (1:3). Добавление этанола в данном случае предотвращает набухание цитоплазмы, вызываемое чистой уксусной кислотой (Дарлингтон, Ла Кур, 1980). Такой способ фиксации снижает степень последующего окрашивания цитоплазмы ацетокармином (McClintock, 1929). Для достижения лучшего

эффекта фиксации необходимо осуществлять смену фиксатора два раза и хранить

о

материал в морозильной камере при температуре -18 С.

2. Окрашивание. Корешки проростков окрашивали 1%-ным раствором ацетокармина в 45% уксусной кислоте в течение 40 минут при комнатной температуре в соответствии с ранее разработанными стандартами (Семенова и др., 2006).

3. Мацерация корневой меристемы и приготовление препаратов. Приготовление хромосомных препаратов осуществляли по ранее разработанной методике (Семенова и др., 2006) Однако ранее было распространено прогревание препаратов над пламенем спиртовки для уплощения клеток и надежного их прикрепления к предметному стеклу (McClintock, 1929). Для стандартизации этого этапа приготовления препаратов в нашей работе был использован термостат. С помощью подбора было установлено, что для оптимальной мацерации клеток корневой меристемы льна препараты необходимо выдерживать 30 секунд при 80°С. После раздавливания клеток меристемы до нужной степени распластывания хромосом в метафазных пластинках препарат замораживали в жидком азоте. Для очищения хромосомных пластинок от остатков клеточных стенок и элементов цитоплазмы на препарат трижды капали фиксатор и высушивали.

4. Дофиксация хромосомных препаратов. После высыхания препараты помещали

о

на 5 мин. в метанол или 96 этанол, чтобы убрать остатки кислоты и воды.

2 3 4 5 6 7

8

9

Рис. 2. Хромосомные пластинки L. alpinum (А) и L. amurense (Б). Сигналы FISH с

последовательностями 26S

ВЫ II ük П!М«Мд« РД"К - ss рд™

|й4 « f>o ük лщ

хромосомы. Окраска DAPI. Справа представлены их кариотипы. Ваг=5 мкм.

(красный). Стрелками

обозначены

спутннчные

Применение разработанного метода для исследования хромосом видов секции AdenoHnum, показало, что при этом на хромосомах выявляется более четкий рисунок DAPI-бэндинга и более точная локализация рДНК-зондов при FISH (Рис. 2).

Тестирование воспроизводимости результатов маркирования хромосом льна с помощью метода DAPI-бэндинга и FISH с зондами SS и 26SрДНК

В результате применения усовершенствованных методов приготовления давленных хромосомных препаратов с использованием интеркалирующего агента (9-АМА или 7-CF3-PBI) было получено более 30 хромосомных пластинок долгунцового сорта льна Beiita, которые были проанализированы и кариотипированы с целью выяснения воспроизводимости рисунка DAPI-бэндинга и локализации сигналов FISH с рибосомными генами (Рис. 3).

Для упрощения идентификации хромосомы одного кариотипа разделяли на группы по следующим признакам:

1. По размеру прицентромерного бэнда и локализации интеркалярных бэндов.

Хромосомы 2, 3, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15 пар обладают крупным прицентромерным гетерохроматиновым DAPI-позитивным блоком и слабовыраженными интеркалярными бэндами. Прицентромерный блок может выглядеть одним бэндом или разделятся на несколько близко расположенных бэндов в зависимости от степени конденсации хромосом. Хромосомы 4, 5, 7, 9, 11 пар обладают наряду с прицентромерным гетерохроматиновым блоком еще крупным бэндом в медианном или дистальном районах длинного плеча. Разделение интеркалярного бэнда на длинном плече таких хромосом наблюдалось крайне редко.

2. По центромерному индексу Так у хромосом второго типа по размеру прицентромерного бэнда центромерный индекс, как правило, сдвинут в сторону

субметацентриков. Внутри каждой группы также возможно отличить более и менее выраженные метацентрики.

3. По размеру хромосом. Следует заметить, что при составлении данной классификации хромосом льна посевного и установления номера каждой пары гомологичных хромосом в кариограмме использовались пластинки, хромосомы которых не превышали трех размеров хромосом, полученных без использования интеркалирующих агентов

4. По наличию сигнала FISH с фрагментами последовательностей рибосомных генов (5S и/или 26S рДНК), которые локализуются на хромосомах 3, 8, 13, обладающих сходным рисунком DAPl-окрашивания и центромерным индексом, но различающихся размерами, а также на спутничной хромосоме 1 Как видно из рисунка 3 интенсивность FISH сигналов может варьировать от пластинки к пластинке, но место локализации остается неизменным.

