Создание биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов Enterococcus faecalis

Ковалева, Елена Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов Enterococcus faecalis
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Создание биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов Enterococcus faecalis"

На правах рукописи

003487988

Ковалева Елена Николаевна

СОЗДАНИЕ БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ВЫДЕЛЕННЫХ И ИЗУЧЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ ЕНТЕШОСОССиЗ РАЕСЛЫЗ

03.00.23 - биотехнология 03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ДЕК 2009

Саратов - 2009

003487988

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Золотухин Сергей Николаевич доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент

Гулий Ольга Ивановна доктор биологических наук, профессор Обухов Игорь Леонидович

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии

Защита диссертации состоится «25» декабря 2009 года в /2^часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан « /£?у> ноября 2009 года и размещен на сайте: www.spau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета Л В Ка п нина

доктор биологических наук, профессор — ' ^ ^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Энтерококки входят в состав нормальной микрофлоры ротовой полости, кишечника и мочеполовой системы животных и человека, поэтому их обнаружение в объектах внешней среды свидетельствует о биологической контаминации изучаемого объекта (Еремина, Седов, 1994; Anderson, Turner, Lewis, 1997; Бухарин, 2002).

Кроме того, среди этих микроорганизмов встречаются патогенные варианты, способные вызывать поражения мочеполовой системы, бактериальные эндокардиты и бактериемии у людей. Гемолизирующие энтерококки также способны вызывать пищевые отравления и дисбакгериозы кишечника (Cassell, 1997; Смирнов, 2000; Kurup, Tee, Loo, Lin, 2001; Макушенко, 2002; Тюрин, 2004).

У животных энтерококки вызывают гастроэнтериты, пневмонии, маститы, эндокардиты, менингиты, септоцемию и другие заболевания (Панин, 1991; Субботин, 2001; Колычев, Петрова, Лазарева, 2006; Иващук, 2006).

Энтерококки в настоящее время являются одними из самых часто встречающихся возбудителей нозокомиальных инфекций. Тем не менее, наибольшую опасность вызывает не столько широкая распространенность этих микроорганизмов, сколько их устойчивость к большому спектру антибактериальных препаратов (Bell, Patón, Tumidge, 1998; Сидоренко, 2003; Hershberger et al., 2005; Kolar et al., 2005). Поскольку из патологического материала чаще всего выделяют E.faecalis, то в большинстве случаев приходиться идентифицировать именно этот вид.

Все вышесказанное обуславливает актуальность своевременной индикации и идентификации изучаемых микроорганизмов. При использовании бактериологических методов идентификация занимает длительное время. Хотя современные методы лабораторной диагностики (Braak et al., 2001; Drews et al., 2006) и являются высокоспецифичными и чувствительными, сложность методик, требования к квалификации персонала, высокая стоимость оборудования и реактивов делает их недоступными для многих бактериологических лабораторий на данный момент.

Таким образом возникает необходимость изыскания специфичных и менее трудоемких методов исследования. Благодаря специфичности действия бактериофаги используются для определения видовой принадлежности микроорганизмов, индикации бактерий в объектах внешней среды, диагностики инфекционных заболеваний.

Цель исследования

Разработка технологии изготовления и применения биопрепарата энтерококко-вых бактериофагов для идентификации и индикации бактерий вида ЕЫегососст/ае-саИх в объектах внешней среды.

Задачи исследования

1. Выделить бактериофаги, активные в отношении бактерий вида Е./аесаШ.

2. Изучить основные биологические свойства выделенных изолятов бактериофагов: морфологию негативных колоний, морфологию фаговых корпускул, литическую активность, диапазон литической активности, специфичность действия, температурную устойчивость, чувствительность к воздействию хлороформа.

3. Отобрать штаммы фагов с заданными биологическим свойствами - высокой литической активностью (титр), широким диапазоном литического действия, выраженной видовой специфичностью, более высоким, чем у бактерий порогом инактивации - для конструирования биопрепарата.

4. Разработать оптимальные параметры идентификации энтерококков с помощью выделенных бактериофагов.

5. Разработать параметры ускоренной индикации бактерий вида Е./аесаШ в объектах внешней среды с помощью реакции нарастания титра фага.

6. Разработать технологические параметры изготовления и контроля биопрепарата энтерококковых бактериофагов.

Научная новизна

□ Впервые выделены бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий вида Е./аесаШ, патогенных для животных.

О Изучены основные биологические свойства новых изолятов фагов.

□ Разработаны параметры идентификации и индикации бактерий вида Е./аесаШ в объектах внешней среды с помощью бактериофагов.

О Впервые определена технология изготовления биопрепарата бактериофагов бактерий вида Е./аесаШ.

□ Доказана эффективность использования биопрепарата для индикации и идентификации бактерий вида Е./аесаШ в условиях производства

Практическая значимость

Выделенные бактериофаги депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (№ 801/15 и № 802/15 от 24 апреля 2009 года), признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов.

Разработана «Инструкция по изготовлению и контролю серии бактериофагов Е./аесаИя ЕР - 4 УГСХА и ЕР - 5 УГСХА», предложены «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида Е./аесаНз из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов ЕР - 4 УГСХА, ЕР - 5 УГСХА» и «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага бактерий вида Е./аесаНз в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды», одобренные Научно-техническим советом Ульяновской ГСХА и утвержденные ректором академии (16 июня 2009 года).

Материалы диссертационных исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по биотехнологии, вирусологии, микробиологии для студентов факультета ветеринарной медицины Ульяновской ГСХА, а также при выполнении тем научно-исследовательских работ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная схема выделения энтерококковых бактериофагов позволяет обнаружить и изолировать фаги Е./аесаШ из объектов внешней среды.

2. Изученные биологические свойства бактериофагов Е./аесаНз дают возможность применять отобранные изоляты с диагностической целью.

3. Разработанная схема фагоидентификации бактерий вида Е./аесаИя с применением бактериофагов ЕР - 4 УГСХА и ЕЙ - 5 УГСХА ускоряет определение видовой принадлежности энтерококков.

4. Разработанные технологические параметры РНФ с использованием фагов ЕР - 4 УГСХА и ЕР - 5 УГСХА значительно сокращают сроки обнаружения гомологичных бактерий в исследуемых объектах.

5. Разработанные технологические параметры изготовления бактериофагов позволили получить фаговый биопрепарат с высокой литической активностью, широким диапазоном действия, строгой видовой специфичностью.

Апробация работы

Материалы работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Аграрная наука и образование в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Ульяновск, 2006); Международных научно-практических конференциях: «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2006), «Роль молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Москва, 2007), «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008), «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозой-ной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); Международном конгрессе МАКМАХ /ЕЭСМГО по антимикробной терапии (Москва, 2009); Молодежном инновационном форуме Приволжского федерального округа (Ульяновск, 2009); Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2009).

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов ЕЙ - 4 УГСХА, ЕР - 5 УГСХА и индикации бактерий вида Е./аесаИз в объектах внешней среды методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА (14 - 16 апреля 2009 года), во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (22 - 25 апреля 2009 года); актами производственных испытаний на базе бактериологического отдела ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» (18-22 мая 2009 года).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГУ ВПО «Ульяновская ГСХА».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и список использованных литературных источников (145 всего, в том числе 65 зарубежных авторов). Работа изложена на 154 страницах текста, иллюстрирована 37 таблицами, 16 рисунками и дополнена приложениями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы

Питательные среды и реактивы: мясопептонпый бульон, мясопептонный агар (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), лактозопептонная среда, молочно-ингибиторная среда, питательная среда для выделения энтерококков сухая (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, машштом (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов (НИИЭМ им. Пасте-ра, г. Санкт-Петербург); натрий хлорид, желчь дегидратированная, перекись водорода, трихлорметан.

Лабораторная посуда и оборудование: термостат ТС-80М-2, автоклав ГК-100-3, шкаф сушильно-стерилизационный ШСС-80п УХЛ 42, холодильник бытовой, дистиллятор, лабораторные центрифуги ОПн-8УХЛ 4,2, ЦЛС-3, СМ-6М с угловыми и баккет-роторами, ультрацентрифуга ТЪ - 100 (Весктап), набор для фильтрации фагов (МИПроге - МШшас), водяная баня, термометр ртутный, микроскоп «Биомед-6» с ви-деофотонасадкой,. электронный микроскоп Ни - 12 А, мерные цилиндры, флаконы, чашки Петри, пробирки, пипетки мерные, колбы, штативы, спиртовки, стекла предметные, стекла покровные.

