Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повышение разрешающей способности и информативности хромосомного анализа растений

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Повышение разрешающей способности и информативности хромосомного анализа растений"

На правах рукописи

003454093

ПОПОВ КОНСТАНТИН ВАСИЛЬЕВИЧ

ПОВЫШЕНИЕ РАЗРЕШАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ И ИНФОРМАТИВНОСТИ ХРОМОСОМНОГО АНАЛИЗА РАСТЕНИИ

03.00.03 - молекулярная биология 03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2008

003454093

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научные руководители: кандидат биологических наук

О.В. Муравенко

доктор биологических наук, профессор

A.B. Зеленин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

B.Ю. Поляков

доктор биологических наук В.И. Попенко

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт

цитологии и генетики Сибирского отделения РАН

©О

ч II

Защита диссертации состоится " " " О^М-Ьц) |Q$s 2008 г. в VI часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан « \\ УЦЬа^рЧ 2008 г.

Учёный секретарь Диссертационного Совета £ / " С ' ^

кандидат химических наук "/ /'L-//' A.M. Крицын

С. - /

Актуальность проблемы

Общий объём научных работ, выполненных на хромосомах животных, значительно превышает число работ по изучению хромосом растений. В первую очередь, это связано с приоритетным изучением хромосом человека, кроме того, существенным является наличие методических трудностей в работе с хромосомами растений. Препараты хромосом растений труднее приготовить, так как растительные клетки защищены прочной клеточной стенкой. Препараты хромосом растений труднее изучать, так как значительное число растений, в том числе и таких хозяйственно важных как рис и лён, имеют хромосомы относительно небольшого размера. Для этих объектов исследования обычные методы анализа, пригодные для изучения крупных хромосом, часто не дают достаточно информации даже для идентификации хромосом.

Однако интерес к молекулярной биологии растений в последнее время неуклонно возрастает. Человечество вынуждено ускорять методы селекции сельскохозяйственных растений, поскольку именно с этим связана возможность дальнейшего развития цивилизации в условиях увеличивающегося населения земли, ухудшающейся экологии и ограничения площадей, пригодных для посева. Возрастает потребность в цитогенетическом анализе растений, который стал неотъемлемой частью генетики и молекулярной биологии. С этим связано непрекращающееся совершенствование методов хромосомного анализа. Интерес представляют как попытки расширения возможностей хромосомного анализа за счёт разработки методов изучения мелких хромосом, так и методы, повышающие информативность исследования растений с крупными и средними хромосомами.

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы явилась разработка методических аспектов хромосомного анализа растений, повышающих его разрешающую способность за счет увеличения числа достоверных параметрических характеристик дифференциально окрашенных хромосом.

Исходя из цели исследования, были сформулированы следующие задачи:

I. Отработать условия применения интеркаляторов ДНК этидия и 9-аминоакридина для получения препаратов метафазных хромосом растений низкой степени конденсации.

2. С использованием разработанной методики провести хромосомные исследовании ряда модельных видов с мелкими, средними и крупными хромосомами.

3. Исследовать качественно и количественно стабильность рисунка С-дифференциального окрашивания хромосом растений, полученных с использованием 9-аминоакридина.

4. Изучить возможность использования светоизлучающих диодов в схеме освещения препаратов в проходящем свете микроскопа для быстрого изменения спектра освещения, оптимального либо для визуального анализа либо для обеспечения регистрации максимально контрастных изображений.

5. Исследовать возможность использования ряда новых димерных бис-бензимидазолов для дифференциального флуоресцентного окрашивания хромосом.

Научная новизна и практическая ценность работы

Разработана надёжная методика получения препаратов метафазных хромосом низкой степени конденсации. Обнаружено, что после обработки меристематических клеток растений 9-аминоакридином окрашивание хромосом ацетоорсеином выявляет высокоразрешающий в-подобный рисунок (бэнднг), содержащий значительно большее число сегментов по сравнению с С-окраской, которая обычно применяется для анализа хромосом растений.

Показано, что методика предобработки клеток 9-аминоакридином расширяет возможности хромосомного анализа для видов с мелкими хромосомами, а также для видов, у которых рисунок С-окраски хромосом в стандартных условиях недостаточно информативен. Только применение 9-аминоакридина позволило провести анализ С-окрашенных хромосом нескольких видов льна. Это открывает перспективы цито-генетического анализа хозяйственно важных видов растений с мелкими хромосомами, включая, лён, рис и хлопчатник.

Предложенная схема освещения препаратов в проходящем свете микроскопа, использующая светоизлучающие диоды, дает возможность в реальном времени изменять спектр света в зависимости от используемых красителей. Это позволяет повысить контраст регистрируемых изображений и улучшить эргономику визуального анализа микроскопических препаратов в проходящем свете.

Предложенные к использованию два новых ДНК-специфичных флуоресцентных соединения - димерные бис-бензимидазолы выявляют рисунок более контрастный в сравнении со стандартно используемыми DAPI и Hoechst 33258. Одним из наиболее значимых применений данных красителей может стать медицинская цито-генетика, поскольку достоверность хромосомного анализа человека напрямую связана с контрастностью рисунка дифференциальной окраски.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на III съезде ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), 2-м съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007) , VII симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования» (Пущино, 2007), 16lh International chromosome conference (Амстердам, Нидерланды, 2007), International society for analytical cytology, cytometry congress (Монпе-лье, Франция, 2004; Будапешт, Венгрия, 2008).

Результаты

1. Эффективность задержки конденсации хромосом человека с помощью эти-дия п 9-аминоакриднна

В работе была изучена эффективность задержки конденсации хромосом с помощью двух интеркаляторов ДНК - этидия и 9-аминоакридина, Проведено сравнение действия интеркаляторов на хромосомы, получаемые из культуры лимфоцитов крови человека, поскольку приготовление препаратов хромосом человека методически хорошо изучено. Кроме того, получение хромосомных препаратов с заданной степенью конденсации остается актуальным и для цитогенетических исследований хромосом человека. Препараты наиболее длинных хромосом с приемлемым уровнем хромосомных наложений были получены при концентрации 9-аминоакридина 0,5 мкг/мл и этидия 1 мкг/мл при обработке в течение одного часа перед фиксацией. В этих условиях число метафазных пластинок со средней длиной хромосом увеличивалась на препаратах на 70-90 %, по сравнению с контролем. Число G-сегментов после обработки в описанных выше условиях достигало 700 на гаплоидный набор после обработки этидием и 850 после обработки 9-аминоакридином, в сравнении с 400 сегментами в необработанных хромосомах. На хромосомных препаратах, полу-

ченных после предобработки 9-аминоакридином, контрастность G-окраски оказалась заметно выше, чем на препаратах после предобработки этидием (при одинаковой степени удлинения). Это позволяет рекомендовать использование 9-аминоакридина для приготовления препаратов с высокоразрешающей G-окраской в цитогенетических исследованиях человека.

2. Эффективность задержки конденсации хромосом ромашки аптечной с помощью этидия и 9-аминоакрндина. Получение G-подобного рисунка хромосом ромашки

Для отработки условий применения интеракаляторов ДНК (этидия и 9-аминоакридина) с целью снижения степени конденсации мелких хромосом растений в качестве объекта исследования была выбрана ромашка аптечная (Matricaria chamomilla L.). Оптимальные условия обработки интеркаляторами, приводящими к достаточному удлинению хромосом и выявлению чёткого G-подобного рисунка на всех хромосомах ромашки аптечной, были определены как 4 мкг/мл для этидия и 1 мкг/мл для 9-аминоакридина в течение 12 часов перед фиксацией при температуре +26°С. Оба интеркалятора ДНК дают возможность получить воспроизводимый, высокоразрешающий и достаточно контрастный рисунок G-подобной окраски хромосом М chamomilla. Снижение концентрации и времени обработки интеркаляторами приводило к укорачиванию хромосом и приближению их по размерам к необработанным интеркаляторами. Увеличение концентрации 9-аминоакридина и этидия выше оптимальной при длительной обработке хромосом указанными реагентами приводило к значительному увеличению их длины и невозможности их идентификации вследствие множества хромосомных наложений. Более четкий и контрастный рисунок G-подобного окрашивания на хромосомах ромашки наблюдался после предобработки 9-аминоакридином. По этой причине в дальнейшей работе использовался только 9-аминоакридин.

3. Исследование карнотнпов модельных объектов с использованием 9-аминоакрнд1ша

Для проверки эффективности применения удлиненных, в результате действия 9-аминоакридина, хромосом для кариологического анализа с помощью С-окраски и оценки воспроизводимости, специфичности и информативности рисунка

G-подобного ацетоорсеинового окрашивания было проведено кариологическое исследование нескольких модельных объектов. Лён посевной представляет собой объект с малыми хромосомами. Льны австрийский и крупноцветковый, ромашка аптечная имеют хромосомы средних размеров. Кариотип цингерии представлен двумя парами крупных хромосом.

