Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация теломерной ДНК Allium fistulosum L.

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Организация теломерной ДНК Allium fistulosum L."

На правах рукописи

ФЕСЕНКО Игорь Александрович

ОРГАНИЗАЦИЯ ТЕЛОМЕРНОЙ ДНК ALLIUM FISTULOSUM L.

Специальности: 00.03.23 - биотехнология, 00.03.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева

Научный руководители:

доктор биологических наук, профессор Л.И. Хрусталева кандидат биологических наук Г.И. Карлов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Егоров Е.Е. Кандидат биологических наук Соловьев A.A.

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится " июня 2005 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д.220.043.10 при Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева по адресу. 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 49

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА.

Автореферат разослан _ ЛС&Л 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Е.А. Калашникова

Актуальность темы. Одним из основных элементов эукариотических хромосом являются теломеры, их физические окончания. Установлено, что теломеры защищают хромосомы от деградации нуклеазами и прогрессирующего укорачивания в результате незавершенной репликации в 5'-концах (Zakian, 1995). Имеются данные о важной роли теломер в коррекции спаривания гомологичных хромосом в мейозе (Heslop-Harrison et al., 1993; de Lange, 1998). Недавние исследования тонкой молекулярной структуры теломер указывают на их важную роль в процессах старения организма и пролиферации клеток (Егоров, 2001).

Теломеры большинства групп организмов представлены простыми повторяющимися GC-богатыми последовательностями ДНК (Futch et. al.,1995). Для высших растений характерен теломерный повтор - TTTAGGG (арабидопсис-тип) (Richards and Ausubel, 1988). Показано, что представители филогенетической ветви - Аспараювые, к которой относится семейство Луковые, потеряли растительный теломерный повтор и взамен, на концах хромосом, содержат характерный для позвоночных повтор - TTAGGG (Adams et. al. 2001, Sykorova et. al. 2003a). Однако, в отличие от других видов растений, у лука репчатого (Allium сера), не обнаружены ни арабидопсис-тип ни характерный для позвоночных теломерный повтор (Fuchs et. al., 1995, Sykorova et. al. 2003). Показано, что окончания хромосом лука репчатого (А сера) и лука-батуна (А ßstulosum) содержат сателлитную ДНК размером 378-380 пар нуклеотидов (Irifune et al., 1995). В настоящее время неизвестно, как луковые защищают окончания своих хромосом и какие последовательности ДНК выполняют функцию теломер. Поэтому данные о строении и природе последовательностей ДНК составляющих теломеры A. fistulosum дополнят наши знания по эволюции растительной теломеры, ее молекулярной организации и функционированию. Более того, данная работа представляет практический интерес для селекции лука репчатого, так как лук-батун (А fistulosum L) является источником хозяйственно-ценных генов, таких как, устойчивость к ржавчине (Urocystis cepulae Frost) (Jones and Mann, 1963), шейковой гнили (Botrytis squamosa Walker), луковой мухе (Hylemyia antique Bouche), корневой гнили (Phoma terrestris E. M. Hans.) (Porter & Jones, 1933), устойчивость к холоду, a также генов контролирующих высокое содержание сухого вещества (Van Der Meer and Van Benekom 1978). Данные об организации теломерной ДНК A. fistulosum L. необходимы для мониторинга и успешной интрогрессии генов в селекционных программах (Khrustaleva et al., 2005).

Цели и задачи исследования.

С целью выяснения механизма восстановления теломерных окончаний хромосом у A. fistulosum была изучена геномная организация теломерной ДНК. При этом были поставлены следующие задачи:

1. С помощью FISH и слот-блот анализа провести поиск последовательностей ДНК гомологичных теломерным повторам позвоночных и арабидопсиса.

2. Изучить организацию сателлитного теломерного повтора с помощью ПЦР, Саузерн-гибридизации и рестрикционного анализа.

3. Изучить организацию и локализацию сателлитной ДНК на митотических хромосомах и растянутой ДНК с помощью FISH анализа.

4. Определить наличие в структуре теломерных повторов микросателлитов и ретротранспозонов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые применен комплексный подход для изучения геномной организации сателлитного терминального повтора Allium fistulosum (378 п.о.), включающий набор молекулярных (ПЦР, рестрикционный анализ, Саузерн-блоттинг) и молекулярно-цитогенетических (FISH на митотическую и растянутую ДНК) методов Показано, что сателлитная ДНК A. fistulosum организована тандемно (в ориентации "голова-хвост") и содержит кластеры последовательностей ДНК с перестройками в исходном сателлитном повторе 378 п.н. Выявлено, что в области сателлитного терминального повтора присутствуют микросателлиты и ретротранспозоны

Впервые показано, отсутствие на окончаниях хромосом A fistulosum функционального теломерного повтора TTAGGG, характерного для позвоночных. Однако выявлено, что в терминальном гетерохроматине присутствуют фрагменты теломерного повтора TTAGGG.

На основе полученных данных построена модель организации ДНК терминального сателлитного повтора A. fistulosum и предложены возможные механизмы восстановления теломер у луковых.

Полученные данные по молекулярной структуре теломерных повторов у Allium fistulosum могут быть использованы для мониторинга и успешной интрогрессии генов в селекционных программах. На основании данных о нуклеотидной последовательности клонов теломерной ДНК могут быть разработаны молекулярные маркеры.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научной генетической конференции, посещенной 100-летию со дня рождения А.Р Жебрака и 701летиА* * образбвания ''кафедр генетики в Московской

сельскохозяйственной ака (емии им К А Тимирязева (2002), 4-й международной российско-иранской конференции «CeibCKoe хозяйство и природные ресурсы 2004. на научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспиранюв МСХА 2004 Публикации

По теме диссертации опубликованы 4 печатных работы Объем и с ipvKl ура шссертании

Материа 1ы диссерыции итожены на/1/^страницах машинописного текста и включает 34 рисунка и 6 и б itiu Диссертация состоит in разде юь "Введение" "Обзор литературы, "Maiepnaibi и методы'' "Результаты иссдедований'' "Объсуждение","Выводы" и "Список литературы" Список цитируемой литературы включает/^Унаименований, из ниу^^иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе был использован следующий растительный материал: лук-батун A fistulobum (2п=16), линии CGN 14763; лук репчатый А сера, сорт Jumbo (полученные из Центра генетических ресурсов, Вагенинген, Нидерланды)

Растительный материал выращивали в пленочной теплице. Семена проращивали в чашках Петри при температуре 24°С.

Получение цитологических препаратов. Цитологические препараты для флюоресцентной m situ гибридизации были приготовлены методом давления.

Выделение ДНК. ДНК выделяли из молодых листьев по методу Beinatzky и Tanksley (1986) с некоторыми модификациями

ПЦР-анализ. Для изучения структуры сателлитного повтора использовадся метод подимеразной цепной реакции (ПЦР) На основании данных о нуклеотидной последовательности сателлитного повтора лука-бадуна (Irifune et al. 1995) были подобраны и синтезированы праймеры:

34902 5'-А7 CGA ÍTCTTCGGACGGCCT-3 '

34903 5 '-ATCCGC AGGGTGC А AC ATCTGCGG-3 '.

