Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание бактериального продуцента антигенной детерминанты панкреатической холистеролэстеразы человека и разработка на его основе иммуноферментного анализа для определения аутоантител

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание бактериального продуцента антигенной детерминанты панкреатической холистеролэстеразы человека и разработка на его основе иммуноферментного анализа для определения аутоантител"

На правах рукописи

ИЛЬИНА Елена Николаевна

СОЗДАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОДУЦЕНТА АНТИГЕННОЙ ДЕТЕРМИНАНТЫ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ Х0ЛЕСТЕР0ЛЭСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА И РАЗРАБОТКА НА ЕГО ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной эндокринологии Эндокринологического Научного Центра РАМН.

Научный руководитель: академик РАМН Панков Ю.А. Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, профессор Рубцов П.М.

- кандидат биологических наук Лунин В.Г.

Ведущее учреждение - Институт биомедицинской химии РАМН

в .ас на заседании диссертационного совета (Д002.7Э.0Х) при ИМБ

им В.А. Энгельгардта РАН по адресу - 117984 Москва, ул. Вавилова, д.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ РАН

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан V

199(/г.

Ученый секретарь

кандидат химических наук

диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Начиная с середины текущего столетия в связи с внедрением достижений биологической науки в практику здравоохранения произошли существенные изменения в структуре заболеваний человека. Изменился спектр инфекционных заболеваний за счет широкого применения антибиотиков и вакцинации населения против наиболее опасных микроорганизмов, возросла доля внутренних болезней и аутоиммунных заболеваний, обусловленных нарушением нормальных физиологических процессов, протекающих в человеческом организме. Томимо сложностей, возникающих в процессе лечения таких больных, зесьма затруднительна диагностика внутренних болезней, особенно превентивная диагностика, так как клиническая картина болезни наблюдается при уже значительных поражениях органов и тканей.

Одной из основных задач клинической биохимии является поиск новых гуморальных маркеров для дифференциальной диагностики различных заболеваний внутренних органов, прогнозирования тяжести течения патологического процесса и возможности развития осложнений. Такого эода маркерами могут служить антитела, вырабатываемые к наиболее шмуногенным белкам органов и тканей. Являясь по сути вторичными на 1ервых стадиях патологического процесса, эти аутоантитела могут играть гущественную роль в процессе развития поздних осложнений, а значит, югут служить гуморальными маркерами последних.

Представляемое исследование является частью общей научной работы, [розодимой в лаборатории молекулярной эндокринологии

)ндокринологического Научного Центра РАМН. Основным направлением этих [сследований является выявление наиболее иммуногенных белков, жспрессируемых клетками инсулиномы человека, создание их ¡актериальных продуцентов и разработка методов тестирования

аутоантител при использовании рекомбинантных белков в качест! антигена. Объектом исследований была выбрана секретирующая инсулиноь человека, из ткани которой сконструирована клонотека кДНК экспрессируицем плазмидном векторе р11ЕХ1 и выделена суммарная фракци экспрессируемых белков.

Цель и задачи исследования. Целью представляемой диссертационно работы было создание бактериального продуцента антигенной детерминант панкреатической холестеролэстеразы человека и разработка на его основ методов тестирования антител с использованием существующей клонотек кДНК из инсулиномы человека.

Конкретными задачами исследования являлись:

• получение иммунологически активной антисыворотки морской свинки суммарным белкам инсулиномы человека, содержащей антитела панкреатической холестеролэстеразе;

• проведение с помощью последней иммуноскрининга клонотеки кДНК и: инсулиномы человека в экспрессируицем плазмидном векторе рЧЕХ1 1 выявление иммунопозитивных рекомбинантных клонов; идентификаци: иммунопозитивных белков;

• установление локализации антигенной детерминанты в структур! иммунопозитивного фрагмента панкреатической холестеролэстеразы, используя методы молекулярного клонирования, секвенирования \ иммуноферментного анализа;

• выделение гибридных белков, вырабатываемых созданными генно-инженерными продуцентами;

• использование рекомбинантных белков в качестве антигена в разработке лабораторного варианта твердофазного иммуноферментного методе выявления антител к панкреатической холестеролэстеразе в сыворотке человека и морской свинки;

> проведение скрининга больных с различными нарушениями функции поджелудочной железы с целью выявления у них аутоантител к панкреатической холестеролэстеразе человека и установления корреляции с определенными видами патологии.

Научная новизна работы заключается в изучении некоторых свойств :равнительно нового объекта, недавно описанного фермента поджелудочной селезы человека - панкреатической холестеролэстеразы (пХЭ.

Новым является изучение природы иммуногенности пХЭ человека. В >езультате проведенных экспериментов показана локализация антигенной ;етерминанты пХЭ в области пролин-богатых повторов типа PVPPTGDSGAP, и 'аким образом, однозночно установлена одна из функций этой уникальной (елковой структуры.

Впервые разработан лабораторный вариант иммуноферментного метода ыявления антител к пХЭ человека в сыворотках человека и морской винки. Проведенная клиническая апробация этого метода способствовала ыяснению возможной роли фермента пХЭ человека в развитии кистозного оражения ткани поджелудочной железы.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены а расширенном межлабораторном заседании Института экспериментальной ндокринологии ЭНЦ РАМН (Москва, 1998), на научной конференции, освященной 80-летию академика H.A. Юдаева (Москва, 1993), на Третьем еждународном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, 1995) , на ретьем Российском съезде эндокринологов (Москва, 1996) и на X еждународном конгрессе по эндокринологии (Сан Франциско, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ и одна дана в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 8 6 траницах машинописного текста; состоит из введения, обзора итературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы

исследования, результаты исследования и их обсуждение, заключения выводов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 15 рисункам! библиографический указатель включает 74 публикаций, в том числе - < зарубежных авторов.

Вклад соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Bet коллегам автор приносит благодарность за участие в совместной работе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали штамм E.coli МС1061 (araD139, Д [ara-leu 7 697, Д (lac)X74, galK", hsdR, rpsL) фирмы "Amersham".

Бактерии культивировали в стандартной среде LB (1% бакто-трипток 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, pH 7,0), которую готовили и реактивов фирмы "Difco". Колонии бактерий выращивали на твердой сред L-arap (1% бактотриптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, 1,5 бакто-агар, pH 7,0). Селективные среды для накоплени трансформированных йлазмидой клеток E.coli дополнительно содержал 0,0025% ампициллина.

Клонотека кДНК. Клонотека кДНК (4,7x10* рекомбинантов) и инсулиномы человека в экспрессирующем плазмидном векторе pUEX сконструирована в лаборатории молекулярной эндокринологии ЭНЦ РАМН использованием коммерческих наборов фирмы "Amersham" "RNA extractio kit"n "cDNA cloning system - plasmid pUEXl". В процессе создани клонотеки кДНК получен препарат суммарных белков инсулиномы.

Получение антисыворотки к белкам инсулиномы. Для получени поликлональной антисыворотки морских свинок иммунизировали суммарно фракцией белков инсулиномы человека. Иммунизацию животных проводил раствором белков в полном адъюванте Фрейнда в отношении 1:1. Одн инъекция состояла во введении 0,5 мл раствора белка подкожно (по 10

1кл в 5 разных мест) . Инъекции проводились пять раз с интервалом в 3 ¡едели, образцы сыворотки получали через 2 недели после каждой [нъекции.

Антисыворотку тестировали твердофазным иммуноферментным методом ELISA), разработанным научным коллективом лаборатории для определения нтител к поверхностным антигенам ß-клеток поджелудочной железы. В ачестве антигенов использовали цитозольную и микросомальную фракции леток инсулиномы человека и RIN (rat insulimona) клеток. Контролем лужила сыворотка интактных морских свинок.

Иммуноскрининг клонотеки кДНК антисывороткой к суммарной фракции елков инсулиномы проводили с помощью набора "SuperScreen mmunoscreening system" фирмы "Amersham". Клоны из клонотеки кДНК нсулиномы человека в экспрессирующем плазмидном векторе pUEXl ысевали на чашки Петри (1,5.103 колоний на чашку диаметром 90 мм), олонии переносили на нитроцеллюлозный фильтр Hybond-C extra "Amersham") и подращивали в течение 30 минут. Экспрессию белков ызывали инкубацией реплики на агаре в течение 2 часов при 42°С. олонии лизировали в парах хлороформа 4 0 минут с последующей бработкой 0.04% лизоцимом и 0,001% ДНКазой в TBS. Фильтры отмывали ри комнатной температуре 4 раза по 5 минут в TBS (10 мМ Трис, 150 мМ aCl, pH 7,4). Для блокирования неспецифических центров связывания елка фильтры насыщали в течение ночи избытком BSA (2% BSA в TBS).