3.1 Сравнение рисунков С- и G-подобных окрасок хромосом в карпотппах трёх сортов ромашки аптечной

Проведено кариологическое сравнение трёх сортов ромашки аптечной (Matricaria chamomilla L.): диплоидных - Азулена и Сибирская бизаболольная (2п=18) и тетраплоидного Подмосковная (2п=4х=36). Препараты для С-окраски готовили с добавлением 9-аминоакридина до концентрации 1мкг/мл за 3 часа перед фиксацией. Препараты для G-подобного окрашивания готовили с добавлением 9-аминоакридина до концентрации 1 мкг/мл на 12 часов перед фиксацией.

Получены рисунки С-окраски хромосом (размеры от 2,5 мкм до 6,5 мкм) всех трёх сортов ромашки. От полученных ранее, без использования 9-аминоакридина, рисунки С-окраски отличаются большей контрастностью и выявлением ряда мелких интеркалярных С-блоков, обнаружение которых было затруднено при работе с препаратами, приготовленными стандартным методом. Обнаружен полиморфизм при-центромерных гетерохроматических районов и ряда мелких интеркалярных и тело-мерных С-блоков.

Получены рисунки G-подобного дифференциального окрашивания хромосом (размеры от 5,3 мкм до 10,2 мкм) всех трёх сортов ромашки. Рисунок G-подобного окрашивания отличается значительно большей сложностью, по сравнению с рисунком С-окраски. На каждой хромосоме выявляется от 12 до 22 G-подобных сегментов. Центромерный район, а также области вторичных перетяжек в хромосомах ромашки аптечной ацетоорсеином не окрашиваются. Сравнение различных сортов позволило установить, что распределение G-блоков у гомологичных хромосом в ка-риотипах различных сортов одинаково.

Рисунки G-подобно окрашенных хромосом ромашки, на основании их размеров, центромерных индексов и локализации основных С-сегментов, которые соответствовали тёмным G-подобным сегментам, были соотнесены с рисунками С-окрашенных хромосом (исключением являлся центромерный С-сегмент, который

не окрашивается ацетоорсеином). Таким образом установлено соответствие между рисунками С- и Б-подобного окрашиваний гомологичных хромосом М СИатотШа Ь. (рис. 1, стр. 11).

3.2. Сравнение кариотипов родственных видов льна австрийского и льна крупиоцветкового по рисункам С-окраски

Хромосомные препараты готовили с добавлением 1 мкг/мл 9-аминоакридина за 3 часа перед фиксацией. Исследованы С-окрашенные хромосомы в кариотипах двух родственных дикорастущих видов льна: Ь.атичасит Ь. (2п=18) и Ь &-апс1'фоп1т Бсз£ (2п=16). Кариотипы обоих видов были сходны по морфологии и размерам хромосом и представлены метацентриками и субметацентриками (2,6-4,3 мкм), а также одной спутничной хромосомой у каждого из видов. Рисунки С-окраски хромосом в кариотипах льна австрийского и льна крупноцветкового содержат крупные гетерохроматические блоки в основном в прицентромерно-теломерных районах хромосом, а мелкие - преимущественно в интеркалярных районах. Распределения гетерохроматических районов восьми хромосом в геномах обоих видов льна было практически идентичным. Незначительные различия наблюдались по величине С-блоков и по центромерному индексу (Рис 2, 3).

123456789

Рис. 2. Идиограмма С-окрашенных хромосом ипит ам1пасит Ь. (2п=18).

1 2 Э 4 5 6 7 В

Рис. 3. Идиограмма С-окрашенных хромосом Ь. ^тпйфотт Ое8Ц2п=16).

3.3. Сравнение рисунков С-окрашениых хромосом трёх образцов льна обыкновенного

Проведено С-дифференциальное окрашивание хромосом в кариотнпах трех образцов семян: лён обыкновенный (2n=30) (L. iisiiatissimiim L., заносная форма), лён прядильный или лён-долгунец (L usitatissimum var. usitatissimum) К-603 и лён масличный или лён-кудряш (L usitatissimum var. humile Mill.) K-594. Препараты для С-окраски готовили с добавлением 9-аминоакридина до концентрации 1 мкг/мл за 12 часов перед фиксацией. Размеры хромосом составляли от 1,5 до 3,5 мкм У всех изученных форм наблюдался общий рисунок С-окраски хромосом, хотя выявились и различия по размерам отдельных блоков. Рисунки распределения гетерохроматических районов по длине хромосом были, в основном, специфичны. В ряде случаев, для точной идентификации гомологов требовалось учитывать также и морфологию хромосом. Выявленный полиморфизм гетерохроматических районов хромосом позволяет различать кариотипы разных разновидностей этого вида льна.

3.4. Карнотипнческое сравнение трёх близкородственных видов льна

Проведено С-дифференциальное окрашивание трёх близкородственных видов льна: лён обыкновенный L usitatissimum L. сорт льна-долгунца Оршанский 2 (2п=30), L. angustifolium (Huds.) (2п=30) и L. bienne Mill. (2n=30), а также межвидовые гибриды: L usitatissimum сорт Оршанский 2 x L. bienne Mill. L usitatissimum сорт Оршанский 2 x L. angustifolium (Huds.). Кариотипы всех форм представлены метацен-трическими, субметацентрическими и одной спутничной хромосомами. Хромосомы изученных форм сходны по морфологии, размерам (1-3,5 мкм) и рисунку С-окраски (рис. 4, стр. И). Изучение рисунков С-окраски хромосом видов и межвидовых гибридов показало, что в кариотнпах всех образцов более крупные гетерохроматические блоки в, основном, расположены в прицентромерных районах хромосом, а мелкие - преимущественно в теломерных и интеркалярных районах. Выявлено большее сходство между L. usitatissimum и L. bienne и меньшее сходство между L usitatissimum и L. angustifolium. Различить родительские гомологичные хромосомы в кариотнпах обоих межвидовых гибридов было во многих случаях затруднительно из-за высокой степени сходства рисунков С-окраски.

3.5. Кариотнпнческое исследование Zingeria biebersteiniana L.

Проведено изучение С- и G- дифференциально окрашенных хромосом в ка-риотипе Zingeria biebersteiniana (Claus) Р. Smirnov (2п=2х=4). Хромосомы цингерии содержат крупные прицетромерные и небольшие интеркалярные С-блоки. После обработки корневой меристемы 9-аминоакридином при последующем окрашивании ацетоорсеином выявлялся чёткий рисунок G-подобного дифференциального окрашивания хромосом (рис. 5, стр. 12). Средний размер хромосом увеличился. Анализировали хромосомы цингерии имеющие длину в интервале 11-15мкм. На хромосоме 1 было 7 крупных районов, включающих в себя 3-6 G-сегментов разной интенсивности окрашивания, разделенных достаточно четкими G-отрицательными районами. В хромосоме 2 выявляется 6 таких районов. Центромерный район, а также области вторичных перетяжек в хромосомах цингерии не окрашивались.

Таким образом, сравнение бедного рисунка С-окраски высокоразрешающего G-подобного бэндига в хромосомах цингериии демонстрирует, что и при анализе крупных хромосом использование 9-аминоакридина позволяет существенно повысить разрешение хромосомного анализа, что может быть необходимым при сравнении геномов родственных видов и точном картировании на хромосомах различных последовательностей ДНК.

4. Сравнение оценки полиморфизма рисунков С-окраски хромосом льна, приготовленных с использованием 9-аминоакрндина, и хромосом ячменя на препаратах, приготовленных по стандартной методике с использованием колхицина

Проведено сравнение полиморфизма рисунка С-окраски и размеров С-блоков в хромосомах четвертых групп в кариотипах ячменя Hordeum vulgare L. сорта Джау-Кабутак и льна L. grandiflorum Desf. Хромосомные препараты ячменя были приготовлены по стандартной методике с использованием колхицина. Препараты хромосом льна были приготовлены в двух вариантах: по стандартной методике с использованием колхицина и по предложенной нами методике с использованием 9-аминоакридина (1мкг/мл на 12 часов перед фиксацией). При стандартной методике хромосомы льна были практически не идентифицируемы из-за малого размера и были использованы только для сравнения распределения длин хромосом на препарате, приготовленном с 9-аминоакридином и без него.

J / s* ( 1

1 2 3

i ' if И

i ч 5 \ *

<5 * i H

л \

%

8 9

Рис. 1. Кариограмма С- (слева) и О-подобно окрашенных хромосом ромашки аптечной (сорт Сибирская бизаболольная).

т С f

Vtv 'Is? -ж**

*; «г Ф Лол

If %

а б в

Рис. 4. Метафазные С-окрашенные хромосомы льнов (2n=30): a) L. angustifolium (Huds.), б) L. bienne Mill, и в) L. usitatissimum сорт Оршанский 2. Масштабная черта 10 мкм.

/

1 ч

Рис. 5. Кариограммы и идиограммы С- (верхний ряд) и О-иодобиого окрашивания хромосом цингерии.

\Л/, мкм

Рис. 6. Функция распределения длин хромосом. Исследованные хромосомы ячменя (1). исследованные хромосомы льна, обработанные 9-аминоакридином (2), хромосомы льна с препарата, не обработанного 9-аминоакридином (3).

1/1п, отн. ед.