Штаммы бактерий:

□ 5 референс-штаммов бактерий вида Е./аесаШ Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (№ 189, № 13, № 345, «Консташшювский», «Соколово»), используемых для изготовления вакцин против энтерококкозов сельскохозяйственных животных;

□ 40 штаммов бактерий рода Ешегососсих (33 - Е./аесаШ, 7 - Е./асшт), выделенные нами из патологического материала павших животных, фекалий больных животных, объектов внешней среды;

□ 169 штаммов бактерий рода ЕШегососсиь (82 - Е/аесаИз, 76 - Е./асшт, 3 -Е.га//то5Ш, 3 - £.саете///7ауы,у, 2 - Е.йигат, 1 - Етшт, 1 - Е^аШпагит, 1 - Е.Ыгае) любезно предоставленные нам НИИ Антимикробной химио терапии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия»;

О 65 референс-штаммов бактерий других родов из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульянов-

ской ГСХА {Staphylococcus: 10 - S.aureus; Streptococcus: 5 - S. pneumoniae; Escherichia: 2 - E.coli; Proteus: 5 - P.vulgaris; Morganella: 3 - M.morganii; Citrobacter. 5 - C.freundii; Enterobacter: 5 - E.cloaceae; Klebsiella: 5 - K.pneumoniae; Yersinia: 5 -Y.enterocolitica; Providencia: 5 - P. rettgeri; Aeromonas: 5 -A.hydrophila; Pseudomonas: 5 - P.aeruginosa; Bacillus: 5 - B.cereus).

Объекты внешней среды: пищевое сырье, бытовые сточные воды, вода открытых водоемов, сточные воды ферм, фекалии больных и патологический материал (кровь сердца, печень, селезенка, кишечник) павших животных.

Штаммы бактериофагов E.faecalis: об-ьектами исследования являлись 7 фагов бактерий вида E.faecalis, выделенные нами из объектов внешней среды.

Методы

Выделение и идентификацию бактерий рода Enterococcus проводили в соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике стрептококкоза животных», утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ СССР (1990). При необходимости использовали дополнительные тесты, изложенные в «Определителе бактерий Берджи» (1997), «Методических рекомендациях по лабораторной диагностике энтерококковой инфекции» (Седов, 1983).

Выделение и изучение основных биологических свойств проводили по методам, предложенным М. Адамсом (1961), Д.М. Гольдфарбом (1961), A.C. Тихоненко (1968), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (2006). Реакцию нарастания титра фага для индикации бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным В.Д. Тимаковым, Д.М. Гольдфарбом (1961), В.Я. Ганюшкиным (1988).

Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми методами (Ашмарин, 1962;Бейли, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение бактериофагов E.faecalis

Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактериофагов Enterococcus из объектов внешней среды. Материалом для выделения являлось пищевое сырье, сточные воды и фекалии свиноводческих и молочно-товарных ферм, частных хозяйств Ульяновской и Самарской областей. Всего исследовано 33 пробы.

Исследуемый материал объемом 10 мл засевали в колбу с мясопептонным бульоном в объеме 50 мл, внося при этом по 1 мл 18-часовых бульонных культур бактерий вида Е./аесаНз № 189, 13, 345, «Соколово», «Константиновский». Посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 18 - 24 часов. После инкубации из колбы брали 10 мл жидкости и помешали в стерильную пробирку. Затем, с целью инактивации посторонней микрофлоры, материал обрабатывали хлороформом (1:10) и центрифугировали в течение 30 мин при 700 &

Полученный надосадок исследовали методом агаровых слоев на присутствие бактериофага, гомологичного энтерококкам. Присутствие бактериофага определяли по наличию прозрачных пятен, хорошо видимых на матовом фоне глубинного роста бактерий. Отбор выделенных бактериофагов и повышение их литической активности проводили пассивированием фагов на индикаторных культурах с периодическим пересевом типичных для данного изолята негативных колоний.

В результате проведенных исследований в отношении бактерий вида Е./аесаИз выделено 7 штаммов бактериофагов (табл. 1).

Таблица 1 - Источник выделения бактериофагов E.faecalis

Фаги Индикаторный штамм E.faecalis Источник Место и год выделения

EF - 1 УГСХА E.faecalis БШ № 1 Сточные воды п. Октябрьский Чердаклинского района, 2006

EF-2 УГСХА E.faecalis БШ № 1 Фекалии поросят Ставропольский район Самарской области, 2006

EF-3 УГСХА E.faecalis Ka И Сточные воды Учебно-опытное хозяйство УГСХА, 2007

EF-4 УГСХА E.faecalis № 189 ' Сточные'воды - - , ■ Птицефабрика «¿Ульяновская». • . Чердаклидскогр района, 2007

E.faecalis Xi 189 : Сточные воды Подсобное xo wücibo ИК Л!> 9.. Заволжского района, 2007■ -::

EF-6 УГСХА E.faecalis № 345 Фекалии телят п. Первомайский Чердаклинского района, 2007

EF -7 УГСХА E.faecalis № 189 Фекалии телят п. Пятисотенный Чердаклинского района, 2007

Характеристика биологических свойств выделенных бактериофагов

Морфология негативных колоний

Морфологию негативных колоний фагов изучали при посевах фагов методом агаровых слоев. Негативные колонии, образуемые изучаемыми бактериофагами, имели схожую морфологию: колонии округлой формы с ровными краями, в диаметре от

1 до 4 мм, прозрачные, без вторичного роста и зоны неполного лизиса.

Литическая активность

Логическую активность выделенных бактериофагов определяли методами Аппельмана (метод серийных разведений в жидкой питательной среде) и Грациа (метод агаровых слоев на плотной питательной среде).

Литическая активность составляла Ю'9 - Ю"10 по методу Аппельмана и 4 х 109 -

2 х 1010 по методу Грациа. Все изоляты фагов обладали литической активностью, достаточной для использования их в качестве диагностических препаратов (табл. 2).

Таблица 2 - Литическая активность бактериофагов Е./аесаШ

Бактериофаги Литическая активность

по методу Аппельмана (степень разведения) по методу Грациа (количество корпускул в 1 мл)

ЕР-1 УГСХА 4х 10"

ЕР-2УГСХА ю-1" 1 х 10ш

ЕР-3 УГСХА 10"ш 2 х 10ш

ЕБ - 4 УГСХА 10-* бх 10" '

ЕК-5 УГСХА Ю-

ЕР-б УГСХА Ю'ш 2 х 10ш

ЕР-7 УГСХА 10'" 8 х 10"

Диапазон литической активности

Диапазон литической активности изучали методом нанесения бактериофага на газон бактериальных культур бактерий вида Е./аесаИ$.

Опыты показали, что спектр лизиса гомологичных микроорганизмов находился в пределах от 48,3 % до 90,2 % из числа изучаемых штаммов. Максимальный спектр совместного литического действия (94 %) был обнаружен у двух бактериофагов - ЕБ - 4 УГСХА и ЕР - 5 УГСХА (табл. 3).

Специфичность

Специфичность энтерококковых бактериофагов изучали методом нанесения фага на газон бактериальной культуры представителей других видов, родов.

В результате изучения специфичности выделенных бактериофагов по отношению к представителям других видов рода ЕШегососсия, других родов установлено, что данные фаги не лизировали ни одну из испытуемых культур (табл. 3).

Таблица 3 - Диапазон активности и специфичность бактериофагов E.faecalisD

Род (вид) бактерий Количество исследуемых штаммов Бактериофаги серии УГСХА

EF-1 EF-2 EF-3 EF-4 EF-5 EF-6 EF-7

Процент лизируемых культур

E.faecalis ' 120 ■ 48,3 .! 58,3, 60,8 50,2 86,6 : 76,? ■■ 79,2¿

E.facium 83 - - - - - - -

E.raffinosus 3 - - - - - - -

E.casseliflavus 3 - - - - - - -

E.durcms 2 - - - - - - -

E.avium 1 - - - - - - -

E.gallinarum 1 - - - - - - -

E.hirae 1 - - - - - - -

Streptococcus 5 - - - - - - -

Staphylococcus 10 - - - - - - -

Escherichia 2 - - - - - - -

Proteus 5 - - - - - - -

Morganelia 3 - - - - - - -

Citrobacter 5 - - - - - - -

Enterobacter 5 - - - - - - -

Klebsiella 5 - - - - - - -

Yersinia 5 - - - - - - -

Providencia 5 - - - - - - -

Aeromonas 5 - - - - - - -

Pseudomonas 5 - - - - - - -

Bacillus 5 - - - - 1 - - -

^Примечание: «-»- отсутствие лизиса.