При скрининге клонотеки кДНК в качестве первых антител ^пользовали поликлональную антисыворотку, которую разводили в 0,2% ЗА в TBS в отношении 1:1000. Для подавления связывания антисыворотки белками E.coli в инкубационную смесь добавляли лизат E.coli (10 г/мл) в разведении 1:20. Фильтры инкубировали с раствором -:тисыворотки и лизата в течение 1 часа при комнатной температуре. зеле отмывки в TBST (10 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4)

фильтры инкубировали в 0,2% BSA в TBS в течение часа с конъюгатс антител козы против Ig морской свинки с пероксидазой хрена, взятом разведении 1:15000. После отмывки TBST связавшийся конъюгат выявляли реакции с 0.01% Н2О2 в присутствии 0.04% DAB (3,3'-диаминобензидш тетрагидрохлорида) в TBS.

Выделение плазмидной ДНК, обработку ДНК эндонуклеазад рестрикции, электрофорез в агарозном и полиакриламидном геле проводи! по стандартным методикам, изложенным Маниатис Т. (1984) и Гловер I (1988) с некоторыми модификациями.

Нуклеотидную последовательность вставки кДНК определяли по метол Сенгера, используя набор "Т7 Sequenase DNA sequencing kit" фир1/ "Amersham".

Клонирование фрагментов кДНК. Вставку кДНК бактериального клон pHICEO, 9 разрезали по участкам расщепления Нае II и Ысо I. Тр фрагмента достраивали до тупых концов Т4 ДНК полимеразой и лигировал с ВатН I-адаптерами. В качестве вектора для клонирования использовал плазмиду pUEXl (6731 п.н.), содержащую ген р-лактамазы (обеспечивающи ампицилин-резистентность трансформантов), сильный контролируемы промотор фага лямбда (Рг) , температурно-чувствительный репрессор структурный ген р-галактозидазы. После трансформации клеток E.col данный вектор продуцирует фермент р-галактозидазу (1000 а. о., 11 кДа) . Клонируемые фрагменты встраивали в вектор по сайту рестрикци ВатН 1, расположенному в полилинкере, который находится на З'-конц нуклеотидной последовательности, кодирующей Р-галактозидазу. Дл корректировки рамки считывания дополнительно использовали дв плазмидных вектора pUEX2 и pUEX3, отличающихся от pUEXl на 1 и нуклеотида соответственно. Данная экспрессируицая плазмида позволяв получать до 105 молекул рекомбинантного белка (гибридного белка

i-галактозидазой) на клетку. Клонирование фрагментов кДНК проводили с гомощыо набора "cDNA cloning system plasmid pUEXl" фирмы "Amersham".

Компетентную культуру бактериальных штаммов приготовляли 'рубидиевым методом", описанным Маниатис Т.

Трансформация клеток E.coli проводили в течение 30 - 60 минут при °С (на льду). После теплового шока (42°С, 90 секунд) рансформированные клетки инкубировали 5 минут на льду, растили в 1 мл В в течение часа при 30°С и высевали на чашки Петри с селективной редой (L-arap, 0,0025% ампициллин).

Экспрессия гибридных белков вызывали разрушением термолабильного елка-репрессора Ьас-оперона тепловой индукцией при 42°С в течение 2-х асов. Наращенную биомассу осаждали центрифугированием, осадок хранили ри -20"С.

Электрофоретическое разделение белков бактериальных клонов роводили в 10% ПААГ в присутствии додецил сульфата натрия (0,1% SDS) о методике Леммли. Окрашивание гелей проводили в течение 1-2 часов з астворе Coomassi Brilliant Blue, R 250 (25% изопропанола, 10% ксусная кислота, 0,05% Coomassi Brilliant Blue, R 250) с последующей гмывкой в растворе 10% изопропанола и 10% уксусной кислоты.

Иммуноблотинг гибридных белков. Электроперенос белков из 10% ПААГ а нитроцеллюлозный фильтр Hybond-C extra ("Amersham") осуществляли по этоду Towbin. Электроперенос осуществляли в течение часа при силе эка 60 мА, после чего фильтры промывали водой и инкубировали в 2% BSA TBS ночь при 4°С. Иммуноферментное выявление гибридного белка доводили после электропереноса белков на нитроцеллюлозные фильтры /bond-С extra ("Amersham") с помощью антисыворотки к суммарным белкам ^сулиномы, конъюгата антител козы против Ig морской свинки с эроксидазой хрена и DAB ("Amersham").

Выделение гибридных белков. Биомассу клеток (1,5 суспендировали в 10 мл буфера 1 (50 мМ Трис-HCl, pH 8,0; 100 мМ NaC 1 мМ ЭДТА). Клетки лизировали с помощью лизоцима (конечн концентрация 0,5 мг/мл) и ультразвуковой обработки при максимальн* мощности и частоте 20 кГц с последующим центрифугированием в течеы 20 мин при 10000 об/мин. Осадок гибридного белка дважды промыва: буфером 1. Выделенный гибридный белок хранили при -35° С в течен! нескольких недель.

Разработанный метод твердофазного иммуноферментного анализ; Иммуноферментный метод определения антител к пХЭ человез разрабатывали с помощью антисыворотки к суммарной фракции белке инсулиномы, содержащей антитела к пХЭ. В качестве антигене использовали рекомбинантные иммунопозитивные фрагменты пХЭ челове! (HICE и HICEM).

Частично очищенные рекомбинантные белки растворяли в карбонатне буфере (50 мМ NaHC03, pH 9,6). Иммобилизацию антигенов (5-8 мкг/мл) i полистирольном планшете проводили в течение 20-22 ч при 4°С. t связавшийся антиген удаляли двух кратной промывкой 0,02% Tween 20 PBS (136 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8мМ Na2HP04, 1,5 мМ КН2РО4, pH 7,6) Места неспецифической сорбции блокировали 2% BSA в PBS при 37°С течение 60 мин. После высушивания 24 ч при комнатной температур планшеты хранили при -20°С.

В лунки иммунологического планшета вносили по 100 мк анализируемой сыворотки, разведенной буфером (1% BSA, 0,3M NaCl в PBS в соотношении 1:1000. Для подавления неспецифической реакции с белкак Е. coli разведенную сыворотку предварительно инкубировали 30 мин лизатом Е. coli (10 мг/мл) в разведении 1:20. После инкубации (90 мин 37°С) с первыми антителами и трехкратной отмывки 0,05% Tween 20 в РЕ во все лунки вносили по 100 мкл конъюгата антител козы против I

дарской сеинки с пероксидазой хрена, разведенного буфером (1% BSA, Э,ЗМ NaCl в PBS) в соотношении 1:10000, и инкубировали 90 »дин при 37°С. После трехкратной отмывки 0,05% Tween 20 в PB S связавшийся сонъюгат выявляли, добавляя в лунки по 100 мкл субстрата - раствора зрто-фенилендиамина (0,07 %) и Н2О2 (0,004 о%) в цитрат фосфатном зуфере (0,01 M лимонная кислота, 0,1 M НагНРО,}, pH 5,5). Цветную зеакцию останавливали через 20 мин, внося в лунки по 100 мкл 2М H2SO4, 1 колориметрировали на мультискане "Сапфир" при длине волны 4 92 нм. :ыворотки параллельно тестировали с ß-галактозидазой, нанесенной на юлистироловый планшет в концентрации, сравнимой с концентрацией 1сследуемого антигена, для выявления неспецифической реакции. ;пеиифичность метода доказали предварительной инкубацией (60 мин) ■вотируемой антисыворотки с рекомбинантными белками HICS или HICEM, Юбавляемыми в пятикратной концентрации по отношению к концентрации (нтигена, нанесенного на планшет.

Определение антител к пХЭ в сыворотке крови человека проводили аналогично, используя разведение анализируемой сыворотки в соотношении :100. Для выявления связавшихся с антигеном антител применяли юнъюгат антител . козы против Ig человека с пероксидазой хрена, 'азведенного буфером (1% BSA, 0,3M NaCl в PBS) в соотношении 1:1000.

Статистическая обработка результатов ELISA. Позитивную реакцию :ыворотки на антиген оценивали в сравнении с негативными сыворотками лабораторный контроль). Сыворотку считали позитивной, если ее птическая плотность превышала таковую контрольной на За (МКОНтр+За). остоверность полученных результатов оценивали с помощью критерия тьюдента.