- галогенная пампа - красный светодиод

- галогенная лампа + зелёный фильтр - зелёный светодиод

белый светодиод - синий светодиод

Рис. 9. Распределение яркости вдоль ломаной линии полученное при разных типах освещения. Абсолютное значение яркости нормировано на значение яркости в точке, лежащей в области эухроматина, отмеченной красной стрелкой.

Р0

/

*

\

ч*' >

.л'щс

Рис. 10. Цветное изображение С-окрашенных хромосом, полученное совмещением трёх снимков, сделанных при освещении препарата красным, синим и зелёным светом. Масштабная черта 10 мкм.

л -л:

^Ч // *"

"И э?

iil Н äi

1J N

F II

10 II

I» П . f» ~ -

Н о Vi Ü Ь' у

16 17

<■ а м г, и

21 22

c9i Vi i* 1С ¡ff fi

с"

X Y

Рис. 12. Метафазная пластинка и кариотип (инвертированное изображение) фибробластов человека линии МЯС-5, окрашенных соединением 0В(17).

У

Рис. 13. Дифференциальная окраска метафазных хромосом льна: DB(8) (а): DAPI (б); Hoechst 33258 (в); С-окраска (г).

Распределение хромосом по длинам в изученных выборках различается для хромосом ячменя и льна (рис 6, стр 12) Длина 76% хромосом ячменя колеблется от 6,7 до 8,6 мкм и занимает около трети всего изученного интервала длины, тогда как длины хромосом льна, обработанные 9-аминоакридином, распределены равномерно. Несмотря на значительно больший разброс длин хромосом, обработанных 9-аминоакридином, рисунок С-окраски остается постоянным в широком интервале длин В нашем случае рисунок С-окраски хромосом был постоянен в интервале длин от 4,32 до 7,16 мкм. В указанном интервале длин обнаружено также постоянство размеров крупных гетерохроматических блоков. Коэффициенты вариации размеров крупных гетерохроматических блоков на хромосомах льна, приготовленных с использованием 9-аминоакридина, не превышали коэффициентов вариации для крупных гетерохроматических блоков на хромосомах ячменя, приготовленных с использованием колхицина. Таким образом, хромосомные препараты, приготовленные с применением 9-аминоакридина, пригодны как для изучения полиморфизма рисунка С-окраски по типу наличия-отсутствия С-блоков, так и для изучения количественного полиморфизма размеров С-блоков в сравнительных генетических исследованиях, аналогично тому, как этот тип полиморфизма изучается и в крупных хромосомах ячменя.

5. Сравнение сортов льна культурного по площади гетерохроматических районов в ядрах и хромосомах

Проведено С-дифференциальное окрашивание хромосом сортов трех разновидностей культурного льна (Ьтит ик11сН'их1тит Ь.). У сортов льна-долгунца рисунок С-окраски хромосом отличался от рисунка у масличных сортов меньшими размерами прицентромерных С-блоков и присутствием теломерных сегментов на большинстве хромосом (рис. 7).

Определено общее количество гетерохроматина (суммарная площадь темно-окрашенных С-блоков) в метафазных хромосомах исследуемых сортов льна (рис. 8). Средняя суммарная площадь гетерохроматина в хромосомах льна масличного больше чем в сортах других разновидностей.

Результаты измерения суммарных площадей гетерохроматина на хромосомных препаратах и на препаратах профазных ядер масличного сорта Шафир и дол-гунцового сорта Оршанский-2 в целом согласуются. Средняя площадь гетерохрома-

тина и дисперсия ее распределения у сорта Оршанский-2 меньше как на хромосомах, так и на ядрах (таблица 1).

1

9 9 4

9 «

\ I Л

% 5 ^

: * г ^ % ч

Рис. 7. С-дифференциально окрашенные метафазные пластинки хромосом сортов разных разновидностей льна (я — лён-долгунец, сорт Балтучай; б — лён масличный, сорт Шафир). Масштабная черта 5 мкм.

10

2-

Рис. 8. Средняя суммарная площадь гетерохроматина и ее дисперсия на мегафазных хромосомах. Лён-долгунец: / — К.-37; 2 — Зарецкий кряж; Л - Балтучай; 4 - Белинка; 5 — Оршанский-2. Лён межеумок: б — Линотт. Лён масличный: 7- Оливер; 8 — Шафир.

Иртерс )азные ядра Метафазные хромосомы

Средняя площадь Дисперсия распределения площади Средняя площадь Дисперсия распределения площади

Оршанский-2 4,1 1,9 4,4 1,5

Шафир 7,6 2,7 6,8 2,5

Таблица I. Средняя площадь и дисперсия распределения площади у льна долгунцового (Оршанский-2) и льна масличного (Шафир) (данные представлены в условных единицах).

6. Сравнение качества изображений дифференциально окрашенных хромосом растений, полученных нрн освещении препарата лампой накаливания и свето-диодами

Была проведена оценка качества изображения при использовании различных типов освещения С-окрашенных препаратов, взятых из коллекции лаборатории (злаки родов Hordeum, Tnticwn, Aegilops).

Препараты последовательно освещали следующими источниками света: гало-геновая лампа с барьерным светофильтром (700 нм), галогеновая лампа с двумя светофильтрами (зелёный (530 нм) и барьерный светофильтры (700 нм)), красный све-тодиод (639 нм), зеленый светодиод (524нм), синий светодиод (470 нм), белый све-тодиод. Барьерный светофильтр, блокирующий излучение с длиной волны больше 700 нм, был использован для ограничения диапазона волн видимой областью. Для достижения приблизительно равных яркостей на регистрируемых изображениях время экспозиции составляло от тысячных долей секунды для лампы накаливания без фильтра до сотых долей секунды для светодиодов. Измерения показали, что во всех случаях использование зелёного освещения (лампа+зеленый светофильтр, зелёный LED) даёт заметный выигрыш в контрастное i и 1ела хромосомы (эухромати-на) на фоне препарата, и гетерохроматина на фоне эухроматина, по сравнению с остальными типами освещения (рис. 9, стр. 13). В результате совмещения изображений одного и того же поля зрения, полученных при поочерёдном освещении препарата тремя светодиодами (R-красный, G- зелёный, В- синий) реконструируется цветное изображение достаточно хорошего качества (рис. 10, стр. 13).

7. Применение ДНК-специфичных димерных бис-бензимпдазольных флуоро-хромов для цитогенетических исследований человека и растений

Специфичность вновь синтезированных ДНК-специфичных димерных бис-бензимидазольных соединений и аналогов Hoechst 33258 (рис. 11) к окрашиванию хроматина ядер и яркости их флуоресценции проведена на препаратах фиксированных клеток линии MRC-5.

DB(4) R-PKMC[l,VOPh, DB(5) R - Ph04U!,V<>Ph DB(6) R- Ph0-(CIIj),0(C[I2)20(( [l,)j-OPh, X= CONH-lCHjVMCII,),

DB(7) к = (I1M1C 0-(< П|,-( П\|[([К , DB(8) к - (II NMUHni^-iOMIC П., DB(17) R = С H;NIICO-(CII,),-CC)NI!ni,, DB(I8) R = С [I,NI!CO-(C П ),-COMICIL, DB(9) К - ( UM К U-a }]),,-( UM к П. X=HHWM"CH.

HA(10) " HA(lOa)

Рис. 11 Структуры димерных бис-бензимидазолов (DB) и аналогов Hoechst 33258 (НА(10) и НА(Юа)).

Флуоресценцию препаратов, окрашенных исследуемыми соединениями, наблюдали при возбуждении в синей (460 нм), зеленой (525 нм) и ультрафиолетовой (365 нм) областях спектра. Контролем специфичности окраски служило окрашивание флуорохромами DAPI и Hoechst 33258.

Отобраны четыре соединения: DB(7), DB(8), DB(17) и DB(18), придававшие яркую, устойчивую к выцветанию гетерогенную окраску клеточного ядра при УФ-возбуждении, низкую яркость флуоресценции ядра при возбуждении синим и зеленым светом и низкую яркость флуоресценции цитоплазмы при возбуждении в УФ, синей и зеленой областях спектра. Флуорохромы DB(7), DB(8), DB(17) и DB(18) оказались близкими по свойствам к АТ-специфичным лигандам DAPI или Hoechst 33258, которые обычно используются в практической цитогенетике.

При окрашивании хромосомных препаратов соединениями DB(7), DB(8), DB(17) и DB(18) наблюдали рисунки дифференциального окрашивания хромосом, сходные с рисунком, выявляемым акрихином, DAPI и Hoechst 33258. Наиболее контрастный рисунок дифференциальной окраски хромосом человека обнаружен при использовании DB(17) (рис. 12, стр. 14) и DB(8). Контрастность рисунка, полученного при использовании всех четырех соединений, была не ниже, чем в случае DAPI и Hoechst 33258, или даже выше. При окрашивании хромосомных препаратов льна (L grandiflorum L.) этими соединениями выявлен рисунок, подобный DAPI- и С-дифференциальному окрашиванию (рис. 13, стр. 14). Такой тип окрашивания характерен для метафазных хромосом растений, у которых флуорохромы обычно ярко окрашивают районы конститутивного гетерохроматина. На хромосомах льна не удалось выявить различий в характере окрашивания тестируемыми соединениями,

что, вероятно, связано с малыми размерами хромосом и бедностью рисунка их дифференциального окрашивания.