Температурная устойчивость

При изучении воздействия высокой температурой на изучаемые фаголизаты было установлено, что температурный диапазон в 60 - 65°С существенно снижает активность тестируемых фагов (с 109 до 102), температура выше 67°С полностью их инактивирует. Используемые температурные режимы (диапазон от 60° до 69°С) не снизили активность культуры индикаторного штамма энтерококков (табл. 4).

Таблица 4 - Температурная устойчивость бактериофагов Е./аесаНя0

Температурный режим, °С Активность штаммов, подвергнутых температурной обработке, количество активных корпускул в 1 мл.

ИШ° ЕР -1 ЕР-2 ЕР-З ЕР-4 ЕР-5 ЕР-6 ЕР-7

60-62 7x10* 1х108 2x10" 5x10" 1x10" 3x108 2x10' 2x10*

63-64 6x10" 2x10' 1x102 6x102 7x103 2x103 3x10^ 1x10'

65-66 6x10" - - 4x102 1x10' 7x10' - 7x10'

67-69 6x10" - - - - - - -

Контроль , • 7x10" 5x10''. 2x10- 2x10'' 3x10"

Чувствительность бактериофагов к воздействию хлороформа Результаты исследований устойчивости фагов к воздействию хлороформа показали, что существенных изменений количества активных корпускул фагов в 1 мл при обработке хлороформом не происходит. Воздействие хлороформом на культуру индикаторного штамма энтерококков в течение 15 минут приводило к полной инактивации изучаемых микроорганизмов (табл. 5).

Таблица 5 - Устойчивость бактериофагов Е./аесаПз к воздействию хлороформа3

Время воздействия хлороформа, мин Активность штаммов, подвергнутых обработке хлороформом, количество активных корпускул в 1 мл

ИШ° ЕР- 1 ЕР-2 ЕР-З ЕЙ-4 ЕР-5 ЕР-6 ЕР-7

15 - 2х10у 2x10* 9x10" 1x10* 7x10" 3x10" 6x10"

30 - 1x10" 1x10'' 9x10" 1x10" 5x10* 3x10" 5x10"

45 - 1x10" 1x10* 6x10" 1x10* 5x10* 1x10* 5x10*

Контроль 7x10" 2x10" 7x10'' 1x10' 5x10" 2хН)" 3x10'

аПримечание: ИШ - индикаторный штамм культуры бактерий вида Е./аесаИх № 189.

Морфология фаговых корпускул

Для электронно-микроскопических исследований морфологии фаговых корпускул использовали фаголизаты EF - 4 УГ'СХА и EF - 5 УГСХА в титре 3 х 109 - 1 х Ю10 фаговых корпускул в 1 мл.

В результате проведенных исследований было установлено, что вирионы фага EF - 4 УГСХА состоят из головки в виде удлиненного многогранника и длинного не-сокращающегося отростка. Длина головки составляет - 97,2 □ 0,8 нм, ширина-41,6 □ 0,2 нм; длина отростка - 125 □ 0,8 нм. Вирионы фага EF - 5 УГСХА также состоят из головки в виде удлиненного многогранника и длинного несокращающегося отростка. На конце отростка имеется базальная пластика. Длина головки - 97,2 □ 0,8 нм, ширина - 50,0 □ 0,2 нм, длина отростка - 138,8 □ 0,8 нм. Морфология бактериофагов EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА представлена на рисунках 1, 2.

Таким образом, согласно Международной классификации и таксономии вирусов по морфологии бактериофаги EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА относятся к семейству Siphoviridae, по классификации A.C. Тихоненко - к IV морфологической группе: «Фаги с длинным несокращаюшимся отростком».

Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных эитерококковых бактериофагов

На основании изученных биологических свойств были отобраны два изолята энтерококковых фагов ЕБ - 4 УГСХА и ЕБ - 5 УГСХА, рекомендованные для изготовления биопрепарата.

Оптимальными технологическими параметрами для изготовления биопрепарата с высокой логической активностью являются: соотношение количества фаговых корпускул к количеству бактериальных клеток индикаторного штамма бактерий вида Е./аесаИз 1 : 3, время инкубации при температуре 37°С - б часов. Для освобождения фаголизатов от жизнеспособных бактерий необходимо применение хлороформа (соотношение 1 : 10 в течение 30 минут).

Разработка параметров ускоренной идентификации бактерий вида Е./аеспИ.ч с помощью бактериофагов

Используя строгую специфичность бактериофагов ЕБ - 4 УГСХА и ЕБ - 5 УГСХА в отношении бактерий вида Е./аесаИз, были отработаны параметры схемы ускоренной идентификации указанных микроорганизмов (рис. 3). В исследованиях использовали воду, комбикорм, мясо, контаминированные бактериями вида Е./аесаИч в концентрации 105, 104, 103, 102, 101 м.к. в 1 мл.

Посев материала проводили на энтерококкагар, молочно-ингибиторную среду, посевы инкубировали 18-24 часа при температуре 37°С. Бульонные культуры, полученные после пересева колоний, микроскопии (окраска по Граму) и при наличии в мазках грамположительных кокков, идентифицировали бактериологическим методом и с помощью отобранных бактериофагов. Идентификацию бактерий проводили методом нанесения фага на газон культуры. Наличие зоны лизиса на сплошном газоне культуры хотя бы одного из фагов указывало на принадлежность исследуемого штамма к виду Е./аесаИз. Фагоидентификация выделенных штаммов как бактерий вида Е./аесаИэ во всех случаях подтверждена результатами биохимических свойств.

Экспериментальные данные определяют возможность идентификации бактерий вида Е./аесаШ фагами Ер - 4 УГСХА и ЕР - 5 УГСХА, срок исследования по сравнению с бактериологическим методом при этом сокращается с 4 до 2 суток при меньшем расходе питательных сред, реактивов, лабораторной посуды.

48 часов (2 суток) 96 часов (4 суток)

Рис. 3. Выделение бактерий вида Е./аесаПз и ускоренная идентификация с помощью бактериофагов (1) в сравнении с традиционной схемой бактериологического исследования (2)

Разработка оптимальных условий постановки РНФ

Определение количественного показателя РНФ

Для определения уровня нарастания титра, при котором РНФ можно считать положительной, были проведены эксперименты по обнаружению культур Е./аесаГя разных заражающих концентраций (от 105 до 101 м.к./мл) в мясопептонном бульоне.

Установлено, что результат реакции является положительным, т.е. увеличение количества корпускул фага ЕР - 4 УГСХА более чем в 5 раз, в пробах, при контаминации мясопептонного бульона бактериями Е/аесаНя в концентрации 103 м.к./мл, для фага ЕБ - 5 УГСХА - при контаминации мясопептонного бульона бактериями Е.[аесаИ$ в концентрации 104 м.к./мл.

Установление оптимального времени РНФ

В разработку оптимальных условий постановки реакции входит установление времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие бактериофага с бактериями. Оптимальное время экспозиции выбирали из следующих параметров:

□ предварительное подращивание исследуемого материала в течение 5, 16, 24 часов при температуре 37°С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37°С;

□ увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 7, 10, 16, 24 часов при температуре 37°С.

В результате исследований было установлено, что после предварительного подращивания исследуемого материала в течение 5 часов удалось обнаружить энтерококки, гомологичные фагу ЕР - 4 УГСХА в концентрации 10г м.к./мл, фагу ЕР - 5 УГСХА - 103 м.к./мл (табл. 6, 7).

Таблица 6 - Чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала с фагом ЕР - 4 УГСХА

Время контакта, часов Концентрация индикаторной культуры, м.к./мл Время на исследование, часов

101 V/ \0' 10 103

Результат РНФ

5 22

16 Ш'Лфл 33

24 ¡Ш'ФШ 41

Таблица 7 - Чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала с фагом ЕБ - 5 УГСХА

Время контакта, часов Концентрация индикаторной культуры, м.к./мл Время на исследование, часов

101 ю2 10° 10' 10>

Результат РНФ

5 - - 22

16 - 33

24 41

Увеличение времени предварительной инкубации до 16 часов повысило чувствительность РНФ на один порядок для обоих фагов. Подращивание материала при 24-часовой экспозиции существенно не повлияло на результаты РНФ.

Во второй серии опытов изучали чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагами.