Праймеры, обратные выше названным:

34905 5 ' - AG ATGTTGC ACCCTTCGGAT-3 '

34906 5'-TGGCCGrCCGAAGAATCGAT-3'

Для анализа также были использованы праймеры специфичные для растительного теломерного повтора:

PTEL01 5' TTI AGG GTT TAG GGT TTA GGG I ГТ AGG GTT TAG GG 3 ' PTEL02 5' CCC TAA ACC CI А AAC CCT AAA CCC TAA ACC СТА AA 3'

Праймеры, специфичные для теломерного повтора млекопитающих: HTEL01 5' ТТА GGG ТТА GGG ТТА GGG ТТА GGG ТТА GGG 3' HTEL02 5' ССС ТАА ССС ТАА ССС ТАА ССС ТАА ССС ТАА 3'

Амплификацию проводили на амптификаторе "Терцик'' ("ДНК-технология", Москва)

Продукты ПЦР разделяти в 1,5% агарозном геле с буфером TBE при напряженности поля 6 V/cm В качестве маркера размеров использовали "100 bp leader" (Fermentas).

Гибридизация по Саузерну. После электрофореза ДНК переносили на мембрану Immobilon-N (Millipore, USA) с помощью вакуумного насоса (Millipore, USA) В качестве метки использовали зонды, меченные biotin-11-dUTP ССинтол', Москва), потученные методом ПЦР. Детекцию проводити с помощью щелочной фосфатазы, ковалентно связанной со стрептавидином

Флюоресцентная in situ гибридизация. Флюоресцентную /и s itu гибридизацию проводили как описано (Khrustaleva & Kik, 1998). Зонды, меченные биотином и дигоксигенином, получали с помощью ПЦР. Смесь для мечения биотином была получена коммерчески и содержала Bio-lld-UTP ("Синтол", Москва). Для детекции биотина использовали систему стрептавидин-антистрептавидин с красителем СуЗ (Vector Laboratories, Burlingame, Cal , U S.A ) Дигоксигенин детектировали с помощью системы ЫТС-антидигоксигенин (Boehringer, Mannenheim, Germany). Хромосомы окрашивали с 6 мг/мл DAPI в Vectashield Анализ FISH-сигнала был проведен на флуоресцентном микроскопе "Axiophot" ("Zeiss", Германия) с соответствующей системой фильтров. Для анализа изображений, производили фотосъемку на пленку Fuji 400. После проявки пленку сканировали в компьютер и обрабатывали изображение, используя программу Photoshop 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Геномная организация сагеллитной ДНК

1.1 ПЦР анализ с праймерами на сателлитный повтор

Для ПЦР-анализа были использованы две пары праймеров: первая пара праймеров 34902 и 34903 в прямой ориентации и вторая пара праймеров 34905 и 34906 в обратной ориентации. При этом праймер 34902 был комплиментарен 34906, а праймер 34903 комплиментарен 34905.

При проведении ПЦР с праймерами 34902 и 34903 амплифицировали два фрагмента ДНК размером 378 и 760 п н., что соответствует длине теломерного повтора. При использовании только одного праймера 34902 происходила амплификация сдвоенных фрагментов длиной от 195 до 1040 п.н. (рис. 1-1) Амплификация таких фрагментов ДНК показывала некоторую периодичность с шагом 380-400 п н При одностороннем ПЦР с праймером 34903 амплифицировалась лестница фрагментов являющихся мультимерами фрагмента 395 п.н. (рис. 1-2) При использовании праймера 34903 в обратной ориентации (праймер 34905) также амплифицировалась лестница фрагментов с шагом в 400 п.н. (рис. 1-3). При ПЦР с праймером 34906, амплифицировалась лестница фрагментов, начиная с фрагмента, размером 400 п.н (рис. 1-4).

Для оценки степени гомологии между полученными фрагментами и сателлит ной ДПК 378 п.н , была использована гибридизация по Cay зерну Было выявлено, что полученные при односторонней амплификации фрагменты ДНК проявляют гомологию к сателлитному повтору и, по-видимому, являются результатом пересгроек в тандемном сателлитном повторе Следует отметить, что размеры ПЦР-продуктов, образующихся при амплификации с одним из теломерных праймеров, практически во всех случаях (за исключением праймера 34903) были меньше исходной единицы повтора.

Рис. 1. Результаты одностороннего ПЦР с сателлитными праймерами.

1 - праймер 34902, 2 - праймер 34903, 3 - праймер 34905, 4 - праймер 34906, М - маркер

Такие данные говорят о том, что перестройки в течо.мерных peí ионах A ßstulosum не являются результатом образования в структуре тандемного теломерною повтора участков с организацией единиц повтора в ориентации голова-к-готове и хвост-к-хвосту, как это было описано Вершининым с соавторами на ржи (Vershinin et al.,1995).

1.2 Рестрикционный анализ

Дтя более дсчального и ¡учения пересфоек в сагеллитном повторе был проведен рестрикционный анализ трех фра1 ментов- 395 п н - продукт праймера 34903, 195 пн - продукт праймера 34902 и 378 пн - исходной постедова!ельности Фрагменты были обрабо1аны восемью рестриктазачи (Bam HI, EcoRI, EcoRV, Нае III, llindlli, Pst I, Taq I, HincII) Бьпо установлено, что перестройка, приведшая к образованию последовательности 395 п н moi ia реализоваться вследствие инверсии участка содержащего сайт для праймера 34903 (Рис. 2). Причем такая перестройка, по-видимому, возникла непосредственно в тандеме, о чем говорят данные ПЦР.

395 п н

праймер 34902 <5=3 праймер 34903

^ место инверсии

Рис. 2. Модель инверсии, которая может приводить к получению продукта праймера 34903 размером 395 п.н

При амплификации с праймером 34905 были получены фрагменты 180, 560, 940 п.н. и выше. Исходя из предложенной выше модели инверсии сайта содержащего праймер 34903, ожидаемый ПЦР продукт от обратного к нему праймера 34905 должен составить 400 п н Амплификация фрагмента меньших размеров (180 п.н) может свидетельствовать о наличии наряду с инверсией

также делеции Рестрикционный анализ с Нае III, Hmc II, EcoRV, Taql показал, что делеция произошла в области близкой к сайту инверсии (рис. 3).

^za

395 пн 378 п н

180 п н

(щ праймер 34905

^ праймер 34903

<rrj праймер 34902

^^ место инверсии

место возможной делеции

Рис.3 Модель перестроек в сателлигном повторе, приводящих к амплификации продуктов П1ДР с праймером 34905

Для проверки степени гомологии ПЦР продуктов с обратными праймерами к исходной теломерной последовательности была использована Саузерн-гибридизация с ДНК-зондом 378 п н Обнаружена сильная гибридизация со всеми продуктами ПНР Такие данные показывают, чю продукты перестроек в сателлитном повторе, происходят внутри единиц этого повтора или между ними. Полученные продукты ПЦР с одним праймером указывают, что перестройки сателлит ной ДНК, такие как делеции, инсерции и инверсии происходили довольно часто.

1 3 Гибридизация in situ на растянутую ДНК A Fistulosum Для и ¡учения 1еномной организации сателлитной ДНК была использована флюоресцентная in situ гибридизация на растянутую ДНК A fistulosum, в качестве пробы был использован сателлитный повтор, полученный с помощью праймеров 34902 и 34903

Метод растянутой ДНК позволяет визуализировать отдельные молекулы ДНК, растянутые на стекле. Такой метод дает возможность изучать организацию сателлитного повтора на отдельных молекулах ДНК. При гибридизации сателлитного повтора 378 п.н. на растянутую ДНК был получен прерывистый сигнал указывающий на возможное наличие вставок несателлитной ДНК в теломерный повтор (рис.4).

Рис. 4. Флуоресцентная m situ гибридизация метки 378 п н на растянутую ДНК A fistulonm

Стрелками показаны места возможных вставок несателлитной ДНК.