-12-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клонирование, определение нуклеотидной последовательности кДНК v. экспрессия в Е. coli иммуногенного белка - С-концевого участка панкреатической холестеролэстеразы человека.

Рекомбинантный клон, содержащий кДНК вставку пХЭ человека бы отобран из созданной в лаборатории молекулярной эндокринологии ЭН РАМН клонотеки кДНК (4.7x10^ рекомбинантов) из секретирующе инсулиномы человека.

В результате иммунизации морских свинок раствором белко инсулиномы получены 5 фракций антисывороток. При содействи сотрудников лаборатории молекулярной эндокринологии ЭНЦ РАМН к.б.н Кеды Ю.М. и к.б.н. Горсковой В.А. антисыворотки протестирован твердофазным иммуноферментным методом (ELISA) при использовании качестве антигенов цитозольной и микросомальной фракций клето инсулиномы человека и RIN клеток.

Таблица 1. Тестирование фракций антисывороток морской свинки суммарным белкам инсулиномы человека методом ELISA.

Антиген RIN, цитозоль RIN, микросомы инсулинома человека, цитозоль инсуликома человека, микросомы

Сыворотка среднее значение OD492

Контрольная 0, 07 0,10 0, 07 0,12

1 фракция 0, 025 0, 05 0,055 0, 05

2 фракция 0, 04 0,07 0,32 0, 06

3 фракция >2,00 0,36 0,36 0,10

4 фракция 0, 15 0,39 0,14 0, 06

5 фракция 0,71 0,41 0,47 0,23

Анализ полученных данных юзволил установить, что наиболее занней иммунологически активной антисывороткой является третья зракция антисыворотки, полученная, :оответственно, после трех

юследовательных иммунизадий

юрской свинки раствором суммарных :елков инсулиномы (таблица 1) . [сходя из предпосылки, что первыми юзникают антитела к наиболее ммуногенным белкам, именно третья ракция антисыворотки была

спользована для иммуноскрининга еловека.

В результате иммуноскрининга клонотеки кДНК этой антисывороткой ыявлен иммунопозитивный рекомбинантный клон рН1СЕ0.9, плазмида оторого содержала вставку кДНК размером около 950 п.н.(рис. 1). екомбинантая плазмида, входящая в состав этого клона, содержит ген (5-алактозидазы (lac Z), на 3'-конце которого в полилинкер по ВатН Г айту с помощью адаптеров встроена вставка кДНК, кодирующая укариотический белок (рис 2) . Для осуществления селективного отбора актериальных клонов, содержащих плазмидную ДНК, в состав используемой пазмиды входит ген (3-лактамазы, обеспечивающий устойчивость рансформантов к ампициллину. Экспрессия гибридного белка созданной энно-инженерной конструкцией обеспечивается сильным промотором фага л Рг) , находящимся под контролем термочувствительного белка-репрессора

4 2 3 и S 6 7

Рис. 1. Электрофореграмма плазмид, выделенных из

иммунопозитивных клонов, и продуктов их рестрикции по ВатН I сайту: 1, 2, 3 - цельные плазмиды; 4, 5, 6 -продукты рестрикции по ВатН I сайту, 7 -маркер длин рестрикционных фрагментов: X/EcoR I, Hind III.

клонотеки кДНК из инсулиномы

(С/857). После трансформации клеток Е. coli штамма МС1061 данна; рекомбинантная плазмида в результате тепловой индукции (42°С! экспрессирует гибридный белок HICE, в состав которого входят ß-галактозидаза и фрагмент пХЭ человека.

Sna I BaibH Г sal I Pat I

III I

GCC CGG CCA TCC GTC GAC CTG CAG CAC AGG TTG CTG ATT GAT TGA Ala Arg Gly Ser Val Asp Leu Gin Pro Ser Leu Leu lie Азр

Структура BamH I адаптера

BaaHI KpnX Ncol

GATCC GGC AAC GAA GGT ACC ATG G G CCG TTG CTI CCA TGG TAC С

Рис. 2. Схема рекомбинантной плазмиды pUEXl со вставкой кДНК С-концевого участка панкреатической холестеролэстеразы человека. Фрагмент кДНК встроен по BamH 1 сайту рестрикции в полилинкер плазмидь с помощью BamH 1 адапторов

Белковые продукты экспрессии бактериальных клонов разделяли в 10Í SDS ПААГ. Наличие белка с молекулярной массой больше 116 кДг (Р-галактозидаза) указывало на экспрессию рекомбинантным клоноь гибридного белка в комплексе с р-галактозидазой. Специфичность используемой антисыворотки к экспрессируемому гибридному белк} показана методом иммуноблота (рис. 3).

Рис.З. А) Электрофореграмма продуктов экспрессии бактериальных штаммов: 1 - р-галактозидгза (116 кДа), 2 - риЕХ1, экспрессируюший р-галактозидазу, 3 - риЕХЗХпэв, экспрессирующий проинсулин в составе гибридного белка с р-галактозидазой, 4 - рН1СЕ0.9. В) Иммуноблотинг продуктов

экспрессии бактериальных штаммов, проведенный при использовании антисыворотки к суммарной фракции белков инсулиномы: 1 - рЦ5Х1, 2 -рНХСЕО.9, 3 - риЕХ31пэ8.

Было установлено, что используемая третья фракция антисызоротки пецифически реагирует только с гибридным белком, экспрессируемым лоном рН1СЕ0.9, оставаясь иммунологически неактивной в отношении р-алактозидазы и гибридного белка с препроинсулином человека. етодом Сенгера было проведено определение нуклеотидной оследовательности вставки кДНК отобранного иммунопозитивного клона, спользование прямого и обратного универсальных праймеров позволило пределить нуклеотидную последовательность концевых участков вставки ДНК (252 п.н. с 51 -конца и 230 п.н. с З'-конца). Полное еквенирование вставки рекомбинантного клона рН1СЕ0.9 не проводили, эскольку сравнение установленных последовательностей с известными труктурами в Банке Генов обнаружило 100% совпадение с оответствующими известными последовательностями кДНК панкреатической злестеролэстеразы (пХЭ) человека (рис. 4).

Исходя из результатов определения нуклеотидной

эследозательности, а также размера вставки кДНК (около 910 п.н. с ■тетом размера ВатН 1 адапторов) и экспериментально построеной гстриктной карты сделано заключение об идентичности вставки кДНК экомбинантного клона рН1СЕ0.9 с 3'-концевым фрагментом пХЭ человека, злученный экспрессирующий клон содержит кодирующую (791 п.н.) и 3'-гтранслируемую (118 п.н.) области.

А ПЗ^ В 4 2 3

•'■« »»V» ь ч

••■•'. 1 с

■»--; V.-

--А»

и

483

1526

1

503

1588

63

523

1648

123

543

1708

183

563

1768

243

583

1828

303

603

1888

363

623

1948

423

643

2008

483

663

2068

543

683

2128

603

703

2188

663

723

2248

723

743

2308

783

2368

843

:. 4.

гмен'

на р]

Уа13егЬу5А1аМеЪ11еМаТугТгрТЬгАБп№еА1аЬузТЬгС1уА5рРгоАзп1^^ САОТСТСТААССССАТСАТСОССТАСТССАССАССТТТСССААААСАбССОАССССААСАТв САСТСТСТААСОССАТСАТССССТАСТСбАССАССТТТОССААААСАвбвОАССССААСАТС

61уА5рЗегА1аУа1РгоТЬгН1£ТгрС1иРгоТугТЬгТЬгС1иАзпЗег01уТугЬеи ССССАСТССССТСТ6СССАСАСАСТСввААСССТАСАСТАС013ААААСАССС5СТАССТС бССОАСТСеССТОТССССАСАСАСТСОСААСССТАСАСТАСОеААААСАСССеСТАССТб

51и11еТЬгЬуЕЬузМеТ01уЗегЗегЗегМе^уЕАгдЗегЬеиА1:етЬгАзпРЬеЬеи бАСАТСАССААОААОАТССССАОСАССТССАТОААССССАгССТСАбАСССАССТТССТС аА5АТСАССААСАА!ЗАТСС0СА6САССТССАТСААССС0А5ССТСАСАСССАССТТССТС