3 4 5 6 7 X 9 10 II 12 13 14 15

• Щ и «• ,rffl *s «• •« "

•• и »• I« в л* •• >»«• »«щя •• ••

1 2

В «»

Ф • 9 t • 1

i к

»• Ш • •

• » щ

• é в н

• • • 9 ••

Рис. 3. Пять кариотипов сорта Beiita. Гомологичные пары хромосом (инвертированное изображение DAPI-окрашивания) с разных пластннок выстроены в вертикальные ряды. Рядом представлены трехслойные изображения DAPI-окрашенных хромосом с локализацией сигналов FISH: 26S рДНК (зеленый), 5S рДНК (красный).

Полиморфизм генома льна посевного Идентификация хромосом льна посевного по рисункам DAPI-бэндинга и локализации сайтов рибосомных генов

Материалом для исследования полиморфизма генома льна посевного послужили 19 образцов льна посевного отечественной и зарубежной селекции. Из них: девять сортов долгунцового типа СLiman usitatissimum L. f. elongata )— Славный 82, Прамень, Алексии, Антей. АР-7 (к5326х). Тверской. Новоторжский, Luna, Beiita. Г-1071/4, Старт: пять сортов масличного типа (Lirmm usitatissimum L. vor. intermedia Vav et Ell.) - Alaska (INF-881),

Воронежский, ЛМ-98, Bison, Вита, один межеумок Lipinska XIII (INF-404); три сорта стародавней селекции (кряжи) - Брагинский, Велижский, Новоторжевский и гибрид от скрещивания ландрасы долгунцового типа к-37 с сортом льна-долгунца Viking (к-37xViking). Материал для исследования был предоставлен научно-исследовательским институтом льна РАСН, г. Торжок, Россия (ВНИИЛ); Институтом натуральных волокон и лечебных растений, г. Познань, Польша (IWNiRZ); Институтом генетики и цитологии НАНБ, г. Минск, Белоруссия (ИГиЦ НАНБ) и Могилевской областной сельскохозяйственной опытной станцией РУП НАНБ, Могилевская обл., Белоруссия.

Все сорта льна содержат 30 хромосом, в основном метацентрических, размером 1-3,5 мкм. Все хромосомы кариотипов были идентифицированы по морфологии, рисункам C/DAPI-бэндинга и распределению сайтов локализации рибосомных генов в соответствии с цитологической классификацией, разработанной ранее (Муравенко и др., 2003; Muravenko et al., 2009). На основе полученных результатов по всем изученным образцам была составлена суммарная идиограмма (Рис. 4). DAPI-бэнды, выявленные на хромосомах у всех изученных образцов, можно отнести к типу константных цитогенетических маркеров, характерных для вида L. usitatissimum. DAPI-бэнды, выявленные в хромосомах только у одного или части изученных сортов льна, можно отнести к типу вариабельных цитогенетических маркеров. Эти маркеры мы использовали для выделения отдельных групп сортов.

Рис. 4. Идиограмма распределения константных (черные) и вариабельных (красные) 1)Л 1'1-бэмдов и сайтов локализации 268 (зеленые точки) и 58 (красные точки) рДНК на хромосомах /..

Хромосома 1- спутничная, самая большая хромосома в кариотипе с крупным прицентромерным блоком. Вторичная перетяжка расположена вблизи центромеры на коротком плече, спутник занимает большую часть короткого плеча. В длинном плече в районе 11Л.З локализован ОАР1-блок среднего размера. Крупные сайты 26в и 58 рДНК ко-локализованы в области вторичной перетяжки.

Хромосома 2- крупная субметацентричная хромосома с большим прицентромерным блоком. Два интеркалярных бэнда в коротком плече локализованы медианно (281.3) и

дистально (281.5). На длинном плече медианно локализованы крупный ОАР1-блок (2Ы.З) и небольшой дисталышй бэнд (2Ы.5).

Хромосома 3- крупная метацентричная хромосома с большим прицентромерным блоком. На обоих плечах хромосомы 3 медианно расположены интеркалярные гетерохроматиновые блоки: 381.3 в коротком плече, ЗЫ.З и дисгальный небольшой бэнд ЗЫ.5 в длинном плече. Локус 58 рДНК с сигналом высокой интенсивности локализован на длинном плече хромосомы 3 под центромерой на бэнде 2Ы.З.

Хромосома 4- крупная субметацентрическая хромосома с крупным прицентромерным блоком. Проксимальный бэнд среднего размера расположен в коротком плече (481.3) и два медианных блока - в длинном плече (4Ы.З и 4Ы.5).

Хромосома 5- субметацентричная хромосома среднего размера с крупным прицентромерным бэндом. Короткое плечо имеет прицентромерный крупный ОАР1-блок 581.3, на длинном плече расположен крупный медианный ОАР1-бэнд (5Ы.З).

Хромосома 6- метацентричная хромосома среднего размера с крупным прицентромерным бэндом. Интеркалярный крупный ЭАР1 -блок находятся проксимально в коротком плече в позиции 681.3, а в длинном плече отмечен полиморфный медианный блок в положении 6Ы.З.