1.4 ПЦР анализ несателлитной ДНК

Анализ организации сателлитной ДНК на уровне отдельных молекул показал наличие несателлитной ДНК в теломерном районе. Было предположено, что участки между сайтами гибридизации представляют собой микросагеллиты и/или ретротранспозоны. Для проверки этой гипотезы был проведен ПЦР с использованием праймеров 34902, 34903, 34905, 34906 с праймерами на межмикросателлитные последовательности и фрагмент обратной транскриптазы ретротранспозона Ту 1-copia (Prl и Рг2)

При использовании микросагеллитного лраймера (GA)8 YC и праймеров на сателлитный повтор были получены дополнительные фрагменты с праймерами 34905 и 34902. Размер получившихся фрагментов составил около 175 п.н (праймер 34902) и 160 п.н. (праймер 34905). Поскольку такие микросателлитные мотивы отсутствуют в нуклеотидной последовательности сателлитного повтора 378 п.н (Irifune et al, 1995), такие результаты лишь под1вердили нашу гипотезу о том, что получившиеся ПЦР-продукты результат перестроек в сателлитном повторе.

При изучении возможного присутствия ретротранснозонов в терминальном гетерохроматине был использован ПЦР с сателлитными праймерами и праймерами на фрагмент обратной транскриптазы ретротранспозона Tyl-copia (Prl и Рг2). Был обнаружен дополнительный фрагмент размером 120 п.н. при ПЦР с сателлитными праймерами 34905 и Рг2 (рис.5а). При Саузерн-гибридизации с ПЦР-продуктами, где в качестве зонда использовалась теломерная последовательность 378 п.н., сигнал не детектировался на фрагменте 120 п н (рис. 5в).

Рис. 51 Результаты ПЦР с сателлитным праймером 34905 и

ретротранспозонным праймером Рг2. А - 1 - праймер 34905, 2 - праймер 34905 и Рг2, 3 -маркерразмера Б -2 Саузерн-гибридизация теюмерной поаедовательности 378 пн на ПЦР-продукты праймеров 34905 и PR2 I - праймер 34905, 2 - праймер 34905 и Рг2, 3 - сателлитный повтор 378 п н Стречкой показан фрагмент, стабо гибридизукпцийся с теломерным повтором

При гибридизации этого фрагмента на рестрицированную геномную ДНК Afistulosum и ПЦР-продукт 378 п.н наблюдалась очень слабая гибридизация на ПЦР-продукт и часть высокомолекулярной геномной ДНК. У А сера были обнаружены в теломерных окончаниях хромосом последовательности гомологичные к транспозонам (Pich et al, 1998) Данные, полеченные Pich et.al (1998) и наши результаты говорят о возможной роли мобильных элементов в формировании теломер у Луковых.

2. Изучение локализации продуктов амплификации на хромосомах А. fistulosum.

Для изучения локализации теломерного повтора и продуктов его амплификации на хромосомах мы использовали флуоресцентную in situ гибридизацию. Дополнительный фрагмент ДНК, полученный в результате амплификации с сателлитным праймером и микросателлитным праймером (GA)8 YC был помечен и гибридизован на хромосомы А fistulosum. При гибридизации был получен четкий сигнал на теломерах, в нескольких прицентромерных и интерстициальных сайтах (рис.7).

Рис 6 Результаты т situ гибридизации ПЦР-продукта праймеров 34902 и GA8YC на хромосомах A fistulosum.

Продукт амплификации между сателлитным праймером 34905 и ретротранспозонным Рг2 также был гибридизован на хромосомы А fistulosum По данным FISH сигнал преимущественно локализовался в теломерной части. Также наблюдали слабый сшнал, распределенный по всей хромосоме Так как данный продукт не имеет гомологию с теломерной последовательностью 378 п.н, то видимо он гибридизуется на другие участки теломерного гетерохроматина Поскольку мы получили лостаточно сильный сигнал из теломерной области, то можно сделать вывод о присутствии в данной области множества участков для гибридизации этой последовательности, что свидетельствует в пользу того, что данный продукт не является результатом уникальной вставки. Также, были локализованы продукты амплификации праймера 34902 и продукт амплификации праймера 34903 размером 395 п.н. В первом случае мы получили четкий теломерный сигнал, говорящий о том, что продукты амплификации результа! перестроек в тандемном сателлитном повторе 378 п.н Фрагмент 395 п.н. локализовался в теломерной области и в нескольких интерстициальных сайтах (рис. 7).

Рис. 7 Результаты in situ гибридизации продукта ПЦР с праймером 34903 (395 п.н.) на хромосомы A flstilosum

В результате проведенных исследований была построена модель организации сателлитного повтора в терминальном гетерохроматине A fistulosum_(рис. 8).

Несателлитная ДНК (микросателлиты, ретротранспозоны)

Рис. 8 Модель организации сателлитного повтора в терминальном гетерохроматине A fistulosum.

Перестройки в сателлитном повторе

3. Слот-блот анализ геномной ДНК A. fistulosum с теломерным повтором позвоночных -TTAGGG

Для некоторых представителей Аспараговых, таких как Aloe, Hyacinthella, Othocalis siberica было показано наличие теломерных повторов, характерных для позвоночных (Weiss-Schneeweiss et. al. 2004, Weisss and Scherthan 2002) Для анализа генома A fistulosum на наличие теломерных повторов, характерных для позвоночных был использован метод слот-блот гибридизации и флуоресцентной in situ гибридизации. Однако и слот-блот анализ и флуоресцентная in situ гибридизация не показали наличия этих последовательностей в геноме A fistulosum. Такие данные соответствуют результатам, которые получила Sykorova и др. (2003 а) при изучении А сера, в геноме которого не было обнаружено теломерных повторов TTAGGG (характерного для позвоночных), а также TTAGG (характерного для насекомых), TTTTAGGG (характерного для водорослей), TTTTGGGG и TTGGGG (характерных для простейших) (Sykorova et. al., 2003 а). Таким образом, оба близких вида из семейства Луковых показывают отсутствие в геноме теломерных повторов тех типов, которые были обнаружены у высших растений - арабидопсис-тип и повтор, характерных для позвоночных

4. ПЦР анализ геномной ДНК с праймерами на теломерный повтор TTAGGG и TTTAGGG

Дтя детального анализа наличия в геномах А сера и 4 fistulosum нуклеождных послелопатетьностей тетомерных повторов обоих типов испо пловали праймсры, обозначенные как PTelol и PTelo2, i ибридиз) ющиеся с теломерным повтором арабидопсис-типа и HTelol и НТе!о2, гибридиз\юшиеся с теломерным повтором, характерных д 1я позвоночных ПЦР с праймерами, специфичными для теломерного повтора, характерного лтя позвоночных, показал наличие последовательностей ДНК специфичных дтя лою повтора в геномах А сера и A fistulosum При проветении ПЦР амп жфицировалось пескотько че1ких фрагментов и прожженные шмеры (Рис 9) При этом размеры амплифицированных фрагментов ДНК различались у обоих видов и обнаруживали схожесть только при ПЦР с праймером HTelo 2 При повышении температуры отжига до 70°С не происходило изменение размеров продуктов амплификации, что указывает на высокую степень гомологии между праймерами и сайтами посадки праймеров. Поскольку сло1-блот гибридизация и in situ гибридизация не показала наличие в геномах обоих видов Луковых какого-либо значительного количества нуклеотидных последовательностей теломерных повторов обоих типов, амплификация, по-

видимому, происходит от разбросанных по геному, коротких участков теломерного повтора.