Заключение

Малый размер хромосом (менее 5 мкм) и особенно малый размер районов хромосом, составляющих рисунки их дифференциального окрашивания, побуждает к усовершенствованию всех этапов хромосомного анализа от методов приготовления хромосомных препаратов до наиболее полного использования всех возможностей системы регистрации изображений. Затрудняет анализ хромосом растений и тот факт, что рисунок их С-окраски часто содержит небольшое число маркерных гетерохроматических сегментов, которых недостаточно не только для точной локализации хромосомных перестроек и высокоразрешающего картирования различных последовательностей ДНК на хромосомах, но и для идентификации индивидуальных хромосом .

Основной целью нашей работы была попытка повышения разрешающей способности хромосомного анализа растений. Решение этой проблемы мы начали с разработки такой методики приготовления препаратов хромосом, которая бы позволила получать удлиненные, по сравнению с приготовленными по стандартной методике, хромосомы. Длина хромосом на препарате зависит от стадии митоза, на которой были фиксированы клетки, из которых готовятся препараты. Обычно для получения удлинённых хромосом с низкой конденсацией клеток синхронизируют, блокируя прохождение клеточного цикла в Б-фазе. Снятие блока и фиксация клеток в момент прохождения ими поздней профазы и ранней метафазы позволяет получить препараты с профазными или митотическими хромосомами. Ограничением на использование данного подхода является необходимость точного знания продолжительности клеточного цикла. Без этого знания требуется фиксировать значительное число образцов клеток через разные интервалы времени. В представленной работе мы развили второй подход синхронизации клеток, основанный на частичном блокировании прохождения митоза. Традиционно для задержки прохождения митоза используются агенты, блокирующие образование веретена деления, однако таким образом удается получить сильно компактизованные хромосомы, что не приемлемо для мелких хромосом. Использование интеркаляторов ДНК позволяет задержать процесс компактизации хромосомы. Мы получили значительно удлинённые хромо-

сомы на препаратах, приготовленных из делящихся клеток, обработанных этидием и 9-аминоакридином. Предложенный нами 9-аминоакридин показал большую, в сравнении с этидием, эффективность в задержке конденсации хромосом. На таких хромосомах выявлялись более контрастные и богатые рисунки С-окраски, а при окрашивании ацетоорсеином - высокоразрешающие рисунки поперечной исчерченно-сти, сходные с рисунками С-окраски животных. Это открывает дополнительные возможности не только для идентификации гомологичных хромосом и их районов, но и точной локализации мест разрывов при хромосомных перестройках.

Однако действие интеркаляроров ДНК не приурочено к какой-либо конкретной стадии митоза, как в случае ингибиторов образования веретена деления. Это приводит к вариабельности длин хромосом. В связи с широким диапазоном длин хромосом возникли опасения, что использование данного метода для сравнительного анализа С-дифференциально окрашенных хромосом окажется невозможным. Для решения вопроса о границах и условиях применимости хромосом, удлиненных действием интеркаляторов в ДНК, была проведена оценка связи вариабельности рисунка С-окраски с изменением длины хромосом. Вариабельность С-окраски считается очень низкой, поскольку выявляемые этим методом районы гетерохроматина остаются конденсированными на протяжении большей части клеточного цикла. Малые изменения степени конденсации гетерохроматина и естественная выравненность по длине метафазных хромосом объясняют высокую стабильность рисунка С-окраски. В нашей работе при изучении препаратов мелких хромосом растений мы столкнулись со значительно большими различиями в размерах наблюдаемых хромосом (более чем пятикратное отличие гомологичных хромосом разной степени компактиза-ции). Как показало исследование, даже при таком большом разбросе длины хромосом, рисунок С-окраски хорошо воспроизводится. При этом сохраняется и возможность количественного сравнения величины С-сегментов хромосом. Однако, следует внимательно подходить к отбору метафазных пластинок для анализа. Можно рекомендовать отбирать метафазные пластинки по двум критериям: удовлетворительная морфология и примерно одинаковая степень компактизации. Стоит избегать использовать хромосомы максимальной длины наблюдаемой на препарате, поскольку часто хромосомы из пластинок с наименьшей компактизацей не имеют видимых концов и у них трудно определить фактическую длину. Следует учитывать, что разли-

чия в рисунке окраски приблизительно одинаково компактизованных хромосом могут быть связаны с геномным полиморфизмом.

При выборе спектрального состава освещения препарата при микроскопическом исследовании нужно учитывать два фактора. Для человека более комфортно наблюдение цветных изображений без доминирования какого-либо цвета. Анализ цветных изображений не только меньше утомляет человека, но проводится с большей скоростью. Регистрация изображений монохромной камерой требует использования монохроматического освещения, длина волны которого соответствует максимуму поглощения, используемого для окраски препаратов красителя. Эти два требования могут быть удовлетворены за счет освещения белым светом - для визуальной оценки непосредственно через окуляры микроскопа, и монохроматическим - для регистрации изображений монохромной CCD камерой. Нами предложена и опробована схема светодиодного осветителя, реализующая такое освещение без дополнительных механических узлов.

В связи с расширяющимся применением методов FISH безусловный интерес представляют флуоресцентные методы дифференциальной окраски хромосом. В ци-тогенетике человека наибольшее распространение получили АТ-специфичные флуоресцентные красители DAPI и Hoechst 33258. Димерные бис-бензимидазолы DB(8) и DB(17) в ряде случаев превосходят их в способности выявлять дифференциальную окраску хромосом человека и растений и могут быть рекомендованы для использования в цитогенетической практике.

Выводы

1. На хромосомных препаратах, полученных с применением 9-аминоакридина, количество метафазных пластинок с длинными хромосомами значительно увеличивается, и на хромосомах выявляется существенно больше дифференциально окрашиваемых районов. Только использование 9-аминоакридина позволило идентифицировать очень мелкие хромосомы льна.

2. При окрашивании ацетоорсеином хромосом растений, обработанных 9-аминоакридином, выявляется высокоразрешающий рисунок, сходный с G-окраской хромосом животных. Получаемый рисунок воспроизводим и специфичен для индивидуальных хромосом. В отличие от С-окраски, наиболее часто используемой для дифференциальной окраски хромосом растений, эта методика является более щадящей для ДНК, что открывает потенциальные возможности её применения совместно с микродиссекцией хромосом и последующим анализом полученных фрагментов ДНК.

3. Рисунки С-окрашенных хромосом растений, полученные с использованием 9-аминоакридина, достаточно воспроизводимы как для идентификации хромосом, так и для сравнительных внутривидовых и межвидовых исследований.

4. Использование 9-аминоакридина позволило провести цитогенетические исследования:

а) изучение внутригеномного полиморфизма по рисункам С- и G-подобной окрасок трёх сортов ромашки Matricaria chamomilla L.

б) сравнение по рисункам С-окраски геномов двух родственных видов льна австрийского Linum austriacum L. (2п=18) и льна крупноцветкового L. grandiflorum Desf. (2n=16).

в) изучение внутригеномного полиморфизма по рисункам С-окраски трёх образцов льна обыкновенного Linum usitatissimum L. (2п=30): льна обыкновенного ди-корастущиего, льна долгунца L usitatissimum var. usitatissimum К-603 и льна масличного L usitatissimum var. humile (Mill) K-594.

г) сравнение геномов по рисункам С-окраски трёх близкородственных видов льнов: льна обыкновенного L usitatissimum L. сорт льна-долгунца Оршанский 2 (2п=30), льна узколистного Linum angustifolium (Huds.) (2п=30) и льна двулетнего Linum bienne Mill. (2n=30), а также межвидовых гибридов: L. usitatissimum сорт Op-

шанский 2 х L bienne Mill. L. usitatissimum сорт Оршанский 2 x L. angustifohiim (Huds.).

д) кариотипирование Zingeria bieberstemiana (Claus) P. Smirnov по рисункам С- и G-подобной окрасок.

5. Предложена схема светодиодного осветителя микроскопа, позволяющая в режиме реального времени изменять спектр освещения препарата для получения максимального контраста изображения.

6. Для флуоресцентной дифференциальной окраски хромосом человека и растений предложены два новых ДНК-специфичных флуоресцентных соединения - ди-мерные бис-бензимидазолы DB(8) и DB(17). При окрашивании данными красителями хромосом человека контраст рисунка дифференциального окрашивания выше, чем при использовании DAPI и Hoechst 33258. Эти красители могут быть использованы вместо DAPI и Hoechst 33258 в стандартных методиках флуоресцентной микроскопии.

Список публикаций по теме диссертации

1. Муравенко О.В., Амосова А.В., Попов К.В., Саматадзе Т.Е., Зеленин А В. Полиморфизм гетерохроматических районов хромосом льна // Биологические мембраны. 2000. Т. 17. С. 599-603.