Хромосома 7- метацентричная хромосома среднего размера с крупным прицентромерным бэндом. Интеркалярный блок среднего размера находиться медианно в коротком плече в позиции 781.3. В медианном районе в позиции 7Ы.З длинного плеча локализован крупный ОАР1-бэнд.

Хромосома 8- среднего размера метацентричная хромосома с крупным прицентромерным блоком. В коротком плече проксимально локализован небольшой бэнд 881.3. В длинном плече ОАР1 -бэнд расположен медианно, на нем расположен сайт 58 рДНК (8Ы.З).

Хромосома 9- маленькая субметацентричная хромосома с крупным прицентромерным блоком. В медианной части длинного плеча локализован крупный гетерохроматиновый бэнд в районе 981.3.

Хромосома 10- маленькая хромосома с очень крупным прицентромерным ОАР1 -блоком. В прицентромерных областях короткого и длинного плечей находятся небольшие гетерохроматиновые блоки (1081.3 и ЮЫ.З, соответственно).

Хромосома 11- маленькая субметацентричная хромосома, с крупным прицентромерным СЛ5АР1 -бэндом. На коротком плече в прицентромерном районе локализован небольшой гетерохроматиновый блок, а на длинном плече медианно находится крупный полиморфный бэнд 11Ы.З.

Хромосома 12- маленькая метацентричная хромосома с очень крупным прнцентромерным DAPI- блоком. На длинном плече дистально находится полиморфный бэнд 11L1.3 среднего размера.

Хромосома 13- маленькая метацентричная хромосома с крупным прнцентромерным DAPI- блоком. В коротком плече медианно расположен интеркалярный бэнд среднего размера (13S1.3) с сайтом 5S рДНК. На длинном плече проксимально локализован небольшой гетерохроматиноый блок 13L1.3.

Хромосома 14- маленькая субметацентричная хромосома с крупным прнцентромерным блоком и медианным бэндом среднего размера на длинном плече (14L1.3).

Хромосома 15- маленькая субметацентричная хромосома, в области центромеры содержит достаточно крупный DAPI-бэнд. В коротком плече DAPI- блок среднего размера локализован проксимально. Теломерный блок в коротком плече выражен слабо.

Внутривидовой хромосомный полиморфизм льна посевного

На основании обобщенной идиограммы и с учетом полиморфизма рисунков DAPI-бэндинга хромосом каждого конкретного образца, были представлены кариограммы и идиограммы изученных сортов, которые были разделены на группы.

К первой группе относятся сорта, на хромосомах которых выявляются все константные и вариабельные DAPI-бэнды. Описание хромосом полностью соответствует приведенному выше. В эту группу входит большинство изученных сортов и гибридная форма (Рис. 5).

Ко второй группе относятся два сорта льна посевного, на хромосомах которых наблюдаются все константные бэнды, а также вариабельные DAPI-бэнды на шестой и одиннадцатой хромосомах (Рис. 6).

К третьей группе был отнесен один масличный сорт Alaska, в кариотипе которого наблюдаются вариабельные сайты 6L1.3 и 12L1.3 (Рис. 6).

К четвертой группе отнесен один долгунцовый сорт Новоторжский, в кариотипе которого присутствует вариабельный гетерохроматиновый блок 11L1.3 (Рис. 6).

Внутрисортовой полиморфизм льна посевного Известно, что геном льна проявляет высокую степень мобильности, и около 15% изменчивости приходится на рибосомные гены (Evans et al., 1966; Schneeberger, Cullis, 1991). Возможно, это является основной причиной наличия у льна посевного довольно

значительного внутрисортового полиморфизма, который у изученных образцов проявился по трем основным типам:

1. По морфологии спутничной хромосомы. У долпниовьгх сортов АР-7, Г-1071/4, Новоторжского, масличного сорта JIM-98, а также стародавних кряжевых сортов Велижского и Брагинского у 7% растений выявлен гетероморфизм гомологов спутничной хромосомы 1, который проявляется в неравных размерах гомологов и различном рисунке дифференциального окрашивания длинного плеча. Наиболее вероятная причина такого изменения морфологии хромосомы - внутри или межхромосомная перестройка, точно установить которую затруднительно.

2. По локализации генов рРНКна спутничной хромосоме. У разных сортов льна посевного от пластинки к пластинке могут наблюдаться разные варианты ко-локализации рибосомных генов на спутничной хромосоме. Сигналы могут бьггь выявлены в области вторичной перетяжки:

- только на спутничной нити,

- на спутничной нити и спутнике,

- на спутничной нити, спутничке и в прицентромерной области короткого плеча,

- на спутничной нити, спутничке, в прицентромерной области короткого и длинного плечей хромосомы.