1 2 3 4 М

Рис. 9 Результаты ПЦР с праймерами, специфичными на теломерный повтор

позвоночных (HTelol и НТе1о2). Дорожки I и 2 амплификация с праймерами HTelol и HTelo2 соответственно, на ДНК А сера

Дорожки 3 и 4 амтификш/ия с праймерами HTelol и HTelol соответственно, на ДНК A fistulosum М - маркер размеров

Поскольку, при ПЦР образовывались в основном фрагменты ДНК варьирующей длины, наличие в геноме инвертированных участков, приводящих к амплификации фрагментов ДНК определенного размера очень мало.

5. Локализация продуктов амплификации праймеров HTelol и НТ1ео2 на хромосомах A. flstulosum.

Для изучения локализации продуктов ПЦР с теломерными праймерами HTelol и НТе1о2 была использована флюоресцентная in situ гибридизация. С этой целью меченые продукты ПЦР гибридизовались на хромосомы A fistulousum. Продукты амплификации праймера HTelol показали теломерную локализацию на некоторых, но не всех хромосомах A fistulousum (рис. 10) Такие данные позволяют сделать предположение, что на окончаниях хромосом присутствуют остатки теломерною повтора TTAGGG Таким образом, у Луковых могло произойти замещение предкового повтора арабадопсис-гипа на повтор, характерный для позвоночных.

Рис 10. Результаты флуоресцентной in situ гибридизации продуктов ПЦР праймера HTelol на хромосомы A fistulousum

Однако в процессе эволюции произошла утрата и этого повтора. Остатки этого повтора могли послужить сайтами посадки для праймеров и амплифицировать последовательность, заместившую теломерный повтор ТТАССв (рис.11). Подтверждением этой гипотезы может служить отсутствие сигнала при гибридизации продуктов ПЦР праймера НТе1о2. Связано это с тем, что праймер НГе1о! удлиняется по направлению к теломере, таким образом, позволяя амплифицировать тот повтор, который, возможно, заместил теломерный повтор П АССв

HTelol

ААТСССААТСССААТСССААТI

TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA

теломера

HTelo2

Рис. 11 Модель амплификации повтора, заместившего теломерный повтор ТТАОСО.

Возможно, в процессе эволюции у Луковых произошла потеря теломерного повтора и функцию защиты теломер стал выполнять сателлитный повтор, обогащенный ретротранспозонными последовательностями. Также, возможно, что произошло замещение этого повтора на другой, неизвестный для других групп организмов.

выводы

1. Сателлитная ДНК в терминальном гетерохроматине А рштйотт организована тандемно (в ориентации "голова-хвост") и содержит кластеры последовательностей ДНК с перестройками в исходном теломерном повторе 378 п.н. Перестройки являются частями единицы сателлитного повтора и образуются в результате инверсий и делеций в структуре повтора.

» 2. Продукты перестроек в сателлитном повторе локализуются в

терминальном гетерохроматине всех 16 теломер и в интерстициальных участках на некоторых хромосомах.

3. Установлено наличие микросателлитов и ретротранспозонов в терминальном сателлитном повторе А А.чшклит.

4. На окончаниях хромосом А АъшЬьит отсутствует функциональный теломерный повтор ТТАСОО, характерный для позвоночных, однако, выявлены отдельные фрагменты этого повтора в теломерной ДНК, что указывает на его наличие у предка современных луковых.

5. Построена модель геномной организации теломерного повтора на основании которой предлагается возможный механизм восстановления теломерных окончаний хромосом у А /гзшЬяит: функции защиты теломер может выполнять сатедлитный повтор, обогащенный ретротранспозонными последовательностями.

4

у

Список опубликованных работ по материалам диссертации

1. G.I.Karlov, G.N.Andreeva, I.A.' Fesenko, L.I. Khrustaleva. Charactenzation and chromosome location of Ту 1-copia group retretransposons in some Alliaceae, Liliaceae and Iridaceae species (Характеристика и локализация на хромосомах Ту 1-copia ретротранспозонов у некоторых представителей Alliaceae, Liliaceae и Iridaceae) // Cytogenetics and Cell Genetics, v.85, 1-2., 1999. P.135

2. Карлов Г.И., Фесенко И.А., Андреева Г.Н., Тикунов Ю.М., Хрусталева Л.И. Изучение физической организации Tyl-cjpia и Ty3-gypsy подобных ретротранспозонов в геноме томата, лука, тюльпана и крокуса // Материалы науч. конф., посвященной 100-летию со дня рождения АР. Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева - М.: Изд-во МСХА, 2002. - С. 136

3. З.Фесенко И.А., Хрусталева Л.И., Карлов Г.И. Использование оптического картирования для изучения структуры генома лука-батуна // Материалы науч. конф., посвященной 100-летию со дня рождения А.Р Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева - М.: Изд-во МСХА, 2002. - С. 336-337

4. Фесенко И.А., Хрусталева Л.И. и Карлов Г.И Изучение организации сателлитного повтора 378 п н. в терминальном гетерохроматине Allium fistulosum // Генетика, 2002, том 38, №7 - С. 894-903

Объем 1,0 печ л Зак. 304. Тираж 100 экз

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО МСХА им. К А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

»- 9 6 25

РНБ Русский фонд

20064 14662

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фесенко, Игорь Александрович

Список иллюстраций.

1. Актуальность проблемы.

2. Цели и задачи работы.

3. Научная новизна.

4. Обзор литературы.

4.1. Теломеры и их функция.

4.2. Молекулярная организация теломерного повтора.

4.3. Белки, связывающиеся с теломерами.

4.4. Роль теломеразы в восстановлении теломерных последовательностей.

4.5. Альтернативные механизмы поддержания структуры теломер.

4.6. Структура теломер в онтогенезе растений.

4.7. Молекулярная организация субтеломерных повторов.

4.8. Особенности организации теломерной ДНК у

Аспараговых (Asparagacea).

4.9. Особенности организации генома Луковых.

4.9.1. Ботаническая характеристика лука-батуна (Л. fistulosum).

4.9.2. Практическая ценность использования Л. fistulosum в селекции лука репчатого.

4.9.3. Молекулярно-генетическая и цитогенетическая характеристика A. fistulosum.

4.10. Особенности молекулярной организации теломер у Allium.

5. Материалы и методы.

5.1. Растительный материал.

5.2. Получение цитологических препаратов.

5.3. Выделение ДНК.

5.4. ПЦР-анализ.

5.5. Гибридизация по Саузерну.

5.6. Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH) и получение растянутой ДНК.

6. Результаты исследований.

6.1. Геномная организация сателлитной ДНК.

6.1.1. ПЦР анализ с праймерами на сателлитный повтор.

6.1.2. Саузерн-гибридизация продуктов амплификации праймеров 34902 и 34903.

6.1.3. Рестрикционный анализ.

6.1.4. Саузерн-гибридизация продуктов амплификации праймеров 34905 и 34906.

6.1.5. Саузерн-гибридизация с геномной ДНК A. fistulosum.

6.1.6. Гибридизация in situ на растянутую ДНК A. fistulosum.

6.1.7. ПЦР анализ несателлитной ДНК.

6.1.8. Саузерн-гибридизация с ПЦР-продуктами праймеров 34905 и PR2.

6.2. Изучение локализации продуктов амплификации на хромосомах A. fistulosum.

6.3. Слот-блот анализ геномной ДНК A. fistulosum с меченным теломерным повтором -TTAGGG.