В результате проведенных исследований было установлено, что при инкубировании материала в течение 7 часов бактерии были обнаружены с помощью РНФ гомологичными фагами ЕЙ - 4 УГСХА и ЕР - 5 УГСХА в концентрации 102 и 103 м.к./мл исследуемого материала соответственно. Увеличение времени контакта материала с фагами позволило обнаружить исходные бактерии в концентрации 102 всеми фагами. 16 и 24-часовой контакт исследуемого материала с фагами не повлиял на чувствительность РНФ (табл. 8, 9).

Таблица 8 - Чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагом ЕР - 4 УГСХА

Время контакта, часов Концентрация индикаторной культуры, м.к./мл Время на

ю1 102 10' 104 103 исследование,

Результат РНФ часов

7 - 19

10 22

16 У. .;■'■■•'■ 28

24 ■у, ' ■ 4+■;.;'•:'■ 36

Таблица 9 - Чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагом ЕР - 5 УГСХА

Время контакта, часов Концентрация индикаторной культуры, м.к./мл Время на исследование, часов

10 10 10' ю4

Результат РНФ

7 - - 19

10 - ЖЖЖ- 22

16 'Ш-'+Ш'ё 28

24 ЖЖШ1 36

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что предварительное подращивание материала увеличивает время реакции, но чувствительность метода при этом не меняется в сравнении с исследованиями без подращивания.

Полученные экспериментальные данные позволяют считать, что наиболее оптимальным является режим РНФ при 7 часовой экспозиции исследуемого материала с фагами без подращивания, когда удается провести индикацию энтерококков в количестве 102- 103 м.к./мл изучаемого субстрата, на исследование которого затрачивается 19 - 24 часа. Поэтому данный режим рекомендован для дальнейших исследований.

Использование РНФ для индикации бактерии вида Е./аесаИх в объектах внешней среды

В настоящее время исследователи уделяют большое внимание разработке простых и надежных методов индикации различных патогенных бактерий в объектах внешней среды. Были проведены исследования по определению возможности использования РНФ для обнаружения бактерий вида Е./аеса!Ь в объектах внешней среды. Параллельно исследования велись бактериологическими методами.

По результатам исследований проб водопроводной воды, комбикорма, мяса, патологического материала установлено, что увеличение титра фагов ЕР - 4 УГСХА и ЕР - 5 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации бактерий вида Е/аесаНя Ю3 м.к./г при наличии посторонней микрофлоры.

При исследовании объектов внешней среды нами было обнаружено существенное преимущество РНФ перед бактериологическим методом исследования. С помощью РНФ за 19 - 24 часа исследования можно обнаружить бактерии вида

Е./аесаНз в изучаемых объектах в количестве 103 м.к./г. Бактериологическим методом удавалось обнаружить бактерии вида Е./аесаИз в минимальной концентрации 104 м.к./г, но при этом затрачивается не менее 96 часов.

Исследование маститиого молока с помощью РНФ на наличие бактерий вида Е./аесаИэ

Для оценки эффективности реакции нарастания тигра фага в условиях производства были проведены исследования по фагоиндикации бактерий вида Е./аесаНз в масгитном молоке. Опыт проводился на базе бактериологического отдела ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория». В качестве исследуемого материала использовали 10 проб молока от больных маститом коров животноводческого комплекса «Октябрьский» Чердаклипского района Ульяновской области.

При исследовании бактериологическим методом бактерии вида Е/аесаШ были выделены из двух проб (20 %). Время исследования составило около 120 часов. При исследовании материала методом РНФ с использованием специфических эитерококковых бактериофагов ЕБ - 4 и ЕР - 5 серии УГСХА бактерии вида Е./аесаИх были обнаружены в пяти пробах (50 %). Время исследования составило 24 часа.

Результаты производственного опыта подтверждают более высокую чувствительность реакции нарастания титра фага при обнаружении бактерий вида Е/аесаИх в сравнении с бактериологическим методом исследования при меньшей затрате времени и реактивов.

Изучение эффективности сконструированного биопрепарата эитерококковых бактериофагов

Для усовершенствования предложенного метода изучалась возможность использования не отдельных монофагов, а их смеси. Установлено, что сконструированный биопрепарат, состоящий их двух эитерококковых бактериофагов ЕР - 4 УГСХА и ЕР - 5 УГСХА, по параметрам необходимым для проведения идентификации и индикации бактерий вида Е./аесаНз (высокая литическая активность, широкий диапазон литической активности, выраженная видовая специфичность, более высокий, чем у бактерий порог инактивации)'соответствует отдельным монофагам. Антагонистический эффект при взаимодействии фагов ЕР — 4 УГСХА и ЕР - 5 УГСХА отсутствует.

ВЫВОДЫ

1. Бактериофаги Е/аесаШ широко распространены в природе: из 33 проб объектов внешней среды выделено 7 изолятов бактериофагов, активных в отношении бактерий вида Е./аесаИз.

2. Изучены основные биологические свойства бактериофагов ЕЫегососсиу.

□ изоляты фагов имели однородные негативные колонии (от 1 до 4 мм);

□ литическая активность составила от 10"9 до Ю"10 по методу Аппельмана и от 4 х 109 до 2 х Ю10 по методу Грациа;

□ бактериофаги обладали выраженной специфичностью к бактериям вида £/аеса/м;

□ все изоляты фагов были термолабильны и хлороформоустойчивы;

□ по морфологии бактериофаги ЕР - 4 УГСХА и ЕБ - 5 УГСХА относятся к семейству 51р}юч1г1(1ае.

3. Показано, то бактериофаги ЕБ - 4 УГСХА и ЕР - 5 УГСХА, отобранные на основании изученных биологических свойств, обладают совместным спектром литиче-ской активности 94 % по отношению к имеющимся штаммам бактерий вида Е./аесаИэ и пригодиы для конструирования биопрепарата.

4. Разработаны параметры схемы фагоидентификации бактерий вида Е./аесаИя с помощью созданного биопрепарата индикаторных бактериофагов ЕР - 4 УГСХА и ЕГ - 5 УГСХА, позволяющие идентифицировать гомологичные бактерии за 48 часов.

5. Разработаны технологические параметры постановки реакции нарастания титра фага для ускоренной индикации бактерий вида Е./аесаШ в объектах внешней среды с использованием биопрепарата из фагов ЕР - 4 УГСХА и ЕБ - 5 УГСХА, позволяющие обнаружить в исследуемом материале указанные бактерии в концентрации от 103 м.к. в 1 г (1 мл) за 19 - 24 часа.

6. Оптимальными технологическими параметрами для изготовления специфического биопрепарата энтерококковых бактериофагов ЕР - 4 УГСХА и ЕР - 5 УГСХА с высокой логической активностью являются: соотношение количества фаговых корпускул к количеству бактериальных клеток индикаторного штамма бактерий вида Е./аесаНя 1: 3, время инкубации при температуре 37°С - 6 часов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены 2 штамма бактериофагов E.faecalis EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА, обладающие высокой литичсской активностью, строгой видовой специфичностью, широким спектром литической активности для изготовления биопрепарата.

2. Фагоидентификацию бактерий вида E.faecalis необходимо проводить с помощью набора бактериофагов, согласно «Методическим рекомендациям по выделению и идентификации бактерий вида E.faecalis из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов EF - 4 УГСХА, EF - 5 УГСХА».

3. Индикацию бактерий вида E.faecalis в исследуемых объектах предложено проводить с помощью набора диагностических бактериофагов EF - 4 УГСХА, EF - 5 УГСХА, согласно «Методическим рекомендациям по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага бактерий вида E.faecalis в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды».

4. Изготовление и контроль набора индикаторных знтерококковых бактериофагов проводить в соответствии с «Инструкцией по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов E.faecalis EF - 4 УГСХА и EF - 5 УГСХА».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ковалева, E.H. Перспективы использования бактериофагов для диагностики, лечения и профилактики инфекций, вызываемых бактериями рода Enterococcus / E.H. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Молодежь и наука XXI века: материалы Международной научно-практической конференции, 21-23 марта, 2006. - Ульяновск, 2006. - 4.1. - С. 356 - 359.

2. Ковалева, E.H. Разработка оптимальной схемы выделения и идентификации Enterococcus faecalis / E.H. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Аграрная наука и образование в реализации национального проекта «Развитие АПК»: материалц Всероссийской научно-практической конференции, 22 - 24 ноября, 2006. - Ульяновск, 2006. - Ч. 1,-С. 323-325.

3. Ковалева, E.H. Выделение и селекция клонов бактериофагов активных в отношении Enterococcus faecalis / E.H. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Роль

молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК»: сборник материалов Международной научно-практической конференции, 29 - 30 мая, 2007. -Москва, 2007. - Ч. 2. - С. 248 - 250.