3.По локализации рибосомных генов на хромосомах 3, 8, 13. Чаще всего на хромосомах 3, 8 и 13 наблюдаются сигналы генов 5S рРНК разного уровня интенсивности. В ряде случаев может встречаться ко-локализация сигналов 5S рДНК с минорными сайтами 26S рДНК:

- чаще всего ко-локализация 26S и 5S рДНК обнаруживается на третьей паре хромосом,

- реже ко-локализация 26S и 5S рДНК наблюдается на др>тих хромосомах или на 3. 8 и 13 парах вместе.

Таким образом, у изученных образцов льна выявлен внутрисортовой и межсортовой полиморфизм по рисункам DAPI- бэндинга хромосом и локализации последовательностей 26S и 5S рДНК, а также по морфологии спутничной хромосомы. Показано, что исследованные сорта льна различаются по присутствию вариабельных DAPI-бэндов на: хромосоме 11 у долгунца "Новоторжский", - хромосомах 6 и 12 у масличного сорта "Alaska", хромосомах 6 и 11 у масличного "J1M-98" и долгунцового сорта "Антей". Кроме того, обнаружены различия по размерам гетерохроматических участков хромосом, локализации 26S и 5S рДНК. У ряда сортов впервые выявлен

Рис. 5 Кариотипы «братов льна посевного (Группа Г), с локализацией на хромосомах сигналов FISH: 26S рДНК (зеленые) и 5S рДНК (красные). Рядом с хромосомами представлены их идиограммы.

Долгунцовые сорта: Beiita

Luna АР-7

Г-1071/4

| 2 3 4 5 6 7 К 9 10 II 12 13 14 15

* • fjr М f ■•»!*« =Г |] i;*« fflt üB»s i»» *:: •• Ш Sí*« г^м

2 3 1 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15

6 7« 9 10 II 12 13

iDD i * К i Hf ti»! Hí JElliJliJ! • ё»9

1 ^^^ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15

flMtM ÜH&' SSX'-s^s^l'SiiSH^B^ti^s'vgtiisHiie-eee*«-»

Hi».f 2 3 4 5 6 7 « 9 II) II 12 13 14 15

Славный I 4 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 82 ■■

lU^i-fr*» ¡ВД»« §«»• «"»s^a»«" s|tt «♦•■«»«

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Тверской Старт

5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15

A* Ü0X Ц»4 S3* Kit=¡IIel;«*Sie»

Межеумок:

Lipinska I р^В 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13

1« 2 3 4 5 6 7 8

resf |Mf$! s forif

Продолжение Рис. 5. Масличные сорта:

Bison I ^21 4 5 6 7 8 9 № II |2 |Э 14 IS

а» 2 3 4 S 6 7 8 9 |0 II 12 13 14 15

9 _

«•'ffufiHtViMt !И§И| r! s::4*

I _ 2 3 4 5 6 7 8 9 1(1 II 12 13 14 15

воронежскийiHH^iji^' -fig»^ »»¿ИмШШ** ir ««e^s^a^se^ «*•»«»•

Ландрасы:

Брагинский 1 ш ^ 1 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15

l^f frfffitB'^Si?' iH ШШИ^-е*»«-««!»

кряж

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15

вслижский fig^; штпшпт*

„ „ I HB 2 з 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15

Новоржевскии VQ

кряж 1Ш»> I и i»« sflt* iitg §§■%%«••«•»

Гибрид: k-

37хВикинг

9 10 II 12 13

¡18^ fit f|M f мШ'-i мш^Н^'^'^мэи^И«»-§*'•»«»»

Рис. 6. Кариотипы образцов льна посевного, имеющие полиморфизм по наличию вариабельных DAPI-бэндов, с локализацией на хромосомах сигналов FISH: 26S рДНК (зеленые) и 5S рДНК (красные). Рядом с хромосомами представлены их идиограммы.

Группа II

Долгунцовый сорт Антей.

I 2 3

I -

5 6 7 *

•> 10 II I? 1.1

X!

> n li^lfl^ * iJtftÜH Я! Tf Si 5.-

Масличные сорт JIM-98.

■ I 2 ' 4 5 6 7« 4 II) II 12 IJ M 15

* . - ** ~ Д -1- »■» i if" ««¡? B"" =

Группа III

Масличный сорта Alaska

I 2 !

ilö

4 5 6 7 X

t 10

12 13 14 15

iЗв-S1 f tS Я"" ЛSt/OfcJflg-i^^*.^^.

Группа IV

Долгунцовый сорт Новоторжский

4 5 6 7 8

11» iiii * • ni III n.-. § »» §

" in II 12 I? 14 15

t* s >. a .»5

гетероморфизм гомологов пары спупшчных хромосом. При этом, сходные типы полиморфных хромосом можно найти как у разных сортов льна, так и в пределах одного сорта.