Аг6ТугТгрТЬг1еиТЬгТугЬеиМаЬеиРгоТЬгУа1ТЬгАзрС1пС1иА1аТЬгРго СОСТАСТССАСССТСАССТАТСТОвСССТССССАСАСТеАСССАССАСОАССССАССССТ СОСТАСТСОАСССТСАССТАТСТСвСССТеСССАСАСТСАСССАССАССАОСССАССССТ

Уа1РгоРгоТЬгС1уАзрЗег01иА1аТЬгРго'Уа1РгоРгоТ11ге1уАарЗег01иТЬг СТ<ЗССССССАСАО<ЗвСАСТССвАОвССАСТССССТОССССССАСО<ЗеТСАСТССОАеАСС ОТСССССССА--------------------------------------------------

А1аРго\Га1РгоРгоТЬгС1уАЕр5ег01уА1аРгоРгоУа1РгоРгоТЬг01уА5рЗег

ссссссстоссосссАсооокзАстссбеовссссссссетсссесссАсеоетоАстсс

01уА1аРгоРгоУа1РгоРгоТЬгВ1уАБрЗег01уА1аРгоРгоУа1РгоРгоТ11г01у (юсвссссссссатсссгссслссоатсАстссоссоссссссссстсссссссАссгвт

А£рЗегС1уА1аРхоРгоУа1РгоРгоТЬг61уАзрЗегС1уА1аРгоРгс^а1РгоРго

ОАСТссеоесссссссссетсссссссАстсетоАстссазаххссссссстсссвссс

ТЬгС1уА5рЗег С1уА1аРгоРгоУа1РгоРгоТЬг31уАБр2егС1уА1аРгоРгоУа1 АсооатсАСТссосзассссссссотоссасссАСоватоАстссоосассссссссатс

РгоРгоТЬгС1уА5рА1аС1уРгоРгоРгоУа1РгоРгоТЬг01уА5рЗегС1уА1аРго

ссесссАсесстаАсосссо<зсссссссссвтессосссАсввот(ЗАСТссеососсссс

РгоУа1РгоРгоТЬг01уА*рЗег01уА1аРгоРгоУа1ТЬгРгоТЬг01уАврЗеге1и СССОТОССОСССАСОвСТОАСТССеб(ЗОССССССССеТОАСССССАСбТОТОАСТССОАв

ТЬгА1аРго\Га1РгоРгоТЬгВ1уАврЗегв1уА1аРгоРгоУа1РгоРгоТ1>г01уА5р АССТСССССОТбССССССАСТССТОАСТССОв&ХХСССССТОТВССССССАСТСОТОАС ----------------ссАсоеетс»стссоск5<к:сссссстотоссссссАСоеотоАС

8ег01иА1аА1аРгоУа1РгоРгоТЬгА5рАБрЗегЬу5е1иА1аС1пг^РгоА1аУа1 ТСТеАаОСТаССССТЭТСССССССАСАЗАТОАСТССААСОААеСТСАСАТСССТССАСТС ТСТ(ЗАОвСТОССССТвТОССССССАСА(5АТаАСТССААО<ЗААвСТСА6АТСССТССАСТС

НеАгдРЬе

АТТАОвТТТТАССбТСССАТеАОССТТССТАТСААСАССССАСААОАСТОССАССССАСе АТТАССТТТТАСССТСССАТСАСССТТССТАТСААСАССССАСААаАСТССвАССССАбС

ОгСТССССТСССАТСТТСАОСТСТТССТСААТАААСССТСАТАССССТААААААААААААА С5СТССССТСССАТСТТСАССТСТТССТ6ААТАААСССТСАТАССССТААААААААААААААА.!\ААА

Аминокислотная (1) и нуклеотидная (2) последовательности С-кондевого а пХЭ; (3) нуклеотидные последовательности 5'- и 3'- кондов кДНК вставки 1СЕ0.9. Жирным выделена область пролин-богатых повторов.

*4ожно полагать, что клон рН1СЕ0.9 продуцирует белок размером 263 а.к., соответствующий С-концевому участку пХЭ. Этот участок включает в себя 16 повторов из 11 аминокислотных остатков типа PVPPTGDSGAP, начиная с 60-ого аминокислотного остатка Pro в пептиде (рис. 4.).

Интересен сам факт обнаружения рекомбинантного клона, содержащего кДНК фрагмента пХЭ, в библиотеке кДНК из инсулиномы человека. В данном случае не правомочно утверждать, что в клетках инсулиномы синтезируется полноценный фермент панкреатическая холестеролэстераза. Матрицей для синтеза выявленной кДНК может быть мРНКовый продукт транскрипции псевдогена пХЭ, невысокий уровень экспрессии которого иблюдается практически во всех тканях. Подобно другим псевдогенам, гго размер составляет всего 4846 п.н. за счет отсутствия сегмента размером 4800 п.н., включающего экзоны 2-7 гена пХЭ человека. Несмотря ¡а эти отличия он имеет на 3'-нетранслируемой области сайт юлиаденилирования и способен транскрибироваться. Показано, что в слетках аденокарциномы поджелудочной железы возрастает уровень жспрессии псевдогена пХЭ. Возможно, что это общее свойство опухолевых ?каней и экспрессия обнаруженного фрагмента пХЭ в клетках инсулиномы [еловека связана с неспецифической активацией гена пХЭ (или [севдогена) вследствие опухолевого перерождения р-клеток.

Наличие антител к пХЭ человека в наиболее ранней иммунологически .ктивной фракции антисыворотки морской свинки к суммарным белкам :нсулиномы, позволил сделать вывод о сильной иммуногенности пХЭ. Специфичное взаимодействие антисыворотки с рекомбинантным белком, сказанное методом иммуноблота, явилось основанием полагать наличие инейной антигенной детерминанты пХЭ человека в С-концевом участке ермента. Закономерность образования антител к пХЭ человека в езультате иммунизации морских свинок раствором суммарных белков

инсулиномы была подтверждена взаимодействием в иммуноблоте боле< поздних фракций антисыворотки (четвертой и пятой) с гибридным белко! HICE.

Судя по данным научной литературы, природа антигенности пх; практически не изучена. Существуют косвенные сведения с полиспецифичности антител к пХЭ крысы, собаки, быка (перекрестнс реагируют с пХЭ человека и различных животных) и моноспецифичност* антител к пХЭ человека (реагируют только с пХЭ человека), позволяющие предположить локализацию сильной антигенной детерминанты в структуре, уникальной для пХЭ человека. Такой единицей могли быть пролин-богатые повторы, функция которых в структуре фермента до настоящего времени не исследована.

Локализация линейной антигенной детерминанты пХЭ в пролин-богатых повторах.

С целью уточнения локализации антигенной детерминанты пХЭ в структуре С-концевого фрагмента белка, три участка вставки кДНК клона рН1СЕ0.9 были клонированы в экспрессирумций плазмидный вектор pUEX. После расщепления изолированной вставки кДНК клона рК1СЕ0.9 рестриктазами Яае II и Neo I три субфрагмента кДНК пХЭ человека: 15261734, 1735-2057 и 2124-2428 п.н. (рис. 5) встроили в плазмидные векторы pUEX 1, 2 или 3 в соответствии с предсказанной рамкой считывания. Были сконструированы рекомбинантные клоны p2HICEN, plHICEíó и рЗН1СЕС, которые синтезируют гибридные белки, содержащие аминокислотные последовательности пХЭ 483-551, 553-658 и 682-745 а.о., соответственно. Таким образом, клон p2HICEN продуцирует фрагмент пХЭ (69 а.о.), который расположен непосредственно перед областью пролин-богатых повторов, а два других клона (plHICEM и рЗН1СЕС) - фрагменты пХЭ, содержащие пролин-богатые повторы. На рис. 6 приведены

электрофореграммы частично очищенных продуктов экспрессии исходного клона рН1СЕ0,9 и трех созданных клонов р2Н1СЕЫ, р1Н1СЕМ и рЗШСЕС.

Бактериальные рекомбгагантные: клоны : - '

plHICEO.9 p2HICEN

plHICEM рЗНТСЕС

1526

1526

Пае II

Пае II Пае II

■ 2428

1734

1735

ороляа~баг&тие повторы

' •• 2057 ■

2124 2428

Рис. 5. Схема клонирования фрагментов 3'-концевого участка пХЭ. )бласть, кодирующая 16 пролин-богатых повторов из 11 а.о., выделена :ерым. Цифры соответствуют положению нуклеотида в полноразмерной кДНК гХЭ человека.