4. Ковалева, E.H. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов Еп-terococcus / E.H. Ковалева, С.Н. Золотухин // Ломоносов: материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, 8 — 11 апреля, 2008. - М.: Издательство МГУ, 2008. - С. 7.

5. Ковалева, E.H. Определение устойчивости бактериофагов Enterococcus к воздействию высокой температуры и хлороформа / E.H. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: материалы Международной научно-практической конференции, 20 - 22 мая, 2008. - Ульяновск, 2008. -Т. IV.-С. 137-139.

6. Ковалева, E.H. Бактериофаги Enterococcus и перспективы их практического применения в ветеринарии / E.H. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел: материалы Международной научно-практической конференции, 9-10 октября, 2008. - Москва, 2008. - С. 333 - 336.

7. Ковалева, E.H. Биологические свойства бактериофагов Enterococcus / E.H. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: материалы Международной научно-практической конференции, 13-14 ноября, 2008. -Покров, 2008. - Т. I. - С. 219 -221.

8. Ковалева, E.H. Подбор штаммов бактериофагов Enterococcus для конструирования диагностического препарата / E.H. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им.

H.Э. Баумана.-Казань, 2008.-Т. 195.-С. 123-128.

9. Ковалева, E.H. Диапазон литического действия и специфичность бактериофагов Enterococcus faecalis / E.H. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - Москва, 2009. - Приложение

I.-Т. 11,№2.-С.19.

Отпечатано в типографии ООО «КОПИРЙНГ» г. Ульяновск, ул. К. Маркса 26, (8422) 42-07-81

Заказ №436 Тираж 100 экз. Бумага офсетная

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковалева, Елена Николаевна

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.стр.

ВВЕДЕНИЕ. стр.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. 1. Характеристика бактерий рода ЕМегососсиБ.стр.

1. 2. Этиологическое значение энтерококков в патологии человека и животных.стр.

1.3. Факторы вирулентности энтерококков.стр.

1. 4. Лабораторная идентификация энтерококков.стр.

1.5. Бактериофаги: вирусы бактерий.стр.

1. 6. Применение бактериофагов в диагностической практике.стр.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

2. 1. 1. Материалы.стр.

2. 1.2. Методы.стр.

2. 2. Результаты исследований и их обсуэвдение

2. 2. 1. Выделение и идентификация бактерий рода ЕЫегососст.стр.

2. 2. 2. Выделение бактериофагов ЕЫегососст.стр.

2. 2. 3. Характеристика биологических свойств выделенных бактериофагов.стр.

2. 2. 4. Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных энтерококковых бактериофагов.стр.

2. 2. 5. Разработка параметров ускоренной идентификации бактерий вида

Е./аесаНз с помощью бактериофагов.стр.

2. 2. 6. Разработка оптимальных условий постановки РНФ.стр.

2. 2. 7. Использование РНФ для индикации бактерий вида Е./аесаШ в объектах внешней среды

2.2.1. 1. Исследование с помощью РНФ воды, контаминированной бактериями вида Е./аесаШ.стр.

2.2.1.2. Исследование с помощью РНФ комбикорма, контаминированного бактериями вида E.faecalis.стр.

2. 2.1. 3. Исследование с помощью РНФ мяса, контаминированного бактериями вида E.faecalis.стр.

2. 2. 7. 4. Исследование с помощью РНФ патологического материала, контаминированного бактериями вида E.faecalis.стр.

2.2.1. 5. Исследование маститного молока с помощью РНФ на наличие бактерий вида E.faecalis.стр.

2. 2. 8. Изучение эффективности сконструированного биопрепарата энтерококковых бактериофагов.стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов Enterococcus faecalis"

Актуальность темы

Кроме того, среди этих микроорганизмов встречаются патогенные варианты, способные вызывать поражения мочеполовой системы, бактериальные эндокардиты и бактериемии у людей. Бактериемии могут развиваться как следствие поражений мочевой системы или внутрибрюшинных абсцессов; в 40 % случаев источник проникновения бактерий в кровоток остается неизвестным. Гемолизирующие энтерококки также способны вызывать пищевые отравления и дисбактериозы кишечника [63, 65, 91].

У животных энтерококки вызывают гастроэнтериты, пневмонии, маститы, эндокардиты, менингиты, септоцемию и другие заболевания [26, 29, 51, 68]. Как и свойственно всем условно-патогенным микроорганизмам, их отрицательное воздействие проявляется у особей со снижением общей резистентности.

Все вышесказанное обуславливает актуальность своевременной индикации и идентификации изучаемых микроорганизмов. При использовании бактериологических методов нередко возникает ряд трудностей, связанных с тем, что основой идентификации бактерий являются биохимические (ферментативные) свойства, изучение которых занимает длительное время. Хотя современные методы лабораторной диагностики [20, 80, 82] и являются высокоспецифичными и чувствительными, сложность методик, требования к квалификации персонала, высокая стоимость оборудования и реактивов для постановки этих реакций, делает их недоступными для многих бактериологических лабораторий на данный момент.

Таким образом возникает необходимость изыскания специфичных и менее трудоемких методов исследования. Благодаря специфичности действия бактериофаги используются для определения видовой принадлежности возбудителя, индикации бактерий в объектах внешней среды, диагностики инфекционных заболеваний.

Цель исследования

Разработка технологии изготовления и применения биопрепарата энтерококковых бактериофагов для идентификации и индикации бактерий вида Егйегососст/аесаШ в объектах внешней среды.

Задачи исследования

1. Выделить бактериофаги, активные в отношении бактерий вида Е./аесаШ.

3. Отобрать штаммы фагов с заданными биологическим свойствами — высокой литической активностью (титр), широким диапазоном литического действия, выраженной видовой специфичностью, более высоким, чем у бактерий порогом инактивации - для конструирования биопрепарата.

4. Разработать оптимальные параметры идентификации энтерококков с помощью выделенных бактериофагов.

Научная новизна

- Впервые выделены бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий вида Е./аесаШ, патогенных для животных.

- Изучены основные биологические свойства новых изолятов фагов.

- Разработаны параметры идентификации и индикации бактерий вида Е./аесаШ в объектах внешней среды с помощью бактериофагов.

- Впервые определена технология изготовления биопрепарата бактериофагов бактерий вида Е./аесаШ.

- Доказана эффективность использования биопрепарата для индикации и идентификации бактерий вида Е./аесаШ в условиях производства.

Практическая значимость

Разработана «Инструкция по изготовлению и контролю серии бактериофагов Е./аесаШ ЕБ — 4 УГСХА и ЕБ — 5 УГСХА», предложены «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида Е./аесаШ из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов ЕБ - 4 УГСХА, ЕР - 5 УГСХА» и «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага бактерий вида Е./аесаШ в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды», одобренные Научно-техническим советом Ульяновской ГСХА и утвержденные ректором академии (16 июня 2009 года).

Основные положения, выносимые на защиту

2. Изученные биологические свойства бактериофагов Е./аесаШ дают возможность применять отобранные изоляты с диагностической целью.

3. Разработанная схема фагоидентификации бактерий вида Е./аесаШ с применением бактериофагов ЕР - 4 УГСХА и ЕР - 5 УГСХА ускоряет определение видовой принадлежности энтерококков.

Апробация работы

Москва, 2007), «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008), «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); Международном конгрессе МАКМАХ / ЕБСМГО по антимикробной терапии (Москва, 2009); Молодежном инновационном форуме Приволжского федерального округа (Ульяновск, 2009); Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2009).

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов ЕР - 4 УГСХА, ЕР - 5 УГСХА и индикации бактерий вида Е./аесаШ в объектах внешней среды методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА (14 - 16 апреля 2009 года), во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (22 - 25 апреля 2009 года); актами производственных испытаний на базе бактериологического отдела ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» (18-22 мая 2009 года).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 2 — в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ковалева, Елена Николаевна

Результаты исследований

При исследовании маститного молока бактериологическим методом бактерии вида E.faecalis были выделены из двух проб. Время исследования составило около 120 часов.

При исследовании материала методом реакции нарастания титра фага с использованием специфических энтерококковых бактериофагов бактерии вида Е./аесаШ были обнаружены в пяти пробах. Время исследования составило 28 часов. Результаты представлены в таблице 36.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалева, Елена Николаевна, Саратов

1. Аврех, В.В. О применении бактериофагов в диагностике сальмонеллезов / В.В. Аврех // ЖМЭИ. 1954. - № 7. - С. 93 - 96.