6.4. ПЦР анализ геномной ДНК с праймерами на теломерный повтор TTAGGG и TTTAGGG.

6.5. Локализация продуктов амплификации праймеров HTelol и НТ1ео2 на хромосомах A. fistulosum.

6.6. Сиквенирование продуктов ПЦР праймеров HTelol и НТе1о2.

7. Обсуждение.

7.1. Негомологичная рекомбинация в сателлитном повторе -механизм восстановления теломеры.

7.2. Дрозофила-подобный механизм восстановления теломер.

7.3. Восстановление теломер с помощью теломеразы.

8. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Организация теломерной ДНК Allium fistulosum L."

-6 1. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Одним теломеры из основных элементов эукариотических от деградации в результате хромосом и являются теломеры, их физические окончания. Установлено, что защищают хромосомы нуклеазами прогрессирующего укорачивания незавершенной репликации в 5-концах (Zakian, 1995). Имеются данные о важной роли теломер в коррекции спаривания гомологичных хромосом в мейозе (Heslop-Harrison et al.,1993; de Lange, 1998). Недавние исследования тонкой молекулярной структуры теломер указывают на их важную роль в процессах старения организма и пролиферации клеток (Егоров, 2001). Теломеры большинства групп организмов представлены простыми повторяющимися GC-богатыми последовательностями ДНК (Futch et. al.,1995). Для высших растений характерен теломерный повтор TTTAGGG (арабидопсис-тип) (Richards and Ausubel, 1988). Показано, что представители филогенетической ветви Аспараговые, к которой относится семейство Луковые, потеряли растительный теломерный повтор и взамен, на концах хромосом, содержат характерный для позвоночных повтор TTAGGG (Adams et. al. 2001, Sykorova et. al. 2003a). Однако, в отличие от других видов растений, у лука репчатого {Allium сера), не обнаружены ни арабидопсис-тип ни характерный для позвоночных теломерный повтор (Fuchs et. al., 1995, Sykorova et. al. 2003). Показано, что окончания хромосом лука репчатого {А. сера) и лука-батуна {А. fistulosum) содержат сателлитную ДНК размером 378-380 пар нуклеотидов (Irifune et al.,1995). В настоящее время неизвестно, как Луковые защищают окончания своих хромосом и какие последовательности ДНК выполняют функцию теломер. Поэтому данные о строении и природе последовательностей ДНК составляющих теломеры А. fistulosum дополнят наши знания по эволюции растительной теломеры, ее молекулярной организации и функционированию. Более того, данная работа представляет практический интерес для селекции лука репчатого, так как лук-батун (А. fistulosum L) является источником хозяйственно-ценных генов, таких как, устойчивость к ржавчине {Urocystis cepulae Frost), (Jones and Mann, 1963), шейковой гнили {Botrytis squamosa Walker), луковой мухе (Hylemyia antique Bouche), корневой гнили {Phoma terrestris E. M. Hans.), (Porter Jones, 1933), устойчивость к холоду, a также генов контролирующих высокое содержание сухого вещества (Van Der Meer and Van Benekom 1978). Данные об организации теломерной ДНК А. fistulosum L, необходимы для мониторинга и успешной интрогрессии генов в селекционных программах (Khrustaleva et al., 2005).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Фесенко, Игорь Александрович

1. Сателлитная ДНК в терминальном гетерохроматине А. fistulosum организована тандемно (в ориентации "голова-хвост") и содержит кластеры последовательностей ДНК с перестройками в исходном теломерном повторе 378 п.н. Перестройки являются частями единицы сателлитного повтора и образуются в результате инверсий и делеций в структуре повтора.2. Продукты перестроек в сателлитном повторе локализуются в терминальном гетерохроматине всех 16 теломер и в интерстициальных участках на некоторых хромосомах.3. Установлено наличие микросателлитов и ретротранспозонов в терминальном сателлитном повторе А. fistulosum.4. На окончаниях хромосом А. fistulosum отсутствует функциональный теломерный повтор TTAGGG, характерный для позвоночных и аспараговых, однако, выявлены отдельные фрагменты этого повтора в теломерной ДНК, что, предположительно, указывает на его наличие у предка современных Луковых.5. Построена модель геномной организации теломерного повтора на основании которой предлагается возможный механизм восстановления теломерных окончаний хромосом у А. fistulosum: функции защиты теломер может выполнять сателлитный повтор, обогащенный ретротранспозонными последовательностями.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фесенко, Игорь Александрович, Москва

1. Георгиев П. Г., Мельникова Л. С Канн Т. Г., Кравчук О. И., Михайловский С Савицкий М.Ю. Различные механизмы регуляции длины теломер Молекулярная биология 34, №5, 743 (2000)

2. Гневышев Н.М. "Лук-батун", Лениздат, 1978

3. Егоров Е.Е, Е. Теломеры, И. теломерная "Многолетние ДНК, хромосомы. Москва Биологичесие мембраны 18, №3, 249 (2001)

4. Луконина луки", "Росагропром", 1990

5. Фесенко И.А., Хрусталева Л,И. и Карлов Г.И. Изучение организации сателлитного повтора 378 п.н. в терминальном гетерохроматине Allium fistulosum. (2002)

6. Adams S.P., Hartman T.P.V., Lim K.Y., Chase M.W., Bennett M.D., Leitch I.J. and Leitch A.R. Loss and recovery of Arabidopsis-type telomere repeat sequences 5-(TTTAGGG)n-3 in the evolution of a major radiation of flowering plants, Proc. R. Soc. Lond. B268, 1541 (2001)

7. Allshire R.C., Dempster M., Hastie N.D. Human telomeres contain at least three types of G-rich repeat distributed nonrandomly. Nucleic Acid. Res. 17, 4611 (1989)

8. Barnes S. R., James A. M., Jamiesson G. The organization, nucleotide sequence, and chromosomal distribution of a satellite DNA from Л. сера. Chromosoma 92, 185 (1985)

9. Bailey S.M., Meyne J., Chen D.J., Kurimasa A., Li. G.C., Lehnert B.E. and Goodwin E.H. DNA double-strand break Генетика 38: 7, 893

10. Baumann P. and Cech T.R. Potl, the putative telomere end(2001)

11. Baumann P., Podell E, and Cech T.R. (protection (2002) 12.

12. Bernatzky R,, Tanksley S. D. Genetics of actin-related Biessmann H. et.al. Addition of telomere-associated HeT DNA sequences "heals" broken chromosome ends in Drosophila. Cell 61, 663 (1990) 14.