2. Муравенко О.В., Амосова А.В., Саматадзе Т.Е., Попов К.В., Зеленин А.В. Сравнительное исследование геномов двух видов льна по рисункам С-окраски хромосом//Генетика. 2001. Т. 37. С. 332-335.

3. Samatadze Т.Е., Muravenko O.V., Popov K.V., Zelenin A.V. Identification and comparison of C- and G-banded chromosomes of different Matricaria chamomilla L. varieties using image analysis system // Caryology. 2001. Vol. 54. P. 299-306.

4. Попов К.В., Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Амосова А.В., Зеленин А.В. Особенности изучения гетерохроматических районов в мелких хромосомах растений //Доклады академии наук. 2001. Т. 381. С. 562-565.

5. Муравенко О.В., Лемеш В.А., Саматадзе Т.Е., Амосомва А.В., Грушет-ская З.Е., Попов К.В., Семенова О.Ю., Зощук Н.В., Хотылева Л.В., Зеленин А.В. Сравнение геномов трёх близкородственных видов льна их гибридов с помощью хромосомных и молекулярных маркеров // Генетика 2003. Т. 39. С. 510-518.

6. Cremonini R., Castiglione М. R., Grif V.G., Kotseruba V.V., Punina E.O., Rodionov A.V., Muravenko O.V., Popov K.V., Samatadze Т.Е., Zelenin A.V. Chromosome Banding and DNA Methylation Patterns, Chromatin Organisation and Nuclear DNA Content in Zingeria biebersteiniana // Biologia Plantarum, 2003. Vol. 46. P. 543- 550.

7. Muravenko O.V. , Amosova A.V., Samatadze Т.Е., Popov К. V. , Poletaev A.I. , Zelenin A. V. 9-aminoacridin- an efficient reagent to improve human and plant chromosome banding patterns and to standardize chromosome image analysis // Cytometry. 2003. Vol. 51. P. 52-57.

8. Popov K.V. , Yegorov Y.E. Light-emitting diodes as a light source for brightfield microscopy // Microscopy and Analysis. 2003. Vol. 17. P. 5-7.

9 Громыко А.В., Попов К.В., Мозолева А П., Стрельцов С.А., Гроховский С.Л., Олейников В.А., Жузе А.Л. Лиганды, специфичные к определенным последовательностям пар оснований ДНК. XII. Синтез и цитологические исследования ди-мерных молекул Хёхст 33258 // Биоорган, химия. 2005. Т. 31. С. 385-393.

10. Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Попов К. В., Юркевич О. Ю., Носова И В., Большева Н. Л., Зеленин А. В. Площадь гетерохроматических районов в ядрах

и хромосомах как показатель изменчивости генома культурного льна // Биологические мембраны. 2007. Т. 24. С. 435-441.

11. Zhuze A.L., Gromyko A.V., Ivanov A.A., Salyanov V.I., Popov K.V., Koro-lev S.P., Gottikh M.B., Oleinikov V.A., Streltsov S.A. New Highly Fluorescing bisHoechsts: Physicochemical, Biochemical and Cytological Studies // The Journal of Bio-molecular Structure and Dynamics. 2007, Vol. 24. P. 666-668.

12. Попов К. В. , Егорова Е. И. , Иванов А. А., Громыко А. В. , Жузе А. Л. , Большева Н. Л. , Юркевич О. Ю. , Муравенко О. В. , Зеленин А. В. Димерные бис-бензимидазольные красители на основе Hoechst 33258 — новые ДНК-специфичные флуорохромы для цитогенетики человека и растений // Биологические мембраны. 2008. Т. 25. С. 173-180.

Заказ № 59/11/08 Подписано в печать 07 11 2008 Тираж 90 экз Уел пл 1,5

' ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20

\vw\v с/г ги ; е-таИ. ¡nfo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Попов, Константин Васильевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. История наблюдений хромосом до появления цитогенетики

1.2. Дифференциальное окрашивание хромосом.

1.3. Методы, основанные на гибридизации in situ.

1.4. Методы повышения разрешения при исследовании хромосом

1.5. Методы анализа изображений для цитогенетического анализа

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Приготовление препаратов хромосом человека

2.2. Приготовление хромосомных препаратов ирастений

2.2.1. Семенной материал

2.2.2. Проращивание семян

2.3. G-дифференциальное окрашивание препаратов хромосом человека

2.4. С-дифференциальное окрашивание препаратов хромосом растений

2.5. Окраска хромосом растений ацетоорсеином

2.6. Окрашивание препаратов флуоресцентными ДНК специфичными красителями

2.7. Регистрация изображения хромосом

2.8. Освещение препарата светодиодами

2.9. Хромосомный анализ

2.10. Анализ изображения

2.10.1. Оценка контрастности изображений хромосом, окрашенных красителем Гимзы

2.10.2. Построение профиля яркости флуоресценции вдоль хромосом

2.10.3. Сравнение скорости обесцвечивания флуоресцентных красителей

2.10.4. Оценка содержания гетерохроматина в хромосомах нескольких сортов льна

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Отработка использования интеркаляторов ДНК - этидия и 9-аминоакридина для получения препаратов с хромосомами низкой степени конденсации

3.2. Исследование кариотипов модельных объектов с использованием 9-аминоакридина

3.2.1 Сравнение рисунков С- и G-подобных окрасок хромосом в кариотипах трёх сортов ромашки аптечной

3.2.2. Сравнение кариотипов родственных видов льна австрийского и льна крупноцветкового по рисункам С-окраски

3.2.3. Сравнение рисунков С-окрашенных хромосом трёх образцов льна обыкновенного

3.2.4. Кариотипическое сравнение трех близкородственных видов льна: L. usitatissimum L. сорт льна-долгунца Оршанский 2 (2п=30), лен узколистный Linum angustifolium (Huds.) (2п=30) и лен двулетний Linum bienne Mill. (2n=30)

3.2.5. Кариотипическое исследование Zingeria biebersteiniana L.

3.3. Сравнение полиморфизма рисунков С-окраски четвёртой хромосомы льна на препаратах, приготовленных с использованием 9-аминоакридина, и четвёртой хромосомы ячменя на препаратах, приготовленных по стандартной методике с использованием колхицина

3.4. Сравнение сортов льна культурного по площади гетерохроматических районов в ядрах и хромосомах

3.5. Сравнение качества изображений дифференциально окрашенных хромосом растений, полученных при освещении препарата лампой накаливания и светодиодами

3.6. Применение ДНК-специфичных димерных бис-бензимидазольных флуорохромов для цитогенетических исследований человека и растений

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Получение G-подобного рисунка на хромосомах растений с помощью интеркаляторов ДНК

4.2. Измерение гетерохроматина

4.3. Применение светодиодов в микроскопии

4.4. Применение ДНК-специфичных димерных бис-бензимидазольных флуорохромов для цитогенетических исследований человека и растений

Введение Диссертация по биологии, на тему "Повышение разрешающей способности и информативности хромосомного анализа растений"

Цитогенетика - наука, изучающая связь структуры хромосом с функционированием генома, зародилась в конце 19-го начале 20-веков. Началом цитогенетики стало соотнесение описаний митоза с наследованием фенотипических признаков и повторное открытие законов Менделя. С момента осознания того, что хромосомы являются теми структурами, в которых сохраняется наследственная информация, интерес изучения хромосом в первую очередь связан именно с поиском отражения наблюдаемых генетических явлений на клеточном уровне.

Как и в большинстве отраслей науки, развитие цитогенетики тесно связано с методическими достижениями. Развитие хромосомного анализа шло по нескольких направлениям. Изначально, доступными для изучения были только наиболее крупные хромосомы: политенные, типа ламповых щеток, мийотические. С развитием микроскопии стали доступны для анализа митотические хромосомы; сначала наиболее крупные растительные, потом хромосомы человека, как наиболее важного объекта. Увеличение видового состава объектов, чьи хромосомы могут изучаться, улучшение визуального качества хромосомных препаратов было лишь первым этапом. Далее наступил этап целенаправленных воздействий на хромосомные препараты с целью визуализации возможно большего количества структурных и функциональных различий. Вначале это были эмпирические воздействия, приводящие к выявлению на хромосомах некоего рисунка, позволяющего повысить разрешение метода (дифференциальные окраски). Впоследствии возникли методы гибридизации in situ, впрямую связавшие хромосомный анализ и молекулярную биологию. Сила хромосомного анализа ярко проявилась в том, что он позволил составлять генетические карты, связанные с конкретными хромосомами еще до открытия того, в какой именно химической форме заключена генетическая информация.

Развитие молекулярных методов в конце 20 века не привело к исчезновению цитогенетики, напротив, с внесением методов молекулярной биологии она приобрела новое значение. Поскольку с одной стороны повысилась разрешающая способность методов, с другой стороны пришло осознание того, что для понимания функционирования генов в клетке необходимо знание не только нуклеотидной последовательности конкретного гена, но и функциональной структуры клеточного ядра в целом.