2. Адаме, М. Бактериофаги / М. Адаме. М.: Медгиз, 1961. - 521 с.

3. Архангельский, И.И. Фаготипирование патогенных стафилококков, выделенных из молока коров / И.И. Архангельский, Б.А. Степанов // Ветеринария. — 1996. — № 3. С. 27.

4. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. Л., 1962.

5. Бактериофаги малоизученных энтеробактерий и перспективы их применения в ветеринарии / С.Н. Золотухин и др. // Ветеринарная патология. 2006. - № 3. - С. 80 - 85.

6. Бейли, Н. Математика в биологии и медицине / Н. Бейли. — М.: Мир, 1970.-326 с.

7. Бухарин, О.В. Механизмы выживания энтерококков в организме хозяина / О.В. Бухарин // ЖМЭИ. 2002. - № 3. - С. 100 - 106.

8. Выделение и селекция клонов бактериофагов патогенных энтеробактерий / С.Н. Золотухин и др. // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: материалы

9. Международной конференции, 21—23 июня, 2006. Ульяновск, 2006. — С. 227-231.

10. Габрилович, И.М. Биологические свойства бактериофагов Serratia marcences / И.М. Габрилович // ЖМЭИ. 1992. - № 6. - С. 10 - 12.

11. Габрилович, И.М. Сравнительное изучение бактериофагов Morganella и Providencia / И.М. Габрилович // ЖМЭИ. 1998. - № 5. - С. 20 - 22.

12. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги Salmonella choleraesuis, сравнительная характеристика и практическое применение / В.Я. Ганюшкин // Автореф. дис. . д-ра ветеринар, наук. Ульяновск, 1984. - 84 с.

13. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии / В.Я. Ганюшкин. Ульяновск, 1988. - 45 с.

14. Ганюшкин, В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят / В.Я. Ганюшкин // Ветеринария. — 1967. № 3. - С. 69 -71.

15. Гольдфарб, Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб. М.: Медгиз, 1961.- 299 с.

16. Гольдфарб, Д.М. Индикация брюшнотифозной палочки в воде с помощью реакции нарастания титра фага / Д.М. Гольдфарб, З.С. Островская //ЖМЭИ.-1957.-№5.-С. 17.

17. Гольдфарб, Д.М. Опыт применения реакции нарастания титра фага для диагностики дизентерии / Д.М. Гольдфарб, В.Н. Кузнецова // ЖМЭИ. 1957.- № 8. — С. 90-94.

18. ГОСТ 28566-90 (СТ СЭВ 6646-89) Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества энтерококков. — М.: Изд-во стандартов, 1990.-6 с.

19. Дехнич, А.В. Современные методы идентификации энтерококков / А.В. Дехнич, Р.С. Козлов, О.У. Стецюк // Антибиотики и химиотерапия. 1996. -т. 41.-№3.-С.32-39.

20. Еремина, А.К. Биологические свойства подвижных энтерококков / А.К. Еремина, В.И. Седов // ЖМЭИ. 1994. - № 6. - С.12 - 13.

21. Золотухин, С.Н. Изучение чувствительности E.coli О 157 к колифагам / С.Н. Золотухин, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев // Вестник УГСХА. 2001. -№ 11.-С. 59-63.

22. Золотухин, С.Н. Разработка оптимальных количественных параметров соотношения культуры и фага для получения препаратов с высокой активностью / С.Н. Золотухин, Л.П. Пульчеровская, Д.А. Васильев // Вестник УГСХА.-2004.-№ 12.-С. 50-53.

23. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий / С.Н. Золотухин // Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Ульяновск, 2007. — 39 с.

24. Иващук, М.А. Усовершенствование лабораторной диагностики энтерококковой инфекции птиц / М.А. Иващук // Автореф. дис. . канд. ветеринар, наук. М., 2006. - 18 с.

25. Камбаратов, П.И. Значение РНФ при распознавании сальмонеллеза / П.И. Камбаратов // ЖМЭИ. 1963. - № 6. - С. 35.

26. Колычев, Н.М. Сперма быков как фактор передачи энтерококковой инфекции / Н.М. Колычев, М.И. Петрова, Л.И. Лазарева // Ветеринария. — 2006. -№ 11.-С. 23-25.

27. Кольпикова, Т.И. Фаготипирование листерий / Т.И. Кольпикова, И.А. Бакулов, В.М. Котляров // Ветеринария. 1990. - № 6. - С. 31 - 32.

28. Коритняк, Б.М. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Yesinia enterocolitica, разработка технологических параметров по их применению / Б.М. Коритняк // Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2005. - 20 с.

29. Кременчук, Г.А. Применение реакции нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды / Г.А. Кременчук, М.А. Гицевич, К.П. Бояршинова // ЖМЭИ. 1961. - № 7. - С. 124.

30. Кривиский, A.C. Вирусы против микробов / A.C. Кривиский. М., 1962.- 162 с.

31. Крылов, В.Н. Фаготерапия / В.Н. Крылов // Химия и жизнь. 2002. - № З.-С. 11-15.

32. Крылова, М.Д. Применение бактериофагов для типирования бактерий / М.Д. Крылова // В книге: Бактериофагия. М.: Медгиз, 1961. - С. 220 - 257.

33. Крылова, М.Д. Схема фаготипирования нетоксигенных дифтерийных бактерий типа gravis / М.Д. Крылова // ЖМЭИ. 1970. - № 12. - С. 16 - 22.

34. Кузнецова, В.Н. Применение реакции нарастания титра фага для индикации дизентерийных бактерий в условиях внешней среды / В.Н. Кузнецова, М.И. Хазанов, Т.Н. Ремова // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - С. 59.

35. Лебедев, В.И. Опыт применения РНФ в эпидемиологической практике / В.И. Лебедев // ЖМЭИ. 1963. - № 12. - С. 29.

36. Лихачев, Н.В. Метод диагностики паратифа свиней при помощи бактериофага / Н.В. Лихачев // Ветеринария. 1948. — № 7. - С. 32.

37. Лурия, С. Общая вирусология / С. Лурия, Д. Дарнелл. М.: Мир, 1970. - 397 с.

38. Ляпустина, Л.В. Бруцеллезные бактериофаги. Оптимизация технологии производства и способов применения в лабораторной диагностике бруцеллеза / Л.В. Ляпустина // Автореф. дис. . д-ра биол. наук. — Ставрополь, 2004. 41 с.

39. Макушенко, A.C. Энтерококки: экологическое и клиническое значение в современных условиях / A.C. Макушенко // Лабораторная диагностика. — 2002.-№3.-С. 43-45.

40. Мащенюк, О.Ю. Идентификация бактерий Pseudomonas mallei с помощью бактериофагов / О.Ю. Мащенюк, И.В. Воложанцев // Микробиология. 1994. - № 3. - С. 537 - 544.

41. Медицинская микробиология / главные редакторы акад. РАМН В.И. Покровский, проф. O.K. Поздеев. М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. - 162 с.

42. Методические указания по лабораторной диагностике стрептококкоза животных. МСХ СССР, М., 1990.

43. Молофеева, Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов E.coli О 157 и их применение в диагностике / Н.И. Молофеева // Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2004. - 20 с.

44. О специфичности листериозных бактериофагов / И.А. Бакулов и др. // Ветеринария. 1990. - № 7. - С. 26 - 27.

45. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований / под редакцией A.C. Лабинской, Л.П. Блинковой, A.C. Ещиной. М.: Медицина, 2004. - 576 с.

46. Определитель бактерий Берджи / под редакцией Дж. Хоулта и др.. 9-е издание. Т. 2. Перевод с англ. под редакцией акад. РАН Г.А. Заварзина. М.: Мир, 1997.-432 с.

47. Островская, H.H. К использованию метода нарастания титра фага для выявления бруцелл во внешней среде / H.H. Островская, Д.М. Гольдфарб // ЖМЭИ. — 1961. -№ 5. С. 145.

48. Панин, А.Н. К вопросу об энтерококковой инфекции / А.Н. Панин // Ветеринария. 1991. - № 1. - С. 25 - 26.

49. Покровский, В.И. Проблемы внутрибольничных инфекций / В.И. Покровский // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 1996. № 2. — С. 4.

50. Покровский, В.И. Современные принципы и методы диагностики инфекционных болезней / В.И. Покровский, O.A. Дунаевский // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. - № 4. — С. 5 - 7.

51. Пономарев, А.П. Электронно-микроскопическое выявление вирусов животных в неконцентрированных вирусосодержащих суспензиях / А.П. Пономарев, О.Г. Андреева, Т.Н. Артамонова // Вестник РАСХН. 2002. — № 2. - С. 74 - 77.