13. Biessmann H. Mason J. M. Genetics and molecular Blackburn E.H. and Gall J.G. A tandemly repeated biology of telomeres. Adv. Genet. 30, 185 (1992) sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena. J. Mol. Biol., 120, 33 (1978)

14. Blasco M. A., Funk W., Villeponteau В., Greider C. W. Functional characterization and developmental regulation of mouse telomerase RNA. Science 269, 1276 (1995)

15. Bodnar A. G. et.al. Extension of the life span by introduction of telomerase into normal human cells. Science 279, 349 (1998)

16. Broun P., Ganal M. W., Tanskley S. D. Telomeric arrays display high levels of heritable polymorphism among closely sequence in tomato. Theor. Appl. Genet. 72, 314 (1986) of telomeres) protein: Human Potl gene Cytolocalization, binding protein in fission yeast and humans. Science 292, 1171 structure, and alternative splicing. Mol. Cell. Biol. 22, 8079

17. Bryan T.M., et. al. Telomere elongation in immortal human (1995)

18. Bryan T.M., et. al. Evidence for an alternative mechanism for maintaining telomere length in human tumors and tumorderived cell lines. Nat. Med. 3(11), 1271 (1997a)

19. Bryan T.M., et. al. The telomere lengthening mechanism in telomerase-negative immortal human cells does not involve the telomerase RNA subunit. Hum. Mol. Genet. 6(6), 921 (1997b)

20. Cesare A.J,, Quinney N., Wilcox S., Subramanian D. and Griffith J.D. Telomere looping in P. sativum (common garden pea). Plant J., 36, 271 (2003)

22. Chen С М Wang C.T. and Ho C.H. A plant gene S. M. and Туе В.-К. Organization of DNA sequences and replication origins at yeast telomeres. Cell 33, cells without detectable telomerase activity. EMBO J. 14, 4240 encoding a Myb-like protein that binds telomeric GGTTTAG repeats in vitro. J. Biol. Chem. 276, 16511 (2001)

23. Collins K. and Gandhi L. The reverse transcriptase component of the Tetrahymena telomerase ribonucleoprotein complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8485 (1998)

24. Concoran L. M., Thompson J. S., Walliker D., Kemp D. J. Homologous recombination within subtelomeric repeat sequences generates chromosome size polymorphisms in P. falciparum Cell 53, 807 (1988)

25. Сооке Н. J. and Smith В. А. Variability at the telomeres of Symp. Quant. Biol. 61, 213 (1986) the human X Y pseudoautosomal region. Cold Spring Harb.

26. Cohn M., McEachern M.J., and Blackburn E.H. Telomeric Curr, sequence diversity within the genus Saccharomyces. Genet.33, 83 (1998)

27. Conrad M. N., Wright J. H., Wolf A. J., Zakian V. A. RAPl protein interacts alters with yeast telomeres and. in vivo: overproduction 30. telomere structure descreases chromosome stability. Cell 63, 739 (1990) Croft J., Bridger J., Boyle S., Perry P., Teague P. and Bickmore W.A. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. J. Cell Biol, 145, 1119 (1999)

28. Currah L. and Maude R. B. Laboratory tests for leaf squamosa in onions. Ann. Appl. Biol. Maude R.B. Breeding for Symp., 105, 277 (1984)

29. Dunham M.A. et. al. Telomere maintenance by recombination in human cells. Nat. Genet. 26, 447 (2000) Emsweller S.L. Jones H.A. An interspecific hybrid in Allium. Hilgardia 9, 265 (1935) 38. Fay M.F. et. al. Phylogenetic studies of Asparagales based on four plastid DNA regions. In Monocots: systematic evolution and (ed. Wilson K.L. Morrison D.A.), Melbourne: CSIRO, 360 (2000)

30. Fajkus J., Kovarik A., Kralovics R. and Bezdek M. Organization of telomeric and subtelomeric chromatin in the higher plant Nicotiana (1995) 40.

31. Fajkus J., Kovarik A. and Kralovics R. Telomerase activity in plant cells. FEBS Lett. 391, 307 (1996) Fitzgerald M.S., McKnight T.D. and Shippen D.E, Characterization and developmental patterns of telomerase expression in plants, Proc, Natl. Acad, Sci, USA93, 14422 (1996)

32. Fitzgerald M.S., Riha K., Gao F., Ren S., McKnight T.D. catalytic and Shippen D.E. Disruption of the telomerase tabacum. Mol. Gen. Genet,, 247, 633 subunit gene from Arabidopsis inactivates telomerase and leads to a slow loss of telomeric DNA. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 96, 14813 (1999)

33. Fitzgerald M.S. Sharicov E.V., Hood E.E., McKnight T.D., Shippen D.E. Different modes of de novo telomere rormation by plant telomerase. The Plant Journal 26(1), 77 (2001)

34. Flavell R. В., Rimpau J., Smith D. В. Repeated sequence (1977) relationship in four cereals genome. Chromosoma 63, 205 45.

35. Feng J. et.al. The RNA component of human telomerase. Science 269, 1236 (1995) Ferguson B. M. and Fangman W. L, A position effect on the (1992)

36. Fuchs J., Brandes A., Schubert I. Telomere sequences localization and karyotype evolution in higher plants. Plant Syst. Evol. 196, 227 (1995)

37. Funabiki H., Hagan I., Uzawa S,, Yanagida M. Cell cycledependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast. J. Cell Biol. 121, 961 (1993)

38. Fussel C. P. The position of interfase chromosomes and late time of replication origin activation in yeast. Cell 68, 333 replicating DNA in centromere and telomere regions of Allium сера. Chromosoma 50, 201 (1975)

39. Ganal M. W., Lapitan N. L. V., Tanksley S. D. Macrostructure of the tomato telomeres. Plant Cell 3, 87 (1992) 51. Gal van G. A., Wietsma W. A., Putrasemedja S., Permadi A. H., Kik C. Screening for resistance to anthracnose {Colletotrichum qloeosporioides) Euphitica 95, 173 (1997)

40. Garrido-Ramos M. A., de la Herran R., Ruiz Rejon M., Ruiz Rejon С A subtelomeric satellite DNA family isolated from the genome of the dioecious plant Silene latiflia. 42, 442 (1998) Genome

41. Gilson Е Laroche Т., Gasser S. М. Telomeres and the functional architecture of the nucleus. Trends Cell Biol, 3, 128 (1993)

42. Gortner G., Nerino M., Weising K., Zink D., Nagi W. Kahl G.. Chromosomal localization and distribution of simple sequence repeats and the Arabidopsis-type telomere sequence in the genome of Cicer arietinum L. Chrom Res 6, 97 (1998)

43. Gottching D. E., Aparicio O. M., Billington B. L., Zakian V. A. Position effect at Saccharomyces cerevisiae telomeres: reversible repression of pol II transcription. Cell 63, 751 (1990)

44. Gottschling D. E. and Zakian V.A. Telomere proteins: Specific recognition and protection of the natural termini of Oxytricha macronuclear DNA. Cell, 47, 195 (1986)

45. Gravel S., Larrivee M., Labrecque P. and Wellinger R.J. Yeast Ku as a regulator of chromosomal DNA end structure. Science 280, 741 (1998)

46. Greider С W. and Blackburn E. H. Identification of a Tetrahymena specific telomere terminal transferase activity in exstracts. Cell 43, 405 (1985)

47. Greider С W. and Blackburn E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature 337, 331 (1989)

48. Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stansel R.M., Bianchi A., Moss H. and de Lange T. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell, 97, 503 (1999)

49. Hanelt P. Zur Taxonomie, Chorologie und Okologie der Wildarten von Allium L., sect. Сера (Mill.) Prokh. Flora 176, 99 (1985)

50. Hanelt Р., Schulze-Motel J., Fritsch R., Kruse J., Maass H.I., Ohle H., Pistrick K. Infrageneric grouping of Allium K., the Gatersleben Approach. In Hanelt P., Hammer Knupffer H., (Eds): The genus Allium taxonomic problems 63. 64. and genetic resources, Gatersleben, Germany: IPK, 107 (1992) Harley C.B. et. al. Telomeres shorten duringageing of human fibroblasts. Nature 345, 458 (1990) Harley C.B. et. al. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb? Mutat. Res.256, 271 (1991)

51. Havey M.J. Restriction enzyme analysis of the chloroplast and nuclear 45S ribosomal DNA of Allium section Сера and Phylodollon ШИасеае) PI. Syst. Evol. 183: 17(1992)