Ранее для нескольких других сортов и форм Л. щиаиатит были описаны рисунки распределения на хромосомах сайтов рибосомных генов и ОАР1-бэндов и отмечено наличие полиморфизма по этим хромосомным маркерам (Муравенко и др., 2003, Мигауепко « а1., 2009), но сравнительного изучения внутри- и межсортового хромосомного полиморфизма проведено не было. Усовершенствование методических подходов по приготовлению хромосомных препаратов мелких хромосом льна посевного позволило нам провести такое уникальное исследование. В результате изучения кариотипов 18 сортов и одной гибридной формы выявлен невысокий уровень внутривидового хромосомного полиморфизма по молекулярно-цитогенетическим маркерам. Вместе с тем, обнаружено наличие у этого вида относительно высокого внутрисортового полиморфизма по молекулярно-цитогенетическим маркерам хромосом по сравнению с межсортовым.

Невысокий уровень внутривидового геномного полиморфизма льна посевного выявлен и с помощью других генетических маркеров (Ри е1 а1., 2003, 01еёепсЬ5еп, Ри, 2005, 2006, Гузенко и др., 2008). По С-гетерохроматическим районам хромосом ранее были обнаружены некоторые различия между масличными и долгунцовыми сортами (Муравенко и др., 2000, 2007). Микросателлитный анализ также позволил идентифицировать индивидуальные сорта долгунцовой и масличной селекционной направленности (Коо5е-Аш5а1е§ е1 а!., 2006). Позднее ЯАРО-анализ обнаружил, что у сортов льна-долгунца доля закрепленных рецессивных локусов в среднем была в два раза выше (40,9%), чем у сортов льна масличного типа (21,1%) (Лемеш, 2007; Гузенко и др.,

2008). Показано, что сорта льна-долгунца весьма сходны по генетическим маркерам и составляют гомогенную группу, в то время как масличный лен образует несколько групп и отличается более выраженным генетическим разнообразием (Уготапя, 2006; Ьеп^И,

2009). Кластерный анализ, проведенный на основании анализа геномов АРЬР-методом показал, что льны-долгунцы более ранней селекции по дендрограмме ближе к масличным, чем сорта более поздней селекции, и это позволило предположить, что долгунцовые сорта произошли от масличных (УготаПБ, 2006). В данной работе сравнительное исследование рисунков ОАР1-дифференциального окрашивания хромосом и локализации рибосомных генов не выявило значительных отличий между группами сортов различной селекционной направленности.

Разработка дополнительных молекулярно-цнтогенетических маркеров хромосом L. usitatissimum

Локализация последовательности теломерного повтора (TTTAGGG) на хромосомах льна посевного

С целью выявления дополнительных полиморфных молекулярных маркеров, специфичных для индивидуальных хромосом льна, проведено исследование распределения теломерной последовательности в кариотипах L. usitatissimum с использованием метода FISH. Гибридизацию проводили на препаратах, приготовленных из сортов льна различной селекционной направленности по ранее разработанной методике (Болыпева и др., 2005), для чего был синтезирован теломерный повтор с помощью ПЦР с праймерами (TTTAGGG)5 и (СССТААА)5 (Сох et al., 1993).

У всех изученных образцов льна отмечалось наличие небольших сайтов гибридизации с теломерным повтором на концах всех хромосом разной интенсивности, а также очень крупный интеркалярный сайт в прицентромерном районе короткого плеча хромосомы 2 (Рис. 8). Изучение локализации теломерного повтора на хромосомах сортов разных селекционных групп не выявило полиморфизма по числу и местоположению сайтов гибридизации.

10 11 12 13 14 15

Б

Рис. 8. Хромосомная пластинка (А) и кариотип сорта Брагинский кряж (Б) с локализацией теломерной последовательности на хромосомах (зеленый) и рДНК (красный); хромосомы окрашены ПА 1*1 (синий). Стрелками обозначена 2 пара хромосом с иптеркалярным сайтом локализации теломерных последовательностей. Ваг=5 мкм.

Считается, что интеркалярная локализация теломерных повторов, в большинстве случаев, является результатом теломерных слияний, произошедших в процессе эволюции кариотипов (Richards, Ausubel, 1988: Schwarzacher, Heslop-Harrison, 1991; Biessman et al., 1994). Принято считать, что L. usitatissimum представляет собой древний тетраплоид, который получился в результате удвоения хромосом у исходной формы с 2n=16 (Dubey,

Kumar, 1973) с последующей хромосомной реорганизацией в процессе видообразования, которая привела к уменьшению числа хромосом с 16 до 15 (Muravenko et al., 2009; Муравенко и др., 2010). Такое уменьшение числа хромосом может происходить, в том числе, за счет хромосомных слияний, в результате которых появляются интерстициальные сайты теломерного повтора (Riha К., et al., 2006; Capper et al., 2007).

Возможен и альтернативный способ образования интерстициального сайта теломерного повтора: de-novo благодаря ферментативной активности теломеразы при репарации разорванных хромосом (Friebe et al., 2001).