Методом иммуноблотинга показано, что антисыворотка морской свинки : суммарной фракции белков инсулиномы, содержащая антитела к пХЭ, 1заимодействует только с рекомбинантными белками HICE, HICEM и HICEC рис. 7}, включающими пролин-богатые повторы пХЭ человека, но не ¡еагирует с р-галактозидазой, рекомбинантным препроинсулином и белком ¡ICEN. Эти данные однозначно свидетельствуют о локализации антигенной ;етерминанты пХЭ человека в пролин-богатых повторах.

Таким образом, в ходе проведенного исследования была частично :зучена природа иммуногенности пХЭ человека и однозначно установлено дно из свойств пролин-богатых повторов, уникальной белкоЕой структуры егзмента.

-202 3^5 6 2

Рис. 6. Электрофореграымы продуктов экспрессии рекомбинанткы: бактериальных клонов: 1 - риЕХ1, синтезирующий р-галактозидазу (11 кЦа); 2 - риЕХ1пз8, синтезирующий гибридный белок препроинсулин-Р-галактозидаза; 3 - рН1СЕ0.9; 4 - р2Н1СЕЫ; 5 - р1Н1СЕМ; 6 - рЗН1СЕС.

4 2 3 4 5" 6

Рис. 7. Иммуноблотинг продуктов экспрессии рекомбинантных бактериальных клонов, проведенный с использованием антисыворотки к суммарной фракции белков инсулиномы: I - риЕХ1, синтезирующий р-галактозидазу (116 кДа); 2 - риЕХ1пз8, синтезирующий гибридный белок прелроинсулин-р-галактозидаза; 3 - рН1СЕ0.9; 4 - р2Н1СЕИ; 5 - р1Н1СЕМ; 6 - рЗКЮЕС.

Раэработка ИФА для определения антител к пХЭ в сыворотке человека и морской свинки.

Для разработки иммуноферментного метода определения антител к пХЭ подобраны условия выделения и растворения гибридных белков, их жмсбилизации на твердую фазу (полистироловые планшеты) с сохранением антигенной активности и отработаны условия проведения реакции ззаимодействия антиген-антитело.

За основу разработки оригинальной методики определения антител к 1ХЭ человека в сыворотки крови человека и животных взяты условия 1ммуноферментного метода определения антител к глутаматдекарбоксилазе, той использовании в качестве антигена гибридного белка таутаматдекарбоксилазы с декапептидом. Отличительной особенностью цредлагаемой методики является использование достаточно большого >елка-носителя (ß-галактозидазы, 116 кДа), что позволяет экранировать [ужеродный участок белка от протеаз Е. coli, сохраняя его нативную :труктуру. В тоже время, большой размер рекомбинантного белка создавал шачительные трудности при его очистке и растворении.

Для выделения гибридных белков бактериальную клеточную массу :изировали с помощью лизоцима и ультразвуковой обработки. Анализ в 10% :DS ПААГ белков супернатанта и осадка, полученных после ;ентрифугирования обработанной ультразвуком суспензии, показал, что ибридный белок присутствует в осадке вместе с другими высоко илекулярными белками (рис. 8) . Дважды промытый буфером (50 мМ Трис-Cl, pH 8,0; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА) осадок гибридного белка хранился о использования при -35° С.

Отрабатывался способ растворения гибридных белков в фосфатном уфере в присутствии мочевины (27 мМ NaH2P04, 70 мМ Na2HP04, 7 М очевина) и в карбонатном буфере при различных значениях pH (9,6 -1) .

-22-

Нерастворимый белок осаждался центрифугированием, супернатант

анализировался в 10% ЭБЭ ПААГ. Наилучший результат растворения гибридного белка с сохранением его антигенных свойств был достигнут в карбонатном буфере, рН 9,6, в течение ночи при комнатной температуре.

4 г

I ifef-.

Рис. 8. Электрофореграмма в 10% SDS ПААГ белковых фракций:

1 - малорастворимый осадок,

2 - супернатант

Иммобилизацию гибридного белка на полистирольные планшет проводили в течение ночи при 4°С. Параллельное использование дву вариантов блокирования мест неспецифического связывания - обработк лунок раствором 2% BSA в PBS или 5% нормальной лошадиной сыворотки PBS в присутствии 0,05% Tween 20 - выявило непригодность последнег для разрабатываемого метода.

Таблица 2. Иммуноферментный метод определения- антител к пХ человека в антисыворотке морской свинки к суммарной фракции белко инсулиномы.

Антиген Контрольная (негативная) сыворотка морской свинки п=5 Антисыворотка морской свинки, содержащая антитела к пХЭ человека (позитивная) п=5

OD492

Р- галактозидаза 0,032±0,030 0,023±0,003

HICE 0,027±0,028 0,935+0,021 р<0,001

HICEM 0,035±0,029 1,020±0,190 р<0,001

Примечание: п - число поставленных экспериментов; р - значени критерия Стыодента, подтверждающее достоверность различий межд реакцией негативной и позитивной сывороткой на антиген.

Иммуноферментный метод определения антител к пХЭ разработан с использованием в качестве антигенов рекомбинантных фрагментов HICE и HICEM, проявляющих наиболее сильную иммунопозитивную реакцию (рис. 7). Также в качестве антигена для учета неспецифической реакции антисыворотки использовали ß-галактозидазу, поскольку последняя входит в состав гибридного белка (таблица 2). В качестве негативного контроля была использована сыворотка интактных морских свинок, позитивным контролем служила антисыворотка морской свинки к суммарной фракции белков инсулиномы, содержащая антитела к пХЭ человека.

Для предотвращения неспецифического связывания с иммобилизованным антигеном тестируемый образец антисыворотки разводили в 1% BSA, 0,ЗМ tfaCl в PBS. Помимо этого, перед внесением в лунки планшета, раствор антисыворотки инкубировали с лизатом Е. coli (0,5 мг/мл белка).

Таблица 3. Влияние предынкубации позитивной антисыворотки морской ;винки с белками-антигенами на специфическое взаимодействие с :оответствующими антигенами.

Антиген Предынкубация сыворотки с PBS (контроль) п=3 Предынкубация сыворотки с ß-галактозидазой п=3 Предынкубация сыворотки с антигеном п=3

OD_

HICE 2,212+0,048 2,050+0,125 0,359+0,038 р<0,001

HICEM 1,369+0,018 1,401+0,016 0,102+0,017 р<0,001

ß" галактозидаза 0,051+0,019 0,050+0,010 0,043+0,025

Примечание: п - число поставленных экспериментов; р - значение ;ритерия Стьюдента, подтверждающее достоверность различий С®492 между ¡начениями, полученными после предынкубации позитивной антисыворотки :о специфическим антигеном и без нее (контролем).

При разработке лабораторного варианта иммуноферментног определения антител к пХЭ сыворотки параллельно тестировали по тре антигенам - HICE, HICEM и р-галактозидазе. Специфичност разработанного метода доказана истощением тестируемой иммунопозитивно антисыворотки рекомбинантными белками HICE и HICEM, тогда ка предынкубация антисыворотки с PBS и р-галактозидазой не снижает е иммунопозитивную реакцию на специфичные антигены (таблица 3).

Выявление антител к пХЭ человека у больных с кистами головки поджелудочной железы.

В современной научной литературе не описаны методы определени антител к пХЭ в сыворотке крови и нет данных об изменении их уровн при различных заболеваниях. Существуют данные об изменении уровн самого фермента в крови [Lombardo,1993] и дуаденальном содержимо [Шибаева, 1989] при различных патологических процессах. Так концентрация пХЭ в сыворотке крови резко возрастает при остро панкреатите, снижается при аденокарциноме поджелудочной железы остается без изменений при хроническом панкреатите, хроническо гепатите и циррозе печени [Lombardo, 1993], что помогает проводит дифференциальную диагностику онкологических заболеваний поджелудочно железы и острого и хронического панкреатитов.

Учитывая полученные данные о сильной иммуногенности пХЭ, можн предположить, что при тяжелых хронических формах заболевани поджелудочной железы (хронический рецидивирующий панкреатит, киста кальциноз и др.) в крови больных появляются антитела к пХЭ, которы усугубляют тяжесть течения болезни. Выявление таких антител може иметь диагностическую и прогностическую значимость.

Совместно с Центральным Научно-исследовательским институто гастроэнтерологии МЗ России проведена апробация разработанного

/частием автора лабораторного иммуноферментного метода определения антител к пХЭ на сыворотках больных с хроническими нарушениями функций тоджелудочной железы.