52. Hiraoka Y., HendersonE., Blackburn E.H. Not so peculiar: (1998)

53. Heller K., Kilian A., Piatyszek M.A. and Kleinhofs A. Telomerase activity in plant exstract. Mol. Gen. Genet. 252, 342 (1996)

54. Heller-Uszynska K., Schnippenkoetter W. and Kilian A. Cloning and characterization of rice (Oryza sativa L) fission yeast telomere repeats. Trends Biochem. Sci 23, 126 telomerase reverse transcriptase, which reveals complex splicing patterns. Plant J. 31, 75 (2002)

55. Heslop-Harrison J. S., Leitch A. R., Schwarzacher T. The physical organization of interphase nuclei. In The Chromosome, J. S. Heslop-Harrison and R. B. Flavell, eds (Oxford: BIOS Scientific Publisher), 221 (1993)

56. Heslop-Harrison J. S. Comparative genome organization in plants: from sequence and markers to chromatin and chromosome. Plant Cell 12, 617 (2000) 71. Hou A. and Peffley E. B. Recombinant chromosomes of advanced backcross plants between Allium Genet. 100, 1190 (2000) сера L. and A. fistulosum L. revealed by in situ hybridization. Theor. Appl.

57. Hwang M.G., Chung I.K., Kang B.G. and Cho M.H. Sequence-specific binding property of Arabidopsis 35 (2001) thaliana telomeric DNA binding protein 1 (AtTBPl). FEES Lett. 503,

58. Irifune K., Hirai K., Zheng J., Tanaka R., Morikawa H. its chromosomal localization in Allium fistulosum. Theor. Appl. Genet. 90, 312 (1995). Nucleotide sequences of a highly repeated DNA sequences and

59. Jones J.A. Mann I.K. Onions and their allies: botany, cultivation and utilization, Interscience, New York, 1963 75.

60. Jones R. N. and Rees H. Nuclear DNA variation in Allium. Heredity 23, 591 (1968) Karlov G.I., Khrustaieva L.I., Lim K.B., Van Tuyl J.M. Homoeologous recombination in 2n-gametes producing interspecific hybrids of Lilium (Liliaceae) studied by genomic in situ hybridization (GISH). Genome 42, 681(1999). 77.

61. Kass-Eisler A., Greider C.W. Recombination in telomerelength maintenance. TIBS 25, 200 (2000) Khrustaieva L. I., de Melo P.E., van Heusden A.W. and Kik C. The integration of recombination and physical maps in a

62. Khrustaleva L. I. and Kik С Cytogenetic studies in the bridge cross Allium сера x (A. fistulosum x A. roley). Theor. Appl. Genet. 96, 8 (1998)

63. Khrustaleva L. I. and Kik C. Introgression of Allium fistulosum into A. сера mediated by A. roley. Theor. Appl. Genet. 100, 17 (2000)

64. Kilian A., Stiff C Kleinhofs A. Barley telomeres shorten during differentiation but grow in callus culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9555 (1995) 82. Lee H.-W., Blasco M.A., Gottlieb G.J., Horner J.W., Greider C.W. and DePinho R.A, Essential role of mouse telomerase in higly proliferative organs. Nature 392, 569 (1998)

65. Linger J., Hendrick L. L. and Cech T. R. Telomerase RNAs permuted template. Genes Dev. 8, 1984 (1994)

66. Linger J., Hughes T.R., Shevchenko A., Mann M., Lundblad V. and Cech T.R. Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase. Science 276, 561 (1997)

67. Lopes C. C Nielsen L., Edstrom J.-E. Terminal long tandem of different ciliates have a common secondary structure and a repeats in chromosomes from Chironomus pallidivittatus. 86. Mol. Cell Biol. 16, 3285 (1996) Lundblad V. and Blackburn E. H. An alternative pathway for yest telomere maintenance rescues estl senescence. Cell 73, 347 (1993)

68. Lundblad V. and Szostak J. W. A mutant with a defect in (1989) telomere elongation leads to senescence in yeast. Cell 57, 633

69. Lustig A. J., Kurtz S., Shore D. Involment of the silencer length. Science 250, 580 (1990) and и AS binding protein RAPl in regulation of telomere

70. Makarov V., Hirose Y. and Langmore J. P. Long G tails at both (1997) 90.

71. Manuelidis L. A view of interphase chromosomes. Science Marie D. and Brown S.C. A cytometric exercise in plant DNA histograms, with 2C values for 70 species. Biol. Cell 78, 41 (1993)

72. Meyne J., et. al. Moyzis, conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7049 (1989)

73. Morin G. B. Cech T.R. The telomeres of the linear mitochondrial DNA of Tetrahymena thermophyla consist of 53 bp tandem repeats. Cell 46, 873 (1986)

74. Moyzis R. K., Buckingham J.M., Cram L.S., Dani M., Deaven L.L., Jones M.D., Meyne J., Ratliff R.A. and Wu J.R. A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG)n, present at the telomeres of human chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6622 (1988)

75. Muller H. J. The remaking of chromosome. The Collecting Net 13, 181 (1938)

76. Nakamura T.M., Morin G.B., Chapman K.B., Weinrich S.L., Andrews W.H., Lingner J., Harley C.B. and Cech T.R. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science 277, 955 (1997)

77. Narayan R. K. J. Constraints upon the organization and evolution of chromosome in Allium. 319 (1988)

78. Netzer D., Rabinowitch H. D., Weintal Ch. Greenhouse technique to evaluate pink root disease caused by Pyrenochaeta terrestris. Euphytica 34, 385 (1985) Theor, Appl. Genet. 75,

79. Nugent I., Hughes Т.К., Lue N. F. and Lundblad V. CdclSp: A single-strand telomeric DNA-binding protein with a dual role in yeast telomere maintenance. Science 274, 249 (1996) jV

80. Nimmo E, R., Cranston G., AUshire R. C. Telomere- associated chromosome breakage in fussion yeast results in variegated expression of adjacent genes. E M B O J. 13, 3801 (1994)

81. Oguchi K., Liu H., Tamura K. and Takahashi H. Molecular thaliana. FEBS Lett. cloning and characterization of AtTERT, a telomerase reverse transcriptase homolog in Arabidopsis 457, 465 (1999)

82. Olovnikov A. M. A theory of marginotomy. The incomplete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon. J. Theor. Biol. 73, 181 (1973)

83. Parsons B. J., Newbury H. J., Jackson M. T. and Fordw Lloyd B. V. Contrasting genetic diversity relationship are revealed in rice iOriza sativa L.) using different marker types. Mol Breeding 3, 115 (1997)

84. Pedersen С Linde-Laursen L Chromosomal location of four minor rDNA loci and a marker microsatellite sequence in barley. Chromosome Res 2, Q7 (1994)

85. Peffley E.B. «c Hou A. Bulb-type onion introgressants S L. recovered from interspecific possessing Allium fistulosum hybrid backcrosses between A.cepa L. and Allium fistulosum L. Theor. Appl. Genet. 100, 528 (2000)

86. Pich U., Fritsch R., Shubert I. Closely related Allium species (Alliaceae) share a very similar satellite sequences. Plant Syst. Evol. 202, 255 (1996b)

87. Pich U., Schubert I. Terminal heterochromatin and alternative telomeric sequences in Allium Res. 6, 315 (1998) сера. Chromosome

88. Pluta A. F. and Zakian V. A., Nature 337, 429 (1989)

89. Porter D.R. Jones H.A. Resistance of some of the cultivated species of Allium to pink root {Phoma Phytopathology 23:2, 298 (1933)