Общий объём научных работ выполненных на хромосомах животных значительно превышает число работ по изучению хромосом растений. В первую очередь это связано с приоритетным изучением хромосом человека, кроме того, существенным является наличие многих методических трудностей работы с хромосомами растений. Препараты хромосом растений труднее приготовить, так как растительные клетки защищены прочной клеточной стенкой. Препараты хромосом растений труднее изучать, так как значительное число растений, в том числе и такие хозяйственно важные как рис и лён, имеют хромосомы относительно небольшого размера, и методы дифференциальной окраски, пригодные для изучения крупных хромосом злаков, не дают достаточно информации даже для идентификации хромосом. Методы физического картирования хромосом на основе флуоресцентной гибридизации in situ в случае изучения хромосом растений работают плохо, в связи с обилием в растительном геноме разнообразных ДНК повторов.

Однако интерес к молекулярной биологии растений последнее время неуклонно возрастает. Человечество вынуждено ускорять методы селекции сельскохозяйственных растений, поскольку именно с этим связана возможность дальнейшего развития цивилизации в условиях увеличивающегося населения земли, ухудшающейся экологии и ограничения площадей, пригодных для посева. Возрастает потребность в цитогенетическом анализе растений, который стал неотъемлемой частью генетики и молекулярной биологии. С этим связано непрекращающееся совершенствование методов хромосомного анализа. Особый интерес представляет попытка расширения возможностей хромосомного анализа за счёт разработки методов анализа мелких хромосом. Очевидным путем решения этой проблемы является увеличение физического размера хромосом на препарате и применение новых методов компьютеризованного видеоанализа. Было решено попробовать уменьшить степень спирализации хромосом с помощью различных интеркаляторов, которые зарекомендовали себя в работах на хромосомах человека. Для увеличения числа видимых деталей решили повысить контрастность изображения, применяя монохроматическое освещение с помощью интерференционных светофильтров и новых сверхярких светодиодов. Помимо этого представлялось важным сделать наблюдения и исследования хромосом по возможности более объективными за счет применения цифровой техники и новых методов видеоанализа.

Большое значение флуоресцентных методов дифференциального окрашивания хромосом в современных технологиях хромосомного анализа побудило на поиски среди новых димерных бис-бензимидазолов ДНК специфичных красителей дающих более контрастный, по сравнению с красителями использующимися в настоящее время, рисунок дифференциального окрашивания.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Попов, Константин Васильевич

ВЫВОДЫ

1. На хромосомных препаратах, полученных с применением 9-аминоакридина, количество метафазных пластинок с длинными хромосомами значительно увеличивается, и на хромосомах выявляется существенно больше дифференциально окрашиваемых районов. Только использование 9-аминоакридина позволило идентифицировать очень мелкие хромосомы льна.

2. При окрашивании ацетоорсеином хромосом растений, обработанных 9-аминоакридином, выявляется высокоразрешающий рисунок, сходный с G-окраской хромосом животных. Получаемый рисунок воспроизводим и специфичен для индивидуальных хромосом. В отличие от С-окраски, наиболее часто используемой для дифференциальной окраски хромосом растений, эта методика является более щадящей для ДНК, что открывает потенциальные возможности её применения совместно с микродиссекцией хромосом и последующим анализом полученных фрагментов ДНК.

3. Рисунки С-окрашенных хромосом растений, полученные с использованием 9-аминоакридина, достаточно воспроизводимы как для идентификации хромосом, так и для сравнительных внутривидовых и межвидовых исследований.

4. Использование 9-аминоакридина позволило провести цитогенетические исследования: а) изучение внутригеномного полиморфизма по рисункам С- и G-подобной окрасок трёх сортов ромашки Matricaria chamomilla L. б) сравнение по рисункам С-окраски геномов двух родственных видов льна австрийского Linum austriacum L. (2п=18) и льна крупноцветкового L. grandiflorum Desf. (2n=16). в) изучение внутригеномного полиморфизма по рисункам С-окраски трёх образцов льна обыкновенного Linum usitatissimum L. (2п=30): льна обыкновенного дикорастущиего, льна долгунца L. usitatissimum var. usitatissimum К-603 и льна масличного L. usitatissimum var. humile (Mill) K-594. г) сравнение геномов по рисункам С-окраски трёх близкородственных видов льнов: льна обыкновенного L. usitatissimum L. сорт льна-долгунца Оршанский 2 (2п=30), льна узколистного Linum angustifolium (Huds.) (2п=30) и льна двулетнего Linum bienne Mill. (2n=30), а также межвидовых гибридов: L. usitatissimum сорт Оршанский 2x1 bienne Mill. L. usitatissimum сорт Оршанский 2 x L. angustifolium (Huds.). д) кариотипирование Zingeria biebersteiniana (Claus) P. Smirnov по рисункам С- и G-подобной окрасок.

5. Предложена схема светодиодного осветителя микроскопа, позволяющая в режиме реального времени изменять спектр освещения препарата для получения максимального контраста изображения.

6. Для флуоресцентной дифференциальной окраски хромосом человека и растений предложены два новых ДНК-специфичных флуоресцентных соединения - димерные бис-бензимидазолы DB(8) и DB(17). При окрашивании данными красителями хромосом человека контраст рисунка дифференциального окрашивания выше, чем при использовании DAPI и Hoechst 33258. Эти красители могут быть использованы вместо DAPI и Hoechst 33258 в стандартных методиках флуоресцентной микроскопии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие методов молекулярной биологии существенно расширило комплекс методических походов и инструментарий для анализа хромосом. С помощью флуоресцентной гибридизации in situ можно изучать распределение на хромосомах индивидуальных последовательностей ДНК, уникальных или повторяющихся, или сравнивать распределение большого числа последовательностей, составляющих геномы. Однако применение методов FISH для анализа видов растений с мелкими хромосомами требует решения трудностей, связанных именно с малыми размерами хромосом.

Малый размер хромосом (менее 5 мкм) и особенно малый размер сегментов рисунка дифференциальной окраски побуждает к возможно полному использованию возможностей микроскопа, ПЗС камеры и усовершенствованию методов приготовления хромосомных препаратов. Затрудняет анализ мелких хромосом и тот факт, что рисунок их С-окраски, одного из самых распространенных методов идентификации хромосом растений, состоит из очень малого числа деталей.

Основной целью нашей работы была попытка разработки такой методики приготовления препаратов хромосом, которая бы позволила получать удлиненные, по сравнению с приготовленными по стандартной методике, хромосомы. Длина хромосом на препарате зависит от стадии митоза, на которой были фиксированы клетки, из которых готовятся препараты. Чаще для получения удлинённых хромосом с низкой конденсацией добиваются синхронизации клеток, блокируя прохождение клеточного цикла в S-фазе. Снятие блока и фиксация клеток в момент прохождения ими поздней профазы и ранней метафазы позволяет получить препараты с профазными или митотическими хромосомами. Ограничением на использование данного подхода является необходимость точного знания продолжительности клеточного цикла, без чего требуется фиксировать значительное число образцов клеток через разные интервалы времени. В нашей работе мы развивали второй подход синхронизации клеток, основанный на частичном блокировании прохождения митоза. Традиционно для задержки прохождения митоза используются агенты, блокирующие образования веретена деления, однако таким образом удается получить сильно компактизованные хромосомы, что не приемлемо для мелких хромосом. Использование интеркаляторов ДНК позволяет задержать процесс компактизации хромосомы. Мы получили значительно удлинённые хромосомы на препаратах, приготовленных из клеток обработанных этидием и 9-аминоакридином. Предложенный нами 9-аминоакридин показал большую, в сравнении с этидием, эффективность в приготовлении удлинённых хромосом. Он действовал в меньших концентрациях, и после обработки им удавалось получать более контрастные, чем при действии этидия, рисунки С-окраски. Наряду с тем, что удалось контролируемо получать препараты удлиненных хромосом, обнаружилось, что на хромосомах, удлиненных под действием интеркаляторов ДНК при их окрашивании адетоорсеином, выявляется рисунок поперечной исчерченности сходный с рисунком G-окраски животных. Рисунок такой окраски содержит значительно больше деталей по сравнению с рисунком С-окраски, что открывает дополнительные возможности для идентификации гомологичных хромосом и их районов.

Однако действие интеркаляторов ДНК не приурочено к какой либо конкретной стадии митоза, как в случае ингибиторов образования веретена деления, это приводит к вариабельности длин хромосом. В связи с широким диапазоном длин хромосом возникли опасения, что использование данного метода для сравнительного анализа С-дифференциально окрашенных хромосом окажется не возможно. Для решения вопроса о границах и условиях применимости анализа хромосом удлиненных действием интеркалятора ДНК было проведена оценка связи вариабельности рисунка С-окраски с изменением длины хромосом. Традиционно вариабельность С-окраски считается очень низкой, поскольку выявляемые этим методом сегменты гетерохроматина остаются конденсированными на протяжении большей части клеточного цикла. Малые изменения степени конденсации гетерохроматина и естественная выравненность по длине метафазных хромосом объясняют высокую стабильность рисунка С-окраски. В нашей работе мы столкнулись со значительно большими различиями в размерах наблюдаемых хромосом (более чем пятикратное отличие гомологичных хромосом разной степени компактизации). Как показало исследование, даже при таком большом разбросе длины хромосом, рисунок С-окраски хорошо воспроизводится. При этом сохраняется и возможность количественного сравнения величины С-сегментов хромосом. Но поскольку на самых длинных и самых коротких хромосомах рисунок С-окраски имел заметные отличия от наблюдаемого на хромосомах средней степени компактизации следует внимательно подходить к отбору метафазных пластинок для анализа.