52. Попхадзе, М.З. Использование бруцеллезного фага для диагностики бруцелл / М.З. Попхадзе // ЖМЭИ. 1968. - № 2. - С. 119 - 124.

53. Пульчеровская, Л.П. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике /Л.П. Пульчеровская // Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2004. -21 с.

54. Ревенко, И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике / И.П. Ревенко. Киев: Урожай, 1978. — С. 88.

55. Результаты многоцентрового исследования антибиотико-чувствительности энтерококков / C.B. Сидоренко и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1998. - 43, № 9. - С. 9 - 18.

56. Русалеев, B.C. Таксономия вирусов бактерий / B.C. Русалеев // Ветеринария. 1990. - № 12. - С. 25 - 28.

57. Русалеев, B.C. Фагочувствительность аэробных спорообразующих бактерий / B.C. Русалеев // Ветеринария. 1990. - № 8. - С. 29 - 30.

58. Седов, В. И. Проблема антибиотикотерапии энтерококковых инфекций / В.И. Седов // Антибиотики и химиотерапия. — 1993. — т. 38 № 7. С. 55 — 59.

59. Седов, В.И. Выделение и количественный учет подвижных энтерококков / В.И. Седов, А.К. Еремина // Клиническая лабораторная диагностика. 1998. - № 11. - С. 17 - 19.

60. Седов, В.И. Лабораторная диагностика энтерококковой инфекции. Методические рекомендации / В.И. Седов. Иваново, 1983.

61. Сидоренко, C.B. Антибактериальная терапия: кризис жанра или свет в конце тоннеля? / C.B. Сидоренко // Русский медицинский журнал. 2003. - т. 11 № 6. - С. 7 - 20.

62. Смирнов, И.В. Возбудители бактериальных инфекций человека / И.В. Смирнов // КМАХ. 2000. - т. 2 № 2. - С. 4 - 11.

63. Субботин, В.В. Профилактика желудочно-кишечных болезней новорожденных животных с симптомокомплексом диареи /В.В. Субботин // Ветеринария. 2001. - № 4. - С. 3 - 7.

64. Таксономия микроорганизмов и методы их идентификации / Е.В. Авдеева и др. Калининград: КГТУ, 2003.

65. Тараканов, Б.В. Регуляция микробных процессов в рубце жвачных животных бактериофагами Streptococcus bovis / Б.В. Тараканов // Микробиология. 1994. - № 4. - С. 23.

66. Тимаков, В.Д. Реакция нарастания титра фага (РНФ) / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб. -М., 1962. 32 с.

67. Тимаков, В.Д. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб // ЖМЭИ. 1956. - № 10. - С. 3 - 7.

68. Тихоненко, A.C. Ультраструктура вирусов бактерий / A.C. Тихоненко. -М.: Наука, 1968-С. 89.

69. Тюрин, В.П. Современные взгляды на лечение энтерококкового эндокардита / В.П. Тюрин, Ю.Г. Тихонов // КМАХ. 2004. - т. 6 № 4. - С. 360-364.

70. Цветков, К.И. Применение специфического бактериофага для диагностики паратифозного аборта кобыл / К.И. Цветков // Ветеринария. -1941.-№ 6.-С. 4-6.

71. Цветкова, И.А. Обоснование, конструирование и стандартизация индикаторных дисков для определения чувствительности энтерококков к антибиотикам / И.А. Цветкова // Автореф. дис. . канд. биол. наук. — С.-Пб., 2007. 20 с.

72. A 24-hour screening protocol for identification of vancomycin-resistant Enterococcus faecium / S .J. Drews et al. // J. of Clinical Microbiol. 2006. - 44, №4.-P. 1578- 1580.

73. A multicentre study: Staphylococcus and Enterococcus susceptibility to antibiotics / A. Turano et al. // Eur. J. Epidemiol. 1994. - № 5. - P.567 - 572.

74. Accuracy of the VITEC 2 system to detect glycopeptide resistance in Enterococci / N. Braak et al. // J. of Clinical Microbiol. 2001. - 39, № 1. - P. 351 -353.

75. Adhesion to bile drain materials and physicochemical surface properties of Enterococcus faecalis strains grown in the presence of bile / K. Waar et al. // Appl. and Environ. Microbiol. 2002. - 68, № 8. - P. 3855 - 3858.

76. Bacteriophage therapy rescues mice bacteremic from a clinical isolate of vancomycin-resistant Enterococcus facium / B. Biswajit et al. // Infection and Immunity. 2002. - 70, № 1. - P. 204 - 210.

77. Bell, J.M. Emergence of vancomycin-resistant Enterococci in Australia: phenotypic and genotypic characteristics of isolates / J.M. Bell, J.C. Paton, J. Turnidge // J. of Clinical Microbiol. 1998. - 36, № 8. - P. 2187 - 2190.

78. Bosley, G.S. Rapid identification of Enterococci / G.S. Bosley, R.R. Facklam, D. Grossman // J. of Clinical Microbiol. 1983. - 18, № 5. - P. 1275 -1277.

79. Bradley, D. The morphology and physiology of bacteriophages as revealed by the electron microscope / D. Bradley // J. Roy Micros. Soc. 1965. - № 84. -P. 141 - 145.

80. Brock, T.D. Survey of the bacteriocines of Enterococci / T.D. Brock, B. Peacher, D. Pierson // J. of Bacteriol. 1963. - 86. - P. 702 - 707

81. Caprioli, T. Phage typing scheme for group D Streptococci isolated from human urogenital tract / T. Caprioli, F. Zaccour, S.S. Kasatiya // J. of Clinical Microbiol. 1975. - 2, № 2. - P. 311 - 317.

82. Cassell, G.H. Emergent antibiotic resistance: Health risks and economic impact / G.H. Cassell // FEMS Immunol, and Med. Microbiol. 1997. - 18, № 4. -P. 271 -274.

83. Classification and identification of Enterococci: a comparative phenotypic, genotypic and vibrational spectroscopic study / C. Kirschner et al. // J. of Clinical Microbiol.-2001.-39, №5.-P. 1763- 1770.

84. Clonal diversity of vancomycin-resistant enterococci from an outbreak in a tertiary care university hospital / Ch.L. Pearce et al. // Amer. J. Infec. Contr. -1998. 26, № 6. - P. 563 - 568.

85. Comparison of conventional and molecular methods for identification of aerobic catalase-negative gram-positive in the clinical laboratory / P.P. Bosshard et al. // J. of Clinical Microbiol. 2004. - 42, № 5. p. 2065 - 2073.

86. Contamination of respiratory therapy equipment with VRE: Abstr. APIC 24th Annu. Educ. Conf. and Int. Meet., New Orleans, La, June 8 12, 1997 / D.J. Mikolich et al. // Amer. J. Infect. Contr. - 1997. - 25, № 2. - P. 145.

87. Das, I. Are glycopeptide-resistant enterococci in animals a threat to human beings? / I. Das, A. Fraise, R. Wise // Lancet. 1997. - 349, № 9057. - P. 997 -998.

88. Deibel, R.H. Physiology of the Enterococci as related to their taxonomy / R.H. Deibel, D.E. Lake, C.F. Niven // J. of Bacteriol. 1963. - 86. - P. 1275 -1282.

89. Deibel, R.H. The group D Streptococci / R.H. Deibel // Bacteriological reviews. 1964. - 28, № 3. - P. 330 - 366.

90. Detection of vancomycin-resistant enterococci colonization in a children's hospital / J.C. Christenson et al. // Amer. J. Infec. Contr. 1998. - 26, № 6. - P. 569-571.

91. Effect of raw-milk cheese consumption on the Enterococcal flora of human feces / R. Gelsomino et al. // Appl. And Environ. Microbiol. 2003. - 69, № 1. -P. 312 — 319.

92. Epidemiology of antimicrobial resistance in enterococci of animal origin / E. Hershberger et al. // J. of Antimicrob. Chemother. 2005. - 55, № 1. - P. 127 -130.

93. Facklam, R. Identification, classification, and clinical relevance of catalase-negative, gram-positive cocci, excluding the Streptococci and Enterococci / R. Facklam, J.A. Elliott // Clinical Microbiol. Reviews. 1995.-8, № 4. - P. 479 -495.

94. Facklam, R.R. Identification of Enterococcus species isolated from human infections by a conventional test scheme / R.R. Facklam, M.D. Colins // J. of Clinical Microbiol. 1989. - 27, № 4. - P. 731 - 734.