Исследуемая клиническая группа состояла из пациентов, страдающих «осложненным хроническим панкреатитом, хроническим панкреатитом с зсложнениями (кальциноз, панкреонекроз, киста) и раком поджелудочной келезы. Формирование группы больных и забор клинического материала осуществлены к. м. н. Садоковым В.М. и к. м. н. Винокуровой Л.В. (ЦНИИГ МЗ России). Проведено тестирование 23 сывороток контрольной группы и 44 сывороток больных, страдающих хроническими заболеваниями юджелудочной железы. Антитела к пХЭ человека не были обнаружены в гонтрольной группе сывороток, но выявлены у ряда больных (таблица 4).

Таблица 4. Выявление антител к пХЭ в сыворотках крови человека с гспользованием разработанного иммуноферментного метода.

Контрольная группа Позитивные сыворотки Негативные сыворотки

больных больных

п=23 п=10 п=34

ОВ4?г

0,087±0,052 0,49+0,15 0,104±0,038

р<0,001

[остоверность различий между позитивными сыворотками и контрольной ■руппой подтверждена с помощью критерия Стьюдента

Проведена корреляция выявления антител к пХЭ человека с •пределенными видами патологии поджелудочной железы, исходя из линических данных больного. В ходе исследований антитела к пХЭ не 'Ыли обнаружены в сыворотках контрольной группы, а также больных роническим панкреатитом без осложнений и раком поджелудочной железы.

тоже время обнаружены антитела к пХЭ у всех 7 больных с одтвержденным диагнозом «киста головки поджелудочной железы». Кроме ого, антитела к пХЭ выявлены у двух из четырех больных с

панкреонекрозом и не обнаружены при других осложнениях хроническое панкреатита (рис.9).

Обнаружение антител к пХЭ у двух из четырех пациентов I панкреонекрозом закономерно, так как обычным разрешение! некротического процесса является киста. Возможно, что выявленные нам] антитела образуются именно на стадии панкреонекроза, являясь не тольк( гуморальным маркером кисты поджелудочной железы, но и участвуя в е< формировании.

Рис. 9 Выявление антител к пХЭ человека у больных с хроническим! заболеваниями поджелудочной железы.

Полученные нами данные позволяют прогнозировать практически значимость определения антител к пХЭ для дифференциальной диагностик: кист поджелудочной железы от других патологических процессов, I частности рака поджелудочной железы.

-27-ЗАКЛШЕНИЕ

Представленная диссертационная работа посвящена изучению 1нтигенных свойств фермента поджелудочной железы человека

№ >

[анкреатическои холестеролэстеразЬ! с использованием молекулярно->иологических, биохимических и иммунологических методов. Этот фермент ;о настоящего времени изучен не полностью, возможно, в силу сложности воей организации. Наиболее полно представлены данные о первичной труктуре белка, ферментативной активности пХЭ человека, процессах Ы-0-гликозилирования. При этом ряд важных биологических свойств этого ермента остаются не исследованными. Так, однозначно не установлен еханизм активации пХЭ солями желчных кислот, нет единого мнения о ункциональной значимости С-концевого фрагмента пХЭ человека, одержащего уникальные пролин-богатые повторы. Сведения об ммуннологической активности пХЭ носят отрывочный характер и граничиваются наблюдением об уникальности антител, вырабатываемых к ХЭ человека, в отличие от антител к пХЭ быка, собаки, крысы, ерекрестно реагирующих между собой.

Сейчас в мире возрос интерес к пХЭ в связи с обнаружением кспрессии этого белка в макрофагах и мононуклеарах крови, а также ндотелиальных клетках стенки аорты. Последний факт является наиболее нтересным, так как служит основанием предполагать наличие связи между ровнем экспрессии пХЭ клетками стенок кровеносных сосудов и развитием геросклероза. Одновременно исследуются процессы активации пХЭ солями елчных кислот, влияние пХЭ на абсорбцию пищевого холестерина, редприняты попытки моделирования трехмерной структуры белка. На общем эне исследований, посвященных пХЭ, представленная диссертационная абота вносит вклад в установление одной из функций пролин-богатых авторов пХЭ человека, изучение иммунологических свойств этого

фермента и его возможной роли в развитии кистозного поражения поджелудочной железы.

ВЫВОДЫ

1.Иммуноскринингом клонотеки кДНК из инсулиномы человека в экспрессирующем плазмидном векторе pUEXl антисывороткой к суммарным белкам инсулиномы отобран рекомбинантный клон, синтезирующий белок, идентичный С-концевому фрагменту панкреатической холестеролэстеразы человека, содержащий антигенную детерминанту.

2.Получена иммунологически активная антисыворотка морской свинки к суммарным белкам инсулиномы человека, содержащая антитела к панкреатической холестеролэстеразе.

3.С помощью клонирования фрагментов кДНК панкреатической холестеролэстеразы человека в экспрессирующий плазмидный вектор pUEX, экспрессии гибридных белков в клетках Е. Coli и анализа их иммуноферментными методами установлена локализация антигенной детерминанты панкреатической холестеролэстеразы в области пролин-богатых повторов.

4.Выделенные рекомбинантные белки, содержащие антигенную детерминанту панкреатической холестеролэстеразы человека, использованы в качестве антигена для разработки твердофазного иммуноферментного анализа наличия антител к панкреатической холестеролэстеразе.

5.Разработан лабораторный вариант иммуноферментного метода, позволяющего выявлять антитела к панкреатической холестеролэстеразе человека в сыворотке крови человека и морской свинки.

6. При проведении клинической апробации разработанного иммуноферментного метода определения антител к панкреатической холестеролэстеразе человека на сыворотках крови больных с нарушением

функций поджелудочной железы установлено наличие искомых антител у пациентов с кистами головки поджелудочной железы.

Список работ,опубликованных по теме диссертации

1. М.К. Чехранова, Е.Н. Ильина, Е.Р. Шувалова, Д.Ю .Панков, Ю.А. анков. Клонирование, определение первичной структуры и экспрессия в scherichia coli С-концевого участка человеческой холестерол-стеразы/липазы, содержащего антигенную детерминанту белка, олекулярная биология, 1994, т. 28, стр. 464-467.

2. М.К. Чехранова, Е.Р. Шувалова, Е.Н. Ильина, Д.Ю. Панков, С.Б. ябирова, Ю.А. Панков. Исследование структурных генов, кспрессирующихся в инсулиноме человека. Вестник РАМН, 1994, т. 12, гр. 17-19.

3. Ю.А. Панков, М.К. Чехранова, Е.Н. Ильина, Е.Р. Шувалова, С.Б. ябирова. Локализация антигенной детерминанты панкреатической элестеролэстеразы человека в пролин-богатых повторах. Молекулярная юлогия, 1997, т. 31, стр. 160-162.

4. Y.A. Pankov, М.К. Chekhranova, E.R. Schuvalova, A.M. Kutin, .N. Xlyina, A.B. Valentsova. Utilization of a human insulinoma cDNA Lbrary to identify novel proteins of islet cells. Abst. P-17.04.036, .541 in "Ninth International Congress of Endocrinology" abstracts, :ance, Nice, 1992.

5. Y.A. Pankov, M.K. Chekhranova, E.N. II'ina, E.R. Schuvalova, ,B. Diybirova, D.Yu. Pankov. Proline-rich repeats are the antigenic :terminants of human carboxylic ester hydrolase/lipase. Abst. P. 49 i "Third International Symposium on Bioorganic Chemistry" abstracts, igomys, 1995.

6. Y.A. Pankov, M.K. Chekhranova, E.N. Il'ina, S.B. Diybirova, R. Schuvalova, V.N. Goncharova, V.A. Gorelysheva, O.M. Smirnova.

Antibodies to human pancreatic cholesterol esterase as markers of lat€ diabetic complications. P3-8 66 Reproduction Poster Presentations oi 10" International Congress of Endocrinology, San Francisco, USA, 1996.