Можно рекомендовать во время предварительного визуального анализа, основываясь на морфологии и рисунке окраски хромосом, выбрать ту стадию конденсации хромосом, которая наиболее соответствуют конкретной задаче. Далее отбирать для анализа хромосомные пластинки соответствующие выбранной степени конденсации. Так, например, часто хромосомы из пластинок с наименьшей компактизацей не имеют видимых концов, и, в большинстве случаев, такие пластинки не стоит использовать в анализе, поскольку трудно определить фактическую длину хромосомы.

Однако в случае если интерес представляют прителомерные области, а анализ проводится с использованием методов FISH, наименее компактизованные хромосомы могут представлять больший интерес, чем среднекомпактизованные.

Корреляция содержания гетерохроматина, выявляемого С-окраской, измеряемого в препаратах интерфазных ядер и метафазных хромосомах позволяет использовать измерение площади гетерохроматина в С-окрашенных ядрах как метод экспресс оценки геномов растений. Особенно видов содержащих много мелких хромосом, анализ хромосом которых особенно труден.

Проведённые исследования ряда модельных видов подтверждают эффективность обработки 9-аминоакридином для кариологических исследований растений. Использования 9-аминоакридина впервые позволило провести кариологический анализ на основе С-окраски видов и сортов льна. Даже для видов с относительно крупными хромосомами (ромашка) использование 9-аминоакридина увеличивает информативность анализа С-окраски хромосом.

Рисунок выявляемый ацетоорсеином на хромосомах обработанных 9-аминоакридином содержит значительно больше деталей, в сравнении с рисунком С-окраски. Это позволит увеличить точность локализации нуклеотидный последовательностей методами гибридизации in situ.

Следующим направлением оптимизации анализа мелких хромосом растений является использование компьютеризированной системы регистрации и анализа хромосом. Если на этапе регистрации изображений не учтены факторы, относящиеся к выбору ПЗС камеры, её установке на микроскопе и установкам микроскопа, то получаемые изображения могут оказаться не пригодными для анализа.

Существуют возможности установки на микроскопы потребительских видеокамер и цифровых фотоаппаратов. Но для регистрации изображений мелких объектов, размеры которых находятся на пределе разрешения оптического микроскопа, рекомендуется устанавливать камеры, разработанные специально для использования в составе микроскопической установки. При разработке таких камер учитываются параметры оптической схемы микроскопа. При изготовлении используются ПЗС матрицы с лучшими электронно-оптическими характеристиками и высококачественные аналогово-цифровые преобразователи. Кроме того, потребительская видео- и фототехника рассчитана на получение цветного изображения. В большинстве случаев цветное изображение получается одной монохромной ПЗС матрицей на поверхность, которой нанесена матрица светофильтров. Над каждым светочувствительным элементов ПЗС матрицы размещён один из трёх светофильтров: красный, зелёный или синий. Значение яркости недостающих цветов в каждой точке изображения получается аппроксимацией значений в соседних элементах. Таким образом, наблюдается снижение светочувствительности камеры, поскольку через светофильтр до светочувствительного элемента доходит только часть света, и снижение оптического разрешения, поскольку реальные измерения яркости каждого цвета производятся элементами разделёнными элементами дополняющих цветов. Рекомендовать такой метод получения цветных изображений можно только для ярких объектов с относительно крупными деталями, в качестве примера такого объекта можно привести гистологические препараты, окрашенные иммунохимическими или химическими методами.

Для регистрации изображений мелких деталей изображения и объектов низкой яркости рекомендуется использовать монохромные ПЗС камеры. Для полного использования разрешающей способности микроскопа, при установке ПЗС камеры на микроскоп необходимо согласовать размер светочувствительно элемента ПЗС матрицы и оптическое увеличение микроскопа. Оптическое разрешение микроскопа в поле объекта по критерию Релея описывается формулой d=0,61*X/NA, где d минимальное разрешаемое расстояние, X длина волны света формирующего изображение, NA числовая апертура микроскопического объектива. Для того чтобы были разрешены два точечных объекта, между изображениями этих объектов на ПЗС матрице должен быть по крайней мере один светочувствительный элемент. Таким образом для того чтобы регистрировать с помощью ПЗС камеры изображения с максимально возможным пространственным разрешением микроскопа нужно, чтобы было реализовано равенство

0,61 *X/NA. 61) *Увеличение=2*размерсветочувствительногоэлемента.

Для случая формирования изображения зелёным светом с длиной волны 550 нм, использования объектива с численной апертурой 1,4 и использования ПЗС камеры с размером светочувствительного элемента 4,65 мкм оптимальным было бы примерно 40 кратное увеличение. Использование нами объективов 63Х и 100Х объясняется двумя факторами. Поскольку разрешение микроскопа определяется в первую очередь апертурой объектива, то использовались объективы с максимальной апертурой. Максимальная апертура реализуется в планапохроматических объективах двух увеличений 63Х и 100Х. Второе обстоятельство заключается в том, что, несмотря на то, что детали меньше указанного выше предела не могут быть разрешены, расстояние между такими деталями может бьггь измерено с большей точностью. Эта возможность реализуется, если дифракционная картина от источника проецируется не на единичный элемент ПЗС матрицы, а на некоторую совокупность элементов. Положение максимума дифракционной картины в этом случае устанавливается с большей точностью. Таким образом, увеличение оптической системы избыточное, с точки зрения оптического разрешения, позволяет точнее проводить измерения расстояний на препарате.

Не менее важно обеспечить правильное освещение препарата. Человеческий глаз обладает чрезвычайно широким диапазоном адаптации к различным факторам маскирующим сигнал. Человеческий глаз отличается от ПЗС камеры значительно большим динамическим диапазоном (способностью одновременно регистрировать сигналы сильно отличающиеся по яркости), возможностями коррекции неоднородности освещения и изменения восприятия цвета связанного с изменением цветовой температуры освещения. Это приводит к тому, что в случае визуального наблюдения небольшое отклонение юстировки и фокусировки микроскопа от оптимальных не значительно сказывается на качестве изображения оцениваемого визуально. Те же отклонения изменения юстировки и фокусировки способны сильно ухудшить качество изображений регистрируемых ПЗС камерой. Погрешность настройки освещения приводит к ухудшению изображения как за счёт снижения эффективной апертуры, которая определяется как среднее апертур объектива и конденсора, так и за счёт рассеянного света, снижающего контраст регистрируемого изображения.

Одно из свойств физиологии зрения таково, что визуальная оценка контраста зависит от углового размера оцениваемых деталей. Применительно к задаче определения границ сегментов дифференциально окрашенных хромосом, указываемые положение границ сегментов, определяемое визуально, будет зависеть от увеличения изображения хромосом. Исследование хромосом должно проводиться при одном и том же увеличении изображения на экране компьютера.

При выборе спектрального состава освещения препарата нужно учитывать два фактора. Для человека более комфортно наблюдение цветных изображений, без доминирования какого-либо цвета. Анализ цветных изображений не только меньше утомляет человека, но проводится человеком с большей скоростью. Регистрация изображений монохромной камерой требует использования монохроматического освещения, длина волны которого соответствует максимуму поглощения, используемого для окраски препаратов, красителя. Противоположные требования могут быть удовлетворены за счёт использования белого освещения для визуальной оценки метафазной пластинки, непосредственно через окуляры микроскопа, и монохроматического для регистрации изображений монохромной ПЗС камерой. Нами предложена и опробована схема на основе светоизлучающих диодов реализующая такое освещение без дополнительных механических узлов.

Компьютерная система анализа изображения даёт преимущества не только в оперативности простейших манипуляций с изображением (вырезание, перемещение частей изображения, изменение контраста изображения и маркирование интересующих деталей), но и возможностью значительного повышения качества изображения методами восстановления изображения. Под качеством изображения понимается снижение искажений и шумов, маскирующих объекты, повышение разрешающей способности регистрирующей системы. Наибольший интерес представляют методы восстановления изображения объединяемые под названием деконволюции. Реальный микроскоп отображает изображение точечного источника в виде размытого пятна, что является следствием дифракции и различных оптических аберраций. Функция, описывающая распределение освещенности в плоскости изображения, когда объектом является светящаяся точка, находящаяся в фокусе, называется функцией рассеяния точки (ФРТ) оптической системы. ФРТ полностью характеризует способность оптического инструмента воспроизводить изображения объектов. В случае отсутствия переменной составляющей изображения, вносимой шумами, имея изображения интересующих нас объектов и ФРТ микроскопа можно было бы достаточно просто восстановить истинное положение и форму объектов. Математическое описание этой процедуры называется деконволюцией. Деконволюция является обращением того процесса который происходит при формировании изображений объектов. Однако в реальности в регистрируемом изображении всегда присутствуют шумы, вносимые как квантовой природой света, так и свойствами регистрирующих систем. Это приводит к необходимости применения сложного математического аппарата для моделирования процессов формирования изображения и оценки качества восстанавливаемого изображения. Программные реализации алгоритмов деконволюции изображения, как правило, требуют значительных вычислительных ресурсов. Современные методы деконволюции позволяют эффективно устранять размытие изображения (вследствие дифракции, аберраций и шумов регистрирующей системы) используя только математическую модель ФРТ. В результате применения методов деконволюции микроскопических изображений разрешение в плоскости препарата может быть улучшено до 100 нм, а разрешение в направлении оптической оси микроскопа 250 нм. Без деконволюции разрешение микроскопа составляет порядка 200 нм в плоскости препарата и около 800 нм в направлении оптической оси микроскопа. Методы деконволюции могут быть применены к изображениям полученным на светлопольном или флуоресцентном микроскопах (Monier и др., 1996). Однако следует проявлять большую осторожность при применении методов деконволюции к изображениям, полученным на светлопольном микроскопе, в отличие от обработки флуоресценто-микроскопических изображений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Попов, Константин Васильевич, Москва

1. Агроскин JL С., Папаян Г. В. Цитофотометрия. Ленинград: Наука, 1977.