90. Postberg J., Juranek S.A., Feiler S., Kortwig H., Jonsson F., Lipps H. J. Association of telomere-binding protein complex of hypotrichous ciliates with the nuclear matrix and dissociation during replication. Journal of Cell Science 114, 1861 (2001)

91. Prescott J.C. and Blackburn E.H. Telomerase RNA template mutations reveal sequence-specific requirements for the activation and repression of telomerase action at telomeres. Mol. Cell. Biol. 20, 2941 (2000)

92. Price CM. and Cech T.R. Telomeric DNA-protein terrestris). interaction of Oxytricha 783 (1987) macronuclear DNA. Genes Dev., 1,

93. Rabinowitch H. D., Acta Hort. 433, 223 (1997)

94. Richards Е. J. and Ausubel F. М. Isolation of a higher eucariotic telomere from Arabidopsis (1988)

95. Ricroch A. and Brown S. С 255 (1997)

96. Riha K., Fajkus J., Siroky J., Vyskot B. Developmental control of telomeres lengths and telomerase activity in plants. Plant Cell 10, 1691 (1998)

97. Riha K., McKnight T.D., Fajkus J., Vyskot B. and Shippen D.E. Analysis of the G-overhang structures on plant telomeres: evidence for two distinct telomere architectures. Plant J., 23, 633 (2000)

98. Riha K., McKnight T.D., Griffing L.R. and Shippen D.E. Living with genome instability: Plant response to telomerase dysfunction. Science 291, 1797 (2001)

99. Riha K. and Shippen D.E. Ku is required for telomeric Cir rich strand maintenance but not for end-to-end chromosome fusion in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 611 (2003)

100. Riha K., Watson J.M., Parkey J. and Shippen D.E. to Telomere length deregulation and enhanced sensitivity EMBO J. 21,2819 (2002) Г

101. Roder M.S., Plaschke J, Konig S.U., Bomer A., Sorells M.E., Tanksley S.D. M.W. Canal. Abundance, variability and chromosomal location of microsatellites in wheat. Mol Gen Genet 246, 327 (1995) DNA base composition of thaliane. Cell 53, 127 Allium genomes with different chromosome numbers. Gene 205, genotoxic stress in Arabidopsis mutants deficient in Ku70.

102. Roder М. S., Lapitan N. L. V., Sorrells М. Е., Tanksley S. D. Genetic and physical mapping of barley telomeres Mol. Gen. Genet. 238, 294 (1993)

103. Rogan Expression E. M. et. al. Alterations in p53 and р1б1К4 and telomere lenght during spontaneous immortalization of Li-Fraumeni syndrome fibroblasts. Mol. Cell Biol. 15, 4745 (1995)

104. Sandell L. and Zakian V. Loss of a yeast telomere: arrest, recovery, and chromosome loss. Cell 75, 729 (1993)

105. Schiestl R. H., Reynolds P., Prakash S., Prakash L. Cloning and sequences analysis of the Saccharomyces cerevisiae RAD9 gene and futher evidence that its product is required for cell cycle arrest induced by DNA damage. Mol. Cell. Biol. 9, 1882 (1989)

106. Schmidt, T. J.S. Heslop-Harrison. The physical and genomic organization of microsatellites in sugar beet. Proc Nati Acad Sci USA 93, 8761 (1996)

107. Schubert I. Mobile nucleolus organizing regions (NORs) in Allium (Liliaceae s. lat.)? interferences from the specifity of silver staining. Plant Syst. Evol. 144, 291 (1984)

108. Schubert I., Wobus U. In situ hybridization jumping nucleolus organizing regions in Allium. 92, 143 (1985)

109. Shampay J., Szostak J. W. and BlackBurn E.H. DNA sequence of telomeres maintained in yeast. Nature, 310, 154 (1984) confirms Chromosoma

110. Singer М. S. and Gottschling D. E. TLCl: template RNA component of Saccharomyces 266, AQ4. (1994)

111. Siroky J., Zluvova J., Riha K., Shippen D.E. and Vyskot B. Rearrangements of ribosomal DNA clusters in late generation telomerase-deficient Arabidopsis, Chromosoma 112, 116 {2003)

112. Stack S.M. Comings D.E. The chromosomes and DNA of Allium сера. Chromosoma 70, 161 (1979)

113. Sykorova E,, Lim K.Y., Kunicka Z., Chase M.W., Bennett M.D., Fajkus J. And Leitch A.R. Telomere variability in the monocotyledonous plant order Asparagales. Proc. R. Soc. Lond, cerevisiae telomerase. Science B270, 1893 (2003a) U

114. Sykorova E., Lim K.Y., Chase M.W., Knapp S., Leitch I.J., Leitch A.R. and Fajkus J. The absence of Arabidopsis-type telomeres in Cestrum and closely related genera Vestia and Sessea (Solanaceae); first evidence from eudicots. The Plant Journal 34, 283 (2003b)

115. Sykorova E., Lim K.Y., Fajkus J., Leitch A.R. The signature of the Cestrum genome suggests an evolutionary response to the loss of (TTTAGGG)n telomeres. Chromosome 112, 164 (2003c)

116. Tamura K., Liu H. and Takahashi H. Auxin induction of cell cycle regulated activity of tobacco telomerase. J. Biol. Chem. 274, 20997 (1999)

117. Teng S-C. and Zakian V.A. Telomere-telomere recombination is a efficient bypass pathway for telomere maintenance in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 19, 8083 (1999) ki

118. Tsujimoto Н., Usami N., HasegawaK., Yamahda Т., Nagaki К., Sasakuma Т. De novo syntliesis of telomere sequences at tiie healed breakpoints of wheat deletion chromosomes. Mol. Gen. Genet 262, 851 (1999)

119. Ulloa G.M., Corgan J.N., Dunfold M. Chromosome 01 characteristics and behavior differences in Allium fistulosum L., A.cepa L., their Fj hybrid and selected backcross progeny. Theor. Appl. Genet. 89, 567 (1994)

120. Vershinin A, V., Heslop-Harrison J.S. Comparative analysis of the nucleosomal structure of rye, wheat, and their relatives. Plant Mol. Biol. 36, 149 (1998)

121. Vershinin A. V., Schwarzacher Т., Heslop-Harrison J. S. The large-scale genomic organization of repetitive DNA families at the telomeres of rye chromosome. Plant Cell 7, 1823 (1995)

122. Wang S. S. and Zakian V.A. Telomere-telomere for telomere recombination provides an express pathway acquisition. Nature 345, 456 (1990)

123. Watson J. D. Origin of concatemeric T7 DNA. Nature 239, 197 (1972)

124. White C. I, and Haber J. E. Intermediates of recombination during mating type switching in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J, 9, 633 (1990) *f

125. Weinert T. A. and Hartwell L. H. The RAD9 gene controls the cell cycle response to DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Science 241, 311 (1988)

126. Weiss-Schneeweiss H., Riha K., Jang C.G., Puizina J., Scherthan monocot H., Schweizer D. Chromosome termini of the plant Othocallis siberica are maintained by telomerase, which specifically synthesizes vertebrate-type telomere sequences. The Plant Journal 37, 484 (2004)

127. Weiss H. Scherthan H. Aloe sp. plant with vertebratelike telomeric sequence. Chromos. Res. 10, 155 (2002)

128. Williams B. and Lustig A. J. The paradoxical relationship between NHEJ and telomeric fusion. Mol. Cell 11, 1125 (2003)