7. M.K. Чехранова, E.H. Ильина, E.P. Шувалова, С.Б. Дябирова, JI.В. Винокурова, В.М. Садоков, Ю.А. Панков. Создание бактериального продуцента антигенной детерминанты панкреатической холестеролэстеразь человека и разработка на его основе иммуноферментного метода определения аутоантител. III Всероссийский съезд эндокринологов. Тезисы докладов, стр. 26, 1956.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

BSA - бычий сывороточный альбумин

PBS - фосфорно-буферная смесь

SDS - долецил сульфат Na

TBS - трис-буферная смесь

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - ДНКовая копия мРНК

мРНК - матричная РНК

ПААГ - полиакриламидный гель

пХЭ - панкреатическая холестеролэстераза

РНК - рибонуклеиновая кислота

ЭДТА - этилендиамин тетрауксусная кислота

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ильина, Елена Николаевна, Москва

/

л ¿? V* ~ «К / о о

У -Г!' / Ж

С*

российская академия медицинских наук эндокринологический научный центр

(директор - академик РАМН, проф. Дедов И.И.) ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЭНДОКРИНОЛОГИИ (директор - академик РАМН, проф. Акмаев И.Г.)

На правах рукописи

ИЛЬИНА Блена Николаевна

"Создание бактериального продуцента антигенной детерминанты панкреатической холестеролэстеразы человека н разработка на его основе мммуноферментного анализа для определения аутоантител".

03.00.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ академик РАМН, профессор Ю.А. Панков

Москва, 1998 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список принятых сокращений__3

ВВЕДЕНИЕ_:__4

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.__10

1.1. Особенности структурной организации молекулы пХЭ; ее биологические и иммунологические свойства.__11

1.2. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности

кДНК пХЭ; организация гена пХЭ.__19

1.3. Роль пХЭ в нормальных физиологических условиях и в патологии. 24

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.__32

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Клонирование, определение первичной структуры и экспрессия в

Е. coli иммуногенного белка - С-терминального участка пХЭ человека. 45

3.2. Локализация линейной антигенной детерминанты пХЭ в пролин-богатых повторах.__58

3.3. Разработка ИФА для определения антител к пХЭ в сыворотке человека и животных.____61

3.4. Выявление антител к пХЭ человека у больных с кистами головки

поджелудочной железы____65

ЗАКЛЮЧЕНИЕ__70

ВЫВОДЫ______74

Список работ, опубликованных по теме диссертации__76

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.____78

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

BSA - бычий сывороточный альбумин

PBS - фосфорно-буферная смесь

SDS - додецил сульфат Na

TBS - трис-буферная смесь

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - ДНКовая копия мРНК

мРНК - матричная РНК

ПААГ - полиакриламидный гель

пХЭ - панкреатическая холестеролэстераза

РНК - рибонуклеиновая кислота

ЭДТА - этилендиамин тетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Начиная с середины текущего столетия в связи с внедрением достижений биологической науки в практику здравоохранения произошли существенные изменения в структуре заболеваний человека. Изменился спектр инфекционных заболеваний за счет широкого применения антибиотиков и вакцинации населения против наиболее опасных микроорганизмов, возросла доля внутренних болезней, обусловленных нарушением нормальных физиологических процессов, протекающих в человеческом организме. Согласно данным, опубликованным в ежегодном докладе Всемирной Организации Здравоохранения, число онкологических, сердечно-сосудистых заболеваний и ряда других хронических болезней, ежегодно уносящих жизни 24 миллионов людей на планете, возрастет и достигнет в следующем тысячелетии сотен миллионов. Среди них отдельно следует выделить патологические процессы, связанные с нарушением обмена веществ (эндокринные заболевания) и онкологические заболевания. Так, ожидается, что в течение ближайших 25 лет количество заболеваний раком в большинстве стран мира удвоится. Диагностика внутренних болезней, особенно превентивная диагностика, весьма затруднительна, так как клиническая картина болезни наблюдается при уже значительных поражениях органов и тканей.

Одной из основных задач клинической биохимии является поиск новых гуморальных маркеров для дифференциальной диагностики различных заболеваний внутренних органов и прогнозирования их осложнений и тяжести течения. Такого рода маркерами могут служить

антитела, вырабатываемые к наиболее иммуногенным белкам органов и тканей. Эти же белки могут играть существенную роль в этиопатогенезе патологического процесса.

Представляемое исследование является частью общей научной работы, проводимой в лаборатории молекулярной эндокринологии Эндокринологического Научного Центра РАМН с использованием ткани инсулиномы человека после хирургической резекции опухоли. Основным направлением этой работы является выявление наиболее иммуногенных белков, экспрессируемых клетками инсулиномы человека, создание их бактериальных продуцентов и разработка методов тестирования аутоантител при использовании рекомбинантных белков в качестве антигена.

В качестве объекта исследования были выбраны клетки инсулиномы человека, как возможный продуцент маркеров сахарного диабета. Можно предположить, что аутоантитела образуются к наиболее иммуногенным белкам. Таким образом, выявление этих белков могло бы привести к открытию новых гуморальных маркеров инсулин зависимого сахарного диабета или других заболеваний.

С другой стороны, так как инсулинома - это опухоль, в ее клетках экспрессируются белки, характерные для опухолевых тканей организма. Как правило, опухолевые белки являются сильными антигенами. Учитывая этот факт можно было предполагать, что в ходе данной работы мог бы быть выявлен рекомбинантный клон, экспрессирующий опухолевый антиген. Результаты такого рода исследования могли бы быть использованы для направленной иммунотерапии раковых клеток.

В рамках этого общего направления исследований была создана библиотека кДНК из инсулиномы человека в экспрессирующем плазмидном векторе риЕХ1, из которой методом нуклеотидного скрининга извлечен рекомбинантный клон, кодирующий полноразмерный белок препроинсулина в составе гибридного белка с р-галактозидазой [6].

Целью представляемой диссертационной работы было создание бактериального продуцента антигенной детерминанты панкреатической холестеролэстеразы человека и разработка на его основе методов тестирования антител с использованием существующей клонотеки кДНК из инсулиномы человека.

Конкретными задачами исследования являлись:

• получение иммунологически активной антисыворотки морской свинки к суммарным белкам инсулиномы человека, содержащей антитела к панкреатической холестеролэстеразе;

• проведение с помощью последней иммуноскрининга клонотеки кДНК из инсулиномы человека в экспрессирующем плазмидном векторе рЦЕХ! и выявление иммунопозитивных рекомбинантных клонов; идентификация иммунопозитивных белков;

® установление локализации антигенной детерминанты в структуре иммунопозитивного фрагмента панкреатической холестеролэстеразы, используя методы молекулярного клонирования, секвенирования и иммуноферментного анализа; в выделение гибридных белков, вырабатываемых созданными генно-инженерными продуцентами;

• использование рекомбинантных белков в качестве антигена в разработке лабораторного варианта твердофазного иммуноферментного метода выявления антител к панкреатической холестеролэстеразе в сыворотке человека и морской свинки;

• проведение скрининга больных с различными нарушениями функции поджелудочной железы с целью выявления у них аутоантител к панкреатической холестеролэстеразе человека и установления корреляции с определенными видами патологии.

Представляемое научное исследование проводилось на базе лаборатории молекулярной эндокринологии Эндокринологического Научного Центра РАМН с использованием созданной ранее клонотеки кДНК из инсулиномы человека [6] и выделенных параллельно из того же биологического материала суммарных белков инсулиномы.

Первая часть диссертационной работы посвящена выявлению и идентификации иммунопозитивных рекомбинантных клонов. Предложена методика получения антисыворотки для иммуноскрининга клонотеки -иммунизация морских свинок суммарным раствором белков инсулиномы. Оригинальность этого подхода состоит в том, что для создания клонотеки кДНК и получения антисыворотки был использован один и тот же биологический материал. Единый образец ткани инсулиномы человека был подвергнут биохимической обработке, в результате которой был выделен пул мРНК, послуживший основой для создания клонотеки кДНК, и суммарные белки инсулиномы, в дальнейшем использованные для иммунизации морских свинок. Этот подход позволил получить антисыворотку, специфичную к сильному иммуногенному белку -

панкреатической холестеролэстеразе. Иммунопозитивный рекомбинантный клон, содержащий кДНК вставку 3' концевого фрагмента панкреатической холестеролэстеразы, был выявлен традиционным методом иммуноскрининга. Идентификацию вставки кДНК проводили с помощью рестрикционного анализа и частичного определения нуклеотидной последовательности методом Сенгера. Аналогичный подход может быть использован для обнаружения антигенов любых других органов и тканей.

Вторая часть работы заключалась в изучении природы иммуногенности панкреатической холестеролэстеразы человека, выявлении локализации антигенной детерминанты в структуре молекулы белка. Эта задача решена на генетическом уровне путем клонирования субфрагментов фермента, создания их бактериальных продуцентов и тестирования иммунологических свойств экспрессируемых гибридных белков. В результате этого исследования установлена локализация антигенной детерминанты панкреатической холестеролэстеразы человека в пролин-богатых повторах фермента. Таким образом, экспериментально показана неизвестная ранее функция уникальной белковой структуры - пролин-богатых повторов панкреатической холестеролэстеразы человека.