Независимо от причин появления крупного сайга теломерного повтора на хромосоме 2 у L. usitatissimum, изучение его хромосомной локализации позволило установить, что этот молекулярный маркер льна можно отнести к хромосомным маркерам константного типа.

Локализация консервативного фрагмента генов целлюлозосинтаз CesA на хромосомах льна

Гены «домашнего хозяйства» клетки, к которым относится мультигенное семейство генов целлюлозосинтаз (CesA), кодирующее фермент гликозилтрансферазу, необходимый для синтеза целлюлозы, достаточно консервативны у разных видов растений, в том числе льна (Brownetal., 1997; Kawagoe, Delmer, 1997; Delmer, 1999; Ranik, Myburg 2006; Грушецкая и др., 2010; Галиновский и др., 2014; Mokshinaet al., 2014).

Для льна-долгунца эти гены имеют особо важное хозяйственное значение, и в течение нескольких лет проводится изучение структуры и экспрессии CesA генов. Совсем недавно были выявлены 16 предсказанных CesA генов, и их классификация приведена в соответствие с хорошо охарактеризованными CesA генами арабидопсиса и тополя (Грушецкая и др., 2010: Галиновский и др., 2014; Mokshina et al., 2014).

С целью локализации на хромосомах льна CesA генов использована последовательность KF011584.1 (GenBank) в качестве зонда для FISH. Этот фрагмент кДНК субъединицы CesA-б размером 301 п.н. был получен в результате амплификации с праймерами, сконструированными на основании сравнения шести нуклеотидных последовательностей EST субъединиц различных CesA генов льна (GenBank: EF409998 -EF410000, EF214742 - EF214744) и депонирован в GeneBank (Grushetskaya, Lemesh, 2013). Сравнение нуклеотидной последовательности KF011584.1 с известными последовательностями CesA генов арабидопсиса, тополя и эвкалипта (Richmond, 2000; Liang, Joshi, 2004; Ranik, Myburg, 2006) показало, что она расположена в области консервативного домена В.

Локализацию последовательности В домена СезА-б гена на хромосомах сортов льна разного направления селекции проводили с использованием П^Н-метода вместе с молекулярно-цитогенетическим маркером известной хромосомной локализации - 5Э рДНК. В результате на двух парах хромосом было выявлено 4 четких сигнала гибридизации. На хромосоме 3 гибридизационные сигналы располагались на длинном плече в районе 31Л.2, между центромерой и сайтом генов 5Э рРНК. На хромосоме 9 гибридизационный сигнал наблюдали в проксимальном районе 91Л.2 длинного плеча (Рис. 9). Сравнительное исследование локализации сигналов гибридизации нуклеотидной последовательности КЮ11584.1 в кариотипах долгунцовых и масличных сортов, а также у межеумка и кряжей различий не обнаружило.

-fri-«ff

Рис. 9. Хромосомная пластинка (А) и кариотип сорта Брагинский кряж (Б) с локализацией на хромосомах генов Се.чА (зеленый) и рДНК (красный); хромосомы окрашены 1)АР1 (синий). Стрелками обозначены хромосомы 9 пары, головками стрелок — хромосомы 3 пары, Ваг=5 мкм.

С помощью генетического картирования выявлено наличие генов CesA на пяти парах хромосом у ячменя, на трех парах хромосом у арабидопсиса и на пяти парах хромосом у кукурузы (Burtonetal., 2004; Holland et al., 2000). При этом, CesA гены могут располагаться в одном (кукуруза, Holland et al., 2000) или обоих плечах хромосом (ячмень, Burton 2004). Ранее установлено, что близкородственные CesA гены часто расположены на разных хромосомах, а гены семейства целлюлозосинтаз с различной нуклеотидной последовательностью, например в 3-UTRs, могут быть локализованы совместно (Holland et al., 2000).

Учитывая разрешающую способность FISH, размер зонда, а также высокую степень гомологии этого района в разных CesA генах, можно предположить, что каждый гибридизационный сигнал выявляет расположение как минимум около десяти одинаковых или различных CesA генов. Обнаруженная нами локализация генов целлюлосинтаз в виде двух основных кластеров на хромосомах у L. usitatissimum может быть особенностью, характерной для этой лубяной культуры. При этом, оба кластера генов могут включать

гены, ответственные за синтез как первичной, так и вторичной клеточной стенки. Возможно, что подобное расположение является проявлением исходной полиплоидной природы генома льна посевного (Wangetal., 2012).