2. Андронова В. Л. и др. ДНК-связывающая и противовирусная активности бис-нетропсинов, содержащих кластеры остатков лизина на N-конце молекулы // ДАН, 2004. -Т. 399, С. 829-834

3. Беляев А. А. G/R-подобная дифференциальная исчерченность М-хромосомы конских бобов Vicia faba. // Цитология, 1992. Т. 34, № 10 - С. 65-68

4. Болынева Н. JL и др. Сравнение дифференциально окрашенных хромосом двух родственных форм ржи. И Генетика, 1984. Т. 20, № 12 - С. 2025-2030

5. Восток К., Самнер Э Хромосома эукариотической клетки Москва: Мир, 1981.

6. Волькенштейн М. В. Молекулярная биофизика Москва: Наука, 1975.

7. Гиндилис В. М. Митотическая спирализация хромосом и кариограмный анализа у человека // Цитология, 1966. Т. 8, № 2 - С. 144-157

8. Гриф В. Г., Агапова Н. Д. К методике описания кариотипов растений. // Бот.журнал, 1986. -Т. 71,№4-С. 550-553

9. Громыко А. В. и др. Лиганды, специфичные к определенным последовательностям пар оснований ДНК. XIII. Новые димерные молекулы Хёхста 33258 ингибиторы интегразы ВИЧ-1 in vitro // Биоорганическая химия, 2007. - Т. 33, - С. 613-623

10. Громыко А. В., Стрельцов С. А., Жузе А. Л. ДНК-специфичный димерный бисбензимидазол // Биоорганическая химия, 2004. — Т. 30, № 4 С. 446-449

11. Дарлингтон С. Д., Ла Кур Л. Ф. Хромосомы. Методы работы. Москва: Атомиздат, 1980.

12. Захаров А. Ф. и др. Хромосомы человека (Атлас). Москва: Медицина, 1982.

13. Зеленин А. В. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой Москва: Наука, 1971.

14. Зеленин А. В., Зощук Н. В. История современного хромосомного анализа. Основопологающий вклад работ Касперсона// Онтогенез, 2000. — Т. 31, № 2 — С. 152-160

15. Зощук Н. В., Бадаева Е.Д., Зеленин А. В. История хромосомного анализа // Биологические мембраны, 2001.-Т. 18,№3-С. 164-172

16. Иванов А. А. и др. Синтез и свойства ДНК-специфичного лиганда ~ симметричного димерного бисбензимидазола // Биоорганическая химия, 2008. Т. 34, № 2 - С. 285-288

17. Инге-Вечтомов С. Г. Генетика с основами селекции. М.: Высш. Шк,, 1989.

18. Кахидзе Н. Т. Строение хромосом Crepis capillaris. // ДАН, 1939. Т. 22, № 7 - С. 451 -452

19. Левицкий Г. А. Морфология хромосом и понятие "кариотипа" в систематике. // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции., 1931. — Т. 27, № 1 С. 187-240

20. Макгрегор Г., Варли Дж. Методы работы с хромосомами животных. Москва: Мир, 1986.

21. Муравенко О. В. и др. Количественный анализ хромосомного полиморфизма ячменя // Генетика, 1986.-Т. 22, № 12 С. 2831-2838

22. Муравенко О. В. и др. Формирование кариотипа у родственных сортов ячменя // Генетика, 1991.-Т. 27, № 12-С. 2109-2118

23. Навашин С. Г. Резюме возражений на доклад Л.Н.Делоне. // Журнал русского ботанического общества, 1921. 6

24. Прокофьева-Бельговская А. А. Выдающиеся советские генетики. Сборник биографических очерков. М.: Наука, 1980. - 37

25. Раскина О. М., Родионов А. В. Индуцированная холодом G/R-подобная исчерченность митотических хромосом овсянницы луговой Festuca pratensis Huds. и райграсса пастбищного Lolium perrenne L. // Цитология, 1992. Т. 34, №10 - С. 59-64

26. Родионов А. В. Эволюция дифференциальной исчерченности хромосом. // Генетика, 1999. -Т. 35,№3-С. 277-290

27. Родионов А. В., Пунина Е. О., Чупов B.C. Эволюция блочной организации хромосом растений // Биологические мембраны, 2001. Т. 18, № 3 - С. 240-248

28. Саматадзе Т. Е. и др. Изучение внутривидового полиморфизма по рисунку С-окрашивания хромосом Matricaria chamomilla L. (syn.= M.recutita L.). // Генетика, 1997. — Т. 33, № 1 С. 130-132

29. Чиряева О. Г. и др. Цитогенетическое картирование крупного рогатого скота (Bos taurus L.)//Генетика, 1989.-Т. 25, №8-С. 1436-1448

30. Элленгорн Я. Е. О различии хромосомеров у аллеломорфных спутничных хромосом Allium сера. // ДАН СССР.Нов.сер., 1940. Т. 27, № 4 - С. 357-360

31. AlInGaP II LED Lamps. Technical Data // f, 2002. 5968-7180E (10/99),

32. Arrighi F. E., Hsu Т. C. Localization of heterochromatin in human chromosomes. // Cytogenetics, 1971. -V. 10, P. 81-86

33. Arrighi F. E., Hsu Т. C. Staining constitutive heterochromatin and Gimsa crossbands of mammalian chromosomes. // Human chromosome methodology/ Yunis J. J. New York, N.Y.: Academic Press, 1974. -P. 59-71

34. Atwell G. J. и др. Potential antitumor agents. 45. Synthesis, DNA-binding interaction, and biological activity of triacridine derivatives // J.Med.Chem., 1986. V. 29, 1 - P. 69-74

35. Babu А. и др. A new approach in recognition of heterochromatic regions of human chromosomes by means of restriction endonucleases. Vol. 42. 1988. P. 60-65

36. Barrett S. D., de Carvalho C. R. A software tool to straighten curved chromosome images //37.40.41,42,43,44,45,4647,4849,50,5152,

37. Chromosome Res, 2003. V.l 1, 1 - P. 83-88

38. Bayani J., Squire J. Multi-color FISH techniques // Curr.Protoc.Cell Biol. Ontario Cancer Institute, Toronto, Canada, 2004. Chapter 22, - Unit

39. Bianchi N. О. и др. The pattern of restriction enzyme-induced banding in the chromosomes of chimpanzee, gorilla, and orangutan and its evolutionary significance. Vol. 22. 1985. P. 323333

40. Bigger T. R., Savage J. R. Mapping G-bands on human prophase chromosomes // Cytogenet Cell Genet., 1975.- 15,2-P. 112-121

41. Bou Dagher-Kharrat M. и др. Karyotype analysis reveals interspecific differentiation in the genus Cedrus despite genome size and base composition constancy. Vol. 103. 2001. P. 846854

42. Brat S. V. и др. A simplified technique for simultaneous staining of nucleolar organizer regions and kinetochores. Vol.54. 1979. P. 107-108

43. Callan H. G. Heterochromatin in Triton. // Proceeding of the Royal Society., 1942. V. 130, -324-335

44. Caspersson Т. и др. Distinction between extra G-like chromosomes by quinacrine mustard fluorescence analysis// Exp.Cell Res, 1970a. V. 63, 1 - P. 240-243

45. Caspersson Т. и др. Identification of human chromosomes by DNA-binding fluorescent agents // Chromosoma, 1970b. V. 30,2 - P. 215-227

46. Caspersson Т., de la Chapelle A., Schroder J. et al. Quinacrine fluorescence of metaphase chromosomes. // Exp.Cell Res., 1972. V. 72, - P. 56-59

47. Caspersson Т., Farber S., Foley G. E. et al. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. // Exp.Cell Res., 1968. V. 49, - P. 219-222

48. Caspersson Т., Haglund U., Lindell B. et al. Radiation-induced non-random chromosome breakage. // Exp.Cell Res., 1972. V. 75, - P. 541-543

49. Caspersson Т., Hulten M., Lindsten J. et al. Identification of different Robertsonian53.56,57.58,59.