Третья часть иллюстрирует практическое применение созданных бактериальных продуцентов в качестве источников антигенов для иммуноферментного тестирования наличия антител к панкреатической холестеролэстеразе в сыворотках человека и морской свинки. Ценность разработанного метода представлена результатами клинической апробации, которая показала возможность оценки наличия антител к панкреатической

холестеролэстеразе человека для дифференциальной диагностики кист поджелудочной железы.

% ^ эК

Автор выражает огромную благодарность Юрию Александровичу Панкову за мудрое научное руководство и предоставленную возможность выполнить настоящее исследование. Искренняя признательность Чехрановой М.К., Шуваловой Е.Р., Яцышиной С.Б за непосредственную помощь в выполнении поставленных задач, а также сотрудникам Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии Садокову В.М. и Винокуровой A.B. за предоставление клинического материала и помощь в интерпретации полученных данных с точки зрения практикующих врачей. Вклад соавторов отражен в совместных публикациях.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В состав панкреатичекого сока млекопитающих входят два важнейших липолитических фермента, участвующих в переваривании пищевых жиров: панкреатическая липаза и панкреатическая холестеролэстераза. Оба фермента относятся к классу эстераз и расщепляют сложноэфирные связи между углеводородными остатками жирных кислот и глицерином или его заместителями (холестерин, фосфатидилхолин и т.д.). Панкреатическая липаза (триацилглицерол липаза, К.Ф. 3.1.1.3) [50, 72] отвечает за расщепление три-, ди- и моно-ацилглицеролов, основных компонентов пищевых липидов. В 1981 году была установлена аминокислотная последовательность панкреатической липазы свиньи [19], а позднее - аминокислотная последовательность и кристаллическая структура панкреатической липазы человека [50, 72]. Помимо панкреатической липазы секрет поджелудочной железы содержит другой липолитический фермент, который гидролизует не только триацилглицеролы, но и другие, реже встречающиеся пищевые жиры, включая фосфолипиды, эфиры холестерина и жирорастворимых витаминов [46, 67]. Для проявления своей активности этот фермент требует присутствия солей желчных кислот. По аналогии с панкреатической липазой он был назван панкреатической холестеролэстеразой (пХЭ) [46]. На ранних этапах исследования продуктов секреции поджелудочной железы помимо этих двух панкреатических эстераз выделяли еще лизофосфолипазу. В дальнейшем было показано, что как самостоятельная единица этот фермент не существует, а функции

лизофосфолипазы в организмах человека, крысы, быка выполняет пХЭ [23, 36, 40]. В настоящее время доказано, что пХЭ идентична неспецифической липазе из молочной железы человека, активируемой солями желчных кислот (bile salt activated lipase) [35, 53]. Представляется весьма затруднительным определить код этого фермента по международной классификации ферментов в связи с его широкой субстратной специфичностью. ПХЭ проявляет свойства карбоксилэстеразы [К.Ф. 3.1.1.1], арилэстеразы [К.Ф. 3.1.1.2], триацилглицерол липазы [К.Ф. 3.1.1.3], лизофосфолипазы [К.Ф. 3.1.1.5], холестеролэстеразы [К.Ф. 3.1.1.13], ацилглицерол липазы [К.Ф. 3.1.1.23] и фосфолипазы А [К.Ф. 3.1.1.32]. В прошлом этот фермент разные исследователи называли по-разному: лизофосфолипаза [30], холестеролэстераза [17], карбоксилэстер гидролаза [9, 46], карбоксилэстер липаза [68], липаза, стимулируемая (активируемая) солями желчных кислот [10, 11, 53] и липаза, зависимая от солей желчных кислот [8].

В настоящей работе, чтобы подчеркнуть связь этого фермента с поджелудочной железой, ее экскреторной функцией, он будет называться панкреатическая холестеролэстераза (пХЭ).

1.1. Особенности структурной организации молекулы пХЭ; ее биологические и иммунологические свойства.

ПХЭ синтезируется в ацинарных клетках поджелудочной железы и поступает в просвет двенадцатиперстной кишки в составе панкреатического сока [46]. У человека полноценный синтез пХЭ

наблюдается только во взрослом состоянии, тогда как новорожденный получает этот фермент с молоком матери [62]. Содержание пХЭ составляет около 4% от общей белковой массы секрета поджелудочной железы [17]. Как известно, протеазы, входящие в состав сока поджелудочной железы, секретируются в неактивной форме в виде зимогенов и подвергаются химической модификации (активации) уже в просвете двенадцатиперстной кишки. Эстеразы (панкреатическая липаза и пХЭ) синтезируются сразу в виде белка, обладающего базальной активностью. Но для резкого увеличения своей активности эти ферменты требуют присутствия солей желчных кислот [11, 32, 67]. Недавно появились данные свидетельствующие, что пХЭ человека частично специфически связана с мембранами эндоплазматического ретикулума зимогенных гранул [13], причем процесс диссоциации этого комплекса является энергетически зависимым и требует присутствия АТФ [55]. Как известно, в процессе секреции содержимое гранул выходит в секреторные протоки, а мембрана вливается в цитоплазматическую мембрану клетки. Таким образом, пХЭ может играть роль молекулярного маркера ацинарных клеток [13]. Показано существование двух форм этого фермента у крысы: секреторной формы, которая выходит в просвет протоков поджелудочной железы, и формы, частично встроенной в эндоплазматическую мембрану, представленной на поверхности зимогенных гранул и обладающей преимущественно фосфолипазной и лизофосфолипазной активностями [73]. Эти две формы пХЭ имеют разную молекулярную массу (70 кДа и 92 кДа, соответственно), что, по мнению авторов, связано с разной степенью гликозилирования свободной и встроенной форм фермента.

ПХЭ человека - гликопротеин с молекулярной массой примерно 100 кДа [17, 32, 67]. Аминокислотный состав пХЭ человека был установлен в 1981 году [32], а в 1988 году проведен N-концевой аминокислотный секвенс молекулы пХЭ [68]. В 1990-1991 годах получена полноразмерная кДНК этого фермента [10, 35, 53, 57] и на ее основе выведена аминокислотная последовательность, которая включает 20 аминокислотных остатков сигнального пептида и 722 аминокислотных остатков структурной части белка, что соответствует белку с молекулярной массой примерно 77 кДа.

Молекула пХЭ имеет уникальную структуру. При сравнении первичной структуры белков пХЭ человека с пХЭ других видов животных (крысы, быка, кролика) [16, 30, 36, 40] наибольшее сходство выявлено между N-концевыми участками белков (14 - 505 а.о.), а основные различия приходятся на С-конец (рис. 1). Сходная картина наблюдается и при сравнении родственных ферментов (панкреатическая липаза, адетилхолинэстераза, пХЭ) внутри одного вида [15].

Трехмерная структура пХЭ человека, в отличие от панкреатической липазы [72], до настоящего времени полностью не изучена. Созданы компьютерные модели молекул пХЭ человека и крысы, экспериментально пока не подтвержденнные [25]. Ведутся активные работы по рентгеноструктурному анализу пХЭ быка [71). Установлено существование 2-х доменов пХЭ быка: глобулярный N-домен и С-домен, структура которого представляет р-складчатый слой. Оба эти домена соединены между собой подвижной петлей, которая принимает фиксированное положение при активации солями желчных кислот.

HUMAN mgrlqlvvlgltcCWAVASAAKLGAVYTEGGFVEGVNKKLGLLGDSVDIFKGIPFAAPTK 60

RAT mgrlevlflgltcCLAAACAAKLGAVYTEGGFVEGWKKLSLLGGDSVDIFKGIPFATAK 60

BOVIN lgasrlgpspg—CLAVASAAKLGSVYTEGGFVEGVNKKLS LFGDSVDIFKGIPFAAAPK 58

RABBIT mgrleltvlglacLLDSGACGDLGPVYTEGGFVEGENKKLSLLGDDSVDIFKGIPFATPA 60

HUMAN ALENPQPHPGWQGTLKAKNFKKRCLQATITQDSTYGDEDCLYLNIWVPQGRKQVSRDLPV 120

RAT TLENPQRHPGWQGTLKATDFKKRCLQATITQDDTYGQEDCLYLNIWVPQGRKQVSHDLPV 12 0

BOVIN ALEKPERHPGW