Не исключено, что имеются минорные сайты или одиночные локусы CesA генов, которые не выявляются использованным методом. Так, по одной копии нуклеотидной последовательности KF011584.1 обнаружено в двух достаточно протяженных (16-23 т.п.н.) контигах ДНК, полученных в ходе выполнения проекта полногеномного секвенирования сорта льна CDS Betune TUFGEN (Total Utilization Flax GENomics) и депонированных в базе данных NCBI под номерами AFSQ01001622 .1, AFSQ01024179.1. Тем не менее, наличие основных сайтов локализации нуклеотидной последовательности KF011584.1 на двух парах хромосом у всех исследованных сортов льна демонстрирует возможность их использования в качестве дополнительных константных молекулярных маркеров хромосом 3 и 9 льна посевного.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлено, что воздействие каждого из трех новосинтезированных интеркалирующих агентов из группы пиридобензимидазолов (7-NH2-PBI, 7-CF3-PBI, 9-NH2-7-CF3-PBI) на делящиеся клетки корневой меристемы тормозит процесс конденсации митотических хромосом. Это приводит к достоверному возрастанию средних значений длин хромосом и увеличению числа выявляемых DAPI-бэндов на полученных хромосомных препаратах, как по сравнению с контролем, так и по сравнению с интеркалятором 9-АМА.

2. Усовершенствована и стандартизована методика приготовления давленных хромосомных препаратов льна, что позволяет значительно улучшить их качество и повысить разрешающую способность щгтогенетического анализа такого мелкохромосомного объекта как лен.

3. Подтверждена воспроизводимость результатов маркирования хромосом льна посевного с помощью метода DAPI-бэндинга и FISH с зондами 5S и 26S рДНК на препаратах, полученных в результате применения усовершенствованных методов приготовления давленных хромосомных препаратов с использованием интеркалирующих агентов.

4. Уточнена классификация хромосом льна посевного с учетом их морфологических параметров и молекулярно-цитогеиетических маркеров, что позволило усовершенствовать обобщенуто идиограмму хромосом генома L. iisitatissimum.

5. Впервые изучен хромосомный полиморфизм у 18 сортов и 1 гибрида льна посевного по распределению хромосомных маркеров (DAPI-бэндов и сайтов 5S и 26S рДНК). Обнаружен как межсортовой, так и внутрисортовой полиморфизм по наличию или отсутствию DAPI-бэндов и по ко-локализации 5S и 26S рДНК на хромосомах 1, 3, 8 и 13. У четырех сортов льна впервые обнаружен гетероморфизм гомологов пары спутничных хромосом. У исследованных форм идентифицированы все хромосомы, составлены кариотипы и построены идиограммы.

6. Последовательность теломерного повтора арабидопсисного типа (TTTAGGG) локализована на концах обоих плеч всех хромосом и в прицентромерной области хромосомы 2 в кариотипах всех изученных образцов льна. Этот интерстициальный сайт теломерного повтора может быть использован в качестве константного молекулярного маркера хромосомы 2.

7. Впервые с использованием метода FISH у изученных долгунцовых и масличных сортов льна в проксимальных районах длинных плеч хромосом 3 и 9 локализованы кластеры генов семейства целлюлозосинтаз CesA. Эти сайты CesA генов могут быть использованы в качестве константных молекулярных маркеров 3 и 9 хромосом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Муравенко О.В., Большева Н.Л., Юркевич О.Ю., Носова И.В., Рачинская OA., Саматадзе Т.Е., Зеленин A.B. Кариогеномика видов рода Linum L. // Генетика. 2010. Т. 46. № 10. С. 1339-1342.

2. Рачинская OA., Лемеш В.А., Муравенко О.В., Юркевич О.Ю., Гузенко Е.В., Большева Н.Л., Богданова М.В., Саматадзе Т.Е., Попов К.В., Малышев C.B., Шостак Н.Г., Хеллер К., Хотылева Л.В., Зеленин A.B. Полиморфизм генома льна посевного по молекулярно-цитогенетическим маркерам // Генетика. 2011. Т. 47. № 1. С. 65-75.

3. Рызванович Г.А., Бегунов P.C., Рачинская O.A., Муравенко О.В., Соколов A.A. Синтез и интеркалирующая активность новых пиридо [1,2-а]бензимидазолов // Химико-фармацевтический журнал. 2011. Т. 45. № 3. 100-102.

4. Рачинская O.A., Попов К.В., Рызванович Г.А., Большева Н.Л., Бегунов P.C., Юркевич О.Ю., Зеленин A.B., Муравенко О.В. Повышение разрешающей способности хромосомного анализа с помощью пиридо[1,2,-а]бензимидазолов // Генетика. 2012. Т. 48. № 10. С. 1228-1236.

5. Yurkevich O.Yu., Naumenko-Svetlova A.A., Bolsheva N.L., Samatadze Т.Е., Rachinskaya O.A., Kudryavtseva A.V., Zelenina D A., Volkov A.A., Zelenin A.V., Muravenko O.V. Investigation of genome polymorphism and seed coat anatomy of species of Adenolinum at genus Linum // Genet. Resour. and Crop. Evol. 2013. V. 60. P. 661-676.

6. Лемеш B.A., Богданова M.B., Гузенко E.B., Грушецкая З.Е., Саматадзе Т.Е., Рачинская O.A., Муравенко О.В. Генетический полиморфизм сортов льна (Linum usitatissimum L.) в зависимости от периода селекции // Молекулярная и прикладная генетика. 2013, Т. 15. С. 75-86.

Патент

Бегунов P.C., Рызванович Г.А., Соколов A.A., Рачинская O.A., Муравенко О.В. Патент на изобретение № 2455356: ДНК-интеркалаторы для цитогенетических исследований геномов мелкохромосомных растений. Опубликовано: 10.07.2012. Бюл. № 19.

Тезисы

1. Рачинская O.A., Большева Н.Л., Саматадзе Т.Е., Юркевич О.Ю., Зелешш A.B., Муравенко О.В. Исследование рисунков С/DAPI-окраски и локализации рибосомальных генов на хромосомах у сортов льна различного направления селекции // Труды V съезда

ВОГИС. 2009. Ч. II. С. 401.

2. Муравенко О.В., Юркевич О.Ю., Носова И.В., Рачпнская О.А.. Попов К.В., Шостак Н.Г., Зеленин А.В. Молекулярно-цитогенетический анализ видов рода linum L. // Труды V Съезда ВОГИС. 2009. Ч. И. С. 402.

3. Рачпнская О.А., Большева H.JI., Юркевич О.Ю., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В., Муравенко О.В. Исследование кариотипов сортов льна масличного, льна-долгунца и межеумка с помощью хромосомно-молекулярных маркеров // Материалы VIII Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". 2009. Т. 2. С. 274-275.

4. Муравенко О.В., Большева Н.Л., Носова И.В., Юркевич О.Ю., Рачинская О.А., Попов К.В., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В. Молекулярно-цитогенетический анализ геномов видов рода Linum L. // Материалы VIII Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". 2009. Т. 2. С. 224-227.

5. Муравенко О.В., Большева Н.Л., Юркевич О.Ю., Носова И.В., Рачинская OA., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В. Кариогеномное исследование видов рода Linum L. // Труды Международной конференции "Хромосома 2009". 2009. Т. 2. С. 66-67.

6. Рачинская О.А., Большева Н.Л., Юркевич О.Ю., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В., Муравенко О.В. Межсортовой хромосомный полиморфизм льна по молекулярно-цитогенетическим маркерам // Труды VI Совещания по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений. 2009. С. 24-28.

7. Большева Н.Л., Юркевич О.Ю., Носова И.В., Попов К.В., Рачинская О.А., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В., Муравенко О.В. Кариосисгематическое исследование рода Linum L. // Труды VI Совещания по кариологии, кариосистематике и молекулярной системетике растений. 2009. С. 21-24.

8. Muravenko О., Bolsheva N., Yurkevich О., Rachinskaya О., Amosova A., Popov К., Samatadze T., Zelenin A. Comparative molecular-cytogenetic analysis of genomes of species sects. Linum, Adenolinum, Stellerolinum, Syllimtm, Dasylinum and Linopsis in genus Linum L. // Abstracts of the 4th Asian Chromosome Colloquium. 2010. P. 69-72.

9. Muravenko O., Bolsheva N., Yurkevich O., Rachinskaya O., Amosova A., Popov K., Samatadze T., Zelenin A. Comparative molecular-cytogenetic analysis of genomes of species sects. Linum, Adenolinum, Stellerolinum, Syllimtm, Dasylimim and Linopsis in genus Linum L. // Materials of the 4Л Asian Chromosome Colloquium. 2010. P. 69-72.

10. Рачинская O.A., Рызванович Г.А., Бегунов P.C., Муравенко О.В. Повышение разрешающей способности хромосомного анализа с помощью пиридо [1,2-

а]бензимидазолов // Фактори эксепериментальщц еволюцп оргаштапв. 2011. Т. 10. С.47-52.

И. Muraveko О., Bolsheva N., Yurkevich О., Rachinskaya О., Melnikova N., Amosova A., Popov K, Samataze Т., Zelenin A. Chromosomes of genus Linum species // Chromosome Research. 2013. V. 21. Supp. 1. P. 130-131.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AFLP - amplified Fragment Length Polymorphisms (полиморфизм длин амплифицированных фрагментов)

DAPI -4'-6'-Diamidino-2-phenylindole (4,6-диамидино-2фенилиндол) FISH - fluorescence in situ hybridization (флоресцентная гибридизация in situ) PBI - pyrido[l,2-a]benzimidazole (пиридо[1,2-а]бензимидазол)

RAPD - random amplified polymorphic DNA (произвольно амплифицированная полиморфная ДНК)

RFLP — restriction fragment length polymorphism (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов)

рДНК (РНК) - рибосомальная ДНК (РНК) 9-АМА — 9-аминоакридин ПЦР - полимеразная цепная реакция .ЯОР - ядрышко-организующий район

Подписано в печать 16.04.2015 г.Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 3406-03-15Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39