95. Frankenberg, L. Enterococcus faecalis heme-dependent catalase / L. Frankenberg, M. Brugna, L. Hederstedt // J. of Bacteriol. 2002. - 184, № 22. - P. 6351 -6356.

96. Genetic variation and evolution of the pathogenicity island of Enterococcus faecalis / Sh.M. McBride et al. // J. of Bacteriol. 2009. - 191, № 10. - P. 3392 -3402.

97. Hanson, K.L. Comparison of simple and rapid methods for identifying Enterococci intrinsically resistant to vancomycin / K.L. Hanson, C.P. Cartwright // J. of Clinical Microbiol. 1999.-37, № 3. - P. 815 - 817.

98. Identification and analysis of recombineering functions from Gram-negative and Gram-positive bacteria and their phages / S. Datta et al. // PNAS. 2008. -105, №5.-P. 1626-1631.

99. Identification of broadly active phage lytic enzyme with lethal activity against antibiotic-resistant Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium / P. Yoong et al. // J. of Bacteriol. 2004. - 186, № 14. - P. 4808 - 4812.

100. Identification of catalase-negative, non-beta-hemolytic, gram-positive cocci isolated from milk samples / M. Fortin et al. // J. of Clinical Microbiol. 2003. — 41, № l.-P. 106-109.

101. In silico and in vivo evaluation of bacteriophage <p EF24C, a candidate for treatment of Enterococcus faecalis infections / J. Uchiyama et al. // Appl. and Environ. Microbiol. 2008. - 74, № 13. - P. 4149 - 4163.

102. Infection of central nervous system by motile Enterococcus: first case report / A. Kurup et al. // J. of Clinical Microbiol. 2001. - 39, № 2. - P. 820 - 822.

103. Intrahospital spread of vancomycin-resistant Enterococcus faecium in Sweden / E. Torell et al. // Scand. J. Infec. Diseases. 1997. - 29, № 3. - P. 259 -263.

104. Jett, B.D. Virulence of Enterococci / B.D. Jett, M.M. Huycke, M.S. Gilmore // Clinical Microbiol. Reviews. 1994. - 7, № 4. - P. 462 - 478.

105. Klein, G. Antiotic resistance patterms of enterococci and occurrence of VRE in raw minced beef and pork in Germany / G. Klein, A. Pack, G. Reuter // Appl. and Environ. Microbiol. 1998. - 64, № 5. - P. 1825 - 1830.

106. Laukova, A. Distribution and characterization of Enterococcus species in municipal sewages / A. Laukova, P. Juris // Microbios. 1997. - 89, № 359. - P. 73 - 80.

107. Low faecal carrier rate of vancomicin resistant enterococci in Norwegian hospital patients / G.S. Simonsen et al. // Scand. J. Infec. Diseases. 1998. - 30, №5.-P. 465-468.

108. Manero, A. Identification of Enterococcus spp. with a biochemical key / A. Manero, A.R. Blanch // Appl. and Environ. Microbiol. 1999. - 65, № 10. - P. 4425-4430.

109. Meeting review. The seventh international conference on the genetics of Streptococci, Lactococci and Enterococci / R.A. Burne et al. // J. of Bacteriol. -2007. 189, № 4. - P. 1209 - 1218.

110. Moellering, R.C. Vancomicin-resistant enterococci / R.C. Moellering // Clin. Infec. Diseases. 1998. - 26, № 5. - P. 1196 - 1199.

111. Murray, B.E. Editorial response: What can we do about vancomycin-resistant enterococci? / B.E. Murray // Clin. Infec. Diseases. 1995. - 20, № 5. -P. 1134-1136.

112. Murray, B.E. Pathogenicity of enterococci and problems of glycopeptide resistance / B.E. Murray // Kansenshogaku zasshi — J. Jap. Assoc. Infec. Diseasea. 1999. - 73, № 8. - P.795.

113. Murray, B.E. The life and times of the Enterococcus / B.E. Murray // Clinical Microbiol. Reviews. 1990. - 3, № 1. - P. 46 - 65.

114. Occurence and significance of Enterococcus faecium resistant to vancomycin / U.P. Zimmermann et al. // Antiinfec. Drugs and Chemother. — 1998. 16, № 2. - P. 147 - 149.

115. Occurrence and relatedness of vancomycin-resistant Enterococci in animals, humans, and the environment in different European regions / I. Kiihn et al. // Appl. and Environ. Microbiol. 2005. - 71, № 9. - P. 5383 - 5390.

116. Occurrence of VRE in humans and animals in the Czech Republic between '2002 and 2004 / M. Kolar et al. // J. of Medic. Microbiol. 2005. - 54. - P. 965 -967.

117. Preliminary evidence for the unrelatedness of human VREF infection from poultry: Abstr. 175th Meet. Pathol. Soc. Gr. Brit. And Irel., Sheffield, 2-4 July, 1997 / M. Kirk et al. // J. Med. Microbiol. 1997. - 46, № 12. - P. 1056.

118. Qamer, Sh. Use of colony morphology to distinguish different Enterococcal strains and species in mixed culture from clinical specimens / Sh. Qamer, J.A.T. Sandoe, K.G. Kerr // J. of Clinical Microbiol. 2003. - 41, № 6. - P. 2644 - 2646.

119. Resistance of enterococci to ampicillin and glycopeptide antibiotics in Italy: Pap. Symp. Bact. Resist.: Lab. Explan. And Clin. Conseq., Surrey, 15-17 Apr.,1996 / R. Fontana et al. // Clin. Infec. Diseases. 1998. - 27, Suppl. № 1. - P. 84 -86.

120. Rogers, C.G. Characterization of the Enterococcus bacteriophages from the small intestine of the rat / C.G. Rogers, W.B. Sarles // J. of Bacteriol. 1963. - 85. -P. 1378- 1385.

121. Ruoff, K.L. Resent taxonomic changes in the genus Enterococcus / K.L. Ruoff // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1990. - v. 9. - P. 75 - 79.

122. Sherman, J.M. The enterococci and related streptococci / J.M. Sherman // Bacteriol. 1938. - v. 35. - P. 81 - 93.

123. Stool carrical isolation, and mortality during an outbreak of vancomycin-resistant enterococci in hospitalized medical and/or surgical patients / C. Wells et al. // Clin. Infec. Diseases. 1995. - 21, № 1. - P. 45 - 50.

124. Susceptibility testing of clinical isolates of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis / M. Louie et al. // J. of Clinical Microbiol. — 1992. 30, № 1.-P. 41 -45.

125. Tang, Yi-Wei Molecular diagnostics of infectious diseases / Yi-Wei Tang, G.W. Procop, D.H. Persing // Clinical chemistry. 1997. - 43, № 11. - P. 2021 -2038.

126. Tritz, D.M. Evaluation of microscan for identification of Enterococcus species / D.M. Tritz, P.C. Iwen, L.W. Gail // J. of Clinical Microbiol. 1990. - 28, №6.-P. 1477- 1478.

127. Tucci, V. Epidemiology and control of vancomycin-resistant enterococci in an adult and children's hospital / V. Tucci, M.A. Haran, H.D. Isenberg // Amer. J. Infec. Contr. 1997. - 25, № 5. - P. 371 - 376.

128. Vancomycin resistant enterococci (VRE): is it possible?: Abstr. APIC 24th Annu. Educ. Conf. and Int. Meet., New Orleans, La, June 8- 12, 1997 / N. White et al. // Amer. J. Infec. Contr. 1997. - 25, № 2. - P. 145.

129. Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis: Now also in Belgium / J. Coene et al. // Acta clin. belg. 1995. - 50, № 1. - P. 46 - 47.

130. Varying linezolid susceptibility of vancomycin-resistant Enterococcus faecium isolates during therapy: a case report / S. Swobodal et al. // J. Antimicrob. Chemother. 2005. - 56. - P. 787 - 789.

131. Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses / Edited by M. H. V. van Regenmortel et al.. San Diego: Academic Press, 2000. - P. 43 - 53, 64 - 129.

132. Yang, H.-Y. Construction of integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of Enterococcal temperate phage cj> FC1 / H.-Y. Yang, Y.-W. Kim, H.-Ihl. Chang // J. of Bacteriol. 2002. - 184, № 7. - P. 1859 -1864.

133. Young, R. Bacteriophage lysis: mechanism and regulation / R. Young // Microbiol. Reviews. 1992. - 56, № 3. - P. 430-481.

Информация о работе

Ковалева, Елена Николаевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Создание биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов Enterococcus faecalis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы